Analisis dengan Imunokimia

Fairul MuflihahFakultas FarmasiUniversitas Mulawarman

Analisis Imunokimia

Imuno (Basis : Sistem Imun Mammalia)

Kimia (Basis : Reaksi Kimia)

Analisis ImunokimiaAnalisis berdasarkan reaksi

spesifik antara Antigen (Ag) dan Antibodi (Ab)

Analisis kualitatif dan kuantitatif

Penggunaan senyawa “label” untuk visualisasi reaksi

Apakah Antigen dan Antibodi itu???

Reaksi spesifik antara Antigen (Ag) danAntibodi (Ab)

Ab dibentuk berdasarkan Ag yang menginduksinya

Antigen (antibody generator)

Imunogenik : Senyawa yang dapat memicu sistem imun mamalia

Antigenik : Senyawa yang dapat bereaksi spesifik dengan antibodi

Syarat : BM tinggi (> 5000), struktur kimia kompleks. (Bila BM rendah dapat dikonjugasi dengan protein carrier agar bersifat imunogenik)

Bahan yang dapat dianalisis(sebagai Antigen) dengan metodeimunokimiaMikroba patogen dan atau toksin

mikrobaToksin tanamanProtein spesifik atau senyawa lain

yang berstruktur spesifikSenyawa obat (narkotik, psikotropik)Senyawa pestisida

AntibodiHasil reaksi humoral sel B dalam

limpa mamaliaSpesifik terhadap antigen yang

memicunyaImunoglobulin: IgA, IgD, IgM, IgE,

IgG.

Struktur IgG dan IgM

Prinsip Reaksi

Reaksi Imunologi di dalam mamalia:

Visualisasi Reaksi Ag-Ab

Senyawa “Label”Senyawa yang dikonjugasi pada

antigen atau antibodi untuk dapat memvisualisasi reaksi Ag-Ab

Dapat berupa enzim, senyawa berfluoresensi, radioaktif, dll.

Reaksi amplifikasi dapat dilakukan sehingga dapat diukur secara fisikokimia.

Beberapa contoh “Label”

Metode analisis berbasis imunokimiaImunopresipitasiImunoaglutinasiImunokimia berlabel

Metode Analisis Imunokimia Berdasarkan Labelnya

Bahan yang diperlukan dalam reaksi Ag-Ab dalam analisis imunokimia

Larutan antibodi B (anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu Label (misalnya suatu Enzim) ditambahkan sehingga akan membentuk kompleks A-B-C-Enz.

Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan kedalam sumur pelat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama waktu tertentu pula (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang digunakan), lalu ditambahkan larutan pem”blok” untuk menghindari ikatan non-spesifik

Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil pada saat pengukuran.

Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalammenggunakan kit pereaksi imunokimia:Apakah kit tersebut dilengkapi dengan

brosur/booklet yang lengkap tentang metode analisis yang digunakan?

Apakah sudah ada parameter evaluasi dan validasi yang dilakukan?

Mengevaluasi sumber-sumber kesalahan yang mungkin terjadi

Seleksi awal kit pereaksi: pada tahap ini perlu dilakukan evaluasi terhadap kurva standar dan apakah ada reduksi data yang dilakukan

Parameter evaluasi: akurasi, presisi, sensitivitas, selektifitas, spesifisitas.

Memahami prosedur percobaan: Efek matriks, perolehan kembali, reaksi silang, pengaruh dan penanganan sampel, modifikasi prosedur, modifikasi teknik assay.

Pengembangan data validasi : rentang normal, uji terhadap kondisi abnormal, stimulasi, supresi, rentang QC

Sumber Kesalahan dalam Analisis Imunokimia

Kesalahan Acak Pipeting: masalah desain pipet itu sendiri, cara

menggunakan dan hal teknis dalam penggunaan pipet (volume yang dikeluarkan, dll)

Pemisahan padatan dari cairan : proses pembentukan endapan yang tergantung pada waktu, kecepatan, suhu, dll, pencucian yang tidak sempurna, dll.

Kondisi reaksi biokimia : kosntanta kesetimbangan antibodi, waktu, suhu

Jumlah radioaktif: untuk proses RIA Intensitas fluoresensi yang terjadi : untuk proses IFA Kesalahan spektofotometrik Stabilitas perekasi

Kesalahan Sistem