ANALISIS GEN 16S rRNA PADA BAKTERI PENGHASIL ENZIM …/Analisis... · 15. Semua pihak yang tidak...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

i

ANALISIS GEN 16S rRNA PADA BAKTERI PENGHASIL ENZIM FITASE

TESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan

Guna memperoleh gelar Magister Sains Program Studi Biosains

Oleh

Rita Wulandari S 900809016

PROGRAM PASCA SARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA 2011


commit to user

ii


TESIS

Oleh

Rita Wulandari

S 900809016

Telah disetujui oleh pembimbing

Komisi

Pembimbing

Nama

Tanda tangan

Tanggal

Pembimbing I Prof. Dr. rer. nat. Sajidan, M.Si ……………… ………..………

Pembimbing II Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D ……………… ………………..

Mengetahui Ketua Program Studi Biosains

Program Pasca Sarjana

Dr. Sugiyarto, M.Si NIP. 19670430199203 1 002


commit to user

iii


TESIS

Oleh

Rita Wulandari S900809016

Telah dipertahankan di depan penguji

Dinyatakan telah memenuhi syarat

Pada tanggal..........................2011

Telah disetujui oleh tim penguji

Jabatan Nama Tanda Tangan Tanggal

Ketua Prof. Dr Sugiyarto, M.Si NIP. 19670430 199203 1 002

..................2011

Sekertaris Dr. Edwi Mahajoeno, M.Si NIP.19601025 199702 1 001

..................2011

Anggota Penguji

Prof. Dr. rer. nat. Sajidan, M.Si NIP.19660415 199103 1 002

Prof. Drs. Suranto, MSc., PhD NIP.19570820 198503 1 004

..................2011 ..................2011

Mengesahkan

Direktur Program Pasca Sarjana

Prof. Drs. Suranto, MSc., PhD

NIP.19570820 198503 1 004

Ketua Program Studi Biosain

Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si

NIP. 19670430 199203 1 002


commit to user

iv

PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa :

1. Tesis yang berjudul : “Analisis gen 16s rRNA pada bakteri penghasil

enzim fitase” ini adalah karya penelitian saya sendiri dan tidak terdapat

karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar

akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau

diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis dikutip dalam naskah

ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar pustaka. Apabila

ternyata di dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan terdapat unsure-unsur

jiplakan, maka saya bersedia Tesis beserta gelar MAGISTER saya

dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan

yang berlaku (UU No.20 Tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70).

2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi BIosains PPs-UNS. Publikasi sebagian

atau keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin

Ketua Prodi Biosains PPS-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan

tim pembimbing sebagai author. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya

satu semester (6 bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan

publikasi dari sebagian atau keseluruhan Tesis ini, maka Prodi Biosains PPS-

UNS berhak mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh

Prodi Biosains PPS-UNS dan atau media yang ditunjuk. Apabila saya

melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka saya bersedia

mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.

Surakarta, 20 Desember 2011

Mahasiswa,

Rita Wulandari S900809016


commit to user

v

ANALISIS GEN 16s rRNA PADA BAKTERI PENGHASIL ENZIM FITASE

Rita Wulandari, Sajidan, Suranto Program Studi Magister Biosains, Program Pasca Sarjana

Universitas Sebelas Maret Surakarta

Abstrak

Fitase merupakan enzim yang mampu melepaskan ikatan fosfat pada fitat, menghasilkan myo-inositol dan fosfat inorganik. Fitase mempunyai peran penting dalam ketersediaan nutrisi pada bahan pangan. Bakteri merupakan salah satu sumber penghasil fitase yang potensial sehingga perlu dilakukan penggalian galur bakteri penghasil fitase dari lingkungan. Tujuan dari penelitian ini adalah (1) Mengukur aktivitas fitase pada bakteri dari abu vulkanik Gunung Merapi, (2) Mengidentifikasi bakteri penghasil fitase berdasarkan gen 16S rRNA, (3) Mengkarakterisasi ekstrak fitase yang diperoleh dari bakteri penghasil fitase pada abu vulkanik Gunung Merapi.

Bakteri diisolasi dari Abu vulkanik gunung Merapi dalam media LB (Luria Bertani) dan media LB (Luria Bertani) + Na fitat 0,4%. Aktivitas fitase diukur dengan metode spektrofotometri. Sebanyak 3 isolat bakteri dengan aktivitas fitase tertinggi diidentikasi dengan marka gen 16s rRNA menggunakan primer universal. Karakterisasi ekstrak kasar fitase meliputi pH optimum, suhu optimum dan efektor logam.

Hasil penelitian diperoleh 3 isolat dengan aktivitas fitase terbesar, yaitu isolat RW Sm A, RW Sm C, dan RW Sl 5 masing-masing dengan aktivitas fitase sebesar 0,1071 U/mL, 0,1020 U/mL dan, 0,0874 U/mL. Berdasarkan analisis gen 16s rRNA ketiga isolat diketahui sebagai Bacilllus cereus RW Sm A, Bacillus aryabhattai RW Sm C dan Bacillus cereus RW Sl 5. Ekstrak kasar fitase dari ketiga isolat masing-masing mempunyai suhu optimum berturut turut; 40 oC, 60 oC, 50 oC. pH optimum ketiga isolat berkisar antara 5-6. Aktivitas fitase isolat dihambat oleh penambahan ion Fe3+, dan Zn2+, tetapi meningkat dengan penambahan ion Ca2+.

Kata kunci : Fitase, asam fitat, 16s rRNA, Bakteri, Bacillus


commit to user

vi

16s rRNA GENE ANALYSIS ON PHYTASE-PRODUCING BACTERIA

Rita Wulandari, Sajidan and Suranto Biosience Program, School of Graduates

Sebelas Maret University of Surakarta

Abstract

Phytases is an enzyme that catalyzes the releasing of phosphomonoester bonds in phytate, thereby producing lower forms of myo-inositol phosphates and inorganic phosphate. Phytase has important role in animal and human nutrition availability. Bacteria is one of potential source of phytase,so more excavation for phytase-producing strains of bacteria from the environment is needed. The purposes of this study are (1) Analyzing the phytase activity bacteria from volcanic ash of Merapi mountain, (2) Identifying of phytase producing bacteria based on 16S rRNA gene, (3) Characterizing of extracted phytase from bacteria on volcanic ash of Merapi Mountain.

Bacteria were isolated from volcanic ash of Merapi Mountain in LB (Luria Bertani) medium and LB (Luria Bertani) + 0.4% Na phytate. Phytase activity measure by spectrophotometric methods. Three isolates of bacteria with the highest activity was identified with 16s rRNA gene markers using universal primer. Crude phytase extract characterization including optimum pH, optimum temperature and mineral efector.

The results should that for three isolates with the largest phytase activity, ie isolates RW Sm A, RW Sm C and RW Sl 5 with phytase activity 0.1071 U / mL, 0.1020 U / mL and, 0.0874 U / mL. Based on 16s rRNA gene analysis of three isolates known as Bacilllus cereus RW Sm A, Bacillus aryabhattai RW Sm C and Bacillus cereus RW Sl 5. Three isolated of crude phytase extractions have an optimum temperature 40 °C, 60 °C, 50 °C respectively, range of the optimum pH between 5-6. Phytase activity was inhibited by the addition of Fe3+ ions, and Zn2+, but increased with the addition of Ca2 + ion.

Key words: Phytase, phytic acid, 16s rRNA, bacteria, Bacillus


commit to user

vii

HALAMAN PERSEMBAHAN

Segala puji bagi Allah Tuhan semesta alam.

Karya ilmiah ini penulis persembahkan kepada,

Ibu Darmini dan bapak Sarjono tercinta,

Suamiku, Muhammad Irham Mahfud tercinta,

Mas Yus dan Dik Arum tersayang.

‘Jagoan kecilku’, yang sebentar lagi hadir.


commit to user

viii

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah Tuhan semesta alam, atas limpahan rahmat dan

hidayah-NYA penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul: “Analisis gen

16s rRNA pada bakteri penghasil enzim fitase”. Tulisan ini menyajikan

bahasan tentang bakteri penghasil enzim fitase, identifikasi, dan karakteristik

enzim yang dihasilkan.

Penelitian ini mempunyai nilai penting dalam penemuan sumber enzim

fitase baru yang diisolasi dari lingkungan sehingga memperkaya sumber enzim

fitase dari mikroorganisme yang berasal dari lingkungan dan wilayah berbeda.

Adanya bakteri penghasil fitase yang diisolasi dari lingkungan vulkanik

diharapkan menambah keberagaman jenis bakteri sumber enzim fitase.

Identifikasi dan karakteristik enzim yang diperoleh selanjutnya dapat digunakan

dan dikembangkan untuk karakterisasi dalam aplikasi bioteknologi serta

pengembangan teknik rekayasa genetika untuk mendapatkan enzim yang lebih

optimal.

Kekurangan penulis dalam mengungkapkan ide, gagasan dan eksplorasi

hasil merupakan keterbatasan yang penulis miliki. Berbagai saran yang

membangun penulis harapkan untuk menambah kemanfaatan tulisan ini.

Desember 2011

Penulis


commit to user

ix

UCAPAN TERIMA KASIH

Segala puji bagi Allah Tuhan semesta alam, atas segala rahmat dan karunia

yang senantiasa tercurah, sehingga penulis dapat menyelesaikan Tesis dengan

judul ” Analisis gen 16s rRNA pada bakteri penghasil enzim fitase”.

Penyusunan tesis ini tidak lepas dari bantuan, kerjasama dan bimbingan

berbagai pihak, oleh karena itu penulis menyampaikan rasa hormat dan terima

kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Rektor Universitas Sebelas Maret yang telah memberikan ijin untuk

mengadakan penelitian ini.

2. Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D selaku Direktur Program Pascasarjana

Universitas Sebelas Maret yang telah memberikan kesempatan yang seluas-

luasnya mengikuti pendidikan pascasarjana.

3. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si dan Dr. Edwi Mahajoeno, M.Si selaku Pengelola

Program Studi BIOSAIN yang telah membimbing dan memotivasi dalam

menyelesaikan program pembelajaran.

4. Prof. Dr. rer. nat. Sajidan, M.Si selaku pembimbing pertama dan Prof. Drs.

Suranto, M.Sc, Ph.D selaku pembimbing kedua yang telah berkenan

memberi bimbingan sepenuhnya sampai tesis ini dapat penulis selesaikan

5. Prof. Dr. rer. nat. Sajidan, M.Si selaku ketua Tim peneliti yang telah

mensupport dana untuk rangkaian penelitian ini

6. Bapak Adi Magna Patriadi Nuhriawangsa, S.Pt., M.P, bapak Dr. sc. agr. Adi

Ratriyanto, S.Pt., M.P, dan Umi Fatmawati M.Si yang telah bekerjasama dan

membantu penelitian ini

7. Semua dosen Program studi Biosain yang telah memberikan ilmu, bantuan

dan pengarahan

8. Seluruh staff UPT sub Laboratorium BIOLOGI Universitas Sebelas Maret

yang telah berkenan mengijinkan dan membantu penulis dalam melakukan

penelitian

9. Seluruh staff UPT sub Laboratorium KIMIA Universitas Sebelas Maret yang

telah berkenan mengijinkan dan membantu penulis dalam melakukan

penelitian.


commit to user

x

10. Seluruh staff Laboratorium Prodi P. Biologi FKIP Universitas Sebelas Maret

yang telah berkenan memberi ijin penelitian bagi penulis.

11. Evi Novitasari, Suci, Lala dan mbak Tri, atas kerjasama serta bantuan selama

penyelesaian penelitian, mas Rosyid dan dek Ivah, atas bantuan dalam

berbagai urusan administrasi.

12. Teman-teman Biosain angkatan 2009 (Pipit, Ana, Ainun, Nina, Dodik, Zahra,

Mbak Ifan, Pak Hamdin, Pak Supriyadi, Bu Yayuk, Bu Mamik, Bu Nony,

Phyllis, Bundo Ria, Bundo Tiwuk, Bu Turweni, Pak Muryanto, Pak

Inpurwanto, Pak Heru, Pak Amar, Pak Supono) yang telah memberikan

bantuan, dukungan dan kerjasama.

13. Ibu Darmini, bapak Sarjono, yang selalu memberi restu, dan doa-doa disetiap

langkah penulis, dek Arum, mas Yus, Ibu Tasmiyati, bapak Ahmad Sardi,

mbak Laily, mbak Nana, mas Udin, dek Fitri, yang semakin membuat penulis

bersyukur berada ditengah tengah keluarga ini.

14. Abi, Muhammad Irham Mahfud, sebagai partner sepanjang waktu yang selalu

mendukung, memotivasi, mendoakan, dan juga telah membantu dalam akses

berbagai jurnal selama penulisan tesis ini.

15. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu yang telah

berkontribusi dalam penyelesaian tesis ini.

Semoga segala kebaikan dibalas dengan kebaikan yang lebih baik dari

Allah SWT.

Surakarta, Desember 2011

Penulis


commit to user

xi

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL i

HALAMAN PERSETUJUAN ii

HALAMAN PENGESAHAN iii

PERNYATAAN ORISINALITAS iv

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

HALAMAN PERSEMBAHAN vii

KATA PENGANTAR viii

UCAPAN TERIMAKASIH ix

DAFTAR ISI xi

DAFTAR TABEL xiii

DAFTAR GAMBAR xv

DAFTAR LAMPIRAN xvi

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang 1

B. Perumusan Masalah 4

C. Tujuan Penelitian 4

D. Manfaat Penelitian 4

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka 5

1. Ribosomal RNA 5

1.1 Gen 16s rRNA 5

1.2 Analisis gen 16s rRNA 6

2. Asam Fitat 7

2.1 Struktur Asam fitat 7

2.2 Sumber Asam fitat 8

2.3 Ketersediaan nutrisi dan dampak lingkungan 10

3. Enzim Fitase 12

3.1 Enzim 12

3.1.1 Aktivitas Enzim 12

3.2 Enzim Fitase 15


commit to user

xii

3.2.1 Klasifikasi Enzim Fitase 16

3.2.2 Aktifitas Enzim Fitase 19

3.2.3 Sumber Enzim Fitase 20

a. Fitase Asal Mikroba 21

b. Fitase Tanaman 23

c. Fitase pada jaringan tubuh hewan 24

B. Kerangka Penelitian 26

BAB III METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian 27

B. Alat dan Bahan Penelitian 27

C. Rancangan Penelitian 28

D. Prosedur Penelitian 28

E. Teknik Analisis Data 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi Bakteri Fitase 35

B. Seleksi Bakteri Fitase 37

C. Karakteristik Bakteri Fitase 40

C.1. Morfologi Sel 40

C.2. Fisiologi Sel dan Ekspresi Fitase 42

D. Identifikasi Bakteri 44

E. Karakteristik Ekstrak Kasar Fitase 53

E.1. Suhu Optimum 53

E.2. pH Optimum 54

E.3. Efektor Logam 56

F. Fitase pada Bacillus 58

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN 61

B. SARAN 61

DAFTAR PUSTAKA 63

LAMPIRAN 69


commit to user

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Ribosomal RNA 5

Tabel 2. Bahan pangan dan kandungan asam fitat 9

Tabel 3. 4 kelompok fitase 20

Tabel 4. Fitase Tanaman 23

Tabel 5. Tabel Homologi Isolat RW Sm A 49

Tabel 6. Tabel Homologi Isolat RW Sm C 50

Tabel 7. Tabel Homologi Isolat RW Sl 5 50

Tabel 8. Karakteristik Enzim Fitase pada Bacillus 59

Tabel L.A1. Pembuatan Kurva Standar Phosphat 69

Tabel L. A2. Aktivitas Relatif Fitase (%) 16 Isolat Bakteri 70

Tabel L. A3. Aktivitas Fitase 16 Isolat Bakteri (U/mL) 70

Tabel L. A4. Aktivitas Relatif Fitase (%) 5 Isolat Bakteri 71

Tabel L. A5. Aktivitas Fitase 5 Isolat Bakteri 71

Tabel L. A6. Absorbansi berdasarkan lama inkubasi Isolat RW Sm A 71

Tabel L. A7. Aktivitas Fitase berdasarkan lama inkubasi Isolat RW Sm A 71

Tabel L. A8. Absorbansi berdasarkan Lama Waktu Inkubasi Isolat

RW Sm C 72

Tabel L. A9. Aktivitas Fitase berdasarkan Lama Waktu Inkubasi Isolat

RW Sm C 72

Tabel L. A10. Absorbansi Berdasarkan Lama waktu Inkubasi Isolat

RW Sl 5 72

Tabel L. A11. Aktivitas Fitase Berdasarkan Lama waktu Inkubasi Isolat

RW Sl 5 73

Tabel L. A12. Absorbansi berdasarkan pH substrat pada Isolat

RW Sm A 73

Tabel L. A13. Aktivitas Fitase berdasarkan pH substrat pada Isolat

RW Sm A 73

Tabel L. A14. Absorbansi berdasarkan pH substrat pada Isolat

RW Sm C 74

Tabel L. A15. Aktivitas Fitase berdasarkan pH substrat pada Isolat

RW Sm C 74


commit to user

xiv

Tabel L. A16. Absorbansi berdasarkan pH Substrat pada Isolat

RW Sl 5 74

Tabel L. A17. Aktivitas Fitase berdasarkan pH Substrat pada Isolat

RW Sl 5 75

Tabel L. A18. Absorbansi berdasarkan Suhu Inkubasi Enzim-Substrat

pada Isolat RW Sm A 75

Tabel L. A19. Aktivitas Fitase berdasarkan Suhu Inkubasi Enzim-Substrat

pada Isolat RW Sm A 75


pada Isolat RW Sm C 76


pada Isolat RW Sm C 76


pada Isolat RW Sl 5 76


pada Isolat RW Sl 5 77

Tabel L. A24. Absorbansi Isolat RW Sm A pada pH dan Suhu optimum

pada berbagai durasi pemanasan (Stabilitas Suhu) 77

Tabel L. A25. Aktivitas Fitase Isolat RW Sm A pada pH dan Suhu optimum


Tabel L. A26. Absorbansi Isolat RW Sm C pada pH dan Suhu optimum


Tabel L. A27. Aktivitas Fitase Isolat RW Sm C pada pH dan Suhu optimum


Tabel L. A28. Aktivitas Fitase Isolat RW Sl 5 pada pH dan Suhu optimum


Tabel L. A29. Aktivitas Fitase Isolat RW Sl 5 pada pH dan Suhu optimum


Tabel L. A30. Absorbansi penambahan Efektor Logam RW Sm A 79

Tabel L. A31. Absorbansi penambahan Efektor Logam RW Sm C 79

Tabel L. A32. Absorbansi penambahan Efektor Logam RW Sl 5 80

Tabel L. A33. Aktivitas Fitase dengan penambahan Efektor Logam 80

Tabel L. G1. Jadwal kegiatan penelitian 89


commit to user

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Aktif Enzim 8

Gambar 2. Ikatan Asam fitat dengan Fe2+ dan Protein 11

Gambar 3. Struktur aktif enzim 12

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi enzim pada aktivitas 13

Gambar 5. Pengaruh Konsentrasi substrat pada aktivitas enzim 13

Gambar 6. Pengaruh pH pada aktivitas enzim 14

Gambar 7. Pengaruh Suhu pada aktivitas enzim 14

Gambar 8. Hidrolisis Fitat 16

Gambar 9. 6 – fitase (EC 3.1.3.26), fitase 3 – fitase (EC 3.1.3.8) 17

Gambar 10.Defosforilasi asam fitat oleh 3-fitase Saccaromices cerevisae.. 17

Gambar 11. Kerangka Penelitian 26

Gambar 12. Isolasi Bakteri medium cair dan padat 36

Gambar 13. Warna kuning pada reaksi vanadomolibdofosforik 38

Gambar 14. Aktivitas fitase 16 isolat bakteri 39

Gambar 15. Koloni Bakteri 40

Gambar 16. Diagram pewarnaan gram bakteri 41

Gambar 17. Perbandingan dinding sel Bakteri gram positif dan gram

Negatif 42

Gambar 18. Perbandingan fase pertumbuhan bakteri 43

Gambar 19. Elektroforesis DNA 45

Gambar 20. Elektroforegram hasil amplifikasi gen 16s rRNA 48

Gambar 21. Perbandingan urutan basa DNA 49

Gambar 22. Pohon filogenetik 52

Gambar 23. Kurva aktifitas fitase pada berbagai suhu inkubasi 54

Gambar.24a. Kurva aktivitas fitase pada berbagai pH 55

Gambar.24b. Kurva aktivitas fitase pada berbagai waktu inkubasi 56

Gambar.25. Kurva aktivitas relatif fitase pada penambahan ion mineral 58


commit to user

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran A. Pengukuran Aktifitas Fitase 69

Lampiran B. Pengenceran Primer 81

Lampiran C. Hasil Sekuensing isolat Bakteri 82

Lampiran D. Fasta Format sekuen DNA 83

Lampiran E. Hasil Alignment sekuen DNA 85

Lampiran F. Surat Pernyataan Kerjasama 88

Lampiran G. Jadwal kegiatan Penelitian 89

Lampiran H. Dokumentasi Penelitian 90


commit to user

1

BAB I PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Sumber pangan makhluk hidup di alam berasal dari tumbuhan. Bahan

pangan yang berasal dari tumbuhan mengandung fosfat sebanyak 30% fosfat

bebas dan sisanya 70% terdapat dalam bentuk Fitat (Kembhavi, 2005). Asam

fitat adalah bentuk utama simpanan fosfat pada tanaman, merupakan sumber

inositol dan fosfat dalam biji tumbuhan. Asam fitat terutama terdapat pada

tanaman dari golongan serealia, biji-bijian dan polong-polongan, antara lain pada

tanaman jagung, gandum, kedelai, kacang tanah, padi dan biji bunga matahari

(Chu et al., 2000).

Asam fitat dapat menjadi sebuah komponen antinutrisi karena

kemampuannya mengikat protein dan ion mineral seperti kalsium, besi, seng,

magnesium, mangan dan copper (Chu et al, 2000). Ikatan yang kuat akan

menurunkan kelarutan, daya cerna dan penyerapan protein serta mineral (Ca,

Fe, Zn dan Mg). Komplek asam fitat bersama dengan protein enzim pencernaan

menyebabkan penurunan aktivitas enzim pencernaan.

Hidrolisis asam fitat akan sangat bermanfaat untuk meningkatkan nilai

nutrisi pada tanaman pangan. Enzim yang mengkatalis perubahan asam fitat

menjadi inositol dan fosfat inorganik adalah fitase. Ternak monogastrik seperti

babi, unggas, dan ikan tidak mampu mendegradasi asam fitat karena alat

pencernaannya sedikit menghasilkan enzim fitase. Sehingga pada hewan

monogastrik asam fitat tidak terhidrolisis dan menyebabkan ketersediaan unsur

fosfor sangat rendah dan zat makanan lain tidak dapat dimanfaatkan secara

maksimal oleh ternak. Fosfor yang tidak dicerna akan dikeluarkan melalui feces

sehingga menyebabkan terjadinya pencemaran tanah, air sungai, dan danau


commit to user

2

karena eutrofikasi yaitu terjadinya penyuburan perairan berlebihan yang akan

menyuburkan alga beracun dan menganggu ekosistem perairan.

Fitase atau mio-inositol heksakisfosfat fosfohidrolase adalah enzim yang

mengkatalis reaksi ikatan fosfodiester pada asam fitat (mio-inositol

heksakisfosfat), menghasilkan fosfat anorganik dan ester ester fosfat dari mio-

inositol yang lebih rendah. Fitase dihasilkan oleh tumbuh-tumbuhan,

mikroorganisme (bakteri, jamur, yaest) dan jaringan tubuh ternak. Fitase dapat

juga dihasilkan dari proses cloning gen Phy A dari fungi Aspergillus ficum (Ullah,

1998a), cloning gen Phy K dari bakteri Klebsiella sp. Strain ASR1 (Sajidan et al.,

2004)

Penambahan fitase pada pakan ternak dapat meningkatkan ketersediaan

fosfat, kalsium dan protein pada ternak. Beberapa penelitian tentang

penggunaan fitase dalam bentuk probiotik pada ternak telah dilakukan dengan

penggunaan bakteri penghasil fitase sebagai campuran wheat pollard pakan

ternak unggas. Diketahui campuran probiotik tersebut dapat meningkatkan

retensi protein dan mineral sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan ayam

(Sajidan et al., 2004). Selain dimanfaatkan dalam industri pakan ternak, industri

pangan pada umumnya juga telah banyak memanfaatkan enzim fitase.

Pembuatan tepung, susu kedelai, sereal bebas fitat, pembuatan roti dan produksi

isolat protein dari tanaman menggunakan fitase dalam prosesnya.

Indonesia sebagai negara tropis mempunyai potensi keanekaragaman

bakteri yang tinggi. Karakteristik wilayah Indonesia yang mempunyai banyak

area vulkanik menambah potensi diversitas bakteri. Aktifitas bakteri fitase telah

berhasil diidentifikasi pada beberapa daerah dengan karakteristik yang berbeda,

antara lain; pada suhu tinggi dari sumber air panas di Sumatera Barat


commit to user

3

(Guzmanizar et al., 2009), pada ekosistem sawah, pada ladang gandum

(Shobirin, 2009), lapisan rizhosfer tanah vulkanik (Jorsquera et al., 2009).

Bakteri sebagai salah satu penghasil enzim yang potensial menjadi faktor

penting dalam produksi enzim. Oleh karena itu diperlukan usaha penggalian

galur galur bakteri penghasil fitase dari lingkungan. Pada penelitian ini dilakukan

screening mikroorganisme yang mampu menghasilkan fitase dari abu vulkanik

Gunung Merapi. Abu vulkanik yang menutup tanah dan lahan pertanian akibat

letusan Gunung Merapi pada tanggal 26 November 2010 mempunyai potensi

untuk diperoleh isolat bakteri baru sebagai penghasil enzim yang mempunyai

rentang suhu dan pH lebih lebar. Suriadikarta dkk (2010) menyebutkan adanya

kandungan fosfat pada abu vulkanik mulai dari rendah sampai tinggi. Sementara

pH abu vulkanik berkisar antara 4 – netral. Lapisan tanah vulkanik mempunyai

kandungan fosfat yang tinggi, tetapi fosfat yang tersedia sangat rendah, pada

lapisan tersebut dapat ditemukan adanya bakteri fosfat (Jorsquera., et al 2008).

Isolat bakteri yang mampu menghasilkan fitase dengan aktifitas terbesar akan

diidentifikasi berdasarkan karakter morfologi dan analisis gen 16s rRNA. Ekstrak

kasar fitase dari bakteri terpilih dikarakterisasi meliputi suhu optimum, pH

optimum, kestabilan termal dan kestabilan pH. Karakterisasi ekstrak kasar enzim

dilakukan dengan harapan akan diperoleh bakteri penghasil fitase yang dapat

dimanfaatkan dalam industri pangan dengan optimal.


commit to user

4

B. RUMUSAN MASALAH

Penelitian ini mempunyai rumusan masalah sebagai berikut:

1. Bagaimana aktivitas fitase pada bakteri yang berasal dari abu vulkanik

Gunung Merapi?

2. Bagaimana identitas bakteri penghasil fitase tersebut berdasarkan

metode 16S rRNA?

3. Bagaimana karakteristik ekstrak fitase yang diperoleh dari bakteri

penghasil fitase tersebut?

C. TUJUAN PENELITIAN

Penelitian ini mempunyai tujuan sebagai berikut:

1. Mengukur aktivitas fitase pada bakteri yang berasal dari abu vulkanik

Gunung Merapi

2. Mengidentifikasi bakteri penghasil fitase berdasarkan gen 16S rRNA

3. Mengkarakterisasi ekstrak fitase yang diperoleh dari bakteri penghasil

fitase pada abu vulkanik Gunung Merapi

D. MANFAAT PENELITIAN

Manfaat yang akan diperoleh dari penelitian ini antara lain:

1. Menambah keanekaragaman bakteri penghasil fitase yang berasal dari

karakteristik area yang berbeda

2. Memberi sumbangan pengetahuan terhadap biodiversitas

mikroorganisme lokal Indonesia

3. Merupakan referensi untuk pemanfaatan enzim fitase selanjutnya


commit to user

5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. TINJAUAN PUSTAKA

1. Ribosomal RNA

Gen rRNA mempunyai area konservatif didalam sel. Urutan basa rDNA

pada beberapa organisme sangat mirip. Gen rRNA biasa digunakan untuk

determinasi taxonomi, untuk mengetahui hubungan evolusi (filogenetik) dan

mengestimasi keberagaman bakteri. Ribosom organisme prokariotik merupakan

organ sel berukuran 70S dan terdiri dari 2 subunit besar dan kecil berukuran 30S

dan 50S, dimana huruf S menyatakan konstanta Svedberg, yaitu satuan

koefisien sentrifugasi (Tabel 1). Subunit 30S mengandung rRNA berukuran 16S

dan protein sebanyak 21 buah, sedangkan subunit 50S mengandung rRNA

berukuran 5S dan 23S, serta protein sebanyak 34 buah (Madigan dan Martinko,

2006).

Tabel 1. Ribosomal RNA

Nama Ukuran Lokasi

5s 120 Sub Unit Besar Ribosom

16s 1500 Sub Unit Kecil Ribosom

23s 2900 Sub Unit Besar Ribosom (Stephanie, 2007)

1.2 Gen 16S rRNA Gen 16S rRNA terletak pada DNA kromosom organisme

prokariotik yang mengkode komponen ribosom 16S rRNA yang dapat

digunakan sebagai daerah sidik jari antar spesies. Penggunaan 16s rRNA

untuk klasifikasi mikroorganisme dilakukan pertamakali oleh Carl woese,

yang mengelompokkan mikroorganisme menjadi 3 sistem utama; Archaea,

Bacteria, Eucarya (Stephanie, 2007).


commit to user

6

Gen 16S rDNA digunakan untuk mempelajari identitas

organisme prokariotik dan dapat digunakan untuk mengukur perubahan

evolusi dan keterkaitan filogenetiknya (Madigan dan Martinko, 2006). Selain

16S terdapat komponen nukleotida lain yang menyusun ribosom yaitu 5S

dan 23S, namun karena ukuran 5S yang terlalu kecil dan 23S yang terlalu

besar maka dipilih 16S sebagai alat penanda sidik jari.

16S rDNA mempunyai beberapa kelebihan sebagai area sidik

jari, yaitu antara lain; gen 16S rDNA berukuran cukup besar untuk dapat

digunakan sebagai pembeda antar spesies, 16S rDNA mempunyai fungsi

konstan dalam sel, terdistribusi secara universal pada seluruh organism

prokariotik dan memiliki beberapa daerah lestari yang dapat digunakan

sebagai pembeda antar spesies. Daerah lestari pada 16S rDNA adalah

daerah yang diapit oleh dua daerah universal yang merupakan daerah yang

sama pada seluruh organism prokaroitik. Sehingga melalui daerah tersebut

dapat dirancanag sepasang primer untuk mengamplifikasi gen 16S rDNA

yang berasal dari berbagai spesies (Madigan dan Martinko, 2006).

1.3 Analisis gen 16s rRNA

Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi prosedur baku

untuk menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem.

16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini

bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme.

Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat

digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rRNA

memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif

dan beberapa daerah urutan basanya variatif. Analisis gen penyandi 16S

rRNA praktis untuk definisi spesies, karena molekul ini bersifat ubikuitus,


commit to user

7

sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh

kelompok.

Indentifikasi bakteri dengan 16s rRNA dilakukan berdasarkan

perbandingan urutan basa yang konservatif. Jika urutan basa memiliki

persamaan yang tinggi maka strain dapat dimasukkan dalam satu spesies

yang sama. Sebaliknya jika derajat kesamaan urutan basa gen penyandi

16S rRNA kurang dari 97% dapat dianggap sebagai spesies baru. Data

urutan basa dari berbagai spesies mikrobia telah dikumpulkan dalam sebuah

database yang dapat diakses. Kumpulan data spesies tersebut memuat data

klasifikasi, diagnose labolatorium dan urutan basa suatu spesies. Melalui

data tersebut dapat dilakukan analisis berdasarkan persamaan urutan basa

menggunakan jarak matrik. Metode yang sering digunakan adalah Multiple

sequence Alignment (MSA), sebuah metode yang akan mengelompokkan

suatu strain berdasarkan derajat kesamaan urutan basa antar spesies (Helal

et al., 2011).

2. Asam Fitat

Asam fitat adalah bentuk simpanan fosfor dalam biji-bijian. Merupakan

garam mio-inositol asam heksafosfat, mampu membentuk kompleks dengan

bermacam-macam kation atau protein dan mempengaruhi derajat kelarutan

komponen tersebut (Piliang, 1997).

2.1 Struktur Asam fitat

Asam fitat atau disebut sebagai Myo-inositol (1,2,3,4,5,6)

hexakisfosfate (C6H18O24P6 dan IP6). Inositol fosfat terdiri dari cincin

inositol dan sebuah kelompok fosfat (Gambar 1). Prefik Myo-

menunjukkan adanya bentuk hidroksil pada cincin inositol (Posternak,


commit to user

8

1965 cit. Bohn et al., 2008). Asam fitat dalam bentuk fosforilase cincin

mio-inositol merupakan struktur yang kuat (Johnson, 1969). Satu molekul

fosfat mengandung dua belas proton dengan letak terpisah. Enam proton

merupakan asam sangat kuat dengan nilai pKa 5.7, 6.8 dan 7.6 dan

sisanya asam sangat lemah dengan pKa lebih besar dari 10 (Costelo et

al., 1976). Asam fitat adalah mio-inositol, mengikat fosfor pada enam

hidroksil group. Fitat membentuk garam asam fitat dengan kalsium dan

magnesium (Irving, 1980). Pada pH netral atau pH umum dalam

makanan, asam fitat memiliki sifat negatif, dimana dalam keadaan ini

sangat aktif membentuk ikatan dengan kation atau protein. Kation akan

berikatan dengan satu atau lebih fosfat group dari molekul asam fitat,

akan tetapi interaksi antara protein dengan asam fitat tergantung pada pH

(Weaver and Kannan, 2002).

Gambar 1. Struktur Asam Fitat (Graf, 1983)

2.2 Sumber Asam Fitat

Kandungan asam fitat sangat banyak terdapat dalam tumbuhan,

sel mikroorganisme dan ternak. Biji-bijian tumbuhan mengandung 60 –

90% fosfor terikat fitat dalam bentuk garam asam fitat. Asam Fitat

terdapat pada tanaman pangan seperti; jagung, gandum, kedelai, kacang

tanah, padi dan juga terkandung dalam biji bunga matahari. Asam fitat


commit to user

9

berperan dalam proses dormansi tanaman dan perkecambahan biji

sebagai sumber ATP, berperan pada fungsi biologis penyimpanan fosfor

dan kation yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bibit tanaman. (Chu et

al., 2000). Kebanyakan tanaman yang mengandung asam fitat

merupakan sumber pangan pada ternak maupun manusia (Tabel 2).

Barriento et al., (1994) menyatakan bahwa asam fitat dalam sereal bukan

merupakan bentuk distribusi dalam biji, akan tetapi merupakan

penghubung dalam komponen morfologi spesifik dalam biji. Dalam biji-

bijian dikotil, biji-bijian yang mengandung minyak dan biji-bijian legume

seperti pir, fitat tersebar didalam seluruh biji termasuk di dalam sub

selluler, dan membentuk ikatan dengan protein. Dalam tanaman komplek

fitat bersama dengan kation (K+ dan Mg2+) membentuk phityn. Phytin

tersimpan dalam protein bodi sebagai Kristal globoid. Pada padi, Kristal

globoid mengandung 67% asam fitat, 19% K, 11% Mg dan 1% Ca

(Ogawa et al., 1975 cit. Maenz et al., 2000).

Tabel 2. Bahan pangan dan kandungan Asam fitat

Tanaman Struktur % Asam fitat Wijen Biji kering 4.71 Labu Embrio 4.08 Canola Biji kering 2.50 Bunga matahari Embrio 2.10 Mustard Biji kering 2.00 Kacang mete Embrio 1.97 Kacang-kacangan Embrio 1.80 Kacang tanah Biji 1.70 Tomat Biji 1.66 Kedelai Biji kering 1.55 Almond Embrio kering 1.42 Terung Biji 1.42 Kapri Biji kering 1.41 Pistachio Embrio 1.38 Semangka Biji 1.36


commit to user

10

Lanjutan

Tanaman Struktur % Asam Fitat Kiwi Buah segar 1.34 Kacang panjang Biji kering 1.11 Mentimun Biji tua 1.07 Sorghum Biji kering 1.06 Coklat Biji kering 1.04 Barley Biji kering 1.02 Oat Biji kering 1.02 Gandum Biji kering 1.02 Kacang polong Biji kering 1.00 (Lott et al., 2002 cit. Afinah et al., 2010)

2.3 Ketersediaan nutrisi dan dampak lingkungan

Pada tumbuhan, asam fitat berperan dalam proses dormansi

dan perkecambahan biji tanaman (Chu et al., 2000). Asam fitat juga

merupakan antioksidan dan agen anti kanker (Raboy et al., 2002). Namun

demikian, pada hewan dan manusia, asam fitat dapat menjadi komponen

antinutrisi. Asam Fitat sangat potensial mengikat protein, asam amino dan

multivalent kation atau mineral pada makanan. Ikatan tersebut

merupakan komplek yang tidak larut sehingga sulit dihidrolisis dalam

pencernakan, sukar di serap dan mempengaruhi ketersediaan nutrisi.

Asam fitat juga mengikat serat sehingga mempengaruhi kecernaan dan

kelarutannya. Asam fitat berikatan dengan mineral penting seperti

kalsium, magnesium, cuper, besi (Fe2+, Fe3+), seng, cobalt dan mangan

(Gambar 2).

Potensi asam fitat mengikat ion mineral penting mengurangi

ketersediaan mineral dalam makanan yang mengandung asam fitat.

Ikatan asam fitat dengan divalent kation (Zn2+, Ca2+, Mg2+) membentuk


commit to user

11

komplek garam mineral-fitat penta-, hexa- yang tidak larut (Weaver and

kannan, 2002).

Gambar 2. Ikatan asam fitat dengan Fe2+ dan protein (Weaver and kannan,

2002).

Tanaman membutuhkan fosfat inorganik dan mempunyai

timbunan asam fitat terutama dalam biji. Asam fitat tersebut harus

dihidrolisis menjadi fosfat inorganik dalam tanah untuk kembali memenuhi

kebutuhan fosfat inorganik tanaman. Adanya fosfat inorganik pada

lingkungan terutama pada perairan menyebabkan terjadinya eutrofikasi,

yaitu pertumbuhan alga atau tanaman air secara berlebihan menutup

permukaan perairan, sehingga menurunkan kadar oksigen perairan dan

keseimbangan lingkungan perairan terganggu.

Pencernaan pada hewan monogastrik tidak dapat menghidrolisis

asam fitat. Asam fitat yang tidak tercerna dengan baik akan disekresikan

melalui kotoran ternak. Kotoran ternak tersebut dapat dihidrolisis oleh

mikrobia tanah dan air, sehingga ikatan fosfat pada asam fitat terlepas ke

lingkungan, mencemari sungai, danau (perairan). Menyebabkan blooming

alga, menurunkan kadar oksigen perairan, dan kematian hewan air (Shin

et al., 2001).


commit to user

12

3. Enzim Fitase 3.1. Enzim

Enzim merupakan katalis yang dapat mengubah laju reaksi tanpa ikut

bereaksi. Enzim bersifat khas dan bekerja secara spesifik sehingga aktifitasnya

dapat diatur. Dalam sitem biologis kecepatan kerja enzim dapat dipengaruhi oleh

kehadiran molekul lain yang dapat berperan sebagai pemicu (aktifator) atau

penghambat (inhibitor), keduanya disebut sebagai efektor (Gambar 3) (Suhara,

2000).

Gambar 3. Struktur aktif enzim (Suhara, 2000).

3.1.1 Aktifitas Enzim

Enzim merupakan protein yang berperan penting dalam

aktivitas biologis. Enzim sebagai katalisator reaksi mempunyai sifat

yang khas. Enzim dapat kehilangan aktivitasnya karena panas, asam

atau basa kuat, pelarut organik, dan keadaan lain yang menyebabkan

protein terdenaturasi (Girindra, 1989:91).

Selanjutnya diungkapkan oleh Suharsono (1990:124), bahwa

enzim yang aktif merupakan enzim yang mampu melakukan aktivitas

katalitiknya. Aktivitas enzim didefinisikan sebagai suatu jumlah yang


commit to user

13

dapat menyebabkan perubahan atau transformasi substrat sebanyak 1

mikromol per menit pada suhu dan lingkungan yang optimal selama

pengukuran aktivitas berlangsung. Satu unit aktivitas enzim (1U)

merupakan perubahan substrat 1µmol/menit.

Enzim bersifat khas dan aktif pada kondisi optimum tertentu,

sehingga aktivitasnya dipengaruhi oleh hal-hal berikut:

a. Konsentrasi Enzim

Enzim dengan derajat kemurnian yang tinggi dalam batas-batas

tertentu, menunjukkan hubungan linier antara jumlah enzim dan taraf

aktivitasnya (Gambar 4).

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi enzim pada laju aktivitas enzim

b. Konsentrasi Substrat

Konsentrasi substrat pada taraf tertentu dapat mempengaruhi laju

aktivitas enzim dan selanjutnya laju aktivitas tidak tergantung pada

konsentrasi substrat yang ada (Gambar 5).

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat pada aktivitas enzim


commit to user

14

c. pH

Aktivitas maksimum dicapai pada pH tertentu saja (Gambar 6).

Gambar 6. Pengaruh pH pada Aktivitas enzim

d. Suhu

Aktivitas suhu akan meningkat pada kenaikan suhu sampai batas

tertentu dan pada kenaikan suhu selanjutnya, aktivitas enzim

berkurang (Gambar 7).

Gambar 7. Pengaruh Suhu pada aktivitas enzim

Aplikasi enzim dalam industri pakan ternak telah banyak

dilakukan dan efektifitas penggunaan enzim tersebut dipengaruhi oleh

aktifitas enzim. Enzim yang ditambahkan dalam pakan ternak

berpengaruh terhadap kecernaan pakan sehingga berdampak pada

pencernaan ternak.

Beberapa keuntungan penambahan enzim pada pakan ternak

antara lain;


commit to user

15

a. Mendegradasi antinutrisi dalam makanan yang mengganggu

proses pencernakan

b. Meningkatkan ketersediaan nutrisi dari suatu bahan pakan yang

tidak dapat terdegradasi oleh enzim pencernakan hewan ternak

c. Sebagai suplemen terhadap aktifitas pencernakan pada hewan

dalam masa pertumbuhan dan pada hewan dalam masa

penyembuhan

d. Membantu efektifitas penyerapan nutrisi sehingga mengurangi

dampak polusi kotoran ternak (Boyce et al., 2004).

3.2. Fitase

Fitase atau myo-inositol heksaisfosfat hidrolase merupakan enzim

fosfatase yang mampu mengkatalis hidrolisis pelepasan fosfat pada fitat.

Hidrolisis asam fitat sangat bermanfaat untuk meningkatkan nilai nutrisi pada

beberapa tanaman pangan (Gambar 8) (Shin et al., 2001).

Fitase adalah enzim yang dapat memutuskan ikatan phospat pada fitat,

yaitu suatu bentuk timbunan fosfat organik yang ada di alam (Jorquera et al.,

2008). Fitase aktif asal mikroba banyak ditemukan pada spesies fungi dan

aspergillus. Shieh dan Ware (1968), menyatakan bahwa hasil penyaringan pada

isolat tanah terdapat lebih dari dua ribu (2000) mikroorganisme yang mampu

menghasilkan enzim fitase. Dari isolat tersebut kebanyakan memproduksi fitase

intraselluler, sedangkan 30 isolat adalah fitase ekstraselluler.


commit to user

16

(Lei et al., 2003)

3.2.1 Klasifikasi Fitase

“The Enzym Nomenclature of The International Union of Biochemistry”

menggolongkan fitase ke dalam dua tipe yaitu 6–fitase (EC 3.1.3.26) dan 3–fitase

(EC 3.1.3.8). Pengelompokan tersebut didasarkan pada posisi gugus fosfat

pertama yang dihidrolisis oleh enzim. Enzim 6-fitase memulai reaksi hidrolisis

fitat dari gugus fosfat posisi L-6 atau D-4, menghasilkan produk awal L-inositol

(1,2,3,4,5)P5. Enzim 3-fitase memulai hidrolisis fitat pada gugus fosfat posisi D-3,

menghasilkan produk awal D-inositol (1,2,4,5,6)P5 (Gambar 9). Enzim 6–fitase

biasanya terdapat pada tumbuhan dan 3–fitase dijumpai pada fungi (Dvorakova,

1998).

Hidrolisis asam fitat terjadi secara berurutan mulai dari ester fosfor mio-

inositol yang lebih rendah (gambar 9), kemudian menurun sesuai dengan nomor

asam fosfat (IP5 – IP1). Enzim dalam bentuk tunggal tidak mampu melakukan

Gambar 8. Fitat dihidrolisis oleh Fitase menjadi inositol, fosfat dan ion mineral Fitat mengikat element besi (Fe) dan seng (Zn) diantara group fosfat pada satu molekul fitat maupun antar molekul fitat. Fitase memulai hidrolisis fitat dari karbon no 1, 3 atau 6 pada cincin inositol, sehingga fosfat terlepas dari ikatan dan melepaskan kalsium (Ca), besi (Fe), seng (Zn) ataupun mineral lain yang terikat sebelumnya.


commit to user

17

defosfolirase asam fitat secara penuh. Kombinasi fitase dan fosfatase non

spesifik akan meningkatkan aktivitas defosforilasi asam fitat (Maenz, 2001).

Degradasi fitat dalam saluran pencernaan unggas berhubungan dengan

aksi fitase dari satu atau tiga sumber enzim. Fitase dalam saluran pencernaan

berasal dari :1). Fitase usus yang terdapat dalam saluran pencernaan, 2) fitase

asal tumbuhan dan 3) fitase asal mikroba.

Gambar 9. 6 – fitase (EC 3.1.3.26), 3 – fitase (EC 3.1.3.8)

Gambar 10. Defosforilasi asam fitat oleh 3-Fitase Saccaromices cerevisae


commit to user

18

Berdasarkan mekanisme hidrolisis fitat terdapat 4 pengelompokkan

Fitase, yaitu; histidine acid phosphatase (HAP), cysteine phytase (CPhy),

purple acid phosphatase (PAP) dan -propeller phytase (BPP) (Tabel 3).

a. Histidine Acid Phophatase (HAP)

Merupakan kelompok enzim yang banyak digunakan dan dipelajari.

Enzim kelompok ini terdapat pada hewan, tumbuhan maupun mikro

organisme. Enzim ini tetap mempunyai aktivitas dalam kondisi asam.

Salah satu prokariotik yang menghasilkan HAPhy (Histidine Acid

Phophatase) adalah Escherichia coli, dari kelompok kapang antara

lain Aspergillus niger PhyA and PhyB. Aktivitas katalitik enzim terjadi

melalui 2 tahap reaksi yang menghidrolisis asam fitat menjadi

monoester fosfat. HAPhy (Histidine Acid Phophatase) banyak

digunakan dalam hidrolisis asam fitat dalam sereal dan biji-bijian

untuk pakan ternak.

b. Cysteine Phytase (CPhy)

Merupakan kelompok fitase yang ditemukan pada bakteri anaerob

dalam rumen yaitu Selomonas ruminantium (Chu et.al., 2004).

Mempunyai suhu optimum 50-55 0C dan pH optimum antara 4-5.

CPhy (Cysteine Phytase) mengkatalis reaksi defosforilasi asam fitat

menjadi myo-inositol monophosphat, aktivitas katalitiknya dihambat

oleh Fe2+

, Fe3+

, Hg2+

, dan Zn2+

.

c. Purple Acid Phosphatase (PAP)

PAP (Purple Acid Phosphatase) merupakan kelompok fitase yang

terdapat pada Burkholderia cepacia, dan pada kedelai (Glycine max L.

Merr) GmPhy (Lim et al., 2007). GmPhy (Glycine max Phytase)


commit to user

19

ditemukan pada perkecambahan biji kedelai. GmPhy (Glycine max

phytase) mempunyai aktivitas spesifik terhadap asam fitat yang lebih

rendah dibanding aktivitas fitase dari kapang. Rendahnya aktivitas

spesifik fitase GmPhy (Glycine max Phytase) menguntungkan bagi biji

tanaman selama proses perkecambahan, dimana defosforilasi terjadi

dengan lambat dan seimbang selama perkecambahan biji. Dalam

tahap perkecambahan biji asam fitat mempunyai peran penting

sebagai sumber fosfat (Mullaney and Ullah, 2003).

d. β-Propeller Phytase (BPP)

Fitase kelompok β-Propeller Phytase (BPP) mempunyai 2 situs

pelekatan, yaitu situs untuk hidrolisis substrat dan situs untuk

mengikat substrat yang akan dihidrolisis. β-Propeller Phytase (BPP)

memutuskan ikatan 3-fosfat pada asam fitat menghasilkan inositol

3fosfat, aktivitas katalitik meningkat dengan adanya Ca (kalsium).

Adanya ikatan fitat dengan Ca (kalsium) akan membentuk

penghubung yang mendekatkan fitase dengan substrat (Shin et al.,

2001). BPP (β-Propeller Phytase) dapat digunakan sebagai tambahan

pada pakan ternak dan bermanfaat pada pertumbuhan tanaman yang

hidup pada kondisi fosfat terbatas. BPP (β-Propeller Phytase)

terdapat pada Bacillus subtilis 168PhyA, Shewanella oneidensis

PhyS, ; Xanthomonas oryzae PhyA (Lim et al., 2007).

3.2.2 Aktivitas fitase

Kebanyakan aktivitas fitase diketahui melalui warna fitat atau fosfat

inorganik yang terbentuk dari reagent setelah terjadi reaksi enzim-substrat.

Metode untuk mengetahui kuantitas fitat meliputi tahap yang kompleks;

beberapa tahap ekstraksi, presipitasi dengan FeCl3, sentrifugasi dan


commit to user

20

pencucian (Thomson, 1982 dalam Lim et al., 2007). Beberapa metode

analisis HPLC atau infrared spektrocopy merupakan teknik lain yang

digunakan (Chen, 2003). Metode yang paling mudah digunakan untuk

mengetahui aktivitas fitase adalah dengan cara menentukan fosfat inorganik

yang dilepaskan setelah terjadi reaksi enzim-substrat. Penentuan tersebut

didasarkan pada terbentuknya komplek warna antara fosfat inorganik dengan

ammonium molybdate vanadat (Sajidan, 2000).

Tabel 3. 4 kelompok Fitase

Kelompok Enzim Struktur Khas Mekanisme Katalitik Contoh

Histidine Acid Phophatase

N-terminal RHGXRXP C-terminal HD motif konsensus

N-terminal H membentuk intermediet phosphohistidin, C-terminal bertindak sebagai donor proton/ sebagai tempat spesifik untuk substrat bermuatan positif

A. Niger,

P. lycii,

E. coli,

Zea mays β Propeller Phytase Molekul yang

berbentuk 6 bilah baling baling

Mekanisme katalitik terdiri dari 2 situs yaitu situs pelekatan dan situs pemecahan. Situs pelekatan mengikat grup phosphat sementara situs yang lain memecah ikatan phosphat pada grup phosphat yang berdampingan. Adanya situs ganda tersebut menguntungkan IP6, IP5 atau IP4 sebagai substrat

Bacillus sp, X. oryzae

Cysteine Phosphatase

Struktur P loop terdiri dari motif konsensus HCXXGXXR(T/S)

Protein tirosin phosphat memecah grup phosphat

S. ruminantium

Purple Acid Phosphat

Motif konsensus: DXG/GDXXY /GNH(E,D) /VXXH/GHXH

Metalloenzim, terdapat pada tanaman

Glycine max, M. truncatula

(Lei et al., 2007)

3.2.3 Sumber Fitase

Fitase terdapat di dalam tumbuh-tumbuhan mikroorganisme dan

jaringan tubuh ternak.


commit to user

21

a. Fitase Mikrobia

Mikroorganisme penghasil fitase berasal dari bakteri misalnya

spesies pseudomonas (Irving dan Cosgrove, 1971), yeast seperti

Saccharomyces cereviceae, dan spesies aspergillus seperti

Aspergillus niger dan Aspergillus ficuum. Dvorakova (1998)

mendaftarkan 29 spesies fungi, bakteri dan yeast yang memproduksi

enzim fitase aktif. Dari 29 spesies yang terdaftar 21 memproduksi

fitase ekstraselluler dengan aktivitas paling tinggi (Volfova. et al.,

1994). Nielsen et al., (1997) menyatakan bahwa hidrolisis fitat pada

induk sapi perah dan anak terjadi di dalam saluran pencernaan.

Keadaan ini memungkinkan fitase asal mikroba akan aktif dalam

saluran pencernaan monogastrik dengan kondisi tertentu, walaupun di

dalam unggas kelihatannya hidrolisis fitat kurang penting. Selanjutnya

dinyatakan bahwa fitase asal mikroba aktif di dalam saluran

pencernaan. Mereka mengadakan penelitian dengan memberikan

penambahan alkali Esceria coli cellular, akibat perlakuan tersebut

terjadi difisiensi fosfor di dalam usus halus, selanjutnya

menambahkan campuran tepung jagung dan kacang kedelei pada

ransum dan terjadi perbaikan pada pertumbuhan dan kalsifikasi

unggas, respon ini mambuktikan akan adanya fitase atau enzim yang

serupa asal bakteri.

Enzim fitase ekstraselluler yang berasal dari mikroba stabil

pada suhu tinggi. Peningkatan suhu pada medium pereaksi dari suhu

ruang menjadi 58oC, terjadi peningkatan hidrolisis fitat oleh fitase asal

Aspergillus ficuum (Ullah et al.,1991). Peningkatan suhu dari suhu

medium secara sinergis terjadi penurunan aktifitas enzim dan tidak


commit to user

22

terdeteksi pada suhu 68oC (Ullah dan Dischinger, 1995). Suhu

optimum perlu diperhatikan untuk menjaga stabilitas enzim terutama

pada saat proses pembuatan ransum. Enzim fitase asal Asphergilus

fumigatus aktif pada kisaran pH yang luas dan suhu ekstrim 100oC

selama 20 menit atau 90oC selama 120 menit (Pasamontes et al.,

1997). Fitase Aspergillus fumigatus memiliki potensi untuk

dikembangkan secara komersial sebab pada lingkungan tersebut

akan mampu mempertahankan aktivitasnya dalam proses pelleting.

Enzim fitase yang diproduksi secara komersial adalah hasil

encoding gen pada Aspergillus niger. Produksi enzim berasal dari

Aspergillus niger var. vacuum perlu dilakukan penelitian lebih lanjut

terhadap aktivitasnya. Enzim fitase komersial asal Aspergillus niger

itu sudah digunakan sebagai pakan aditif pada hewan monogastrik di

Eropa (Wodzinski dan Ullah, 1996)

Secara umum fitase aktif pada suhu 45℃ sampai 60℃ dan

stabil pada pH tertentu. Sementara Asphergilus fumigates dapat stabil

sampai suhu 100℃ , selama 20 menit dengan hanya kehilangan 10%

aktivitas enzim (Pasamontes et al., 1997). Fitase dari mikroba yang

berasal dari fungi, umumnya mempunyai pH optimum berkisar antara

4.5-6.0, dan aktivitas enzimnya menurun pada pH kurang dari 3.0

atau pada pH yang lebih tinggi dari 7.5. Fitase dari

Enterobacter,mempunyai pH optimum 7,5.


commit to user

23

b. Fitase Tanaman

Beberapa Fitase yang ditemukan pada tanaman merupakan

jenis Histidin Acid phytase (HAP). Umumnya bahan pangan yang

mengandung fitat juga mempunyai kandungan enzim fitase (Tabel 4).

Tabel 4. Fitase Tanaman

Sumber Fitase pH Temp (0C) Km (mmol/L) M (kD) Reference

Labu 4.8 48 67 Goel and Sharma, 1979

Biji canola 4.5 - 5 50 0.36; 0.25 70 Kim and Eskin, 1987

Kacang Faba 5 0.148 65 Greiner et al., 2001b

Biji Hazel 5 0.162 72 Andriotis and Ross, 2003

Biji Legum 8 Scott, 1991

Pollen bunga Lily 8 55 0.081 88 Jog et al., 2005

Biji Lupin 5 50 0.08; 0.3; 0.13 57 - 64 Greiner, 2002

Kacang Mung 7.5 57 0.65 160 Mandal et al., 1972

Kacang Navy 5.3 50 0.018 Lolas and Markakis, 1977

Kacang tanah 5 55 22 Gonnety et al., 2007

Biji lobak 5.2 50 Mahajan and Dua, 1997

Daun Bawang daun 5.5 51 0.2 Phillippy, 1998

Biji kedelai 4.5 – 4.8; 55; 0.05; 119; Gibson and Ullah, 1988;

4.5 – 5 58 0.061 72 – 130 Hegeman and Grabau, 2001

Bunga matahari 5.2 55 0.29 Agostini and Ida, 2006

Akar tomat 4.3 45 0.038 164 Li et al., 1997

Serbuk sari Typha latifolia

8 0.017 Hara et al., 1985

Barley 5; 6 45; 55 0.072; 0.19 67 Greiner et al., 2000

Jagung 5 55 0.02; 0.03 71; 76 Hubel and Beck, 1996

0.04; 0.117 Laboure et al., 1993

Oat 5 38 0.030 67 Greiner and Alminger, 1999

Beras 4.4; 4.6 40 0.17; 0.09 66;61 Hayakawa et al., 1989

Rye 6 45 0.3 67 Greiner et al., 1998

Spelt 6 45 0.4 68 Konietzny et al., 1994

Gandum murni 5.15 55 0.3 Peers, 1953

Dedak gandum 5 0.49 Nagai and Funahashi, 1962

Dedak gandum 5.6; 72 0.02; 0.2 47 Lim and Tate, 1973

Dedak gandum 6 45; 50 0.0005; 0.0008

68; 66 Nakano et al., 1999

Ekstrak kasar gandum 6 45 0.83 65 Bohn et al., 2007

(Bohn et al., 2008).


commit to user

24

c. Fitase pada jaringan tubuh Hewan

Beberapa fitase yang berasal dari jaringan tubuh hewan

memiliki pH optimal antara netral sampai basa. Fitase yang terdapat

pada jaringan membran intestinal vesikel unggas mempunyai pH

optimal antara 5,5-6,0. Meskipun di dalam jaringan tubuh unggas

terdapat fitase, namun tetap membutuhkan supplement fitase dari luar

tubuh untuk memenuhi kebutuhan diet unggas (Maenz, 1998).

Aktifitas fitase yang ditemukan pada rumen sapi berasal dari mikrobia

yang terdapat melimpah pada rumen (Yanke et al., 1998).

3.2.4 Prospek dan Aplikasi Enzim Fitase

Fitase biasanya digunakan sebagai supplement pada

makanan untuk meningkatkan ketersediaan P (fofat), melaui hidrolisis

fitat yang terdapat pada bahan pangan dari tumbuhan. Peningkatan

ketersediaan fosfat pada makanan dapat mengurangi kandungan

fosfat pada kotoran ternak, sehingga mengurangi melimpahnya fosfat

pada lingkungan peternakan. Fosfat inorganik (Pi) merupakan

sumberdaya yang tidak dapat diperbaharui, diperkirakan ketersediaan

fosfat di bumi akan habis dalam kurun 50 tahun. Sehingga Fitase

sangat efektif digunakan sebagai sumber natural fosfat dalam skala

global (Lei et al., 2007).

Fitase telah banyak digunakan sebagai supplement tambahan

pada makanan ternak. Diantaranya sebagai campuran wheat pollard

pakan ternak unggas. campuran probiotik tersebut dapat meningkatkan

retensi protein dan mineral sehingga dapat meningkatkan

pertumbuhan ayam (Sajidan et al., 2004). Prospek aplikasi fitase

selanjutnya adalah sebagai tambahan nutrisi pada manusia.


commit to user

25

Kebanyakan sumber pangan berasal dari sereal dan biji bijian.

Tanaman tersebut mempunyai kandungan fitat yang tersimpan dalam

biji yaitu pada aleuron dan pada titik germinasi yang merupakan

tempat penyimpanan utama mineral dalam tanaman. Adanya fitase

yang menhidrolisis fitat, akan memperbaiki ketersediaan mineral,

protein dan nutrisi penting dalam konsumsi makanan manusia (Raboy

et al., 2002). Fitat yang berikatan dengan beberapa mineral, misalnya

besi dapat berperan sebagai antioksidan dan anti kanker. Sehingga

penggunaan fitase sebagai enzim yang bermanfaat pada ketersediaan

mineral, protein dan nutrisi dalam tubuh melalui hidrolisis fitat dengan

tetap mempertimbangkan efek positif fitat, merupakan bagian menarik

yang perlu diketahui lebih lanjut. Beberapa industri pembuatan

gandum, roti atau makanan dari bahan sereal dan biji-bijian telah

menggunakan fitase untuk mengurangi adanya fitat dalam bahan

makanan, sehingga bahan makanan menjadi lebih mudah dicerna

(Brune et al., 1992 cit. Lei et al., 2007).


commit to user

26

B. KERANGKA PENELITIAN

Gambar 11. Diagram Kerangka Penelitian

Abu Vulkanik

Koloni dengan aktifitas Fitase tertinggi

Platting Method (Isolasi Bakteri)

Sub Kultur

Koloni Koloni Tunggal

Inokulasi pada media Screening cair

Morfologi Molekuler (16S rRNA)

Isolasi DNA

Amplifikasi gen 16S rRNA

Penentuan Urutan

Nukleotida

Analisis Filogenetik

Pengamatan Koloni

Pewarnaan

Gram

Uji aktifitas Enzim

Identifikasi Bakteri Fitase Ekstrak kasar Fitase

Karakterisasi

pH Suhu

Efektor Logam Stabilitas pH & Suhu


commit to user

27

BAB III

METODOLOGI

A. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN

1. Waktu

Penelitian dilaksanakan bulan Desember sampai Mei 2010. Jadwal

kegiatan penelitian terlampir (Table L. G1, lampiran G).

2. Tempat

Sampel Abu vulkanik gunung Merapi Jawa Tengah diambil dari 2 tempat

yaitu; Desa Lencoh Kecamatan Selo Kabupaten Boyolali dan Cangkringan

Sleman Yogyakarta. Abu merupakan lapisan di atas tanah setebal 5 cm. Isolasi

bakteri dari sampel abu Selo Boyolali dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi

FKIP Universitas Sebelas Maret Surakarta. Isolasi bakteri dari sampel abu

Cangkringan Sleman Yogyakarta dilaksanakan di LPPT Universitas Gajah Mada.

Identifikasi bakteri dilaksanakan di sub laboratorium Mikrobiologi FKIP UNS dan

sub Lab. Biologi laboratorium pusat Universitas Sebelas Maret. Karakterisasi

ekstrak kasar enzim fitase dilaksanakan di sub Lab. Biologi dan sub Lab. Kimia

laboratorium pusat Universitas Sebelas Maret. Sekuensing DNA dilaksanakan

dengan jasa komersial Laboratorium 1st base Singapura.

B. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:

1. Alat

Bunsen, cawan petri, tabung reaksi, gelas beker, gelas ukur, ose,

pinset, pipet, pipet mikro, tip, tabung mikro 1500 ml (eppendorf), neraca

timbang, inkubator, vortex, stirer, elektroforesis DNA, laminar air flow,

autoklaf, lampu ultraviolet, refrigerator, freezer, sentrifuge, PCR,

microwave, incubator, ice maker, sarung tangan.


commit to user

28

2. Bahan

Aquades, dH2O filter, Master mix PCR (goTaq green Promega),

agarosa, DNA kit (Promega), etidium bromide, kristal violet, safranin.

primer forward Bact F1 (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3’), primer

reverse Uni B1 (5‘-CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘). Marka DNA 1 kb

(Fermentas). Media Luria Bertani (LB), terdiri dari; 1% tripton, 1% NaCl,

0,5% yeast extract, 2% bacto agar untuk media LB padat, 0,4% Na Fitat

(Natrium Fitat) untuk media screening, Ammonium molibdate, Ammonium

metavanadate, HNO3 (asam nitrat), HCL (asam klorida).

C. RANCANGAN PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif. Abu vulkanik

gunung Merapi diambil dari Desa Kepuh Harjo Cangkringan Sleman Yogyakarta

dan Lencoh Selo Boyolali. Sampel Abu diambil dari lahan pertanian penduduk.

D. PROSEDUR PENELITIAN

1. Isolasi Bakteri dari sampel Abu Vulkanik

Bakteri fitase diisolasi dari abu vulkanik gunung Merapi dengan

menggunakan metode seri pengenceran (Platting Method). 1 gram abu dilarutkan

ke dalam 10 ml aquades ditambah larutan NaCl fisiologis 1%. Diambil sebanyak

1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis

sehingga didapat pengenceran 10-2. Pengenceran dilanjutkan sampai 10-6, 10-7

dan 10-8. Masing-masing seri pengenceran diambil 10 µl dimasukkan kedalam

cawan Petri yang telah berisi media LB (Luria bertani). Kemudian diinkubasi

selama 16 jam pada suhu 37oC. Subkultur dilakukan terhadap hasil kultur

sebelumnya sehingga diperoleh koloni tunggal.

2. Seleksi bakteri Fitase

Masing masing koloni tunggal ditumbuhkan pada media LB (Luria bertani)

yang mengandung 0,4% Na fitat, dengan komposisi media LB (Luria bertani); 1


commit to user

29

Tripton : 1 yeast ekstrak : 2 NaCl. Koloni bakteri diinokulasi pada 10 mL media

cair. Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16 jam. Produksi ekstrak kasar enzim

fitase dilakukan dengan sentrifugasi kultur cair 4000 rpm selama 5 menit pada

suhu 4 oC. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim fitase.

Kemudian dilanjutkan dengan pengukuran aktivitas fitase.

3. Pengukuran Aktivitas Fitase

Pengukuran aktivitas bakteri penghasil fitase dengan metode dari Sajidan

(2002): 25 µl enzim, 125 µl susbtrat 0,4 % natrium fitat dalam 100 mM Natrium

asetat diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan

penambahan larutan STOP yang terdiri dari 2,352 g Ammonium molibdate/100

ml Aquadest sebagai larutan A, 10 g Ammonium metavanadate/100 ml Aquadest

sebagai larutan B. Larutan STOP dibuat dengan perbandingan : 1,5 volume

larutan A + 1,5 volume larutan B + 1 volume HNO3 pekat + 2 volume aquades.

Warna kuning dari fosfomolibdovanadat diukur dengan spektrofotometer pada

ʎ=415 nm

4. Tahap Identifikasi

Bakteri penghasil fitase dengan aktivitas tertinggi selanjutnya dilakukan

identifikasi berdasarkan karakter morfologi dan analisis gen 16s rRNA.

a. Pewarnaan Gram dan pengamatan Koloni

Kaca objek ditetesi dengan aquades, kemudian jarum ose steril

diusapkan dalam biakan bakteri, dihomogenkan dan difiksasi diatas nyala

bunsen (± 30 cm). Usapan yang telah kering ditetesi satu tetes kristal violet

dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya diteteskan satu tetes lugol dan

dibiarkan selama 30 detik. Bercak Lugol dibilas sampai warna bilasan bening

menggunakan etanol 95%. Kemudian diteteskan larutan safranin, dibiarkan

30 detik dan dibilas dengan aquades. Warna koloni diamati dengan


commit to user

30

mikroskop. Warna ungu pada sel menunjukkan Gram positif dan warna

merah menunjukkan Gram negatif.

b. Isolasi DNA Bakteri

Isolat bakteri ditumbuhkan dalam medium LB (Luria bertani), sebanyak

1 ml kultur disentrifugasi pada 12.000 rpm. Kemudian DNA diekstrak dengan

DNA kit (Promega USA) dengan langkah kerja sebagai berikut:

i. Pellet sel yang diperoleh ditambah 480 µL 50 mM EDTA dicampur

sehingga tersuspensi, kemudian ditambahkan 120 µL Lisozim 10mg/ml

dan diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit, kemudian di sentrifuge

12.000 rpm selama 2 menit. (Untuk bakteri gram Positif)

ii. Pellet sel ditambah 600 µL Nuclei Lysis Solution (Promega) dicampur

sehingga sel tersuspensi kembali.

iii. Inkubasi 800C selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang.

iv. Ditambahkan 3 µL RNAse Solution (Promega) mikro tube dibolak balik

sampai tercampur.

v. Inkubasi 370C selama 60 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang.

vi. Ditambahkan 200 µL Protein precipitation Solution, vortex dengan

kecepatan tinggi selama 20 detik

vii. Inkubasi dalam es selama 5 menit, kemudian sentrifuge 12.000 rpm

selama 3 menit.

viii. Supernatan dipindahkan ke dalam mikro tube baru yang telah berisi 600

µL isopropanol (mikro tube dibolak balik sehingga tercampur dan benang-

benang DNA terlihat)

ix. Sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit, kemudian supernatant dibuang dan

tube dikeringkan


commit to user

31

x. Ditambahkan 600 µL 70% etanol, kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama

2 menit

xi. Mikro tube dikering-anginkan selama 10 sampai 15 menit

xii. Ditambahkan 100 µL DNA Rehidration Solution (Promega), inkubasi pada

suhu 650C selama 60 menit.

xiii. Disimpan pada suhu 40C

Kualitas DNA diketahui melalui spektrofotometer (A260) dan

kemurnian DNA yang telah berhasil diisolasi di cek melalui elektroforesis

pada agaros gel 1%.

c. Amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)

menggunakan universal primer (Shobirin et al., 2009) Primer Forward :

(5'GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3'), Primer Reverse:

(5‘CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘). 1 mikrotube reaksi PCR berisi 25 µl

yang terdiri dari; 6, 5 µl master mix PCR go-Taq Green Promega, 2 DNA µl, 2

µl primer forward, 2 µl primer reverse, 12,5 µl dH2O filter. Siklus PCR

(Polymerase Chain Reaction) meliputi 3 tahap yaitu; denaturasi, annealing

dan ekstention. Denaturasi awal pada 94°C selama 2 menit dilanjutkan

dengan 30 siklus, denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, 45 detik

annealing pada 50° C dan 1.5 menit primer ekstension pada 72°C.

Kemudian 72°C ektra ektension selama 5 menit dan terakhir 4°C selama 1

menit.

Pita DNA dari reaksi PCR diamati dengan 1% agarosa, dengan DNA

marker 1 Kb. Setelah itu dilakukan sekuensing pada hasil PCR di

laboratorium 1st base Singapura.


commit to user

32

5. Karakterisasi Ekstrak Kasar Fitase dari Isolat Terpilih

Isolate bakteri yang mempunyai aktivitas fitase paling tinggi

ditumbuhkan dalam 5 ml medium screening cair pada suhu 370C selama 16

jam. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit pada

suhu 40C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar fitase.

Karakterisasi ekstrak kasar fitase meliputi penentuan pH optimum,

suhu optimum, efektor logam (MgCl2, ZnCl2, CaCl2, FeCl3 pada 10-3 dan 10-4

M), stabilitas pH dan stabilitas suhu.

5.1. pH optimum

pH optimum ditentukan dengan cara mengukur aktivitas enzim pada

berbagai pH substrat yaitu pada rentang 3 – 9. 0,4% Na-fitat dalam 100 mM

Na-asetat digunakan sebagai substrat di atur tingkat keasamannya sehingga

mempunyai pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

5.2. Suhu optimum

Suhu optimum ditentukan dengan cara mengukur aktifitas enzim pada

berbagai suhu inkubasi enzim-substrat. Mulai dari suhu diruang, 370C, 400C,

500C, 600C, 700C, 800C. Ekstrak kasar enzim fitase sebanyak 25 µL

ditambahkan substrat 125 µL dan diinkubasi selama 60 menit pada berbagai

suhu yang telah ditentukan tersebut. Setelah itu ditambahkan 400 µL larutan

STOP, kemudian diukur absorbansi larutan pada ʎ = 415 nm.

Stabilitas termal enzim diketahui dengan memanaskan enzim pada

suhu optimum selama rentang waktu tertentu dan diukur aktivitasnya sampai

enzim tidak memperlihatkan aktivitas yang signifikan. Pada pengukuran

stabilitas pH dilakukan dengan cara melarutkan enzim dalam larutan buffer

dengan berbagai pH. Masing masing campuran diinkubasi pada suhu


commit to user

33

optimum selama 1 jam kemudian diukur aktifitas fitase pada tiap-tiap pH

tersebut.

5.3. Efektor Logam

Kedalam setiap larutan enzim-substrat ditambahkan 10 µL FeCl3,

MgCl2, CaCl2, dan ZnCl2 dengan konsentrasi 10-3 dan 10-4 M. Kemudian

diinkubasi pada pH dan suhu optimum selama 60 menit.

E. ANALISIS DATA

Data yang telah diperoleh kemudian dianalisis meliputi;

1. Data Pengukuran aktivitas Fitase

Nilai absorbansi yang diperoleh pada pengukuran ekstrak kasar Fitase

dianalisis jumlah kandungan fosfat anorganik (PO43-) yang terbentuk Unit/ml

dengan menggunakan persamaan regresi linier dari kurva standar P

(KH2PO4). Kurva standar fosfat dibuat dengan mengukur nilai absorbansi

larutan KH2PO4 pada berbagai konsentrasi.

Larutan KH2PO4 untuk membuat kurva standar fosfat dibuat dengan

cara melarutkan 0,38334 g KH2PO4 dalam 100 mL aquades. Kemudian

larutan tersebut diencerkan 100 kali sehingga setiap larutan mengandung

0,03834 mg KH2PO4. Seri standar dibuat dengan mengambil 0.025, 0.5,

0.075, 1, 2, 3, 4 larutan standar ditambah 6.25 mL molibdo-vanadat, dan

diencerkan sampai 25 mL. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada ʎ =

415 nm. Nilai absorbansi larutan pada berbagai konsentrasi tersebut dihitung

korelasinya dan dibuat persamaan regresi.

2. Analisis gen 16s rRNA

Data urutan nukleotida dari hasil sekuensing gen 16s rRNA diolah

dengan program Bioedit untuk menggabungkan nukleotida menjadi satu untai

utuh. Kemudian dilakukan analisis BLAST yaitu, penjajaran urutan DNA


commit to user

34

sampel dengan urutan DNA data genbank. Analisis BLAST dilakukan secara

online di http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Melalui analisis BLAST akan

diperoleh data homologi dari isolat bakteri terhadap data urutan nukleotida

spesies-spesies dalam genebank. Data urutan nukleotida spesies spesies

yang memiliki homologi dengan isolat dikumpulkan dalam satu file dengan

format fasta. Data-data urutan nukleotida tersebut kemudian dianalisis

Multiple sequence Alignment dengan program ClustalW2 secara online di

http://www.ebi.ac.uk/tool/msa/clustalW. Setelah kumpulan data urutan

nukleotida disejajarkan, dilanjutkan dengan analisis filogenetik dengan

menggunakan program ClustalW2. Dari analisis filogenetik diperoleh jarak

matrik berdasarkan urutan DNA isolat dengan DNA spesies spesies yang

telah dikumpulkan dari data homologi sebelumnya. Matrik jarak tersebut

digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik dengan program treeview

yang diunduh dari http://darwin.zoology.gla.ac.uk.


commit to user

35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Isolasi Kultur Bakteri Fitase

Fitase merupakan kelompok enzim yang mampu membebaskan fosfat

dari fitat, yaitu bentuk penimbunan fosfat organik di alam. Enzim fitase dapat

ditemukan pada beberapa organisme, salah satunya adalah bakteri (Jorquera

et al., 2008). Bakteri fitase diisolasi dari abu vulkanik gunung Merapi Jawa

Tengah yang berada diatas tanah, diambil dari 2 lokasi yaitu Selo Boyolali

dan Cangkringan Sleman Yogyakarta. Lapisan tanah paling atas dan lapisan

tanah yang berdekatan dengan akar tanaman merupakan tempat tumbuh

berbagai spesies bakteri, antara lain bakteri fosfat (Rengel, 2008).

Lokasi Selo Boyolali dan Cangkringan Sleman merupakan daerah yang

ikut terkena dampak letusan gunung Merapi pada tanggal 26 November

2010. Pada jarak 2,92 km dari puncak merapi di daerah Selo, abu menutupi

lahan mencapai ketebalan 2-3 cm. pH abu dan tanah yang tertutup abu

berkisar 5,4-netral. Sementara di daerah Cangkringan ketebalan abu yang

menutupi tanah mencapai ketebalan 10-29 cm dengan kisaran pH 5,5-netral.

Kandungan P (fosfat) pada abu vulkanik berkisar antara rendah sampai tinggi

(8-232 ppm P2O5). Abu vulkanik mempengaruhi mikroorganisme tanah, pada

ketebalan Abu sampai 5 cm, total bakteri abu vulkanik mencapai 7,2 x 107 –

1,4 x 109 , terdiri dari Azotobacter spp (0 - 3,1 x 105), Azospirillum spp (0 - 1,1

x 106), bakteri pelarut P (0 – 6,0 x 104) (Suriadikarta dkk., 2010).

Kultivasi bakteri dilakukan pada medium LB (Luria Bertany) padat

maupun cair (Gambar 12). Kultivasi pada media padat dilakukan dengan

teknik pengenceran untuk memisahkan bakteri menjadi koloni koloni tunggal.

Masing-masing isolat yang diperoleh dibedakan berdasarkan penampakan


commit to user

36

bentuk fisik koloni yang tumbuh sehingga belum dapat dipastikan apakah

isolat-isolat yang diperoleh merupakan spesies yang berbeda atau sama.

Isolat yang tampak berbeda diambil sehingga mewakili seleksi untuk

mendapatkan bakteri yang memiliki aktivitas fitase.

Semua koloni tunggal yang telah diperoleh selanjutnya ditumbuhkan

pada medium LB (Luria bertani) yang mengandung 0,4% Na-fitat dalam 100

mM Na-asetat pH 5 (Nuhriawangsa dkk., 2004). Koloni bakteri yang tumbuh

pada medium yang mengandung Na-fitat dan membentuk zona bening

merupakan bakteri fitase. Fitat yang terdapat pada medium akan

terdegradasi menjadi fosfat anorganik. Sehingga kebutuhan fosfat anorganik

yang tidak terdapat pada medium terpenuhi karena kerja enzimatis. Dari 20

strain yang dapat diisolasi hanya 16 strain bakteri dapat tumbuh pada

medium dengan Na-Fitat namun tidak semua isolat bakteri membentuk zona

bening. Park (2001) mengungkapkan bahwa tidak semua bakteri fitase

membentuk zona bening pada medium skrining. Isolat-isolat yang tidak dapat

tumbuh atau tidak membentuk zona bening dalam medium skrining memiliki

2 kemungkinan, yaitu isolat tersebut bukan merupakan bakteri fitase, tidak

memiliki gen fitase atau isolat tersebut bisa jadi termasuk bakteri fitase

dengan gen fitase yang tidak berhasil diekspresikan. Induksi fitase tergantung

pada 2 hal, yaitu ketersediaan Na-Fitat dan tidak adanya fosfat anorganik

dalam media (Kusumadjaja., 2009).

Gambar 12. Isolat bakteri dalam (a) medium cair Luria bertany,

(b) medium Luria Bertany padat

a a b b


commit to user

37

B. Seleksi Bakteri Fitase

Dalam berbagai usaha menemukan sumber-sumber enzim baru

ataupun usaha peningkatan sifat-sifat enzim sesuai dengan kebutuhan,

terdapat berbagai metode skrining yang digunakan sehingga diperoleh sifat

spesifik yang diharapkan. Suatu sistem seleksi atau skrining yang efisien

diperlukan untuk mengidentifikasi spesies-spesies dengan aktifitas fitase.

Pengukuran aktivitas fitase pada penelitian ini menggunakan metode Sajidan

(2000) yaitu dengan menentukan kadar fosfat melalui spektrofotometri.

Aktifitas fitase diartikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalis reaksi yang

menghasilkan 1,0 µmol fosfat anorganik per menit pada kondisi optimum.

Penentuan konsentrasi fosfat anorganik dilakukan dengan persamaan regresi

dari kurva standar fosfat.

Aktivitas fitase ditentukan dengan mengukur kadar fosfat yang

dihasilkan selama proses enzimatik berlangsung. Filtrat kultur cair bakteri

yang mengandung ekstrak kasar enzim direaksikan dengan Na-Fitat,

diinkubasi selama 1 jam. Kemudian ditambahkan komplek asam

vanadomolibdofosforik sebagai larutan stop. Senyawa fosfat anorganik dalam

filtrat akan bereaksi dengan reagen ammonium molibdat membentuk

kompleks asam molibdofosforik, selanjutnya bersama ammonium vanadat

membentuk komplek asam vanadomolibdofosforik yang berwarna kuning

(Kusumadjaja, 2009). Vanadat merupakan senyawa yang menghambat

aktivitas fosforilasi enzim fitase dengan cara membentuk komplek bangun

trigonal bipiramid (Kerovuo et al., 2000). Warna kuning yang terbentuk diukur

nilai absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm. Digunakan kontrol

yaitu filtrat kultur bakteri tanpa substrat, untuk membedakan warna kuning


commit to user

38

yang terbentuk karena adanya asam komplek vanadomolibdofosforik

(Gambar 13).

Gambar 13. Perbandingan Warna kuning dari Reaksi vanadomolibdofosforik yang terbentuk dari ikatan fosfat dengan vanadat-molibdat antara (a) control; enzim Fitase tanpa Fitat, tidak menghasilkan fosfat anorganik, (b) sampel; enzim fitase dengan Fitat, menghasilkan Fosfat anorganik ditunjukkan dengan warna yang lebih terang.

Nilai absorbansi (lampiran 1) yang terbaca pada spektrofotometer

dikonversikan dalam aktivitas fitase U/mL dengan persamaan linier yang

diperoleh dari kurva standar KH2PO4 pada beberapa tingkat konsentrasi yang

berbeda (Lampiran 1). Aktivitas fitase dinyatakan dalam unit/mL, yaitu jumlah

enzim yang diperlukan untuk melepaskan 1 mikromol fosfat anorganik

permenit pada kondisi pengukuran. Dari aktivitas fitase 16 isolat bakteri

(Gambar 14) dipilih 3 isolat bakteri dengan aktivitas fitase tertinggi, yaitu RW

Sm A, RW Sm C, RW Sl 5, masing masing berturut-turut memiliki aktivitas

sebesar; 0,1071 U/mL, 0,1020 U/mL, 0,0874 U/mL.

Umumnya aktivitas fitase dari bakteri masih jauh lebih rendah

dibandingkan dengan fitase yang dihasilkan oleh kapang, Candida

diddensiae mempunyai aktifitas sebesar 676,02 U/mL (Makhode, 2006).

Aktifitas fitase ketiga isolate juga masih lebih rendah dibandingkan dengan

Bacillus cereus ASUIA260 sebesar 1,160 U/mL (Sobirin et al., 2009), namun

lebih tinggi dibanding Bacillus subtilis AP-17 sebesar 0,0296 U/mL

(Kusumadjaja, 2009).

a b a b b


commit to user

39

Gambar 14. Aktivitas fitase dari 16 isolat bakteri (RW Sm merupakan isolat dari

sampel abu yang diambil di daerah Sleman Yogyakarta , RW Sl merupakan

isolat dari sampel abu yang diambil dari daerah Selo Boyolali)


commit to user

40

C. Karakteristik Bakteri Fitase

C.1. Morfologi Sel

Identifikasi mikroorganisme dilakukan dengan mengamati ciri-ciri

morfologi, meliputi; bentuk, ukuran dan reaksi pewarnaan. Identifikasi

mikroorganisme yang didasarkan pada morfologi tidak mampu memberikan

informasi filogenetik suatu mikroorganisme namun pengamatan morfologi sel

tetap diperlukan sebagai tahap awal identifikasi Iebih lanjut.

Isolat bakteri terpilih; RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl 5 diidentifikasi

berdasarkan bentuk koloni dan pewarnaan gram. Isolate RW Sm A memiliki

karakteristik koloni berwarna putih, agak mukoid, tepi tidak rata (Gambar

15a). Pewarnaan gram terhadap isolate RW sm A, menunjukkan bakteri

bentuk batang, gram positif. Isolat RW Sl 5 memiliki koloni berwarna putih,

berbentuk bulat kecil, tepi rata, tidak tembus cahaya (Gambar 15b). Hasil

pewarnaan gram menunjukkan isolate RW Sl 5 merupakan bakteri gram

positif, bentuk batang. Isolat RW Sm C memiliki koloni berwarna putih, tepi

rata (Gambar 15c), merupakan bakteri gram positif berbentuk batang.

Gambar 15. Koloni 3 isolat Bakteri yang mempunyai aktivitas fitase tertinggi,

masing-masing (a) isolat RW Sm A, (b) isolat RW Sl 5, (c) Isolat RW Sm C

Pada pewarnaan bakteri, Kristal violet akan membentuk senyawa

komplek dengan lugol memberi warna ungu. Pada beberapa jenis bakteri, zat

warna tersebut dengan mudah dilepaskan dengan pencucian menggunakan

larutan alkohol 95%, sementara pada jenis bakteri yang lain, zat warna

a b c


commit to user

41

tersebut dapat tetap melekat setelah dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri

yang zat warnanya tidak terlepas setelah pencucian dengan alkohol 95%

akan berwarna ungu dan tidak terwarnai oleh pewarna safranin merupakan

bakteri gram positif. Bakteri yang tidak terwarnai oleh Kristal violet setelah

pencucian dengan alkohol 95%, kemudian terwarnai oleh safranin sehingga

berwarna merah, merupakan bakteri gram negatif (Gambar 16) (Mark, 2000).

Gambar 16. Diagram pewarnaan Gram pada Bakteri (Mark, 2000).

Pada pewarnaan gram terjadi perbedaan kemampuan terhapusnya zat

warna tertentu ketika proses berlangsung. Hal tersebut disebabkan oleh

perbedaan struktur dinding sel bakteri, antara bakteri gram positif dan gram

negative (Gambar 17). Bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan

yang lebih tebal dibanding pada bakteri gram negatif sehingga warna dari

Kristal violet melekat kuat pada bakteri gram positif.


commit to user

42

Gambar 17. Perbandingan Dinding sel bakteri gram positif dan gram

negative, pada bakteri gram positif terdapat lapisan peptidoglikan yang

lebih tebal

C.2. Fisiologi Bakteri dan Ekspresi Fitase

Pengamatan fisiologi bakteri dilakukan terhadap 3 isolat bakteri dengan

aktivitas fitase tertinggi; RW Sm A, RW Sm C, RW Sl 5, meliputi kurva

pertumbuhan bakteri (Gambar 18). Dari seleksi terhadap isolat bakteri ketiga

isolat terpilih mempunyai aktivitas fitase tertinggi, dimana pembentukan

enzim pada suatu mikroorganisme sangat tergantung pada kondisi optimum

ketika sebuah sifat diekspresikan (Qiagen, 2003 cit. Sajidan, 2010).

Selanjutnya perlu diketahui fase optimum produksi enzim pada masing-

masing isolat bakteri.

Kurva pertumbuhan dibuat untuk mengamati pola pertumbuhan bakteri.

Pola keberlangsungan hidup bakteri dapat diamati sehingga diketahui fase

optimum aktivitas fitase tertinggi pada masing-masing isolat tersebut. Pola

pertumbuhan bakteri meliputi 4 fase, yaitu :

Lapisan Peptidoglikan


commit to user

43

a. Fase Adaptasi (Lag phase)

Merupakan fase adaptasi bakteri terhadap lingkungan pertumbuhan.

Individu bakteri tumbuh menjadi dewasa tetapi tidak diikuti dengan

pembelahan sel.

b. Fase Eksponensial (Exponential phase atau Logaritmik phase)

Merupakan fase terjadinya penggandaan jumlah bakteri. Jumlah

bakteri baru yang terbentuk per satuan waktu sebanding dengan

populasi.

c. Fase Stasioner (Stationery phase)

Laju pertumbuhan bakteri melambat oleh beberapa factor antara lain;

ketersediaan nutrisi, akumulasi metabolisme, ketersediaan ruang

d. Fase Kematian (Dead Phase)

Merupakan fase yang ditandai dengan menurunnya populasi bakteri

(Dwidjoseputro, 2008).

Gambar 18. Perbandingan fase pertumbuhan Bakteri antara isolate RW Sm A,

RW Sm C, RW Sl 5, ketiga isolate mencapai fase eksponensial pada 16 jam

inkubasi dengan Aktifitas tertinggi dicapai pada puncak fase eksponensial.


commit to user

44

Pada umumnya enzim diproduksi selama pertumbuhan bakteri dan

akan mencapai aktivitas tertinggi pada akhir fase eksponensial atau fase log

(Haros et al., 2005). Kurva pertumbuhan (Gambar 18) memperlihatkan

aktivitas ketiga isolate bakteri mencapai aktivitas tertinggi pada akhir fase log

yaitu pada 16 jam inkubasi. Pada akhir fase log terjadi peningkatan jumlah

sel dan setiap sel aktif menggandakan diri. Aktivitas fitase mulai menurun

ketika memasuki fase stasioner. Pada fase stasioner tidak lagi terjadi

penggandaan sel-sel bakteri.

D. Identifikasi Bakteri

Setelah mendapatkan informasi sifat morfologi bakteri, selanjutnya

dilakukan identifikasi dengan marka gen 16s rRNA. Gen 16s rRNA terdapat

pada sub unit ribosom 30s. Gen 16s rRNA ditemukan pada semua

prokariotik, memiliki jumlah nukleotida yang cukup banyak, terdapat basa-

basa yang bersifat lestari sehingga dapat disusun sebuah primer universal

untuk mengamplifikasi gen 16s rRNA suatu organisme.

Analisis gen 16s rRNA untuk identifikasi bakteri membutuhkan jumlah

gen yang cukup dengan cara mengamplifikasi fragmen gen 16s rRNA

menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA kromosom

terlebih dahulu diekstraksi dari isolat RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl 5.

Profil DNA kromosom yang telah diisolasi dianalisis dengan elektroforesis

agarosa 1%. Elektroforegram hasil elektroforesis DNA kromosom ketiga

isolat (Gambar 19) menunjukkan adanya 1 pita tunggal. Kuantitas DNA

(Dioksiribo Nukleotida) diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 260 dan 280. Kuantitas DNA merupakan perbandingan hasil

absorbansi yang terbaca pada kedua panjang gelombang tersebut. Kuantitas


commit to user

45

1 2 3

DNA sebesar 1,7 menunjukkan kuantitas yang cukup, DNA kromosom

berhasil diisolasi dengan baik.

Ekstraksi DNA untuk mendapatkan DNA dari isolat bakteri,

menggunakan langkah kerja sesuai dengan protokol dari promega. Proses

ekstraksi DNA diawali dengan proses lisis dinding bakteri, melarutkan DNA,

mengendapkan DNA dan RNA. Setelah itu RNA dihilangkan dengan RNAse.

Protein didetanasi dengan protein presipitasion. DNA yang telah diperoleh

diendapkan dalam bentuk benang-benang dengan isopropanol. DNA yang

telah ter-ekstrak kemudian di elektroforesis dalam gel agarosa 1%.

Prinsip dasar teknik elektroforesis adalah pemisahan molekul DNA oleh

medan listrik. Molekul DNA dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh

gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Sampel molekul DNA ditempatkan

dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan didalam larutan penyangga

(TBE), kemudian dialirkan medan listrik. Molekul DNA akan bergerak di

dalam matriks gel kearah elektroda positif, karena adanya muatan negatif

pada rangka gula-fosfat.

Gambar 19. A. Elektroforesis DNA, B. Elektroforegram agarosa 1%. (1,

2 & 3) Hasil isolasi DNA kromosom Isolat RW Sm A, RW

Sm C, dan RW Sl 5 (dilihat dengan bantuan sinar UV)

A B


commit to user

46

Gen 16s rRNA berukuran 710 pb pada isolat RW Sm A, RW Sm C, dan

RW Sl 5 berhasil diamplifikasi dengan primer universal; forward Bact F1 (5'-

GAGAGTTTGATCCTGGCCAG-3’), primer reverse Uni B1

(5‘CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3‘) (gambar 20).

Lisdiyanti (1997) menjelaskan bahwa hal-hal yang perlu diperhatikan

dalam pemilihan primer adalah :

a. Panjang urutan basa primer yang optimal adalah 18-20 basa dan tidak

terdapat duplikasi antara kedua primer untuk mendeteksi gen target.

b. Spesifitas urutan basa harus tinggi untuk menghindari bergabungnya primer

pada daerah yang tidak diiinginkan, terutama pada daerah terminal 3’.

c. Persentase kandungan basa G + C kedua primer antara 40-60%.

d. Nilai Tm (melting temperature) kedua primer antara 55-800C.

e. Konsentrasi optimal dari primer antara 0,1-0,5 µM. Konsentrasi yang tinggi

akan mengakibatkan kesalahan menempel sehingga mensintesis produk

yang tidak diiinginkan.

Nilai Tm dari kedua primer adalah sebagai berikut :

Forward Primer; Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

= 2 (4 + 5) + 4 (7 + 4)

= 18 + 44

= 62 0C

Reverse Primer; Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

= 2 (1 + 8) + 4 (3 + 8)

= 18 + 44

= 62 0C


commit to user

47

Kedua primer mempunyai Tm (melting temperature) 62 0C sehingga diperoleh

suhu annealing 62 0C dan presentase kandungan basa G dan C kedua primer

55%. Kandungan basa G dan C yang rendah menyebabkan nilai Tm (melting

temperature) rendah.

Reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) dalam penelitian

menggunakan master mix gotaq green (Promega). Program PCR (Polymerase

Chain Reaction) yang digunakan berdasarkan optimasi alat PCR (Polymerase

Chain Reaction) yang akan digunakan. Komposisi larutan dalam 1 mikrotubr

reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) terdiri dari; 2 µL DNA, 2 µL Primer

Forward, 2 µL Primer reverse, 12,5 µL gotaq green master mix PCR (Promega)

dan 6,5 µL dH2O filter. Reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) dimulai pada

kondisi Pra PCR (predenaturasi) pada suhu 94oC selama 2 menit, 30 siklus

meliputi denaturasi pada suhu 94oC selama 1 menit, annealing (penempelan)

pada suhu 50oC selama 45 detik, pemanjangan 72oC selama 1,5 menit,

dilanjutkan pasca PCR 72oC selama 5 menit, pendinginan pada suhu 4oC selama

1 menit.

Dalam satu siklus PCR (Polymerase Chain Reaction) mempunyai tiga

tahap yaitu:

a. Pemisahan (Denaturation).

Tahap pertama dalam proses penggandaan adalah pemisahan utas ganda

menjadi utas tunggal dengan temperatur tinggi, yaitu 90-95oC selama 30 detik

hingga 1,5 menit.

b. Penempelan primer (Renaturation/Annealing).

Tahap penempelan primer terjadi pada suhu yang lebih dingin dibanding

dengan tahap denaturasi, yaitu antara 55-70oC. Pada suhu tersebut primer

akan menempel pada komplemen DNA target yang spesifik.


commit to user

48

1500

500 700

1000 ±710 bp

1 2 3 4

c. Sintesa (Synthesis/Ekstension).

Pada tahap sintesa atau ekstensi, temperatur dinaikkan menjadi 72oC, suhu

ini merupakan kondisi optimum untuk proses katalisa taq DNA polimerase.

Enzim polimerase mulai bekerja dengan cara menyusun pasangan untai DNA

baru dengan nukelotida-nukleotida dari dNTPs yang telah tersedia dalam

larutan. Sintesa DNA dimulai dari ujung 3’-hidroksi pada tiap primer.

Produk PCR yang berukuran 710 pb tersebut kemudian disekuensing

(1st base Singapura). Setiap urutan DNA yang diperoleh dari masing-masing

primer untuk masing-masing isolat disejajarkan dengan program bioedit

sehingga diperoleh satu urutan DNA utuh. Berdasarkan analisis penyusunan

gen, diperoleh 317 pasang basa untuk isolat RW Sm A, 351 pasang basa

untuk isolat RW Sm C dan 353 pasang basa untuk isolat RW Sl 5 (Lampiran

C).

Gambar 20. Elektroforegram hasil amplifikasi gen 16s rRNA

isolat RW Sm A (2), RW Sm C (3),RW Sl 5 (4)

marker DNA 1kb (1) (dilihat dengan sinar UV).


commit to user

49

Urutan DNA yang telah berhasil disekuensing kemudian dianalisis

dengan program BLASTn. Data sekuen DNA isolat RW Sm A, RW Sm C, RW

Sl 5 dibandingkan dengan data sekuen DNA yang tersedia di genebank.

Identifikasi ditentukan dari kemiripan urutan nukleotida penyusun gen 16s

rRNA. Hasil analisis BLASTn terhadap gen 16s rRNA yang mempunyai

homologi urutan yang kurang dari 98% menunjukkan bahwa spesies yang

dibandingkan merupakan spesies berbeda, homologi antara 93–95%

menunjukkan bahwa spesies yang dibandingkan berada pada genus yang

berbeda dan homologi antara 89–93% menunjukkan spesies yang

dibandingkan berada pada famili yang berbeda. Analisis BLASTn pada

isolate RW Sm A, RW Sm C, RW Sl 5 menunjukkan homologi 99%, sehingga

ketiga isolat tersebut merupakan kelompok Bacillus (Tabel 5, tabel 6 dan

tabel 7). Perbandingan urutan DNA ketiga isolat RW Sm A, RW Sm C dan

RW Sl 5 dengan DNA bakteri dari gen bank, Bacillus cereus acc no.

EU621383.1 dan Bacillus aryabattai acc no. JF939025.1) (gambar 21).

Tabel 5. Hasil Homologi urutan nukleotida isolat RW Sm A

No Deskripsi Total Nilai %

kemiripan

1 Bacillus sp. 3 599 99%

2 Bacillus cereus strain AIMST PV6.0 599 99%

3 Bacillus sp. Clone RS2 599 99%

4 Bacillus cereus strain CM100B 1165 99%

5 Bacillus cereus strain 6 599 99%

6 Bacillus cereus 599 99%

7 Bacillus sp. Cp-h45 599 99%

8 Bacillus subtilis strain AIMST 1.Dl.3 597 99%

9 Bacillus subtilis strain AIMST 1.All.14 597 99%

10 Bacillus cereus strain AIMST Saf2 597 99%


commit to user

50

Tabel 6. Hasil Homologi urutan nukleotida isolat RW Sm C


kemiripan

1 Bacillus aryabhattai strain AIMST Ngse11 542 100%

2 Bacillus sp. TBRh7 542 100%

3 Bacillus aryabhattai strain starin Z7B-11 542 100%

4 Bacillus aryabhattai PSB53 542 100%

5 Bacillus megaterium strain AIMST Hli2 542 100%

6 Bacillus megaterium strain AIMST 2.Hb.5 542 100%

7 Bacillus megaterium strain AIMST 1.Ic.3 542 100%

8 Bacillus sp. PL18-1 542 100%

9 Bacillus sp. 210_33 542 100%

10 Bacillus sp. 210_27 542 100%

Tabel 7. Hasil Homologi urutan nukleotida isolat RW Sl 5


kemiripan

1 Bacillus sp. ATY3 597 99%

2 Bacillus sp. ATY2 597 99%

3 Bacillus cereus starin Hs2-17 595 99%

4 Bacillus sp. IBA 33 isolat 1 595 99%

5 Bacillus sp 2 595 99%

6 Bacillus cereus strain TBLs6 595 99%

7 Bacillus cereus strain C4 595 99%

8 Bacillus anthracis strain H7B-47 595 99%

9 Bacillus anthracis strain G7Ba-66 595 99%

10 Bacillus cereus strain J9B-45 595 99%

Analisis homologi mikroorganisme memberikan informasi kemiripan

tertinggi isolat yang diuji dengan data yang tersedia pada genebank.

Sedangkan analisis mikroorganisme berdasarkan hubungan kekerabatan

pada sistem klasifikasi organisme dilakukan melalui analisis filogenetik.


commit to user

51

RW_Sm_A GGGAAATAAA AAGANAACCA AAACGGGTGC TATACATGCA AGTCGAGCGA 50 RW_Sl_5 N..G...C.. .GAGA...T. ...-AAC... .......... .......... 50 RW_Sm_C -..GGCCT.. ....G...A. ....A..... .......... .......... 50 Bacillus_a ---------- ---------- --GG...... .......... .......... 50 Bacillus_c ---------- ----T.G.-- .TG....... .......... .......... 50 RW_Sm_A ATGGATTAAG AGCTTGCTCT TATGAAGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC 100 RW_Sl_5 .......... .......... .......... .......... .......... 100 RW_Sm_C .CT.....GA ........TC .....C.... .......... .......... 100 Bacillus_a .CT.....GA ........TC .....C.... .......... .......... 100 Bacillus_c .......... .......... .......... .......... .......... 100 RW_Sm_A ACGTGGGTAA CCTGCCCATA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT 150 RW_Sl_5 .......... .......... .......... .......... .......... 150 RW_Sm_C .......C.. ......TG.. .......... ....T..... .....AA... 150 Bacillus_a .......C.. ......TG.. .......... ....T..... .....AA... 150 Bacillus_c .......... .......... .......... .......... .......... 150 RW_Sm_A AATACCGGAT AACATTTTGA ACCGCATGGT TCGAAATTGA AAGGCGGCTT 200 RW_Sl_5 .......... .......... .......... .......... .......... 200 RW_Sm_C .......... .GG..C..CT C.TT.....G AGATG..... ...AT..T.. 200 Bacillus_a .......... .GG..C..CT C.TT.....G AGATG..... ...AT..T.. 200 Bacillus_c .......... .......... .......... .......... .......... 200 RW_Sm_A CGGCTGTCAC TTATGGATGG ACCCGCGTCG CATTAGCTAG TTGGTGAGGT 250 RW_Sl_5 .......... .......... .......... .......... .......... 250 RW_Sm_C .....A.... ...CA..... G......GT. .......... .......... 250 Bacillus_a .....A.... ...CA..... G......GT. .......... .......... 250 Bacillus_c .......... .......... .......... .......... .......... 250 RW_Sm_A AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC 300 RW_Sl_5 .......... .......... .......... .......... .......... 300 RW_Sm_C .......... .......... ....A..... .......... .......... 300 Bacillus_a .......... .......... ....A..... .......... .......... 300 Bacillus_c .......... .......... .......... .......... .......... 300 RW_Sm_A CACAC TGGGACTGAG ACGCGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTAGGGAA-- 355 RW_Sl_5 ..... .........C ..A....... T......... .......... ........TC 355 RW_Sm_C ..... .......... ..A------- ---------- ---------- ---------- 355 Bacillus_a ..... .......... ..A....... .......... .......... ........TC 355 Bacillus_c ..... .......... ..A....... .......... .....CAGCA GTAGG...TC 355 Gambar 21. Perbandingan urutan basa DNA dari Bacillus sp (i. RW Sm A, ii. RW Sm C

dan iii. RW Sl 5) dengan data gen bank Bacillus aryabattai no.akses JF939025.1 dan Bacillus cereus no.akses EU621383.1 (Keterangan : Tanda titik (.) menunjukkan adanya kesamaan basa DNA antar spesies)

,


commit to user

52

0,01

Konstruksi pohon filogenetik didasarkan pada data urutan gen 16s

rRNA yang memiliki kemiripan dengan isolat RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl

5 yang telah diketahui melalui analisis homologi. Analisis filogenetik dilakukan

dengan menggunakan program ClustalW2. Urutan DNA dari spesies spesies

yang memiliki homologi dengan isolat bakteri terpilih dikumpulkan pada satu

file format fasta (Lampiran D) untuk disejajarkan dengan program Multiple

sequence Alignment dari software ClustalW2 (Lampiran E). Analisis MSA

(Multiple sequence Alignment) dilakukan dengan bootstrap 1000

pengulangan. Diperoleh nilai jarak matrik berdasarkan perbedaan urutan

nukleotida tiap spesies. Nilai tersebut digunakan untuk mengkonstruksi

pohon filogenetik.

Isolat RW Sm A dan isolat RW Sl 5 memiliki hubungan kekerabatan

terdekat dengan Bacillus cereus. Isolat RW Sm C berkerabat dekat dengan

Bacillus aryabhattai (Gambar 22).

Gambar 22. Pohon filogenetik Bacillus cereus RW Sm A, Bacillus aryabhattai

RW Sm C, Bacillus sp RW Sl 5 dengan beberapa spesies Bacillus

dengan kelompok luar dari Pantoea agglomerans menggunakan

ClustalW2 (Skala yang terlihat merupakan nilai subtitusi yang

diharapkan 1 dari 100 sekuen).


commit to user

53

Ketiga isolat yang diisolasi dari abu vulkanik gunung Merapi, seluruhnya

merupakan mikroorganisme dari genus Bacillus. Mikroorganisme dari genus

Bacillus memiliki kemampuan membentuk endospora, sehingga

memungkinkan genus ini dapat hidup pada kondisi lingkungan yang kurang

mendukung dan memilki rentang temperatur yang lebar. Bacillus merupakan

salah satu kelompok bakteri yang diketahui memiliki aktivitas fitase, Bacillus

Subtilis AP-17 memiliki aktivitas fitase 0.0296 U/mL (Kusumadjaja, 2009),

Bacillus Subtilis TS 16-111 0.05 U/mL (Park, 2001), Bacillus cereus

ASUIA260 dengan aktivitas fitase 1,160 U/mL, Bacillus stewartii ASUIA271

dengan aktivitas fitase 1,570 U/mL, Bacillus sakazaki ASUIA279 dengan

aktivitas fitase 4,480 U/mL (Sobirin et al., 2009).

E. Karakteristik Ekstrak Kasar Fitase

E.1. Suhu Optimum

Suhu optimum merupakan suhu yang menyebabkan terjadinya reaksi

kimia dengan kecepatan paling besar. Suhu tersebut memungkinkan

terjadinya reaksi yang efektif oleh enzim tertentu. Setiap enzim memiliki

aktivitas maksimum pada suhu tertentu. Aktivitas akan meningkat pada suhu

tertentu dan menurun ketika suhu semakin tinggi karena terjadi denaturasi

protein (Pelczar dan Chan, 1986: 318-320).

Isolat RW Sm A, RW Sm C, dan RW Sl 5 mempunyai aktivitas fitase

pada suhu optimum berturut turut; 40oC, 60 oC, 50 oC (Gambar 23). Pada

reaksi yang terjadi antara enzim-substrat, kenaikan suhu pada tingkat

tertentu akan menaikkan energi kinetik sehingga meningkatkan gerakan

molekul-molekul yang bereaksi dan tumbukan antara enzim-substrat


commit to user

54

berlangsung optimum. Sementara peningkatan suhu pada batas tertentu

menyebabkan aktivitas enzim menurun, karena protein terdenaturasi.

Enzim fitase aktif antara suhu 35 oC - 63 oC (Wodzinski et al., 1996).

Beberapa bakteri mempunyai aktivitas fitase dengan suhu optimum yang

berbeda, antara lain; Enterobacter spp pada suhu 50oC (Sun Yoon, 1998),

Klebsiella oxycota MO-3 pada suhu 55 oC (Jareonkitmongol, 1998), Bacillus

substilis TS16-III pada suhu 70 oC (Park, 2001), Bacillus substilis AP-17 pada

suhu 75 oC (Kusumadjaja, 2009) kapang Candida sp memiliki pada suhu 30

oC (Makhode, 2006).

Gambar 23. Kurva aktivitas fitase pada berbagai suhu inkubasi (pH substrat 5)

E.2. pH Optimum

pH optimum enzim terjadi ketika aktivitas enzim mencapai nilai tertinggi.

Sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzim akan terjadi pada suatu kondisi

optimum tertentu. Pada kondisi tidak optimum aktivitas enzim akan

berkurang. Kondisi pH yang terlalu ekstrim mampu merusak enzim (Pelczar

dan Chan, 1986:326). Beberapa jenis kapang Candida sp memiliki pH

optimum antara 5,5 – 6 (Makhode, 2006), Enterobacter sp mempunyai


commit to user

55

aktivitas optimum pada pH 7 – 7,5 (Jun Yoon, 1998), Klebsiella oxycota pada

pH 5 – 6 (Jareonkitmongol, 1998), Bifidobacterium sp pada pH 7 (Haros et

al., 2005), Bacillus subtilis TS16-III pada pH 7 (Park, 2001) dan Bacillus

subtilis AP-17 pada pH 6 (Kusumadjaja, 2009).

Isolat RW Sm A, dan RW Sl 5 mempunyai aktivitas fitase pada pH

optimum 5, sementara isolate RW Sm C mempunyai aktivitas fitase pada pH

optimum 6 (Gambar 24a). Isolat RW Sm C mempunyai rentang pH yang lebih

luas dibanding isolat RW Sm A dan RW Sl 5. Pada pH optimum, enzim

mempunyai tingkat ionisasi paling sesuai untuk berikatan dengan substrat.

Ikatan tersebut dalam keadaan paling stabil sehingga meningkatkan

efektifitas enzim-substrat. Adanya perubahan pH akan menyebabkan

perubahan konformasi ikatan enzim-substrat sehingga efektifitas enzim-

substrat menurun dan aktivitas enzim berkurang (Nelson et al., 2000).

Gambar 24a. Kurva Aktivitas Fitase pada berbagai pH (pada suhu optimum )

Waktu inkubasi enzim-substrat yang tepat dapat mempengaruhi

aktivitas enzim (Nelson et al., 2000). Isolat RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl 5

mempunyai waktu inkubasi enzim-substrat optimum pada pH dan suhu

optimal selama 1 jam (60 menit) (Gambar 24b). Enzim fitase dari ketiga isolat


commit to user

56

cukup stabil, setelah 6 jam inkubasi enzim-substrat, aktivitas fitase dari ketiga

isolate masih tersisa 25%. Bacillus sp AP-17 mempunyai 32% aktivitas pada

pemanasan selama 6 jam pada suhu optimum 75 0C (Kusumadjaja, 2009).

Gambar 24b. Kurva aktivitas relatif fitase pada berbagai waktu inkubasi

(pH dan suhu optimum)

E.3. Efektor Logam

Enzim membutuhkan kofaktor untuk aktivitasnya, yaitu sebuah

komponen non protein, kofaktor terdiri dari 3 macam jenis yaitu berupa ion

organik, gugus prostetik dan koenzim (Sasmitamihardja dkk., 1996: 134). Ion

logam yang ditambahkan dalam reaksi enzim-substrat dapat berfungsi

sebagai aktivator atau inhibitor. Aktivator merupakan substansi yang mampu

meningkatkan aktivitas enzim, dan inhibitor adalah substansi yang

menghambat aktivitas suatu enzim (Pelczar dan Chan, 1986: 329). Hasil dari

penelitian, berperan sebagai aktivator aktivitas fitase adalah Mg2+ dan Ca 2+,

isolate RW Sm A mempunyai aktivitas fitase yang tinggi dengan penambahan

ion Mg2+ (10-4 M). Isolat RW Sm C dan RW Sl 5 meningkat aktifitas fitasenya

dengan penambahan ion logam Ca2+. Sementara sebagai inhibitor yang


commit to user

57

menghambat aktivitas enzim pada ketiga isolat adalah Zn2+ dan Fe3+

(Gambar 25 a,b,c).

Aktivitas fitase dihambat oleh Zn2+, Ba2+, Cu2+ dan Al3+ (Sun Yoon,

1998), NaF dan Fe2+ jg merupakan ion logam yang berperan sebagai inhibitor

pada enzim fitase (Jareonkitmongkol, 1998). Aktivitas ketiga isolat dihambat

dengan penambahan ion mineral Zn2+ dan Fe3+. Mineral Fe merupakan

inhibitor enzim fitase. Ikatan asam fitat dengan Fe menyebabkan

pengendapan garam fitat sehingga ikatan fosfat pada fosfat cincin inositol

sulit dihidrolisis oleh fitase.

Aktivitas fitase akan meningkat dengan penambahan EDTA atau N-

ethymalemide (Jareonkitmongkol, 1998), serta penambahan Ca2+ dan Mg2+

(Maenz, 2005). Adanya ikatan Ca2+ dengan fosfat pada fitat menyebabkan

salah satu rantai fosfat yang terikat lepas sehingga menghasilkan Inositol

trifosfat (Oh et al., 2006). Ikatan kalsium pada fitase meningkatkan stabilitas

struktur dan meningkatkan aktivitas enzim fitase (Ha et al., 2000). Bacillus

cereus RW Sm A mengalami peningkatan aktivitas fitase dengan

penambahan mineral Mg2+. Bacillus subtilis N-77 (natto) mempunyai aktivitas

relatif sebesar 55,8% pada penambahan 5 mM MgCl2 (Shimizu, 1992).

Bacillus subtilis TS16-111 mengalami peningkatan aktivitas pada

penambahan 1 mM dan 5 mM MgCl2 (Park, 2001). Enzim fitase menjadi

relatif stabil dengan kehadiran bivalen kation seperti, kalsium dan

magnesium. Fitase lebih stabil pada suhu tinggi dengan keberadaan bivalen

kation (Ha et al., 2000).


commit to user

58

Gambar 25. Kurva Aktivitas Relatif Fitase Isolat RW Sm A, RW Sm C, RW Sl 5

dengan penambahan ion mineral 10-4 M

F. Fitase pada Bacillus

Dalam penelitian ini aktivitas fitase tertinggi terdapat pada Bacillus

cereus strain RW Sm A dengan suhu optimum 40 0C, pH optimum 5. Diikuti oleh

Bacillus cereus strain RW Sl 5, pada suhu optimum 50 0C, pH optimum 5 dan

Bacillus aryabhatttai strain RW Sm C pada suhu optimum 60 0C, pH optimum 6.

Aktivitas fitase pada ketiga Bacillus tersebut meningkat dengan penambahan Ca

(kalsium) pada substrat.

Fitase Bacillus (table 8) diketahui mempunyai aktivitas pada pH

dibawah netral, stabil pada suhu yang tinggi dan mempunyai substrat spesifik

komplek kalsium-fitat (Fu et al., 2008). Fitase yang stabil pada suhu tinggi

merupakan kriteria penting dan sangat potensial digunakan sebagai supplement

pakan. Dalam proses industri, enzim akan mendapat perlakuan panas dan dalam

saluran pencernakan terdapat suasana asam. Fitase dari bacillus merupakan

kandidat yang sesuai untuk aplikasi tersebut.


commit to user

59

Tabel 8. Karakteristik Enzim fitase pada Bacillus

Spesies pH optimum

Suhu optimum(0C)

Berat Molekul (kDa)

Aktivator Pustaka

Bacillus cereus strain RW Sm A 5,0 50 - Mg2+, Ca2+ Penelitian ini

Bacillus aryabhattai strain RW Sm C 6,0 60 - Ca2+ Penelitian ini

Bacillus cereus strain RW Sl 5 5,0 50 - Ca2+ Penelitian ini

aBacillus substilis 7,0-7,5 60 36,5 Power dan Jagannatan, 1982

bBacillus substillis 6,0-6,5 60 36; 38 Ca2+ Shimizu, 1992

cBacillus substilis VTT F-68013 7,0 55 - Ca2+ Kerovuo et al., 1998

dBacillus sp KHU-10 6,5-8,5 40 44 Ca2+ Choi et al., 2001

eBacillus laevolacticus 7,0-8,0 70 - Gulati et al., 2007

fBacillus megaterium 6,0 70 - Dechavez et al., 2011

gBacillus substilis TS16-IIIc 7,0 70 - Mg2+, Ca2+ Park, 2001

hBacillus substilis AP-17d 6,0 75 - Ca2+ Kusumadjaja, 2009

iBacillus subtilis CF92 7,0 60 46 EDTA Hong et al., 2010

Karakteristik fitase pada Bacillus adalah β-propeller Phytase (Gambar

26). Kelompok β-propeller Phytase (BPP) mempunyai 2 situs aktif yaitu situs

afinitas (affinity site) dan situs pemecahan (cleavage site), cleavage site

berperan dalam menghidrolisis substrat dan affinity site berperan dalam

meningkatkan afinitas terhadap substrat yang mengandung grup fosfat. Aktivitas

katalitik BPP (β-propeller Phytase) tergantung pada keberadaan ion metal

terutama kalsium. Enzim yang aktif berikatan dengan 6 ion kalsium, sedangkan

enzim yang tidak aktif hanya mempunyai 3 kalsium yang hilang dari situs aktif

enzim, sehingga hanya berikatan dengan 3 kalsium (Shin et al., 2001). Pada

BPP (β-propeller Phytase) ion Ca2+ bukan hanya sebagai activator enzim

melainkan juga merupakan komponen substrat (komplek garam fitat). Aktivasi


commit to user

60

enzim merupakan hasil interaksi antara enzim, ion Ca2+, dan substrat. Pada

enzim yang aktif minimal membutuhkan 5 ikatan Ca2+ (Kim et al., 2010)

Gambar 26. Mekanisme katalitik β-propeller Phytase pada Fitat yang mengikat Ca2+

Bakteri dari genus bacillus penghasil fitase berhasil diisolasi dari abu

vulkanik gunung Merapi, dalam studi sebelumnya beberapa Bacillus sp yang

mampu melarutkan fosfat telah diisolasi untuk meningkatkan ketersediaan fosfat

telah diisolasi dari lapisan rhizosfer tanah vulkanik (Jorsquera et al., 2011).


commit to user

61

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Sebanyak 16 isolat bakteri telah berhasil diisolasi dari abu vulkanik

gunung Merapi. Terdapat 3 isolat dengan aktifitas fitase terbesar, yaitu isolate

RW Sm A dengan aktifitas fitase 0,1071 U/mL, RW Sm C dengan aktifitas

fitase 0,1020 U/mL dan RW Sl 5, memiliki aktifitas sebesar 0,0874 U/mL.

Berdasarkan uji morfologi dan analisis gen 16s rRNA ketiga isolat merupakan

kelompok Bacillus, masing-masing adalah Bacilllus cereus RW Sm A,

Bacillus aryabhattai RW Sm C dan Bacillus cereus RW Sl 5.

Ekstrak kasar fitase dari ketiga isolate RW Sm A, RW Sm C dan RW Sl

5 masing-masing mempunyai suhu optimum berturut turut; 40oC, 60oC, 50oC.

pH optimum ketiga isolate berkisar antara 5-6. Aktifitas fitase isolate

dihambat oleh penambahan ion Fe3+, dan Zn2+, tetapi meningkat dengan

penambahan ion Mg2+ dan Ca2+.

B. Saran

Penelitian ini merupakan penelitian awal untuk mengisolasi dan

mengkarakterisasi enzim fitase dari bakteri galur lokal yang berasal dari

lingkungan ekstrim (abu vulkanik Gunung Merapi). Penelitian ini selanjutnya

masih menyediakan banyak aspek yang perlu dikaji untuk menemukan

sumber-sumber bakteri baru penghasil Fitase dengan karakteristik yang

beragam. Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui enzim yang telah

dihasilkan meliputi kajian tentang struktur, fungsi, aktifitas dan termostabilitas

untuk aplikasi dalam bioteknologi. Lebih lanjut, diperlukan studi dengan

pendekatan molekuler untuk DNA rekombinan, mutagenesis acak,


commit to user

62

mutagenesis terarah ataupun rekayasa protein, sehingga produksi enzim

lebih efektif, stabil, dan optimal.

ANALISIS GEN 16S rRNA PADA BAKTERI PENGHASIL ENZIM …/Analisis... · 15. Semua pihak yang tidak...

Documents

Transcript of ANALISIS GEN 16S rRNA PADA BAKTERI PENGHASIL ENZIM …/Analisis... · 15. Semua pihak yang tidak...