ANALISIS FLAVONOID

Flavonoid dalam tumbuhan hijau umumnya terdapat dalam bentuk O-glikosida ( jarang yang C-glikosida ), dimana 1 gugus hidroksi flavonoid (atau lebih) terikat pada 1 gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal.

O-glikosida → lebih mudah dihidrolisis dengan asamC-glikosida → ikatan lebih kuatGlikosida → glikon dan aglikon

Gula umum : GlukosaGula lain : galaktosa, ramnosa, xilosa, arabinosaGula jarang : alosa, manosa, fruktosa, apiosa, as. glukuronat, galakturonat

flavonoid dalam tumbuhan terikat dengan gula, tidak bebas, atau terikat dengan yang lain, yang kelarutannya akan berbeda

Struktur umum 15 atom C dalam konfigurasi C 6 – C 3 – C 6

PENGGOLONGAN1. Antosianin: pigmen bunga merah, biru pada daun dan bunga2. Proantosianidin: tak berwarna, biasa terdapat dalam galih (bakal) dan daum3. Flavonol: ko-pigmen tak berwarna, pada tumbuhan berkayu4. Flavon: ko-pigmen tak berwarna, pada tumbuhan berkayu5. Glikoflavon: ko-pigmen tak berwarna, sudah berikatan dengan glikosida6. Biflavonil: ko-pigmen tak berwarna, terbatas pada gymnospermae7. Khalkon & Auron: pigmen bunga kuning, cincin C nya terbuka8. Flavanon: tak berwarna, biasanya terdapat pada daun & buah. Ikatan rangkap di cincin C hilang 19. Isoflavon: cincin B nempel di C no 3. Tak berwarna, biasa pada akar tumbuhan Leguminosae

SIFAT KELARUTANKarena punya sejumlah gugus –OH bebas atau suatu gula, maka umumnya flavonoid bersifat polar, sehingga larut dalam air & pelarut polar lain: etanol, metanol, aseton, butanol, dimetilsulfoksida (DMSO), dimetil formamida (DMF), dll. Pemisahan KKt, proses lambat. DMSO & DMF untuk instrumen

Aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon, flavonol yang termetoksilasi, larut dalam pelarut nonpolar: eter, kloroform, benzen, heksan, toluen). Dalam bentuk aglikon, pemisahan lebih mudah (dengan KLT)

SIFAT FISIKA KIMIAAglikon flavonoid adalah polifenol, karena itu punya sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa (INGAT! Dalam larutan basa flavonoid akan lebih cepat / mudah terurai & teroksidasi)

Sifat ini digunakan sebagai cara deteksi flavonoid pada pelat KLT.Senyawa fenol + basa (amoniak) → perubahan warna. Warna bercak visibel, warna bercak dengan UV, dan warna bercak UV + amoniak, dapat dijadikan salahsatu petunjuk untuk identifikasi flavonoid.Contoh: - flavonoid glikosida

kuning → (+ amoniak) coklat tua → (UV) kuning coklat

- antosianidin – 3 – glikosidamerah / jingga → (+ amoniak) merah / jingga → (UV) biru

Flavonoid mengandung senyawa dengan sistem aromatik terkonjugasi, sehingga menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah spektrum UV-vis → dapat dijadikan sebagai petunjuk identifikasi.UV → panjang gelombang 200 – 400Vis → panjang gelombang 300

pita II (nm) pita I (nm) jenis250-280 310-350 flavon

250-280 330-360 flavonol (3-OH tersubtitusi)250-280 350-385 flavonol (3-OH bebas)245-275 310-330 isoflavon275-295 300-330 bahu flavanon & dihidroflavonol

230-270 (I rendah) 340-390 khalkon230-270 (I rendah) 380-430 auron

270-280 465-560 Antosianidin & antosianin

TAHAP ANALISIS1. EKSTRAKSI

Maserasi 2 tahap dengan menggunakan:Pelarut 1 → metanol : air (9 : 1) selama 6 – 12 jam ======= untuk penetrasi, membuka menbran

karena flavonoid ada di vakuola selPelarut 2 → metanol : air (1:1) selama 6 – 12 jamKedua ekstrak disatukan kemudian diuapkan. Bahan + pelarut 1 → ampas + pelarut 2 → ekstrak

2. FRAKSINASIDengan n-heksan : air atau CHCl3 : air, lapisan n-heksan atau CHCl3 untuk menghilangkan senyawa yang kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil, dll., dengan cara Ekstraksi Cair-Cair (ECC) menggunkan 2 pelarut yang beda kepolarannya jauh.

3. DALAM LAPISAN AIR mengandung sebagian besar senyawa flavanoid

KROMATOGRAFI KERTAS (KKt) 2 ARAH→ bisa mempunyai informasi tambahan dari jenis flavanoidMerupakan cara paling umum & berguna untuk analisis pendahuluan ekstrak & menguji adanya flavanoid.Penyangga: kertas Whatman 3 mmPengembang: 1. BAA = 4:1:5 (lapisan atas)

2. As. asetat 15 %Pendeteksi: sinar UV 366 nm → bercak terang (bukan 254 yang menghasilkan bercak gelap/pemadaman)Informasi / petunjuk dari KKt 2 arah dapat digunakan untuk menunutn struktur flavanoid dilihat dari:

o Warna bercak sebelum disinari UV & setelah disinari UV o Letak bercak pada KKt 2 arah pada kondisi baku spt diatas

Pengembang lain: TBA = t-buOH : HOAc : air = 3:1:1 KAA = kloroform : HOAc : air = 30:15:2 Forestal : HOAc : air : HCl = 30:10:3 BEA = benzen : HOAc : air = 125:72:3 Air HCl 1%

Pereaksi semprotAlCl3 5 % 5 – OH flavanoid terhihat sebagai bercak kuning berfluoresensi (UV 366 nm) Bercak yang semula tak terlihat jadi terlihat

Kompleks difenil-as borat-etanol amin (Natur Stoff reagenz A) 3’ 4’ –dihidroksi flavon & 3’ 4’ dihidroksi flavonol = bercak jingga (UV atau vis) 4’ – hidroksi flavon & 4’ – hidroksi flavonol = bercak kuning hijau

As sulfanilat terdiazotasiSenyawa yang mempunyai gugus fenol = bercak kuning, jingga, merah

Vanilin HCl Katekin & protoantosianidin = bercak merah atau merah lembayung segera setelah

penyemprotan Flavanon & dihidroflavonol = bercak merah atau merah lembayung terbentuk lebih lambat

setelah penyemprotan

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Tujuan: - mencari pelarut untuk krom. Kolom (KK)- analisis fraksi yang diperoleh dari KK- identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi- isolasi flavonoid skala kecil

Untuk KK perlu ditambah pelarut nonpolarnya untuk mengurangi kecepatan, Rf = 0.3

Ko-kromatografi → dibandingkan dengan baku autentik yang di KLT sama2 dalam 1 plat 1 sistem.

KROMATOGRAFI KERTAS PREPARATIF (1 ARAH / 2 ARAH)Pemisahan 1 komponen dalam skala besar, kertasnya lebih besar Bercak ditutulkan berupa pita lebar 1 – 3 cm Cara ini memungkinkan kita memisahkan ekstrak 10 – 15 kali jumlah yang dapat dipisahkan secara KKt

biasa Setelah pengembangan, pita yang terjadi dipotong-potong & diekstraksi dengan pelarut

KROMATOGRAFI KOLOM Fasa diam / penjerap: selulosa, silika, poliamida, sephadex Fasa gerak / eluen: pelarut / campuran pelarut yang berurutan dimulai dari yang kurang polar & sedikit-

sedikit meningkat ke yang paling polar (elusi gradien / elusi landaian)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) Pada dasarnya sama dengan KK, perbedaan terletak pada ukuran pertikel kolom yang lebih kecil & lenih

teratur Karena ukuran partikel lebih halus, maka diperlukan tekanan sampai 5000 lb/inchi atau 2000 kg/cm Memungkinkan untuk menganalisis komponen flavonoid dalam suatu campuran secara kuantitatif pada

asas resolusi & kepekaan yang tinggi ( < 50 ng) Kolom: fasa balik (hidrokarbon terikat pada kemasan silika) = µ Bondapak C-18 Eluen: air-metanol, air-metanol-HOAc, air-asetonitril