ANALISIS DNA MIKROSATELIT UNTUK IDENTIFIKASI PATERNITAS PADA MONYET EKOR PANJANG.docx

5/19/2018 ANALISIS DNA MIKROSATELIT UNTUK IDENTIFIKASI PATERNITAS PADA MONYET EKOR PANJANG.docx

1/9

ANALISIS DNA MIKROSATELIT UNTUK IDENTIFIKASI

PATERNITAS PADA MONYET EKOR PANJANG (Macaca fasciculari s) DI

KAWASAN PURA PULAKI, BALI

PROPOSAL PENELITIANDisusun untuk memenuhi tugas akhir matakuliah TABM

yang diampu oleh Prof.Dr. A. Duran Corebima, M.Si & Prof.Dr. Siti Zubaidah, M. Si

Oleh :

Fia Izzatul Muna 100342400939

GE 2010

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI BIOLOGI

Mei 2013


2/9

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Monyet Ekor Panjang atauMacaca fascicularismemang monyet populer.

Monyet dengan ekor panjang inilah yang sering kita lihat. Selain populasi monyet

jenis ini cenderung masih banyak, kemampuannya beradaptasi membuat monyet

ekor panjang terbiasa dengan kehadiran manusia sehingga banyak dipelihara.

Bahkan monyet ini populer dipergunakan dalam atraksi topeng monyet.Dalam

bahasa Inggris,monyet ekor panjang dinamakan Crab-eating MacaqueatauLong-

tailed Macaque. Sedangkan dalam bahasa latin (nama ilmiah) primata ini

dinamaiMacaca fascicularisyang bersinonim denganMacaca irus.

Macaca fascicularis (monyet ekor panjang) merupakan salah satu satwa

primata yang menyebar secara luas. Di kawasan Asia Tenggara monyet ekor

panjang ditemukan di Vietnam, Myanmar, Muangthai, Malaysia, Filipina, danIndonesia (Supriatna dan Wahyono, 2000). Monyet ekor panjang di Indonesia

diperkirakan berasal dari daratan Asia Tenggara dan bermigrasi melebihi satu juta

tahun yang lalu saat daratan Asia dan lempeng Sunda menyatu (Eudey, 1980;

Monica, et al., 2012). Monyet ekor panjang menyebar dari barat ke timur dengan

pulau Jawa sebagai pintu penyebarannya (Fooden, 1995; Monica, et.al, 2012).

Monyet ekor panjang Bali diyakini migrasi langsung dari Jawa saat kedua

pulau menyatu pada waktu sebelum dan saat glasiasi maksimum terakhir ( 18

ribu tahun yang lalu) (Eudey, 1980; Fooden, 1995; Monica, et.al, 2012). Di pulau

Bali, populasi monyet ekor panjang dapat ditemukan pada 43 lokasi (Fuentes dan

Garmel, 2005). Populasi monyet ekor Bali telah bertambah menjadi 46lokasi

(Pusat Kajian Primata, 2007, data tidak dipublikasikan). Di Bali populasimonyet ekor panjang dapat ditemukan di beberapa lokasi diantaranya Alas

Kedaton, Alas Nenggan, Sangeh, Wanara Wana Padang Tegal Ubud, Pura Luhur

Uluwatu, dan Pura Pulaki (Fuentes dan Garmel, 2005).

Pura Pulaki yang berada di kawasan Pulaki desa Banyu Poh kecamatan

Gerokgak dikenal sebagai tempat wisata monyet yang berada di kabupaten

Buleleng Bali. Pura Pulaki dengan luas sekitar 5 ha ditempati oleh fauna

monyet ekor panjang dan merupakan cagar alam untukmelindungi dan

melestarikan hutan. Menurut survei yang dilakukan oleh Wandia (2007) kawasan

ini dihuni oleh 68 ekor monyet ekor panjang. Satwa primata ini perlu

dipertahankan keberadaannya karena telah berkontribusi besar terhadap

perkembangan ekonomi masyarakat sekitar. Salah satu upaya dalammempertahankan keberadaan monyet ekor panjang adalah dengan mempelajari

struktur genetiknya dalam suatu populasi.

Keragaman genetik suatu populasi dapat didekati melalui polimorfisme

mikrosatelit (Muladno 2000). Mikrosatelit dikenal juga sebagai Simple Sequence

Repeats (SSRs) atau Simple Tandem Repeats (STRs) merupakan runutan

nukleotida pendek sederhana (khususnya di-, tri-dan tetranukleotida) yang

terulang secara berurutan dalam genom eukariot (Avise 1994; Anggraeni, 2009).

Dalam hubungannya dengan kegunaan mikrosatelit dalam uji paternitas, beberapa

penelitian primata banyak memanfaatkan mikrosatelit untuk berbagai macam

tujuan. Kanthaswamy et al. (2006) memilih lokus mikrosatelit dengan motiftetranukleotida dalam pembuatan strategi manajemen genetik standar untuk koloni
http://alamendah.wordpress.com/2011/03/06/nama-latin-dan-inggris-100-hewan-fauna-indonesia/http://alamendah.wordpress.com/2011/03/06/nama-latin-dan-inggris-100-hewan-fauna-indonesia/http://alamendah.wordpress.com/2011/03/06/nama-latin-dan-inggris-100-hewan-fauna-indonesia/http://alamendah.wordpress.com/2011/03/06/nama-latin-dan-inggris-100-hewan-fauna-indonesia/http://alamendah.wordpress.com/2011/03/06/nama-latin-dan-inggris-100-hewan-fauna-indonesia/


3/9

Macaca mulata di berbagai Pusat Penelitian Primata di Amerika. Meier et al.

(2000) melakukan penelitian untuk menentukan paternitas karakteristik genetik

dan sosial yang berkorelasi dengan ukuran kelompok simpanse yang

dikandangkan. Chambers et al. (2004) menggunakan penanda mikrosatelit

manusia untuk amplifikasi sampel non-invasive yang berasal dari Hylobates lar.Keane et al. (1997; Anggraeni, 2009) melakukan identifikasi variasi genetik

dengan menggunakan lokus mikrosatelit untuk tujuan analisis paternitas pada

Macaca sinicadi Polonnaruwa, Srilanka.

Berdasarkan informasi diatas, dianggap perlu meneliti analisis DNA

mikrosatelit untuk identifikasi paternitas pada monyet ekor panjang (Macaca

fascicularis), yang berada di kawasan Pura Pulaki, Bali. Hasil dari penelitian ini

diharapkan akan membentuk suatu data paternitas yang baik, sehingga berguna

dalam penentuan manajemen koloni monyet ekor panjang sebagai upaya dalam

mempertahankan keberadaan monyet ekor panjang.

B.

Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan analisis DNA mikrosatelit

pada monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) untuk identifikasi paternitas

yang pada nantinya berguna dalam manajemen koloni monyet ekor panjang.

C. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi seputar analisis

DNA mikrosatelit pada monyet ekor panjang untuk identifikasi paternitas agar

upaya dalam mempertahankan keberadaan monyet ekor panjang di kawasan Pura

Pulaki tersebut dapat berlangsung.


4/9

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

A. DNA Mikrosatelit

Salah satu marka molekuler pada tingkat DNA adalah mikrosatelit.

Mikrosatelit (runutan nukleutida sederhana, di-, tri- atau tetranukleotida, yang

berulang dalam genom) adalah segmen dari materi genetik (DNA), sehingga

penggunaannya sebagai marka molekuler akan lebih mencerminkan struktur

genetik populasi (Whitton et al., 1997; Rumba, 2013). Mikrosatelit pada

umumnya bersifat netral yaitu tidak menimbulkan kematian pada individu yang

membawa alelnya (Morin et al., 1997; Rumba, 2013). Genotip individu dalam

populasi merupakan kombinasi antar alel mikrosatelit tetuanya. Akumulasi tinggi

suatu alel dalam populasi kemungkinan timbul, salah satunya oleh intesitas kawin

keluarga (inbreeding) yang tinggi. Melalui pemilihan marka molekuler

mikrosatelit yang tidak terpaut satu dengan yang lainnya, marka molekulermikrosatelit sangat baik untuk mengkaji berbagai parameter genetik populasi

seperti diversitas genetik (heterosigositas), kawin acak, dan aliran genetic

(Rumba, 2013).

Beberapa karakter mikrosatelit seperti alel mudah dibedakan, memiliki

tingkat variabilitas yang tinggi, dan mudah didekati melalui teknik PCR

menjadikannya sebagai penanda molekul yang paling diminati oleh ahli genetika

untuk mencerminkan struktur genetik suatu populasi (Ellegren et al., 1992;

Monica, 2012). Tidak semua lokus mikrosatelit baik digunakan untuk

mengungkapkan keragaman genetik populasi. Meskipun berbagai keunggulan

yang dimiliki mikrosatelit, lokus mikrosatelit yang bersifat polimorfik yang akan

dipilih untuk studi genetik populasi. Semenjak berkembangnya Human GenomProject pada tahun 2005, banyak lokus mikrosatelit manusia diujicobakan pada

Non Human Primata (NHP) (Rogers dan Hixson, 1997; Monica, 2012). Karakter

mikrosatelit tersebut tidak selalu selaras dengan populasi alamiah karena

karakteristiknya hanya dilakukan pada hewan NHP di stasiun penangkaran

(Monica, 2012).

Mikrosatelit telah digunakan secara luas sebagai penanda dalam dunia

genetika molekuler. Beberapa karakter mikrosatelit, seperti memiliki variabilitas

yang tinggi, kemudahan untuk membedakan genotipe melalui ukuran jumlah

motif dan mudah didekati melalui teknik PCR, menjadikan mikrosatelit sebagai

penanda molekul yang baik untuk mempelajari struktur genetik suatu populasi

(Wandia 2003). Selain itu, mikrosatelit dapat digunakan dalam uji paternitas(Smith et al. 2000). Mikrosatelit terdapat melimpah dalam genom dan mudah

ditemukan, oleh karena itu digunakan dalam pemetaan genom (Weber 1990;

Anggraeni, 2009). Mikrosatelit juga digunakan sebagai penciri genetik (Lehmann

et al. 1996) atau dapat digunakan sebagai penanda yang ideal untuk mengukur

tingkat keragaman populasi karena memiliki jumlah alel yang tinggi, serta

ekspresi pola pitanya kodominan sehingga dengan mudah dapat membedakan

individu homozigot. Lokus mikrosatelit dengan motif tetranukleotida akan lebih

mudah dibedakan jenis alelnya melalui teknik elektroforesis (Valdes et al. 1993;

Anggraeni, 2009).


5/9

B.Identifikasi Paternitas

Identifikasi paternitas diketahui melalui alel yang diwariskan dari induk

kepada anak, yang ditentukan berdasarkan migrasi pita dari setiap lokus

(Anggraeni, 2009). Tes paternitas dapat dilakukan untuk beberapa alasan, antaralain untuk menentukan siapakah ayah dari seorang bayi yang dikandung oleh

seorang wanita. Di dalam kasus perkosaan, tes paternitas ini dapat diajukan oleh

sang wanita (korban), sang lelaki (tertuduh) atau penyidik untuk membuktikan

bahwa bayi yang dikandung adalah memang benar anak dari sang pemerkosa,

apalagi apabila terjadi juga dugaan multiple sexual partners (Hernanda, tanpa

tahun)

C.Monyet Ekor Panjang (Macaca fasciculari s)

Salah satu jenis satwa liar yang diekspor Indonesia adalah monyet ekor

panjang (Macaca fascicularis). Satwa ini banyak dimanfaatkan di bidangkedokteran, biomedis, teknologi antariksa, dan lain-lain. Jumlah monyet ekor

panjang yang diekspor Indonesia dari tahun 1970-1975 mencapai sekitar 86.332

ekor. Kemudian pada tahun 1980 diekspor sebanyak 14.519 ekor (Direktorat PPA,

1981; Santosa, 1996). Monyet ekor panjang merupakan salah satu primata non-

manusia yang berhasil. Monyet ini tersebar di Asia Tenggara antara 20LU-10LS

dan antara 920-1280 BT (Wheatley, 1980; Putra, 2006). Penyebarannya di Bali

juga sangat luas. Berdasar pada hasil survei yang dilakukan oleh Suaryana et al.

(2001), sedikitnya ada 44 lokasi habitat monyet yang tersebar di seluruh Bali.

Beberapa lokasi tersebut digunakan sebagai obyek wisata, seperti Sangeh, Ubud,

Alas Kedaton, Uluwatu, Pulah, dan Bedugul (Putra, 2006).

Monyet ekor panjang Bali diyakini migrasi langsung dari Jawa saat keduapulau menyatu pada waktu sebelum dan saat glasiasi maksimum terakhir ( 18

ribu tahun yang lalu) (Eudey, 1980; Fooden, 1995; Monica, et.al, 2012). Di pulau

Bali, populasi monyet ekor panjang dapat ditemukan pada 43 lokasi (Fuentes dan

Garmel, 2005). Populasi monyet ekor Bali telah bertambah menjadi 46lokasi

(Pusat Kajian Primata, 2007, data tidak dipublikasikan). Di Bali populasi

monyet ekor panjang dapat ditemukan di beberapa lokasi diantaranya Alas

Kedaton, Alas Nenggan, Sangeh, Wanara Wana Padang Tegal Ubud, Pura Luhur

Uluwatu, dan Pura Pulaki (Fuentes dan Garmel, 2005).


6/9

BAB III

METODE PENELITIAN

A.

Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental dimana seluruh

proses analisis datanya dilakukan di laboratorium molekuler.

B.Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari sampai dengan April 2013.

Tempat pengambilan sampel berada di kawasan Pura Pulaki, Bali dan tempat

untuk analisis DNA mikrosatelit untuk identifikasi paternitas dilakukan di

Laboratorium Molekuler Gedung Biologi Universitas Negeri Malang.

C.

Instrumen Penelitian

Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi:

Sampel darah monyet ekor panjang yang diambil dari 2 titik

pengamatan (titik A dan B)

Ketamin HCL 10-15 mg/kg bobot badan

Nacl 0,2%

1mM EDTA

Nacl 0,9%

STE (Sodium-Tris-EDTA)

Proteinase K (10 mg/ml)

10% SDS

5M Nacl

Kloroform iso Amil Alkohol

Fenol

Etanol Absolut

TE

Primer D1S548 dan D3S1768

D.Prosedur Penelitian

Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah monyet ekor panjang,

yang berada di 2 titik pengamatan. Titik A terdiri dari 2 jantan dan 20 betina dantitik B terdiri dari 2 jantan dan 12 betina. Monyet ekor panjang disedasi dengan

Ketamin HCl 10-15 mg/kg bobot badan, darah diambil melalui vena femoralis

dengan alat suntik 3,5 ml, kemudian disimpan dalam tabung EDTA

(Ethylenediaminetetraacetic Acid). Darah disentrifugasi pada kecepatan 3.500

rpm selama 10 menit dan akan terbentuk tiga lapisan plasma, buffy coat (sel

darah putih) dan sel darah merah.

Analisis ragam. Sampel yang digunakan untuk analisis keragaman, berasal dari

4 jantan dan 32 betina dari titik A dan B.

Ekstraksi DNA. DNA diekstraksi dari buffy coat, dengan mengacu pada metodepenelitian yang digunakan oleh Kan et al. (1997) dengan beberapa modifikasi.


7/9

Buffy coat yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml, kemudian

dicuci dengan Nacl 0,2% dan 1mM EDTA lalu dikocok hingga tercampur merata

tanpa ada endapan di dasar tabung lagi. Setelah itu disentrifugasi dengan

kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit. Pencucian dilanjutkan yaitu dengan

memasukkan NaCl 0,9% dan 1mM EDTA ke dalam tabung dan diputar kembalidengan kecepatan 3.500 rpm selama 10 menit. Sel darah putih yang sudah dicuci,

ditambah 300 l 1x STE (Sodium Tris-EDTA), 20 l Proteinase K (10 mg/ml)

dan 40 l 10% SDS (Sodiumdodesilsulfate). Campuran ini dikocok pelan-pelan

selama 2 jam pada suhu 55C. DNA dimurnikan dengan metode fenol-kloroform,

yaitu dengan menambahkan 40 l 5M NaCl, 450 l kloroform iso amil alkohol

(24:1) dan 450 l fenol (saturasi dengan 1M Tris-HCl, pH 8.0), kemudian diputar

perlahan pada suhu 27C menggunakan rotator selama satu jam. Proses ekstraksi

dilanjutkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama 10 menit.

DNA dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 40 l 5M NaCl dan

800 l etanol absolut yang berfungsi untuk mengendapkan DNA. Campuran

diinkubasi selama semalam minimal tiga jam pada suhu -20C. Pada endapanyang dihasilkan dilakukan pencucian dengan menambahkan 800 l 70% etanol,

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm selama 10 menit, setelah itu

etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum. DNA

kemudian dilarutkan dengan 80 l 80% larutan penyangga TE (10-2 M Tris, 10-

3M EDTA pH 8.0).

Amplifikasi Mikrosatelit. Suhu annealing untuk primer D1S548 dan D3S1768

sebesar 50 C, suhu annealing untuk primer D5S820 adalah 55 C, dan untuk

primer D12S1777 sebesar 48 C. Amplifikasi lokus mikrosatelit menggunakan

empat pasang primer manusia dengan motif tetranukleotida. Primer ini sudah

digunakan pada penelitian sebelumnya pada monyet ekor panjang (Perwitasari-Farajallah et al. 2004). Reaksi PCR dilakukan menurut Sambrook et al. (1989)

yang telah dimodifikasi yaitu melakukan pencampuran yang merata dengan

volume reaksi 25 l, yang terdiri dari campuran Green Master Mix (Promega)

12,5 l, pasangan primer 1 l (pengenceran 1000 Pmol/ l), air steril 5,5 l dan 5

l template DNA. Amplifikasi mikrosatelit DNA dilakukan dengan mesin Gene

Amp PCR System 9700 (Applied Biosystem). Siklus amplifikasi sebanyak 30

siklus; dengan kondisi : denaturasi selama 40 detik pada suhu 94 C, penempelan

primer pada suhu 50-55 C selama 50 detik, dan pemanjangan pada suhu 71 C

selama 60 detik, kemudian diikuti dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 C

selama 5 menit. Untuk penentuan alel, hasil amplifikasi dipisahkan secara

elektroforesis dengan gel poliakrilamid 15% pada voltase 160 V selama 35 menit.Pita dimunculkan dengan pewarnaan perak dan ukuran alel dihitung dengan

menggunakan ukuran standar DNA 100 pb (Promega).

Analisis Paternitas. Sampel yang digunakan untuk analisis, berasal dari titik A

yaitu 2 jantan dan 10 ekor betina (serta anakannya) dan titik B berasal dari 2

jantan dan 11 ekor betina (serta anakannya). Betina yang lain tidak dianalisis,

karena anakan tidak diketahui (sampel tidak ada). Identifikasi paternitas diketahui

melalui alel yang diwariskan dari induk kepada anak, yang ditentukan berdasarkan

migrasi pita dari setiap lokus.


8/9

Daftar Rujukan

Anggraeni, N., Ayuningsih, E.D., Farajallah, D.P., Pamungkas, J. 2009. Analisis

DNA Mikrosatelit untuk Identifikasi Paternitas pada Beruk (Macaca

nemestrina) di Penangkaran Pusat Studi Satwa Primata IPB. JurnalPrimatologi Indonesia, 6 (2): 32-39

Chambers EK, Reichard UH, Moller A, Nowak K, Vigilant L. 2004. Cross-

Species Amplification of Human Microsatellite using Noninvasive Samples

from White-Handed Gibbons (Hylobates lar). American Journal of

Primatology, 64:19-27

Fuentes, A., Garmel S. 2005.Dispropotionte participation by age/sex clases in

aggresive interaction between long-tailed macaque (macaca fascicularis)

and human tourist at padangtegal monkey forest, Bali, Indonesia: Brief

Report. America Journal of Primatology, 66: 197-204.

Hernanda, P.Y. Tanpa tahun.Pap Smear dengan Analisa DNA Fingerprintingnya

sebagai Alat untuk Tes Paternitas saat Prenatal. Fakultas Kedokteran

Universitas Wijaya Kusuma, Surabaya

Kanthaswamy, S et al. 2006. Microsatellite markers for standardized genetic

management of captive colonies of rhesus macaques (Macaca mulatta).

American Journal of Primatology. 68:73-95

Monica, S.W., Widyastuti, S.K., & Wandia, I.N. 2012. Keragaman Genetik

Populasi Monyet Ekor Panjang di Pura Pulaki menggunakan Marka

Molekul Mikrosatelit D13s76. Jurnal Indonesia Medicus Veterinus, 1(1): 37-

54

Muladno. 2000. Polimorfisme dan analisis keterpautan mikrosatelit pada genom

babi. Jurnal Hayati, 7(1): 11-15Putra, 1.G.A., Wandia, I. N., Soma, I.G., Sajuthi, D. 2006. Indeks Massa Tubuh

dan Morfometri Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) di Bali. Jurnal

Veterinus 7(3): 119-124

Rumba, J. N., Putra, I.G.A.A., & Wanida, I.N. 2013. Karakteristik Lokus

Mikrosatelit D8S1100 pada Populasi Monyet Ekor Panjang di Bukit

Gumang, Karangasem, Bali. Jurnal Indonesia Medicus Veterinus, 2(1): 115-

125

Santosa, Yanto. 1996. Beberapa Parameter Bio-Ekologi Penting dalam

Pengusahaan Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis). Jurnal Media

Konservasi V(1): 25-29

Smith DG, Kanthasmawy S, Viary J, Cody L. 2000. Additional highlypolymorphic microsatellite (STR) loci for estimating kinship in Rhesus

Macaques (Macaca mulatta). American Journal of Primatology, 50: 1-7

Supriatna, J., E.H. Wahyono. 2000. Panduan Lapangan Primata Indonesia.

Yayasan Obor Indonesia, Jakarta

Wandia, I.N. 2003. Mikrosatelit sebagai Penanda molekul untuk mengukur

polimorfisme genetik monyet ekor panjang di Sangeh, Bali. J. Vet. Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Udayana, 4(3):93-100

Wandia, I.N. 2007. Struktur dan Keragaman Genetik Populasi Lokal Monyet

Ekor Panjang (Macaca fascicularis) di Jawa Timur, Bali, dan Lombok.

Disertasi. PRM. IPB. Bogor


9/9

ANALISIS DNA MIKROSATELIT UNTUK IDENTIFIKASI PATERNITAS PADA MONYET EKOR PANJANG.docx

Documents

Transcript of ANALISIS DNA MIKROSATELIT UNTUK IDENTIFIKASI PATERNITAS PADA MONYET EKOR PANJANG.docx