TUGAS AKHIR – SB141510

AKTIVITAS SENYAWA ALKALOID SA2014 DARI SPONS LAUT Cinachyrella anomala TERHADAP PROTEIN p53 KANKER PAYUDARA T47D MENGGUNAKAN DOCKING MOLEKULER FITRI LIANINGSIH 1512100011

Dosen Pembimbing Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2016

TUGAS AKHIR – SB141510

AKTIVITAS SENYAWA ALKALOID SA2014 DARI SPONS LAUT Cinachyrella anomala TERHADAP PROTEIN p53 KANKER PAYUDARA T47D MENGGUNAKAN DOCKING MOLEKULER FITRI LIANINGSIH 1512100011

Dosen Pembimbing Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2016

FINAL PROJECT – SB141510

ACTIVATED ALKALOID COMPOUND SA2014 OF MARINE SPONGE Cinachyrella anomala AGAINST p53 PROTEIN T47D BREAST CANCER USING MOLEKULAR DOCKING FITRI LIANINGSIH 1512100011

Advisor Lecturer Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si

BIOLOGY DEPARTMENT Faculty of Mathematic and Natural Sciences Institute Technology Sepuluh Nopember Surabaya 2016

LEMBARPENGESAHANLAPORAN TUGAS AKIIIR

AKTIVTTAS SENYAWA ALKAI,JOID SA2O14 I}ARISPONS LAUT Cinachyrella anomala TERIIADAPPROIEIN p53 KANKER PAYUDARA T47DMENGGUNAKAN DOCKING MOLEKULER

Oleh:

FTTRI LIAI{INGSIHr\RP. 1s12 100 011

Disefujui oleh pembimbing Tuges Akhir:

Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati" M.Si.

(r- {..\

ffiq4t$fll s 3

#f,

fit[3H',r",+f/ffff?iS

199802 2 001

vii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, rasa syukur dipanjatkan kehadirat Allah

SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga

penulis dapat menyelesaikan penyusunan laporan Tugas Akhir

dengan judul Aktivitas Senyawa Alkaloid SA2014 Dari Spons

Laut Cinachyrella anomala Terhadap Protein p53 Kanker

Payudara T47D Menggunakan Docking Molekuler. Penelitian

ini dilakukan pada bulan Februari - April 2016. Penyusunan

laporan Tugas Akhir ini merupakan persyaratan untuk

memperoleh gelar kesarjanaan strata 1 (S1) pada Jurusan

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya. Penyusunan laporan Tugas Akhir ini tidak lepas dari

bimbingan berbagai pihak. Penulis mengucapkan terima kasih

kepada para pihak yang membantu terselesaikannya laporan

Tugas Akhir ini, yaitu Ibu Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si

selaku pembimbing serta tim penguji Dr.rer.nat. Edwin Setiawan,

M.Sc, dan Aunurohim, DEA. Penulis juga mengucapkan terima

kasih kepada orangtua, saudara, dan teman-teman seperjuangan

angkatan 2012 yang telah memberikan dukungan baik moril

maupun materil.

Penulis menyadari bahwa penulisan laporan Tugas Akhir ini

masih memiliki banyak kekurangan. Namun, besar harapan

penulis agar laporan ini dapat bermanfaat.

Surabaya, 7 Juni 2016

Fitri Lianingsih

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN ....................................... ii

ABSTRAK .................................................................... iii

ABSTRACT .................................................................... v

KATA PENGANTAR ................................................... vii

DAFTAR ISI ................................................................. ix

DAFTAR TABEL ......................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................. xvii

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ........................................................ 1

1.2 Rumusan Permasalahan ........................................... 5

1.3 Batasan Masalah ...................................................... 5

1.4 Tujuan ..................................................................... 5

1.5 Manfaat ................................................................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kanker ..................................................................... 7

2.2 Kanker Payudara ...................................................... 9

2.3 p53 (Tumor Protein 53) ........................................... 12

2.4 Respon Protein p53................................................ 18

2.4.1 Aktivasi Protein p53 ........................................... 18

2.4.2 Induksi Terhadap Ketahanan Siklus Sel ............. 21

2.4.3 Perbaikan DNA dan Apoptosis ........................... 21

2.5 Kemoterapi dan Efek Sampingnya ......................... 24

2.6 Spons Cinachyrella anomala ................................... 28

2.7 Simbiosis Spons dan Mikroba .................................. 30

2.8 Docking molekuler ................................................... 33

2.9 Docking PLANTS .................................................... 36

BAB III METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian .................................. 39

3.2 Alat dan Bahan ......................................................... 39

x

3.3 Metode yang Digunakan .......................................... 39

3.3.1 Pengambilan Data .............................................. 39

3.3.2 Docking Molekuler ........................................... 40

3.3.2.1 Preparasi Database Protein ........................ 40

3.3.2.2 Preparasi Database Ligan .......................... 41

3.3.2.3 Input File Konfigurasi ................................ 41

3.3.2.4 Simulasi Program Docking PLANTS ......... 41

3.3.2.5 Evaluasi dan Interpretasi Hasil ................... 41

3.3.3 Visualisasi Hasil Docking ................................. 43

3.3.3.1 Visualisasi Asam Amino menggunakan

YASARA .................................................. 43

3.3.3.2 Visualisasi Jarak Ikatan Ligan dan

Protein menggunakan VMD……................ 43

3.3.4 Rancangan Penelitian dan Analisa Data ………. 44

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Struktur Protein Target ................................................. 47

4.2 Hasil Docking Ligan dan Protein Target....................... 48

4.3 Validasi Hasil Docking Ligan dan Protein Target ......... 49

4.4 Visualisasi Hasil Docking Menggunakan YASARA ..... 51

4.4.1 Visualisasi Hasil Docking SA2014 dan Protein .......... 51

4.4.2 Visualisasi Hasil Docking Doxorubicin dan Protein p53

....................................................................................... 53

4.5 Analisa Visualisasi Asam Amino pada p53 ................... 57

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan ................................................................... 63

5.2 Saran.............................................................................. 63

DAFTAR PUSTAKA ......................................................... 65

LAMPIRAN ....................................................................... 83

xi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1.1

Contoh beberapa gen penekan

tumor lokasi, fungsi, jenis

mutasi dan gejala yang terlibat

dalam kanker

manusia……………………..

15

Tabel 1.2

Nilai dari skor docking

……………………………….

44

Tabel 1.3

Hasil seleksi docking

……………………………….

45

Tabel 1.4 Hasil dari skor docking ligan

dan protein p53

……………………………….

49

Tabel 1.5

Hasil seleksi docking Ligan

dan Protein p53

……………………………….

49

Tabel 1.6

Jenis Asam Amino pada

Interaksi p53 dan senyawa

alkaloid SA2014

……………………………….

57

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Sifat kanker……………………………… 8

Gambar 2.2 Domain fungsional pada gen p53 terdiri

atas domain N‐terminal, domain central

core dan domain c terminal

………………………….................... 12

Gambar 2.3 Representasi skematik molekul

p53…………………......................... 13

Gambar 2.4 Struktur tiga dimensi p53 tumor

supresor kompleks dengan

DNA………………………………….. 15

Gambar 2.5 Jalur pada p53 dihubungkan dengan

Mdm2 ketika terjadi kerusakan

DNA………………………………… 17

Gambar 2.6 Model mekanisme protein p53 pada

tumor ……………..…….…………... 18

Gambar 2.7 Berbagai jalur dalam regulasi AMPK

yang dapat memodulasi proliferasi sel

…………………..................................... 20

Gambar 2.8 Mekanisme apoptosis…………………. 24

xiv

Gambar 2.9 Struktur doxorubicin…………………. 26

Gambar 2.10 Karakteristik spons laut Cinachyrella

sp. …………………………………….

28

Gambar 2.11

Struktur kimia senyawa dari spons laut

C.anomala……………………………..

25

Gambar 2.12

Model produksi metabolit sekunder

melalui simbiosis spons dengan

mikroba………..……………………… 32

Gambar 2.13 Filosofi docking …...…………………. 29

Gambar 2.14 Penambatan molekul…………………. 36

Gambar 3.1 Hasil docking yang benar dan salah….. 42

Gambar 3.2

Contoh hasil visualisasi docking…….. 45

Gambar 4.1 Struktur tiga dimensi MDM2 berikatan

dengan domain transaktivasi pada p53.. 47

Gambar 4.2a Hasil RMSD senyawa hasil docking

dengan referensinya………………….. 50

Gambar 4.2b

Perbesaran hasil RMSD senyawa hasil

docking dengan nilai 1.0300A………. 50

xv

Gambar 4.3A Visualisasi hasil docking SA2014 dan

protein p53 menggunakan YASARA

tampak depan…………………………. 51

Gambar 4.3B Visualisasi hasil docking SA2014 dan

protein p53 menggunakan YASARA

tampak samping……………………… 51

Gambar 4.3C Visualisasi hasil docking SA2014 dan

protein p53 menggunakan YASARA

tampak belakang……………………… 52

Gambar 4.3D Visualisasi asam amino pada SA2014

dan protein p53 menggunakan

YASARA…………………………….. 52

Gambar 4.3E Visualisasi asam amino pada SA2014

dan Protein p53 menggunakan

YASARA jika diperbesar……………. 53

Gambar 4.3F

Visualisasi struktur ligan SA2014

menggunakan Marvin

Space………………………………….. 53

Gambar 4.4A Visualisasi hasil docking doxorubicin

dan protein p53 menggunakan

YASARA tampak depan…………….. 54

Gambar 4.4B Visualisasi hasil docking doxorubicin

dan protein p53 menggunakan

YASARA tampak samping…………… 54

xvi

Gambar 4.4C Visualisasi hasil docking doxorubicin

dan protein p53 menggunakan

YASARA tampak belakang…………. 55

Gambar 4.4D

Visualisasi asam amino pada

doxorubicin dan protein p53

menggunakan YASARA……………. 55

Gambar 4.4E Visualisasi asam amino pada

doxorubicin dan Protein p53

menggunakan YASARA jika

diperbesar……………………………. 56

Gambar 4.4F

Visualisasi struktur ligan doxorubicin

menggunakan Marvin

Space…………………………………. 56

Gambar 4.5 Hasil visualisasi jarak asam amino

disekitar ligan menggunakan VMD…

58

Gambar 4.6

Struktur fenilalanin……………………

59

Gambar 4.7

Struktur leusin………………………...

61

Gambar 4.8

Struktur senyawa alkaloid SA2014…...

61

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1

Prosedur docking menggunakan

PLANTS………………………

83

Lampiran 2

Biodata penulis..........................

97

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Siklus sel merupakan proses penting dalam kehidupan

setiap organisme karena berperan pada pembelahan sel. Secara

normal, siklus sel terdiri atas dua proses utama yaitu mitosis/M

(pembelahan satu sel menjadi dua sel) dan interfase, yang terdiri

atas fase gap 1 (G1), sintesis DNA (S) dan gap 2 (G2) (Alberts, et

al., 2008). Siklus sel dikontrol oleh sejumlah gen dan apabila

salah satu gen tersebut mengalami perubahan fungsi maka akan

berpengaruh pada seluruh sistem. Akibatnya, sel normal

membutuhkan sejumlah mekanisme intrinsik yang melibatkan

“gatekeeper” molekuler untuk menghindarkan diri dari

pembelahan yang tidak terkontrol. Pembentukan dan

perkembangan tumor terjadi jika protein khusus yang mengatur

pembelahan sel mengalami perubahan fungsi, ekspresi gen atau

hilang kedua-duanya. Salah satu protein yang berhubungan erat

dengan pengendalian siklus sel adalah p53 (Syaifuddin, 2010).

p53 merupakan faktor transkripsi (protein regulator)

yang mempunyai berat molekul 53 kilodalton (kD) dan pertama

kali ditemukan pada tahun 1979 (Lane & Crawford, 1979 dalam

Syaifuddin, 2010). p53 yang berfungsi normal akan mengontrol

siklus sel dan induksi apoptosis (Agarwal, et al., 1995).

Kehilangan fungsi p53 akan mengakibatkan proliferasi tidak

terkendali dan menimbulkan kanker. Mutasi p53 merupakan

perubahan genetik dengan frekuensi lebih dari 50% pada kanker

manusia (Bai & Wei, 2006). Pasien dengan mutasi p53 memiliki

ketahanan yang buruk dibandingkan dengan pasien yang tidak

memiliki mutasi p53 (Olivier, et al., 2006; Sjogren, et al., 1996).

Mutasi pada p53 terlibat pada proses pembentukan kanker

payudara (Hanahan, et al., 2011; Solomon, et al., 2011 dalam

Walerych, et al., 2012).

Kanker payudara merupakan penyakit kompleks yang

disebabkan oleh pertumbuhan abnormal dan proliferasi sel yang

2

tidak terkontrol pada bagian duktus terminal dan lobular pada

payudara (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast

Cancer, 1996). Menurut World Health Organization (WHO),

kanker merupakan salah satu penyebab kematian didunia dengan

setiap tahun jumlah penderita kanker di dunia bertambah 7,9 juta

orang pada tahun 2007 dan jumlah ini akan bertambah 80 juta

setiap tahunnya (Maxwell, 2000). Kanker payudara merupakan

penyebab maligna pada wanita yang melibatkan satu juta pasien

setiap tahunnya mencakup sekitar 10% dari semua kanker dan

23% kanker wanita di negara berkembang (Coley, 2008). Pada

tahun 2014, Berdasarkan Sistem Informasi RS (SIRS), jumlah

pasien rawat jalan maupun rawat inap pada kanker payudara

terbanyak yaitu 12.014 orang (28,7%) dan kanker serviks 5.349

orang (12,8%) (Anonim1, 2014). Hal tersebut menunjukkan

bahwa kanker payudara tergolong jenis kanker yang

membahayakan. Pengobatan kanker umumnya menggunakan kemoterapi,

yaitu membunuh sel-sel kanker, mengontrol pertumbuhan sel

kanker, menghentikan pertumbuhannya agar tidak menyebar dan

mengurangi gejala-gejala yang disebabkan oleh kanker.

Kemoterapi terkadang merupakan pilihan pertama untuk

menangani kanker namun menimbulkan efek samping antara lain

terjadinya penurunan jumlah sel-sel darah, infeksi, anemia,

pendarahan seperti mimisan, rambut rontok, kadang muncul

keluhan seperti kulit gatal dan kering, mual dan muntah, dehidrasi

dan tekanan darah rendah, sembelit/konstipasi, diare dan

gangguan sistem syaraf (Siswandono, 2000). Tingginya efek

samping dari kemoterapi disebabkan obat yang dipergunakan

masih belum mempunyai mekanisme yang spesifik terhadap sel

kanker saja, tetapi obat tersebut juga menyerang sel-sel normal.

Obat kanker umumnya berfungsi menghambat proliferasi sel

tanpa mematikan sel kanker dan bersifat multidrug resistance

(MDR) atau tahan terhadap berbagai obat kanker (William &

Andersen, 2006). Riset untuk mendapatkan kandidat potensial

obat antikanker baru sangat diperlukan untuk menjawab

3

permasalahan tersebut. Obat antikanker yang sedikit

menimbulkan efek samping dan memiliki target bioaktif spesifik

umumnya diperoleh dari alam (Iwamaru, et al., 2007). Salah

satunya adalah spons laut.

Spons sebagai salah satu organisme bentik yang telah

diketahui memiliki kandungan senyawa bioaktif yang paling luas

dan paling banyak mendapat perhatian para peneliti dibandingkan

invertebrata laut lainnya yang telah diteliti. Menurut Jha dan Zi-

Rong (2004), spons merupakan kontributor terbesar senyawa

bioaktif dari laut jika dibandingkan dengan biota laut lainnya

yaitu 37%, disusul coelenterata (21%), mikroorganisme (18%),

alga (9%), echinodermata dan tunikata masing-masing (6%),

moluska (2%) dan bryozoa (1%). Spons merupakan biota sesil,

sehingga tidak dapat menghindari serangan predator dengan

berpindah tempat sehingga spons mempunyai mekanisme

pertahanan secara kimiawi. Mekanisme pertahanan kimiawi

dilakukan dengan cara menghasilkan senyawa bioaktif (Joseph &

Sujatha, 2011). Senyawa bioaktif tersebut antara lain alkaloid,

steroid, dan terpene (Sjogren, 2006). Senyawa bioaktif tersebut

diisolasi dan dimurnikan kemudian secara terpisah dilakukan

sintesis secara kimia sehingga organisme bentik penghasil

senyawa bioaktif tidak dieksploitasi secara berlebihan (Sukandar,

2014). Beberapa senyawa bioaktif ini bersifat antivirus, antijamur,

antimikroba, antiinflamasi, antitumor, dan sitotoksik (Joseph &

Sujatha, 2011). Spons juga memiliki potensi farmakologis

(Faulkner, 2001).

Cinachyrella anomala merupakan spons laut yang tergolong

kelas Demospongiae, ordo Tetractinellida, dan familia Tetillidae

(Cardenas, 2015). C. anomala merupakan spons laut yang

melimpah ditemukan di perairan Indonesia. Organisme bentik ini

memiliki kadar metabolit sekunder lebih tinggi dibanding zat

metabolit sekunder pada tanaman. Tingginya zat metabolit

sekunder tersebut dapat digunakan sebagai alternatif pengobatan

kanker.

4

Beberapa penelitian yang pernah dilakukan antara lain

Shimogawa, et al. (2006) berhasil mengisolasi senyawa

Cinachyramine dari spons genus Cinachyrella sp. dari perairan

Okinawa, Jepang. Penelitian yang telah dilakukan Machida, et al.

(2014) berhasil mengidentifikasi senyawa Cinanthrenol A dari

spons Cinachyrella sp. dan diketahui pula aktivitas biologinya.

Komponen alkaloid dari Cinachyrella sp.telah diisolasi dan

diidentifikasi dari kelompok derivat cinachyramine dengan

formula molekular dan nama struktur 4,9 triaza

tricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol (SA2014)

(Nurhayati, et al., 2014). Uji sitotoksik dan antiproliferasi spons

laut Cinachyrella sp. dapat menghambat proliferasi sel T47D

lebih baik dibandingkan pada sel Hela, Widr dan Vero

(Nurhayati, et al., 2014). Komponen1,4,9-

triazatricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol (SA2014) yang

telah diisolasi dari spons laut C.anomala memiliki mekanisme

seluler melawan sel T47D (Nurhayati, et al., 2015).

Senyawa bioaktif spons C. anomala berpotensi sebagai

obat kanker. Obat yang ditargetkan diharapkan merupakan

treatment yang lebih baik melalui interaksi protein-ligan yang

penting untuk mendesign obat. Biologi komputasi dan

bioinformatika memiliki potensi untuk mempermudah proses

penemuan obat serta membantu mengidentifikasi metode yang

bervariasi untuk identifikasi komponen obat. Salah satu metode

yang digunakan adalah docking molekul obat dengan reseptor

(target). Studi interaksi protein-ligan melalui metode komputasi

membantu mengetahui struktur berdasarkan desain obat (Lyskov,

et al., 2008). Penelitian docking molekuler antara senyawa

alkaloid SA2014 dari C. anomala terhadap p53 kanker payudara

T47D belum pernah dilakukan. Metode docking molekuler membantu mengetahui ikatan

molekul yang stabil dengan energi minimum pada target protein

p53 dan senyawa alkaloid SA2014 dari spons laut C. anomala.

Penelitian ini penting dilakukan sebagai salah satu metode untuk

mendesain obat yang sesuai dengan pasien kanker payudara

5

T47D akibat mutasi p53 dan berpotensi menambah informasi dari

manfaat bahan alam laut, khususnya spons C. anomala di

Indonesia.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada penelitian ini adalah sebagai

berikut:

a. Bagaimana skor docking senyawa alkaloid SA2014 dari

spons laut C.anomala terhadap protein p53.

b. Bagaimana peran asam amino pada interaksi senyawa

alkaloid SA2014 dari spons laut C.anomala terhadap

protein p53 kanker payudara T47D.

1.3 Batasan Masalah

Batasan masalah pada penelitian ini adalah sebagai

berikut:

a. Skor docking senyawa alkaloid SA2014 dari spons laut

C.anomala dibandingkan dengan skor docking

doxorubicin terhadap protein p53 menggunakan software

PLANTS.

b. Jarak ikatan asam amino pada interaksi senyawa alkaloid

SA 2014 terhadap protein p53 menggunakan software

VMD.

1.4 Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui skor docking

senyawa SA2014 terhadap protein p53 dan asam amino yang

berperan pada ikatannya.

1.5 Manfaat

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

mengenai potensi bahan alam laut di Indonesia untuk desain obat

yang efektif mengobati kanker payudara.

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kanker

Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh

kehilangan fungsi kontrol regulasi siklus sel dan homeostatis.

Akibatnya, sel akan berproliferasi dengan pertumbuhan jaringan

abnormal (Ullah & Aatif, 2009). Sel-sel kanker akan berkembang

dengan cepat, tidak terkendali, dan akan terus membelah diri,

selanjutnya menyusup ke jaringan sekitarnya (invasive) dan terus

menyebar melalui jaringan ikat, darah dan menyerang organ-

organ penting serta syaraf tulang belakang. Sel hanya akan

membelah diri untuk mengganti sel-sel yang telah mati dan rusak

dalam keadaan normal, sebaliknya sel kanker mengalami

pembelahan secara terus menerus meskipun tubuh tidak

memerlukannya sehingga terjadi penumpukan sel baru yang

disebut tumor ganas. Penumpukan sel akan mendesak dan

merusak jaringan normal sehingga mengganggu organ yang

ditempatinya. Kanker dapat terjadi di berbagai jaringan dalam

berbagai organ di setiap tubuh, mulai dari kaki sampai kepala.

Kanker yang terjadi di permukaan tubuh mudah diketahui dan

diobati sedangkan ketika kanker terjadi didalam tubuh, kanker

sulit diketahui dan kadang-kadang tidak memiliki gejala. Jika

timbul gejala biasanya sudah stadium lanjut sehingga sulit diobati

(Anonim2, 2006).

Sel kanker memiliki karakteristik yang unik, antara

lain sel kanker mampu melakukan proliferasi sendiri, dapat

melawan suppresor growth, mampu menembus jaringan yang

lain, tidak ada kematian sel (immortal), replikasi immortal, dan

induksi angiogenesis (pembentukan pembuluh darah baru)

(Hanahan, et al., 2011).

Kanker memiliki gen-gen yang berperan yaitu onkogen

dan protoonkogen. Onkogen adalah bentuk mutan dari proto-

onkogen (disebut juga gen-gen untuk pertumbuhan atau growth

promoting genes). Proto-onkogen mengkode protein seluler yang

8

merespon sinyal dari sel-sel lain dan membawanya ke inti sel,

untuk menstimulasi pertumbuhan. Proto-onkogen berfungsi

dalam pertumbuhan dan pembelahan sel-sel normal (Hunt, 1998).

Apabila proto-onkogen mengalami mutasi menjadi onkogen

(berasal dari bahasa Yunani “Oncos”yang berarti tumor) yang

bersifat karsinogen, akibatnya sel-sel mengalami multiplikasi

(penggandaan) secara berlebihan, karena gen-gen mutan ini tidak

bereaksi terhadap sinyal pengatur pertumbuhan (Does, et

al.,2007).

Gambar 2.1 Sifat kanker (Hanahan, et al., 2011)

Kanker secara garis besar dibagi menjadi dua kelompok,

yaitu kanker jinak dan kanker ganas. Kanker jinak (benign)

memiliki kecenderungan untuk tumbuh lebih lambat dari kanker

ganas dan tidak menyebar ke organ lain. Kanker ganas (malign)

memiliki pertumbuhan sel yang sangat cepat, dapat menginvasi

serta menghancurkan jaringan disekitarnya dan pada tahap

selanjutnya akan menyebar ke organ-organ lain (Lumongga,

2008). Kanker juga dapat diklasifikasikan berdasarkan jaringan

dan tipe sel tempat mereka tumbuh. Kanker yang tumbuh dari sel

epitel disebut karsinoma sedangkan kanker yang tumbuh pada

9

jaringan penghubung (connective) atau sel otot disebut sarcoma

(Alberts, et al., 1994).

Mekanisme kanker adalah mulanya, sel normal terdiri

atas ukuran yang sama, yang terorganisir dan semua lapisan sel

berada diatas membran basement. Membran tersebut membagi sel

berdasarkan tipe selnya untuk membentuk organ yang berbeda.

Sel normal yang mengalami mutasi akan tumbuh lebih cepat

daripada sel disekitarnya. Sel termutasi yang tumbuh lebih cepat

disebut dengan hyperproliferative cell. Akumulasi dari

hyperproliferative cells akan membentuk tumor benign kecil.

Tumor tersebut dikenal dengan adenoma. Jika adenoma diangkat,

penderita akan sembuh dan kanker tidak akan menyebar lebih

ganas. Jika adenoma belum terangkat seluruhnya dapat

mengakibatkan adenocarcinoma. Sel adenocarcinoma akan

terlepas dari membrane basement dan menyebar melalui

pembuluh darah dan mengalami metastasis. Sel kanker yang telah

mengalami metastasis disebut malign (Hunt,1998).

2.2 Kanker payudara

Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang

mempunyai prevalensi yang paling sering ditemukan di Indonesia

setelah kanker leher rahim. Data Badan Registrasi Kanker Ikatan

Ahli patologi Indonesia (BRK-IAPI) tahun 1994 menunjukkan

bahwa kanker payudara tetap menduduki peringkat ke-2 tertinggi

setelah keganasan pada wanita kanker leher rahim dengan angka

kejadian 17,1% dari keseluruhan kanker pada wanita. Namun,

baru- baru ini data melaporkan bahwa kanker payudara

menempati posisi pertama penyebab kematian terbesar di

Indonesia. Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) tahun 2004

jumlah kasus kanker payudara yang dilaporkan oleh rumah sakit

di Jawa Tengah adalah lebih tinggi dibanding kanker leher rahim,

jumlah kasus kanker payudara 3.593 (43,91%) dibanding kanker

leher rahim sebanyak 2.780 kasus (33,98%) (Anonim3, 2004).

Data Sistem Informasi Rumah Sakit (2010) menunjukkan bahwa

kasus rawat inap kanker payudara 12.014 kasus (28,7%), kanker

10

leher rahim 5.349 kasus (12,8%). Pada tahun 2014, Berdasarkan

Sistem Informasi RS (SIRS), jumlah pasien rawat jalan maupun

rawat inap pada kanker payudara terbanyak yaitu 12.014 orang

(28,7%) dan kanker serviks 5.349 orang (12,8%) (Anonim1,

2014). Hal tersebut menunjukkan bahwa kanker payudara

tergolong jenis kanker yang membahayakan. Kanker Payudara adalah tumor ganas yang menyerang

jaringan payudara yang berasal dari kelenjar, saluran kelenjar dan

jaringan penunjang payudara. Kanker payudara terjadi karena

adanya kerusakan gen yang mengatur pertumbuhan dan

diferensiasi sehingga sel ini tumbuh dan berproliferasi tanpa

dapat dikendalikan (Mardiana, 2004). Pada umumnya tumor pada

payudara bermula dari sel epitelial, sehingga kebanyakan kanker

payudara dikelompokkan sebagai karsinoma (keganasan tumor

epitelial) (Hondermarck, 2003).

Kanker payudara pada umumnya berupa ductal yang

invasif dengan pertumbuhan tidak terlalu cepat (Tambunan,

2003). Kanker payudara sebagian besar (sekitar 70%) ditandai

dengan adanya gumpalan yang biasanya terasa sakit pada

payudara, juga adanya tanda lain yang lebih jarang yang berupa

sakit pada bagian payudara, erosi, retraksi, pembesaran dan rasa

gatal pada bagian puting, juga secara keseluruhan timbul

kemerahan, pembesaran dan kemungkinan penyusutan payudara

(Bosman, 1999).

Salah satu model sel kanker payudara yang banyak

digunakan dalam penelitian adalah sel T47D. Sel kanker

payudara T47D merupakan continous cell lines yang

morfologinya seperti sel epitel yang diambil dari jaringan

payudara seorang wanita berumur 54 tahun yang terkena ductal

carcinoma. Sel ini dapat ditumbuhkan dengan media dasar

penumbuh RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640

(Anonim4, 2008) yang mengekspresikan ER-β (Zampieri, et al.,

2002) dibuktikan dengan adanya respon peningkatan proliferasi

sebagai akibat pemaparan 17β-estradiol (Verma, et al., 1998).

Sel diklasifikasikan sebagai sel yang mudah mengalami

11

diferensiasi karena memiliki reseptor estrogen + (Wozniak &

Keely, 2005). Sel ini sensitif terhadap doxorubicin (Zampieri, et

al., 2002) dan mengalami mutasi missense pada residu 194

(dalam DNA binding domain) gen p53. Mutasi missense

merupakan perubahan materi genetik yang mengakibatkan

penggantian satu kodon sense oleh kodon sense lainnya sehingga

mengubah asam amino yang dikodekan (Stansfield, et.al., 2006).

Jika p53 tidak dapat berikatan dengan element pada DNA,

kemampuannya untuk regulasi siklus sel dapat berkurang atau

hilang (Schafer, et al., 2000). Sel kanker dengan mutasi p53

diketahui terjadi pengurangan respon terhadap agen-agen yang

menginduksi apoptosis (kematian sel terprogram) dan kanker

tersebut kemungkinan menjadi resisten terhadap obat antikanker

yang memiliki target kerusakan DNA (Crawford, 2002).

Penyebab kanker payudara sangat beragam, tetapi ada

sejumlah faktor risiko yang dihubungkan dengan perkembangan

penyakit ini yaitu asap rokok, konsumsi alkohol, umur pada saat

menstruasi pertama, umur saat melahirkan pertama, lemak pada

makanan, dan sejarah keluarga tentang ada tidaknya anggota

keluarga yang menderita penyakit ini (Macdonald & Ford,1997).

Hormon juga memegang peranan penting dalam terjadinya

kanker payudara. Estradiol dan atau progesteron dalam daur

normal menstruasi meningkatkan resiko kanker payudara. Hal ini

terjadi pada kanker payudara yang memiliki reseptor estrogen.

Kasus kanker payudara dengan prevalensi 50% merupakan

kanker yang tergantung estrogen (Gibbs, 2000). Kompleks

estrogen dengan reseptornya juga akan memacu transkripsi gen

suppressor tumor, seperti p53 namun pada penderita kanker

payudara (yang umumnya telah lewat masa menopause) gen-gen

tersebut telah mengalami perubahan akibat dari hiperproliferasi

sel-sel payudara selama perkembangannya, sehingga tidak

berperan sebagaimana mestinya (Adelmann, et al., 2000; Clarke,

2000). Gen p53 secara normal menyandi protein dengan berat

molekul 53 kDa yang terlibat dalam kontrol pertumbuhan sel.

12

Mutasi yang terjadi pada gen ini dapat menyebabkan

pertumbuhan sel menjadi tidak terkontrol (Gondhowiarjo, 2004).

2.3 p53 (Tumor Protein 53)

p53 yang merupakan faktor transkripsi berada pada

kromosom manusia 17p13.1, terdiri dari 393 asam amino, 11

exon, dan mempunyai panjang 20 kilobasa. Gen penekan tumor

diperlukan untuk mempertahankan pembelahan sel tetap

terkontrol. Gen penekan tumor yang berfungsi normal akan

mengontrol siklus sel dan replikasi DNA, jika gen tersebut tidak

berfungsi dengan baik maka proliferasi sel tidak dapat terkendali

dan menimbulkan kanker. Gen penekan tumor tidak saja diyakini

sebagai protein yang diperlukan sebagai alat deteksi kerusakan

DNA, tetapi memiliki fungsi yang lebih luas setelah terjadinya

penekanan selular seperti aktivasi onkogen (Vousden, 2000). Gen

penekan tumor telah menjadi topik utama penelitian kanker

karena umumnya termutasi pada kanker manusia.

Gambar 2.2. Domain Fungsional pada Gen p53 terdiri atas domain

N‐terminal, domain Central core dan domain C terminal (Bai &

Wei, 2006).

13

Gambar 2.3 Representasi Skematik Molekul p53 (Syaifudin,

2010).

Menurut Bai & Wei (2006), p53 disebut juga TP53 (tumor

protein 53) merupakan protein yang memiliki 393‐residu

polipeptida. p53 memiliki tiga domain fungsional, yaitu:

1. Domain N‐terminal (residu 1‐94) terdiri atas domain

transaktivasi (1-42) dan domain kaya Prolin (residu 61‐94),

domain yang berperan dalam stabilitas p53 dengan ikatan

MDM2.

2. Domain central core, paling besar (residu 102‐292) melibatkan

ikatan DNA dan lokasi hampir semua mutasi p53 onkogenik.

3. Domain C terminal dasar (residu 324‐393) regulator terdiri atas

domain tetramer (324- 355) dan regulator (363- 393).

p53 mengikat DNA dalam bentuk yang spesifik untuk

menjalankan fungsinya sehingga memungkinkan p53

mengaktifkan transkripsi gen sasaran. Bagian tengah protein

tersebut (residu asam amino 102-292) adalah deret spesifik

daerah DNA-binding, umumnya mutasi p53 spontan berada pada

daerah ini dan secara langsung atau tidak langsung

mempengaruhi interaksi p53 dengan DNA. Residu asam amino

yang paling banyak mengalami mutasi berada pada atau dekat

14

antar-muka (interface) DNA-protein (Chen, et al.,1994). Mutasi

p53 memiliki frekuensi paling banyak pada domain terkonservasi

yaitu domain II, III, IV and V yang bertanggungjawab pada

residu asam amino 117-142 (ekson 4-5), 171-181 (ekson 5), 234-

258 (ekson 4) dan 270- 286 (ekson 8). Region terkonservasi pada

ekson 5-8 yang merupakan target dari mutasi p53 pada maligna

manusia (Nigro, 1989 dalam Makwane, 2009).

Menurut George (2011) fungsi seluler gen p53 antara

lain: 1.) p53 mencegah adanya transmisi dari informasi genetik

yang rusak dari generasi 1 sel ke sel berikutnya melalui ikatan

faktor transkripsi yang disebut E2F. 2.) Inisiasi apoptosis jika

kerusakan pada beberapa sel dan bekerja sebagai penanda

kerusakan pada pembentukan kanker dengan cara membunuh sel

yang berproliferasi. 3.) p53 berperan sebagai tumor suppressor:

mutasi pada p53 dapat menyebabkan sel menjadi berubah secara

onkogen (oncogenically transformed). 4.) p53 merupakan faktor

transkripsi dan sekali diaktivasi akan menekan transkripsi pada

satu set gen (beberapa untuk menstimulasi pertumbuhan sel). 5.)

Fungsi p53 penting untuk pengobatan banyak kanker dengan cara

membunuh sel sejak radioterapi dan kemoterapi berperan untuk

memperbaiki kerusakan DNA. Keberhasilan respon terapi ini

berkurang ketika p53 mengalami mutasi (mutan p53), sehingga

kanker sulit diobati.

15

Gambar 2.4 Struktur Tiga Dimensi MDM2 Berikatan dengan

Domain Transaktivasi pada Protein p53

(http://www.rcsb.org/pdb).

Tabel 1.1 Contoh beberapa Gen Penekan Tumor, Lokasi, Fungsi,

Jenis Mutasi dan Gejala yang Terlibat dalam Kanker Manusia

(Donehower, et al., 1992).

Gen p53 merupakan pelindung siklus sel. Bila sel

terluka, p53 dalam inti memicu sel untuk melakukan “arrest”

a

b

16

pada perbatasan G1/S dengan menginduksi penghambat CDK

(cyclin dependent kinase) dan sistem perbaikan DNA terlebih

dahulu menghilangkan luka tersebut sebelum sel memasuki fase

S tanpa adanya DNA yang terluka. Program “arrest”dan

apoptosis ini tergantung pada lingkungan fisiologik ataupun jenis

sel. Kehilangan fungsi gen p53 ini merupakan penyebab

munculnya malignansi (Parada, 1982 dalam Syaifuddin, 2010).

Penelitian membuktikan bahwa mutan p53 memperbesar proses

pembentukan tumor (Finlay et al., 1989; Lehman, et al., 1991;

Lowe, et al., 1993). p53 dalam bentuk aktif atau stabil mengkode

pengaktif transkripsi yang targetnya dapat meliputi gen-gen yang

mengatur kestabilan genomik. Contoh gen tersebut adalah

Murine double minute 2 (MDM2) (Grosovsky, et al., 1988).

Produk gen MDM2 berikatan dengan p53 dan

berlawanan dengan fungsi transaktivasi p53. Amplifikasi gen

MDM2 terjadi pada beberapa jenis kanker seperti payudara dan

leukemia. fungsi normal MDM2 adalah membatasi lamanya

“arrest” yang diinduksi oleh p53 (Lodish, et al., 2000).

Aktivitas p53 secara normal dalam kadar rendah karena

mudah didegradasi dan tidak stabil. Kadar p53 yang rendah

tersebut dikontrol oleh MDM2. Pada proses respon kerusakan

DNA dalam ketahanan G1 (pada gambar 3) dapat dijelaskan

sebagai berikut: aktivitas kinase diaktifkan oleh respon kerusakan

DNA akibat stress yang bervariasi (contohnya: panas, iradiasi

UV). Ataxia telangiectasia (ATM) serine kinase teraktivasi

kemudian menggerakkan tiga jalur yang berperan dalam

ketahanan G1: (1) Chk2 difosforilasi kemudian memfosforilasi

Cdc25, dan membuatnya terdegradasi dan menahan aktivasi

CDK2 (enzim yang berikatan dengan siklin E berperan dalam

checkpoint dan siklus sel).(2) jalur kedua, fosforilasi p53 akan

menstabilkannya sehingga p53 teraktivasi mengekspresikan gen

yang mengkode protein yang menyebabakan ketahanan G1,

memicu apoptosis dan perbaikan DNA. (3) jalur ketiga adalah

cara lain untuk mengontrol kelimpahan p53. Protein MDM2

dalam bentuk aktif dapat membentuk kompleks dengan p53,

17

menghambat faktor transkripsi dan menyebabkan ubiquitinasi

dan degradasi oleh proteosom. ATM memfosforilasi MDM2

untuk tidak mengaktifkannya, menyebabkan bertambahnya

stabilisasi p53. Level MDM2 dikontrol oleh P14ARF yang

berikatan dengan MDM2. Gen ini diinduksi oleh level yang

tinggi dari sinyal mitogenik yang secara frekuensi diteliti pada sel

yang membawa mutasi onkogen pada jalur sinyal faktor

pertumbuhan. Gen MDM2 pada manusia secara frekuensi

teramplifikasi pada sarcoma dan mengakibatkan inaktivasi p53

dan P14ARF juga ditemukan termutasi pada beberapa kanker

(Lodish, et al., 2000).

Gambar 2.5 Jalur pada p53 dihubungkan dengan MDM2 Ketika

Terjadi Kerusakan DNA (Lodish, et al., 2000).

Mekanisme inaktivasi gen p53 pada kanker payudara

dapat terjadi melalui 1) mutasi perubahan asam amino pada DNA

binding domain yang mengakibatkan p53 dihalangi dari binding

pada deret DNA spesifik dan mengaktifkan gen didekatnya. 2)

Delesi gen P14ARF sehingga mengakibatkan kegagalan

18

menghambat MDM2 dan menahan degradasi p53 untuk tetap

terkendali 3) Mis-lokasi p53 pada sitoplasma, diluar inti

mengakibatkan kegagalan fungsi p53 (Smith & Fornace,1996).

2.4 Respon Protein p53

2.4.1 Aktivasi Protein p53

Respon seluler yang ditimbulkan oleh p53 terhadap

mutasi atau kerusakan DNA melalui aktivasi p53, induksi

terhadap ketahanan siklus sel, perbaikan DNA dan apoptosis

(Reles, 2001; Bai & Zhu, 2006). Aktivasi dari p53 bergantung

induksinya (stress yang bervariasi dan kerusakan gen). Respon

p53 terhadap stress yang rendah dan tinggi berbeda. Respon p53

akibat stress yang rendah, p53 berperan sebagai “pelindung” yang

menghasilkan ketahanan siklus sel, menghambat pertumbuhan,

perbaikan DNA dan antioksidan. Respon tersebut mampu

mengembalikan sel akibat kerusakan yang diinduksi oleh stress.

Gambar 2.6 Model Mekanisme Protein p53 pada Tumor

(Vousden & Prives, 2009).

Ketika sel menerima stress yang tinggi, maka p53

berperan sebagai “pembunuh” yang menginduksi apoptosis atau

penuaan, mencegah proliferasi sel berlebih. Jika p53 salah

merespon sebagai “pelindung” ketika sel menerima stress tinggi,

19

maka sel tidak dapat diperbaiki, sel tetap mengalami kerusakan

dan berdampak menjadi kanker. Model mekanisme p53 pada

tumor ditunjukkan pada gambar 4.6 (Vousden & Prives, 2009).

Jalur yang berperan dalam perkembangan kanker dan

berhubungan dengan p53 terdiri atas tiga jalur, yaitu jalur AMPK,

PI3K dan mTOR.

1. Jalur AMPK

Protein AMP-kinase teraktivasi (AMPK) merupakan

kompleks kinase protein yang berperan dalam regulasi

homeostasis energi selular, mempertahankan, energi dan viabilitas

selular. AMPK diaktivasi pada keadaan stress seperti kekurangan

energi dan hipoksia. Aktivasi AMPK dapat positif atau negatif

terhadap pertumbuhan tumor tergantung pada konteks p53.

Apabila terdapat p53, AMPK menginduksi titik periksa siklus sel

metabolik yang pada proliferasi sel. Ketika tidak terdapat p53,

dibutuhkan inhibitor progresi tumor lain yang mampu berperan

sebagai pengganti p53 (Maddocks, 2011; Luo, et al., 2011;

Gottlieb, 2010).

Aktivasi AMPK telah dilaporkan dapat menekan proliferasi

pada berbagai tipe sel. Temuan-temuan ini mengindikasikan

bahwa sistem AMPK memainkan peranan penting dalam regulasi

proliferasi sel (Luo, et al., 2011; Fruman, et al., 2008). AMPK

dapat meregulasi berbagai variasi jalur sinyal yang berperan

dalam proliferasi sel (Gambar 4.7). AMPK dapat mempengaruhi

proliferasi sel, termasuk:

Inhibisi ACC yang menyebabkan supresi sintesis asam lemak;

Inhibisi reduktase HMG-CoA yang menyebabkan supresi

sinstesis mevalonat dan produk jalur sintesis kolesterol lainnya.

Inhibisi jalur mTOR sehingga menyebabkan hambatan

terhadap sintesis protein; dan

Inhibisi progresivitas siklus sel dengan aktivasi aksis p53-p21.

Saat ini belum ada data yang menyediakan cukup informasi untuk

menentukan seberapa banyak dan lama aktivasi AMPK dapat

berfungsi untuk menekan sintesis protein, asam lemak dan juga

20

DNA sehingga dibutuhkan studi lanjutan (Luo, et al., 2011;

Fruman, et al., 2008; Zhou, et al., 2009).

Gambar 2.7 Berbagai Jalur dalam Regulasi AMPK yang dapat

Memodulasi Proliferasi Sel (Luo, et al., 2010). Keterangan:

Aktivasi AMPK dapat meregulasi proliferasi sel, tidak hanya dengan

aktivasi aksis p53-p21 dan inhibisi sinyal mTOR, namun juga dengan

penekanan jalur sintesis asam lemak. Pada saat AMPK teraktivasi,

beberapa jalur yang diindikasikan dengan garis titik-titik mengalami

supresi.

2. Jalur PI3K

Phospatidilinositol 3 kinase (PI3K) merupakan jalur yang

mengatur level phospatidil inositol terfosforilasi (PIP3) pada

membran plasma. Aktivasi PI3K terkait faktor pertumbuhan

menyebabkan aktivasi mammalian target of rapamycin (mTOR),

yang mengkoordinasi aktivitas metabolik pendukung biosintesis

selular (Sokolosky, et al., 2011).

3. Jalur mTOR

Mamalian target of rapamycin (mTOR) merupakan jalur

yang berperan dalam sintesis protein dengan mengatur asupan

asam amino, TRNA dan inisiasi translasi. Asam amino akan

21

berperan dalam mTOR sehingga akan mempengaruhi laju sintesis

protein. Jalur mTOR terbagi menjadi dua kompleks protein

berbeda yaitu: TORC1 dan TORC2. TORC1 berperan dalam

menentukan ukuran sel sedangkan TOR2 berperan dalam

mengatur bentuk sel dan sitoskeleton aktin (Wullschleger, 2006;

Luo, et al., 2010).

2.4.2 Induksi Terhadap Ketahanan Siklus Sel

Kemampuan protein p53 untuk menghambat

pertumbuhan sel sangat penting karena berfungsi sebagai penekan

tumor. Inhibisi terhadap siklus sel terjadi apabila timbul blokade

di dalam siklus pembelahan sel. Induksi ketahanan siklus sel oleh

p53 dapat memberikan tambahan waktu bagi sel untuk

memperbaiki kerusakan genom sebelum memasuki tahapan

penting sintesis DNA dan mitosis. Sel-sel yang sebelumnya

tertahan akan dikembalikan ke kondisi proliferasinya melalui

fungsi biokimia p53 yang memfasilitasi perbaikan DNA termasuk

diantaranya nucleotide excision repair (NER) dan base excision

repair (Bai & Zhu, 2006).

2.4.3 Perbaikan DNA dan Apoptosis

Respon p53 melalui perbaikan DNA yang terlibat dalam

koreksi berbagai jenis kerusakan pada DNA tidak bekerja secara

langsung saat mengalami aktivasi. Hal ini karena mutasi pada

gen ini menyebabkan instabilitas genetik sehingga terjadi

akumulasi kerusakan dari semua gen, termasuk gen yang

mengatur pertumbuhan sel. p53 berperan penting dalam

memelihara stabilitas genetik. Mekanismenya masih belum jelas,

tetapi p53 mungkin terlibat pada induksi gen yang meregulasi

Nucleotide excision repair (NER) dari DNA, rekombinasi

kromosomal dan segregasi kromosom (Vogelstein, 2000).

Inaktivasi p53 dapat menimbulkan peningkatan frekuensi mutasi

akibat dari tidak efisiennya NER. NER yang buruk menyebabkan

instabilitas genom. Instabilitas ini dimanifestasikan dengan

amplifikasi gen, aneuplodi, dan aberasi kromosom, berasosiasi

dengan progresi malignansi (Reles, 2001). Induksi gen spesific

ribonucleotide reductase oleh p53 setelah terjadinya kerusakan

22

DNA merupakan bukti lain peran p53 dalam perbaikan DNA

(Vogelstein, 2000).

Protein p53 melakukan modulasi pada sebagian besar

proses perbaikan DNA melalui jalur transaktivasi dependen

maupun independen, sehingga protein p53 berfungsi sebagai

molecular node yang terletak pada persimpangan upstream

signaling cascade dan downstream DNA-repair (Sengupta,

2005). Akumulasi protein p53 menghasilkan transient arrest

pada siklus sel di Gl, sesaat sebelum replikasi DNA, atau di G2,

sesaat sebelum mitosis. Berhentinya pembelahan sel ini

memberikan kesempatan pada sel mengaktivasi sistem perbaikan

DNA enzimatis untuk memperbaiki lesi yang terjadi. Dengan kata

lain, pada sel yang mengekspresikan mutasi p53, pembelahan sel

tidak berhenti walaupun telah terjadi kerusakan DNA (Soussi,

2004).

Salah satu peranan p53 adalah untuk memonitor stress

selular dan menginduksi apoptosis apabila lesi DNA irreversible

atau tidak dapat diperbaiki. Apoptosis merupakan proses

bertingkat yang diregulasi dengan ketat, ditandai dengan

penyusutan sel, kondensasi kromatin, serta fragmentasi sel dan

inti. Dalam perkembanganya apoptosis juga sering disebut dengan

programmed cell death, yang berlangsung terus selama proses

kehidupan dengan maksud untuk menjaga homeostasis jaringan,

yaitu keseimbangan antara proliferasi dengan kematian sel (Bai

& Zhu, 2006; Miettinen, 2009).

Apoptosis merupakan barier utama onkogenesis dan

protein tumor supressor p53 merupakan kunci utama regulasi

apoptosis dan karsinogenesis (Maximov, 2008). Apoptosis

dimediasi oleh dua jalur apoptosis utama, yaitu jalur ekstrinsik

dan intrinsik. Apapun jalur aktivasi yang diinduksi, masing-

masing jalur tersebut menimbulkan aktivasi protease selektif yang

disebut sebagai caspase. Caspase dikenal sebagai eksekutor

apoptosis, merupakan sistein protease selektif yang mengontrol

semua tahap apoptosis. Caspase terdapat di setiap sel sebagai

prekursor tidak aktif yang disebut procaspase. Jalur ekstrinsik

23

dikenal sebagai death receptor pathway dan jalur intrinsik sebagai

mitochondrial pathway. Jalur ekstrinsik dan intrinsik diaktifkan

oleh tumor suppressor protein p53 (Miettinen, 2009). Pada jalur

ekstrinsik terjadi aktivasi caspase 8 untuk menginduksi apoptosis,

sedangkan pada jalur intrinsik terdapat peran protein mitokondria

dalam aktivasi caspase 9 untuk menginduksi apoptosis. Selain itu,

protein p53 dapat mengaktifkan Apaf-1 secara langsung untuk

menginduksi apoptosis (Maximov, 2008).

Menurut Rashmi, et al. (2012) p53 merupakan protein

supresor tumor yang mampu mengaktivasi apoptosis, melalui dua

jalur:

1. Jalur ekstrinsik, melalui induksi gen yang mengkode 3 protein

transmembran, yaitu: Tumor Necrosis Factor receptor 1

(TNFR1), Fas, dan Death Receptor-5 (DR-5). Protein ini akan

mengaktifkan sinyal transduser yang akan mengaktifkan caspase.

p53 menginduksi protein Fas melalui ikatan elemen pada

promotor dan intron, sedangkan p53 akan mengaktifkan DR-5

dan TNFR1 dalam merespon kerusakan DNA dan melalui caspase

8 akan memicu kematian sel.

2. Jalur intrinsik, melalui protein pro-apoptosis: Bax, Noxa,

Puma, Bid dan protein anti-apoptosis: Bcl-XL, Bcl2 yang

berfungsi untuk pengeluaran sitokrom C dari mitokondria.

Mekanisme terjadinya apoptosis ketika terjadi kerusakan

DNA adalah induksi pro-apoptosis, dengan membentuk lubang di

mitokondria melalui pengeluaran sitokrom C dan protein pro-

apoptosis dari permukaan intermembran. Keluarnya sitokrom C

dari mitokondria merupakan mekanisme yang penting dalam

induksi apoptosis sehingga mampu berinteraksi dengan protein

Apoptotic protease activating Factor 1 (Apaf 1). Kompleks

multiprotein antara Apaf 1 dan sitokrom C akan membentuk

apoptosom. Pembentukan apoptosom akan mengaktifkan caspase

9 dan menginduksi apoptosis (Rashmi, et al., 2012).

24

Gambar 2.8 Mekanisme Apoptosis (Rashmi, et al., 2012).

Caspase terdiri atas dua jenis, yaitu sebagai inisiator: caspase

9, caspase 2, caspase 8 dan caspase 10 dan sebagai efektor yaitu

caspase 3, caspase 6 dan caspase 7. Inisiator caspase berfungsi

untuk merespon perubahan mitokondria dan efektor caspase

berfungsi sebagai aktivasi reseptor kematian dengan target

proenzym sebagai target yang penting untuk ketahanan sel

(Rashmi, et al., 2012).

2.5 Kemoterapi dan Efek Sampingnya

Terapi kanker payudara dapat digolongkan menjadi

pembedahan, radioterapi, kemoterapi dan terapi hormonal (Jong,

2005). Kemoterapi adalah proses pengobatan dengan

menggunakan obat-obatan yang bertujuan untuk menghancurkan

atau memperlambat pertumbuhan sel-sel kanker (Noorwati,

2007). Kemoterapi neoadjuvant merupakan kemoterapi

preoperative berdasarkan perawatan sistemik dengan obat

sitotoksik sebelum diinjeksikan ke pasien dengan tumor maligna

25

lokal pada tahap akhir. Kemoterapi neoadjuvant menjadi metode

konvensional untuk mereduksi tahapan dan ukuran tumor primer

(Charfare, 2006). Salah satu contohnya adalah traztuzumab.

Traztuzumab merupakan obat dengan prinsip kerja antibodi

monoklonal yang beraksi pada reseptor HER2/ neu (Human

Epidermal growth factor Receptor) (Hudis, 2007). Traztuzumab

memiliki tingkat toksisitas yang rendah sehingga dapat

diberikan dalam dosis yang cukup tinggi. Kemampuan afinitas

traztuzumab terhadap reseptor HER2 cukup ampuh namun

beberapa pasien pengguna traztuzumab tidak merespon adanya

pengobatan tersebut dan mengalami suatu resistensi. Mekanisme

resistensi ini dimungkinkan karena kekurangan p27Kip

translokasi ke nukleus, yang menyebabkan CDK2 menginduksi

proliferasi suatu sel (Kute, et al., 2004).

Obat lain yang digunakan untuk mengobati kanker

adalah doxorubicin, yaitu antibiotik golongan antrasiklin yang

banyak digunakan untuk terapi berbagai macam jenis kanker

seperti leukemia akut, kanker payudara, kanker tulang dan

ovarium (Childs, et al., 2002). Senyawa ini diisolasi dari

Streptomyces peucetius var caesius pada tahun 1960-an dan

digunakan secara luas (Minotti, et al., 2004). Antibiotik

antrasiklin seperti doxorubicin memiliki mekanisme aksi

sitotoksik melalui empat mekanisme yaitu: (1) penghambatan

topoisomerase II, yaitu suatu enzim tergantung ATP yang

bekerja mengikat DNA dan menyebabkan double-strand break

pada ujung 3′fosfat sehingga memungkinkan penukaran strand

dan pelurusan DNA. Pelurusan strand ini diikuti dengan

penyambungan strand DNA oleh topoisomerase II.

Topoisomerase ini sangat penting fungsinya dalam replikasi dan

perbaikan DNA (Gewirtz, 1999; Minotti et al., 2004). (2)

interkalasi DNA sehingga mengakibatkan penghambatan

sintesis DNA dan RNA dan mempengaruhi transkripsi dan

replikasi (Gewirtz, 1999; Minotti, et al., 2004). (3) pengikatan

membran sel yang menyebabkan aliran dan transpor ion (4)

pembentukan radikal bebas semiquinon dan radikal bebas

26

oksigen melalui proses yang tergantung besi dan proses reduktif

yang diperantarai enzim. Mekanisme radikal bebas ini telah

diketahui bertanggungjawab pada kardiotoksisitas akibat

antibiotik antrasiklin (Bruton, et al., 2005).

Gambar 2.9 Struktur Doxorubicin (Anonim6, 2015).

Doxorubicin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada

penggunaan jangka panjang, sehingga penggunaannya secara

klinis menjadi terbatas. Efek samping pada pemakaian kronisnya

bersifat irreversibel, termasuk terbentuknya cardiomyopathy dan

kegagalan jantung (Han, et al., 2008). Terjadinya

cardiomyopathy pada pemakaian doxorubicin kemungkinan juga

terjadi akibat peningkatan produksi oksidan di jantung.

Mitokondria diperkirakan merupakan target utama

kardiotoksisitas akibat doxorubicin. Elektron tunggal di

mitokondria ditransfer ke doxorubicin sehingga menyebabkan

peningkatan pembentukan radikal oksigen melalui autooksidasi

doxorubicin semiquinon (Bruton, et al., 2005). Mekanisme

toksisitas doxorubicin telah banyak diketahui. Toksisitas kronis

doxorubicin kemungkinan diperantarai oleh konversi metabolik

doxorubicin menjadi doxorubicinol yang melibatkan berbagai

enzim antara lain karbonil reduktase. Mekanisme utama toksisitas

doxorubicinol terjadi karena interaksinya dengan besi dan

pembentukan reactive oxygen species (ROS) yang merusak

makromolekul sel (Minotti et al, 2004). Doxorubicin umumnya

27

digunakan dalam bentuk kombinasi dengan agen antikanker

lainnya seperti siklofosfamid dan cisplatin. Peningkatan respon

klinis dan pengurangan efek samping cenderung lebih baik pada

penggunaan kombinasi dengan agen lain dibandingkan

penggunaan doxorubicin tunggal (Bruton, et al., 2005).

Kemoterapi memiliki efek samping karena obat-obat

kemoterapi tidak hanya menghancurkan sel-sel kanker tetapi juga

menyerang sel-sel sehat, terutama sel-sel yang membelah dengan

cepat (Noorwati, 2007). Penelitian yang dilakukan oleh Love, et.

al (1989) menunjukkan bahwa persentase pasien yang mengalami

efek samping dari kemoterapi yang dijalaninya yaitu kerontokan

rambut sebanyak 89%, mual 87%, lelah 86%, muntah 54%,

gangguan tidur 46%, peningkatan berat badan 45%, sariawan

44%, kesemutan 42%, gangguan pada mata 38%, diare 37%,

konstipasi 19 %, kemerahan pada kulit 18% dan penurunan berat

badan 13%.

Efek samping kemoterapi bervariasi tergantung regimen

kemoterapi yang diberikan. Efek samping yang dapat terjadi

akibat kemoterapi berbasis antrasiklin (adriamisin/doxorubicin)

dikelompokkan menjadi mual, muntah, diare, stomatitis, alopesia,

rentan terinfeksi, trombositopenia, neuropati, dan myalgia

(Partridge, et al., 2001). Salah satu efek samping yang sering

ditemukan akibat kemoterapi adalah alopesia (kehilangan

rambut). Penelitian yang dilakukan oleh Kiebert, et al.(1990)

menunjukkan bahwa lebih dari 80% wanita yang menjalani

kemoterapi mengatakan bahwa alopesia (kerontokan rambut)

merupakan aspek paling traumatik dari kemoterapi yang

dijalaninya dan 8% pasien bahkan berhenti dari kemoterapi

karena ketakutannya akan mengalami alopesia (Botchkarev,

2003). Efek samping penggunaan doxorubicin juga

mengakibatkan resistensi obat. Mekanisme yang menyebabkan

resistensi doxorubicin adalah adanya overekspresi PgP yang

menyebabkan doxorubicin dipompa keluar sel dan konsentrasi

doxorubicin dalam sel turun (Bruton, et al., 2005).

28

2.6 Spons Cinachyrella anomala

Spons merupakan hewan akuatik yang melekat pada

substrat dan mampu memakan partikel makanan yang telah

disaring melalui kanal pada tubuhnya (filter feeder) (De Goeij, et

al., 2008). Spons merupakan organisme sederhana sel

terspesialisasi sesuai fungsinya namun belum membentuk

jaringan atau organ. Semua spons memiliki kulit dari sel datar

atau bentuk T yang disebut pinakosit sebagai penutup terluar dari

spons, ruang (chamber) dan kanal. Jarak antara kanal dan ruang

terisi oleh matriks kolagen, yang dsebut mesohil yang

mengandung sel individu, mendukung serat dan struktur skeleton

(De Vos, et al., 19911981 dalam Van Soest, 2012). Skeleton

dibentuk oleh silika atau elemen kapur (spikula) dan atau serat

kolagen (spongin) (Hentschel, 2003; Taylor, 2007).

Keanekaragaman yang besar dari organisme simbiotik dapat

hidup pada tubuh spons, misalnya: polychaetes, hydrozoa dan

ikan (Westinga & Hoetjes, 1981 dalam Van Soest, 2012).

Spons adalah komponen biota laut yang memiliki potensi

bioaktif yang belum sepenuhnya dieksplorasi. Senyawa aktif

Gambar 2.10 A. Karakteristik Spons Laut Cinachyrella sp.

dibawah batu, B. Penampang Cinachyrella sp. dilihat dari

bawah (Nurhayati, et al., 2014).

29

tersebut memiliki persentase yang lebih tinggi dibandingkan

dengan tanaman darat (Thakur & Muller, 2004). Jenis porifera

yang hidup di laut dangkal ini merupakan sumber metabolit

sekunder yang tinggi dengan struktur unik, yang tidak ditemukan

pada organisme darat (Haufner, 2003).

Spons sebagai salah satu sumber penemuan senyawa-

senyawa baru dari laut telah diketahui memiliki kandungan

senyawa bioaktif yang paling luas dan paling banyak mendapat

perhatian para peneliti dibandingkan invertebrata laut lainnya

yang telah diteliti. Menurut Jha & Zi-Rong (2004), spons

merupakan kontributor terbesar senyawa bioaktif dari laut jika

dibandingkan dengan biota laut lainnya yaitu 37%, disusul

coelenterata (21%), mikroorganisme (18%), alga (9%),

echinodermata dan tunikata masing-masing 6%, moluska (2%)

dan bryozoa (1%). Spons merupakan biota sesil, sehingga tidak

dapat menghindari serangan predator dengan berpindah tempat

sehingga spons mempunyai mekanisme pertahanan ssecara

kimiawi. Mekanisme pertahanan kimiawi dilakukan dengan cara

menghasilkan senyawa bioaktif. Beberapa senyawa bioaktif ini

bersifat antivirus, antijamur, antimikroba, antiinflamasi,

antitumor, dan sitotoksik (Joseph & Sujatha, 2011).

Senyawa bioaktif spons dihasilkan dari metabolisme

yaitu suatu proses perubahan senyawa yang satu menjadi

senyawa lain. Hasil metabolisme tersebut disebut metabolit.

Metabolit diklasifikasikan menjadi dua, yaitu metabolit primer

dan metabolit sekunder. Metabolit primer yang dibentuk dalam

jumlah terbatas dan penting untuk pertumbuhannya, sedangkan

metabolit sekunder tidak digunakan untuk pertumbuhan dan

dibentuk dari metabolit primer pada kondisi stress. Contoh

metabolit sekunder adalah alkaloid, fenol, flavonoid dan

sebagainya (Djide, et al., 2007). C. anomala merupakan salah

satu spons laut yang memiliki senyawa bioaktif alkaloid.

Senyawa alkaloid tersebut memiliki potensi farmakologis. Jenis

spons ini umumnya melimpah dan belum banyak diteliti

manfaatnya (Faulkner, 2001).

30

Klasifikasi dari C. anomala menurut Cardenas (2015)

adalah sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Filum : Porifera

Kelas : Demospongiae

Ordo : Tetractinellida

Famili : Tetillidae

Genus : Cinachyrella

Spesies : C. anomala

Komponen alkaloid dari C.anomala telah diisolasi dan

diidentifikasi dari kelompok derivat cinachyramine dengan

formula molekular dan nama struktur 4,9

triazatricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol atau SA2014

(Nurhayati, et al.,2014).

Gambar 2.11 Struktur Kimia Senyawa dari Spons Laut C.

anomala dengan Rumus Molekul C10H13N3O dan Nama Struktur

yaitu 1,4,9-triazatricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol

(SA2014).

2.7 Simbiosis Spons dan Mikroba

Pembentukan metabolit sekunder diatur oleh nutrisi,

penurunan kecepatan pertumbuhan, feedback control, inaktivasi

31

enzim dan induksi enzim. Keterbatasan nutrisi dan penurunan

kecepatan pertumbuhan akan menghasilkan sinyal yang memiliki

efek regulasi sehingga menyebabkan diferensiasi kimia (metabolit

sekunder) dan diferensiasi morfologi (morfogenesis) (Demain,

1998 dalam Nofiani, 2008). Sinyal ini adalah suatu induser

dengan berat molekul rendah yang bekerja sebagai kontrol

negatif, sehingga pada keadaan normal (pertumbuhan cepat dan

cukup nutrisi) mencegah pembentukan metabolit sekunder dan

morfogenesis. Jalur metabolit sekunder belum banyak dimengerti

(Nofiani, 2008).

Hasil eksplorasi metabolit sekunder selama ini

menunjukkan bahwa bakteri laut merupakan salah satu sumber

potensial metabolit sekunder. Berdasarkan cara hidupnya, bakteri

penghasil metabolit sekunder dapat berasal dari bakteri yang

hidup bebas, bakteri laut yang terdapat pada sedimen, bakteri

yang berasosiasi dengan alga maupun invertebrate (Burgess, et

al., 1999). Bakteri yang hidup berikatan dengan partikel tertentu

menghasilkan lima sampai sepuluh kali lebih tinggi dibanding

dengan bakteri yang hidup bebas (Long, 2001).

Simbiosis antara mikroba dengan invertebrata menjadi

suatu aturan yang digunakan mikroba dalam menghasilkan jenis

metabolit sekunder yang akan dihasilkan (Thakur, et al., 2003).

Umumnya jenis metabolit sekunder yang dihasilkan mikroba

dimanfaatkan oleh invertebrata laut untuk melawan serangan

makhluk hidup lain. Simbiosis yang menghasilkan metabolit

sekunder dapat dipicu karena adanya halangan biotik. Model yang

digunakan untuk menjelaskan konsep ini adalah simbiosis bakteri

dengan spons pada gambar berikut (Muller, et al., 2004).

32

Gambar 2.12. Model Produksi Metabolit Sekunder melalui

Simbiosis Spons dengan Mikroba (Muller, et al., 2004). Keterangan: 1. Sel inang (spons) mensintesis senyawa bioaktif untuk

melengkapi perlindungan melawan serangan mikroba/eukariot; 2.

Mikroba berasosiasi dengan spons menghasilkan suatu metabolit

sekunder yang berperan dalam sistem pertahanan spons; 3. Perlindungan

dengan sistem imun; 4. Perlindungan tidak langsung; 5. Simbiosis

bakteri atau fungi menghasilkan metabolit sekunder.

Mula-mula sel inang (spons) mensintesis metabolit

sekunder untuk melengkapi perlindungan melawan serangan

mikroba atau eukariot (perlindungan langsung pertama), contoh

senyawa asetilenat. Spons juga mampu menghasilkan metabolit

sekunder berupa protein yang dapat menahan pertumbuhan

bakteri (perlindungan dengan sistem imun), contohnya adalah

perforin (Thakur, et al, 2003) dan tachylectin (Schroder, et al,

2003). Secara fungsional, senyawa ini beraksi sebagai molekul

pertahanan. Akibat adanya interaksi metabolit sekunder yang

dihasilkan dengan bakteri yang berasosiasi dengan spons

menyebabkan kemungkinan bakteri terinduksi untuk

menghasilkan suatu metabolit sekunder. Metabolit sekunder yang

dihasilkan memiliki bermacam-macam fungsi, misalnya berfungsi

dalam sistem pertahanan sekaligus pengaktivasi jalur penting

33

untuk pertahanan diri (aktivator metabolit). Contoh metabolit

sekunder bakteri adalah asam okadaat (okadaic acid) yang

dihasilkan oleh bakteri dalam spons Suberites domuncula. Asam

okadaat berperan sebagai molekul pertahanan melawan serangan

metazoa asing dan secara simultan merupakan modulasi positif

jalur ini untuk memperbesar respon imun sel inang (Wiens et al,

2003). Bakteri yang hidup pada permukaan sel inang spons

menghasilkan metabolit sekunder spesifik untuk melawan bakteri

tertentu (perlindungan tidak langsung), contoh senyawa

antifouling (Thakur, et al., 2003) dan senyawa tribromophenol

(Claire, et al., 1999).

2.8 Docking molekuler

Studi komputasi dikenal dengan terminologi in silico

merupakan analog in vivo dan in vitro yang menggunakan

aplikasi komputer sehingga waktu dan biaya menjadi lebih

efisien (Quinion, 2011; Kroemer, 2003). Terminologi in silico

diantaranya dikenal sebagai penapisan virtual. Penapisan/

penambatan senyawa biologis terhadap milyaran senyawa masih

sulit dilakukan, sehingga pendekatan senyawa secara virtual

menjadi alternatif. Metode ini relatif lebih cepat dan mampu

menangani ribuan senyawa dalam waktu yang lebih cepat dan

bergantung pada senyawa yang diuji serta kecepatan computer.

Penapisan virtual telah mencapai status sebagai teknologi yang

dinamis dan menguntungkan dalam penemuan senyawa obat

(Schoichet, 2004; Schapira, et al., 2003).

34

Gambar 2.13 Filosofi Docking

Prediksi struktur kompleks ligan dengan protein, yang

disebut docking protein-ligan dibutuhkan pada proses

pengembangan obat. Tujuan docking adalah menemukan

konformasi energi ligan rendah di situs pengikatan protein yang

sesuai. Docking molekuler akan menghasilkan skor yang

menggambarkan energi total ikatan protein ligan. Perbandingan

skor suatu senyawa dengan senyawa lainnya dapat menjelaskan

suatu senyawa bersifat poten atau tidak. Makin kecil suatu hasil

docking berarti kompleks protein- ligan makin stabil sehingga

senyawa makin poten. Visualisasi dibutuhkan untuk mengetahui

asam amino yang berperan dalam menjaga stabilitas senyawa

tersebut pada reseptornya (Purnomo, 2011). Jika target telah

diketahui, algoritma docking dapat digunakan untuk

menempatkan kandidat obat ke dalam sisi aktif dari target seperti

enzim atau reseptor. Kemudian interaksi senyawa-senyawa yang

telah diikatkan kemudian diurutkan berdasarkan hasil analisis

secara komputasi (Barnard & Drowns, 1998; Bender & Glen,

2005; Kurumbail, et al.,1996).

Docking molekuler atau penambatan molekul adalah

metode komputasi yang bertujuan meniru peristiwa interaksi

suatu molekul ligan dengan protein yang menjadi targetnya pada

uji in-vitro (Motiejunas & Wade, 2006). Molekul ligan dan situs

Gambar 2.9 Filosofi docking

35

tambat proteinnya yang cocok adalah spesifik, seperti kecocokan

lubang kunci dengan anak kuncinya (lock-and-key) (Motiejunas

& Wade, 2006). Situs aktif atau situs tambat mendesak

(menginduksi) pengubahan konformasi ligan untuk menuju

kecocokan ini (Foloppe & Chen, 2009; Motiejunas & Wade,

2006).

Docking molekuler bermanfaat karena digunakan untuk

penemuan obat dan pada satu target protein dengan jutaan obat

memungkinkan untuk diteliti. Keuntungan docking adalah

menghemat waktu, biaya, dan dapat digunakan untuk

memprediksi aktivitas senyawa untuk pengobatan (Knapp, 2012).

Protein ligan atau protein konformasi didapatkan secara

in-silico dan dibandingkan dengan struktur yang didapatkan dari

crystallography sinar X atau spektroskopi NMR (Nuclear

Magnetic Resonance) yang disimpan dalam Protein Data Bank

(PDB) (Marshall, 1987).

Program docking terdiri atas 2 bagian, yaitu docking

algorithms dan scoring function. Docking algoritms berfungsi

untuk mencari orientasi / konformasi ligan dan reseptor sehingga

didapat konformasi yang paling stabil. Gugus fungsional ligan

akan berinteraksi dengan residu asam amino reseptor dan

membentuk ikatan. Ikatan ini akan dihitung dan diranking dengan

scoring function (Tegar & Purnomo, 2013).

Docking terdiri atas dua jenis, yaitu: blind docking dan

oriented docking. Blind docking merupakan proses docking tanpa

mengetahui posisi sisi aktif enzim kemudian pada grid box yang

ditentukan tidak spesifik tetapi diaplikasikan ke area enzim.

Oriented docking merupakan jenis docking dengan target sisi

aktif enzim dan grid box yang ditentukan spesifik. Parameter grid

box dibutuhkan untuk mendeskripsikan area proses docking

(Tambunan, et al., 2011).

36

Gambar 2.14 Penambatan Molekul (Santoyo, et al., 2013).

2.9 Docking PLANTS

Docking PLANTS (Protein-Ligand Ant System)

merupakan suatu metode penambatan molekul berdasarkan

software PLANTS dengan optimasi koloni semut ACO (Ant

Colony Optimization). ACO terinspirasi oleh perilaku semut

nyata menemukan jalan terpendek antara sarang dan sumber

makanan. Semut menggunakan komunikasi langsung dalam

bentuk jalur feromon yang menandai jalur antara sarang dan

sumber makanan. Kasus docking protein-ligan, sebuah koloni

semut buatan digunakan untuk menemukan konformasi energi

minimum ligan di situs yang mengikat. Semut ini digunakan

untuk meniru perilaku semut nyata dan menandai ligan

konformasi energi rendah melalui jalur feromon. Informasi jejak

feromon buatan yang diubah dalam pengulangan (iterasi)

berikutnya digunakan untuk menghasilkan konformasi energi

rendah (Purnomo, 2011).

PLANTS adalah program aplikasi docking molekuler

gratis yang diketahui memiliki kualitas seperti GOLD (aplikasi

docking molekuler yang berbayar). PLANTS memiliki banyak

kelebihan seperti gratis, software ini sederhana dan mudah

diaplikasikan. Kekurangannya adalah PLANTS tidak

menyediakan fungsi preparasi database protein, ligan, dan

visualisasi. PLANTS tidak memiliki aplikasi untuk Windows

sehingga hanya dapat digunakan untuk LINUX. Jika pengguna

Windows ingin memakai PLANTS, dapat menggunakan bantuan

37

Co-Pendrivelinux-KDE yaitu software untuk hibridisasi LINUX

dalam Windows, YASARA digunakan untuk preparasi protein

dan visualisasi asam amino, Marvinsketch ChemAxon digunakan

untuk preparasi database ligan dan Visual Molecular Dinamic

(VMD) digunakan untuk mengetahui jarak ikatan ligan dan

protein (Purnomo, 2011).

39

BAB III

METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai April

2016 di Laboratorium Zoologi, Jurusan Biologi, Institut

Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya dan Laboratorium Kimia

Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah prosesor :

Pentium(R) Dual Core Acer sistem operasi Windows 8.1 RAM

1GB, jaringan internet, software PLANTS (Protein Ligand ANT

System) (http://www.tcd.uni konstanz.de/research/plants.php)

melalui Co-Pendrivelinux KDE (http://www. pendrivelinux.

com), YASARA (http://www.yasara.org), MarvinSketch

ChemAxon (http://www.chemaxon.com), MarvinSpace dan Visual

Molecular Dinamic (VMD) (Purnomo, 2011). Bahan yang

digunakan pada penelitian ini adalah database protein p53,

struktur kimia senyawa alkaloid SA2014 dan doxorubicin.

Beberapa sumber data antara lain: Protein Data Bank (PDB),

database Drug bank, dan NCBI.

3.3 Metode yang Digunakan

3.3.1 Pengambilan Data

Data struktur protein target (p53) dengan kode spesifik

yaitu 1YCR dan Doxorubicin, dengan kode 3NS9 diambil melalui

Protein Data Bank (PDB). Protein Data Bank merupakan tempat

penyimpanan dunia untuk proses dan distribusi 3D data struktur

biomolekuler biologi. Struktur protein didownload dari situs

dengan kata kunci spesifik (Berman et.al, 2000). Database Drug

bank merupakan sumber bioinformatika dan informasi kimia yang

dikombinasikan dengan obat, misalnya data farmakologi dengan

target obat (informasi struktur, sekuens dan jalur) (Wishart,

2006). Protein target yang digunakan adalah p53 yang akan di-

40

docking-kan dengan ligan (target obat) yaitu senyawa alkaloid

SA2014 dan doxorubicin.

3.3.2 Docking Molekuler

3.3.2.1 Preparasi Database Protein

Penelitian docking molekuler yang akan dilakukan adalah

protokol docking PLANTS (Purnomo, 2011). Protokol yang

dikembangkan pada penelitian adalah protokol docking untuk

memprediksi posisi dan interaksi senyawa alkaloid SA2014 dari

spons C. anomala, sebuah senyawa metabolit sekunder sebagai

antikanker dengan target protein p53. Hasil docking tersebut

akan dibandingkan dengan doxorubicin sebagai obat terapi.

Preparasi database protein target dilakukan dengan

menggunakan YASARA, yaitu berkas protein dalam format

#.pdb, kemudian dihapus salah satu rantai protein untuk

meminimisasi wilayah docking, dilanjutkan dengan menghapus

bagian dari sistem yang tidak diperlukan dalam protokol docking

(dibutuhkan hanya satu protein, termasuk air jika esensial dan

satu ligan). Hidrogen ditambahkan ke dalam sistem dengan

bantuan YASARA sebab resolusi struktur kristal tidak mampu

memprediksi keberadaan hidrogen (Edit > Add> Hydrogens to:

all). Simpan file sebagai YASARA Object ( File> Save as>

YASARA Object). Ligan asli di hapus sehingga hanya

menyisakan protein target saja dengan pocket untuk docking (Edit

> Delete > Residue). Hasilnya disimpan dalam bentuk berkas

protein.mol2 (File > Save as > Other format). Koordinat pocket

dapat diketahui dengan merujuk pada koordinat ligan 3D asli,

sehingga dibutuhkan file mol2 yang berisi ligan asli. Ketik File >

New dan klik “Yes”. Buka File > Yasara Object lalu pilih Edit >

Delete > Residue). Pilih nama SA2014, atau Belongs to or has

All, opsi "negate name" diaktifkan kemudian klik “OK". Hasil

disimpan sebagai ref_ligand.mol2. Preparasi protein docking ini

yang akan digunakan sebagai protokol docking untuk pe-napisan

virtual p53 (Purnomo, 2011).

41

3.3.2.2 Preparasi Database ligan

Pemodelan molekul senyawa antikanker dari bahan alam

dilakukan dengan menggambar struktur sampel. Data struktur

sampel dari bahan alam digambar dengan mengunakan

MarvinSketch (disimpan dalam format file ligand_2D.mrv).

Kemudian protonasi senyawa dicek pada pH = 7.4 ( Tools>

protonation > Major microspecies lalu klik “ OK” pada jendela

yang baru terbuka. Klik kanan dijendela yang memunculkan

major species pilih “ Save as” dan disimpan di C:/ docking_plants

sebagai ligand_2D.mrv lalu ditutup jendela marvinSketch.

Jendela marvinSketch yang baru dibuka (File>

Open…ligand_2D.mrv lalu konformasi dicari (Tools>

Conformation> Conformers) dan klik “OK” untuk diperlihatkan

dalam bentuk 3-dimensi, kemudian berkas disimpan dalam

bentuk mol2 (Purnomo, 2011).

3.3.2.3 Input File Konfigurasi

Langkah input file konfigurasi yaitu hasil peparasi

protein, ligan dan file konfigurasi dipersiapkan lalu pendrivelinux

dibuka dan di salin file yang dibutuhkan. Pada pendrivelinux

yang telah dijalankan, binding site center dan binding site radius

akan diketahui. Kemudian beberapa tipe atom yang tidak dapat

dikenali perlu diperbaiki. Secara manual dengan cara dihapus

salah satu atom dan diganti, lalu diperbaiki file plantsconfig

dengan mengganti binding site definition (Purnomo, 2011).

3.3.2.4 Simulasi Program Docking PLANTS

Simulasi peogram docking dilakukan dengan cara

pendrivelinux dijalankan, ditunggu prosesnya hingga selesai

kemudian konformasi 10 hasil docking terbaik akan didapat.

Konformasi dipilih dengan hasil skor terendah, lalu file dicopy ke

C:/docking_plants (Purnomo, 2011).

3.3.2.5 Evaluasi dan Interpretasi Hasil

Manual folder results akan dihasilkan yaitu 10 input

konformasi. Konformasi hasil dengan skor terendah dipilih.

YASARA dijalankan lalu ligan dan hasil docking disalin ke

C:/docking_plants ke YASARA. Hasil docking dengan referensi

42

hasil eksperimen dihitung dengan RMSD (Root Mean Square

Distances) dengan cara Analyze > RMSD of > Molecules.

Perhitungan RMSD dilakukan untuk evaluasi validasi. RMSD

merupakan pengukuran dua pose dengan membandingkan posisi

atom hasil docking dibandingkan dengan referensinya (Hawkinset

et.al, 2008). Nilai RMSD < 2,0 Å biasanya digunakan sebagai

kriteria kesuksesan metode docking (Jain & Nicholls, 2008;

Moitessier, et.al, 2008). Apabila nilainya kurang dari 2Ǻ, maka

dapat digunakan sebagai protokol docking untuk skrining virtual

sampel berikutnya. Semakin kecil nilai RMSD menunjukkan

bahwa pose/ikatan ligan yang diprediksi semakin baik karena

semakin mendekati konformasi native. Formula RMSD adalah:

Keterangan:

N - nomor atom

δi -jarak antara dua atom i berdasarkan dua struktur

unit RMSD : Ångstrom

Gambar 3.1 Hasil docking yang benar dan salah. Hasil docking

dinyatakan benar jika protein dan ligan terinduksi sempurna (kiri)

sedangkan hasil docking dinyatakan salah jika protein dan ligan

tidak terinduksi sempurna (Knapp, 2012).

43

File hasil docking dicopy dan disimpan didalam format PDB

untuk dilakukan visualisasi.

3.3.3 Visualisasi Hasil Docking

3.3.3.1 Visualisasi Asam Amino menggunakan YASARA

Software YASARA dapat digunakan untuk preparasi

protein dan visualisasi asam amino anatara ligan dan protein.

Langkah yang dilakukan yaituprogram YASARA dibuka lalu klik

File > Load > PDB File > Cari PDB yang akan dibuka, missal

1YCR_SA2014 lalu klik OK. Klik F6, lalu klik kiri pada

1YCR_SA2014 > Klik molekul baris ke 3 > klik non > klik

kanasn> stick. Untuk mengetahui aam amino sorot kursor dilayar

bagian bawah. Klik Effect > label > residu > kemudian klik non 0

pada Sequence > Unk pada Name > All pada Belong to or has >

centang Negate Name > oke > set label color [tercentang residu

name dan residu number] lalu pilih warna putih dan klik OK.

Klik kiri untuk memutar gambar, klik kanan untuk mengatur jarak

jauh dan dekat gambar,sehingga dapat diketahui asam amino

disekitar ligan yang didockingkan.

3.3.3.2 Visualisasi Jarak Ikatan Ligan dan Protein

menggunakan VMD

Visualisasi jarak ikatan ligan dan protein menggunakan

software Visual Molecular Dinamic (VMD). Langkah yang

dilakukan yaitu program VMD diinstal dan ditunggu prosesnya

hingga selesai. Program VMD dijalankan lalu klik File-New

molecule, kemudian klik Browse untuk mencari file PDB yang

akan divisualisasi. Klik “Load” dan tutup (klik X) pada Molecule

File Browser. Klik Graphic Representative > Create Rep lalu klik

dua kali pada Line Name All baris pertama. Pada “selected atom

“ganti “All” dengan “resname UNK”. Pada software ini senyawa

dikenal sebagai UNK atau non; untuk mengetahui klik Selection

> klik resname, sehingga di kolom “Value” akan tampak UNK

atau non. Klik Line Name all baris ke 2 dan pada Selected Atom

ditulis dengan [same residue as within 4 of resname UNK]. Untuk

44

mengganti tampilan “resname UNK” agar berbeda dengan

protein, klik Draw style > Drawing Method > Bonds.

Langkah- langkah yang dilakukan untuk melihat ikatan

hydrogen pada ikatan antara protein dan ligan adalah klik mause

> labels > bond 2 kemudian dilihat dilayar terdapat tanda +

[pertanda software sudah dapat digunakan]. Layar tampilan

dibesarkan denagn menggeser mouse tengah sehingga diketahui

ketiga asam amino yang berperan pada ikatan protein dan ligan.

Software VMD dapat digunakan untuk mengetahui jarak ikatan

tersebut.

3.3.4 Rancangan Penelitian dan Analisa Data

Penelitian ini merupakan penelitian dengan pendekatan

bioinformatika menggunakan analisis docking molekuler ligan

terhadap protein. Penelitian ini bersifat deskriptif. Analisis data

dilakukan dengan nilai skoring. Molekul dengan nilai skoring

terendah menunjukkan afinitas kestabilan yang baik, setelah itu

visualisasi interaksi menggunakan YASARA. Visualisasi

interaksi untuk mengetahui asam amino disekitar ligan yang

didockingkan. Hasil yang diperoleh akan dikaitkan dengan

aktivitas obat pada protein target p53 pada kanker payudara

T47D.

Tabel 1.2 Nilai dari skor docking

Konformasi SA2014 doxorubicin

entry_00001_conf_01

entry_00002_conf_01

entry_00003_conf_01

entry_00004_conf_01

entry_00005_conf_01

entry_00006_conf_01

entry_00007_conf_01

entry_00008_conf_01

entry_00009_conf_01

entry_000010_conf_01

45

Tabel 1.3 Hasil Seleksi Skor Docking

Ligan Skor docking terhadap p53

SA2014

Doxorubicin Keterangan: Ligan [SA2014] = struktur senyawa1,4,9-

triazatricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol spons laut C.

anomala, doxorubicin= obat anti kanker.

Hasil visualisasi docking akan ditunjukkan melalui asam

amino yang berperan pada ikatan antara ligan dan protein target

(gambar 3.2) misalnya LYS 129 adalah kode asam amino lisin

nomor 129 dan ILE 192 adalah kode asam amino ileusin nomor

192 yang berperan dalam ikatan reseptor dan protein targetnya.

Gambar 3.2 Contoh Hasil Visualisasi Docking (Nurhayati, et al.,

2015).

47

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Struktur Protein Target

Protein p53 yang berikatan dengan Murine Double

Minute 2 (MDM2) telah digunakan sebagai target terapi dalam

kanker payudara. Struktur tiga dimensi protein p53 didapatkan

dari kode PDB : 1YCR berdasarkan kristalografi sinar X dengan

resolusi 2.6 Å .

Gambar 4.1 Struktur Tiga Dimensi MDM2 Berikatan dengan

Domain Transaktivasi pada Protein p53

(http://www.rcsb.org/pdb). Keterangan: a. MDM2; b. Domain

Transaktivasi p53.

p53 merupakan protein supresor tumor sebagai master

regulator pada jalur sinyal yang bervariasi. Peran protein p53

sebagai supresor tumor termasuk kemampuan untuk menahan

siklus sel, perbaikan DNA, dan apoptosis. Aktivitas protein p53

sebagai supresor tumor akan terganggu jika terjadi mutasi baik

pada p53 maupun MDM2. Onkoprotein MDM2 merupakan

regulator negatif yang mengatur aktivitas p53 dengan

menghambat secara langsung aktivitas transkripsi p53. Aktivitas

a

b

48

protein p53 dapat distabilkan melalui penghambatan interaksi

antara p53 dan MDM2 (Leao, et al., 2013).

4.2 Hasil Docking Ligan dan Protein Target

Docking molekuler dilakukan untuk memprediksi kemungkinan aktivitas yang terjadi antara ligan dengan protein

target. Salah satu mekanisme molekuler antikanker adalah dengan

menghambat aktivasi protein p53 yang berikatan dengan MDM2

yang berperan dalam proliferasi sel kanker.

Penelitian ini menggunakan metode docking molekuler

melalui software Protein Ligand Ant System (PLANTS) untuk

mengetahui skor docking, Co-Pendrivelinux KDE untuk

hibridisasi LINUX dalam Windows, YASARA untuk preparasi

protein dan visualisasi hasil docking, Marvinsketch untuk

preparasi ligan dan Visual Molecular Dinamic (VMD) untuk

analisa jarak antara ligan dan protein. Database protein p53

didapatkan dari Protein Data Bank (PDB) dan database

doxorubicin didapatkan dari Drug Bank. Berdasarkan penelitian, hasil docking antara ligan dan

protein target p53 didapatkan 10 hasil konformasi nilai terbaik.

Hasil docking menunjukkan bahwa senyawa alkaloid SA2014

memiliki skor docking sebesar -52.0728 pada konformasi ke 6

lebih stabil dibandingkan dengan skor doxorubicin sebesar

-50.6343 pada konformasi ke 8. Penghambatan molekul p53

berikatan dengan MDM2 oleh senyawa alkaloid SA2014 akan

menghasilkan respon biologis berupa efek penghambatan

proliferasi (antiproliferasi) yang dapat diprediksi melalui skor

yang didapatkan dari hasil docking. Skor merupakan parameter

kekuatan afinitas pengikatan ligan uji terhadap reseptor. Semakin

stabil interaksi ligan-protein dicerminkan dengan semakin

rendahnya skor (minus) (Purnomo, 2011). Sehingga senyawa

SA2014 memiliki aktivitas antikanker terhadap protein p53 yang

berikatan dengan MDM2 pada kanker payudara T47D melalui

docking molekuler.

Perbandingan skor suatu senyawa dengan senyawa

lainnya dapat menjelaskan suatu senyawa bersifat poten atau

49

tidak. Makin kecil suatu hasil docking berarti kompleks protein-

ligan makin stabil sehingga senyawa makin poten. Visualisasi

dibutuhkan untuk mengetahui asam amino yang berperan dalam

menjaga stabilitas senyawa tersebut pada reseptornya (Purnomo,

2011). Nilai skor docking dicantumkan dalam tabel 1.4 dan 1.5.

Tabel 1.4 Hasil dari Skor Docking Ligan dan Protein p53

Konformasi SA2014 Doxorubicin

entry_00001_conf_01 -51.8614 -49.9983

entry_00002_conf_01 -51.8600 -49.1915

entry_00003_conf_01 -51.7016 -49.5867

entry_00004_conf_01 -51.6456 -47.5193

entry_00005_conf_01 -50.7724 -49.1704

entry_00006_conf_01 -52.0728 -49.9439

entry_00007_conf_01 -52.0493 -50.4389

entry_00008_conf_01 -52.0076 -50.6343

entry_00009_conf_01 -51.2384 -49.9637

entry_000010_conf_01 -51.2131 -50.1500

Tabel 1.5 Hasil Seleksi Docking Ligan dan Protein p53

Ligan Skor docking terhadap p53

SA2014 -52.0728

Doxorubicin -50.6343 Keterangan: Ligan SA2014 = struktur senyawa1,4,9-

triazatricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol spons laut C.

anomala, doxorubicin= obat anti kanker.

4.3 Validasi Hasil Docking Ligan dan Protein Target

Hasil penyimpangan kuadrat rata - rata akar atau Root

Mean Square Deviation (RMSD) berat atom senyawa hasil

docking dengan referensinya adalah 1.0300 Angstrom. Sebuah

protokol diterima apabila hasil RMSD berat atom dibandingkan

dengan referensinya kurang dari 2.0 Angstrom (Purnomo, 2011).

Jadi protokol yang dikembangkan dapat diterima dan dilakukan

50

uji lanjutan untuk skrining dalam usaha penemuan antikanker

yang bekerja pada protein p53 kanker payudara T47D.

Gambar 4.2A. Hasil RMSD Senyawa Hasil Docking dengan

Referensinya

Gambar 4.2B. Perbesaran Hasil RMSD Senyawa Hasil Docking

dengan Nilai 1.0300 A.

51

4.4 Visualisasi Hasil Docking Menggunakan YASARA

4.4.1 Visualisasi Hasil Docking SA2014 dan Protein p53

Visualisasi hasil docking senyawa alkaloid SA2014

dengan protein p53 menggunakan software YASARA

ditampilkan dalam gambar 4.3A- 4.3C, hasil visualisasi asam

amino pada SA2014 dan protein p53 ditampilkan dalam gambar

4.3D dan 4.3E. Visualisasi Struktur Ligan SA2014 menggunakan

Marvin Space ditampilkan dalam gambar 4.3F.

Gambar 4.3A. Visualisasi Hasil Docking SA2014 dan Protein p53

Menggunakan YASARA Tampak Depan.

Gambar 4.3B. Visualisasi Hasil Docking pada SA2014 dan

Protein p53 Menggunakan YASARA Tampak Samping.

52

Gambar 4.3C. Visualisasi Hasil Docking pada SA2014 dan

Protein p53 Menggunakan YASARA Tampak Belakang.

Gambar 4.3D. Visualisasi Asam Amino pada SA2014 dan Protein

p53 Menggunakan YASARA

53

Gambar 4.3E. Visualisasi Asam Amino pada SA2014 dan Protein

p53 Menggunakan YASARA Jika Diperbesar.

Gambar 4.3F. Visualisasi Struktur Ligan SA2014 Menggunakan

Marvin Space.

4.4.2 Visualisasi Hasil Docking Doxorubicin dan Protein p53

Visualisasi hasil docking senyawa doxorubicin dengan

protein p53 menggunakan software YASARA ditampilkan dalam

gambar 4.4A- 4.4C, hasil visualisasi asam amino pada

doxorubicin dan protein p53 ditampilkan dalam gambar 4.4D dan

4.4E. Visualisasi struktur ligan doxorubicin menggunakan marvin

space ditampilkan dalam gambar 4.4F.

54

Gambar 4.4A. Visualisasi Hasil docking Doxorubicin dan Protein

p53 Menggunakan YASARA Tampak Depan.

Gambar 4.4B. Visualisasi Hasil docking Doxorubicin dan Protein

p53 Menggunakan YASARA Tampak Samping.

55

Gambar 4.4C. Visualisasi Hasil Docking Doxorubicin dan Protein

p53 Menggunakan YASARA Tampak Belakang.

Gambar 4.4D. Visualisasi Asam Amino Doxorubicin dan Protein

p53 Menggunakan YASARA.

56

Gambar 4.4E. Visualisasi Hasil Docking Doxorubicin dan

Protein p53 Menggunakan YASARA Jika diperbesar.

Gambar 4.4F. Visualisasi Struktur Doxorubicin Menggunakan

Marvin Space.

57

4.5 Analisa Visualisasi Asam Amino pada p53

Berdasarkan visualisasi hasil docking antara ligan dan

protein p53 (sub bab 4.3.1 dan 4.3.2) menggunakan software

YASARA, jenis asam amino yang berperan pada interaksi p53

dan senyawa alkaloid SA2014 pada table 1.6.

Tabel 1.6 Jenis Asam Amino pada interaksi p53 dan senyawa

alkaloid SA2014

Asam Glutamat 25

Asam Glutamat 69

Asam Glutamat 95

Asam Glutamat 52

Threonin 26

Threonin 47

Threonin 49

Threonin 63

Threonin 101

Leusin 27

Leusin 33

Leusin 34

Leusin 35

Leusin 37

Leusin 38

Leusin 54

Leusin 57

Leusin 66

Leusin 81

Leusin 82

Leusin 85

Leusin 107

Valin 28

Valin 41

Valin 53

Valin 75

Valin 88

Arginin 29

Arginin 65

Arginin 97

Arginin 105

Prolin 30

Prolin 32

Prolin 89

Lisin 31

Lisin 36

Lisin 39

Lisin 45

Lisin 51

Lisin 64

Lisin 70

Lisin 94

Lisin 98

Serin 40

Serin 78

Serin 90

Serin 92

Glisin 42

Glisin 58

Glisin 83

Glisin 87

Glutamin 72

Tirosin 48

Tirosin 56

Tirosin 60

Tirosin 67

Tirosin 76

Tirosin 100

Tirosin 104

Metionin 50

Metionin 62

Metionin 102

Fenilalanin 55

Fenilalanin 86

Fenilalanin 91

Ileusin 61

Ileusin 74

Ileusin 99

Ileusin 103

Asparagin 68

Asparagin 79

Asparagin 80

Asparagin 84

Asparagin 105

Asparagin 106

58

Valin 93

Valin 108

Valin 109.

Glutamin 44

Glutamin 59

Glutamin 71

Histidin 73

Histidin 96

Sistein 77

Jenis asam amino yang dekat dengan interaksi antara

senyawa alkaloid SA2014 dan protein p53 dapat diketahui

melalui jarak ikatan protein dan ligan menggunakan software

Visual Molecular Dinamic (VMD). Jenis asam amino yang dekat

dengan interaksi antara senyawa alkaloid SA2014 dan protein p53

adalah leusin 34 dengan jarak sebesar 3.91 oA , leusin 57 sebesar

4.12 oA dan fenilalanin 91 memiliki jarak 5.72 oA. Berikut

merupakan hasil visualisasi jarak antara asam amino disekitar

ligan menggunakan VMD.

Gambar 4.5 Hasil Visualisasi Jarak Asam Amino disekitar Ligan

Menggunakan VMD. Keterangan: a. Leusin 34; b. Fenilalanin 91

dan c. Leusin 57.

Berdasarkan hasil visualisasi menggunakan VMD, jenis

asam amino yang dekat dengan interaksi ligan dan protein adalah

fenilalanin dan leusin. Fenilalanin merupakan reseptor yang

a

b

c

59

berperan pada ikatan p53-MDM2 dengan SA2014. Hal ini

dikarenakan fenilalanin merupakan asam amino yang terdapat

pada daerah tetramerisasi daerah p53 protein supresor tumor.

Asam amino fenilalanin berada pada daerah interface interaksi

p53 dan penting untuk menstabilkan struktur tetramerik (Gambar

2.2 pada halaman 12) melalui ikatan hidrogen (Nomura, et al.,

2011). Sehingga apabila terjadi mutasi pada asam amino

fenilalanin dapat mengubah kestabilan struktur tetrameriknya.

Fenilalanin memiliki cincin aromatik yang tidak larut

dalam air (non polar) (Poedjiadi, 2005). Fenilalanin juga memiliki

gugus fenil pada rantai sampingnya (Poedjiadi, 2005). Gugus

fenil inilah yang dapat berikatan dengan senyawa alkaloid

SA2014 pada gugus hidroksil (OH- ).

Gambar 4.6 Struktur Fenilalanin

Asam amino leusin yang berperan pada ikatan p53 dan

SA2014 akan mempengaruhi ketahanan siklus sel pada fase G1/S

dan memicu apoptosis. Hal ini sesuai dengan teori bahwa leusin

menstimulasi biogenesis mitokondria melalui siklus sel (Filhiol,

2012; Sun & Zemel M, 2009). Siklus sel merupakan proses yang

diatur oleh empat fase, yaitu G1, S, G2, and M (Anderson et al.,

2010; Johnson et al., 1999). Biogenesis mitokondria dan

transkripsi dari mitokondria telah ditunjukkan terjadi pada awal

siklus sel, selama fase G1. Selama Fase G1, siklus sel lambat.

Progresi ke fase S tidak akan terjadi tanpa sinyal seluler setelah

60

DNA dikodekan dengan benar (Seyfried & Shelton, 2010;

Michel, et al., 2011; Johnson et al., 1999).

Fungsi mitokondria dibutuhkan untuk siklus sel normal,

terutama fase G1 menuju fase S (Anderson et al., 2010; Michel, et

al., 2011; Chicco, et al., 2007). Fase S dan G2/M tidak

membutuhkan proses mitokondria (Michel, et al., 2011).

Beberapa sel dengan kerusakan DNA atau kehilangan fungsi dari

fosforilasi oksidatif akan mengakibatkan ketahanan siklus sel

untuk perbaikan DNA melalui p53 (Tucci, 2012). Kerusakan

DNA yang tidak dapat diperbaiki akan dikirim ke organel

degradasi melalui autofag atau apoptosis (Anderson, et al., 2010;

Michel, et al., 2011 ; Johnson, et al., 1999).

Kerusakan DNA dapat direspon melalui gen ketahanan

proapoptosis dan akumulasi p53 akan menginisiasi ketahanan

siklus sel (Johnson, et al., 1999). Pada kondisi ini, p53

ditranslokasikan ke nukleus untuk memicu transkripsi p21

(Johnson, et al.,1999; Tucci, 2012). Pada jalur downstream, p21

mengekspresikan cyclin dependent kinase (CDK) untuk

mengakumulasi siklin yang dibutuhkan pada siklus sel (Seyfried

& Shelton, 2010).

p53 akan mengatur siklus sel melalui apoptosis dengan

dua jalur berbeda, yaitu apoptosis bergantung transkripsi dan

apoptosis yang tidak bergantung transkripsi (Seyfried & Shelton,

2010; Leontieva, et al., 2010; Yi J, et al., 2010). Apoptosis

bergantung transkripsi terjadi melalui translokasi p53 ke nukleus

yang akan menginisiasi gen apoptosis BAX, PUMA, dan NOXA.

Pada waktu yang sama, p53 akan mengeblok gen anti apoptosis.

Disisi lain, p53 akan mengatur apoptosis yang tidak bergantung

transkripsi. Bentuk dari apoptosis ini terjadi melalui translokasi

p53 ke mitokondria yang berikatan dengan Bcl-2, akan

mengaktifkan Bax dan bak, aktifnya protein tersebut akan

memicu protein selektif, caspase untuk melakukan apoptosis

(Johnson & Walker, 1999). Kelimpahan leusin dapat berperan

dalam penambahan caspase 3 dimediasi apoptosis (Sheen, et al.,

2011). Sehingga aktivitas p53 dengan SA2014 melalui peran

61

asam amino leusin kemungkinan dapat memicu apoptosis dalam

pengobatan kanker payudara T47D.

Gambar 4.7 Struktur Leusin

Berdasarkan struktur kimianya, leusin memiliki

percabangan pada gugus R alifatiknya sehingga disebut asam

amino berantai cabang. Percabangan gugus R kemungkinan dapat

berikatan dengan OH- pada senyawa alkaloid SA2014 (Poedjiadi,

2005).

Gambar 4.8 Struktur Senyawa Alkaloid SA2014

63

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, senyawa

alkaloid SA2014 memiliki skor docking sebesar -52.0728

sedangkan skor doxorubicin sebesar -50.6343. Jenis asam amino

yang dekat dengan interaksi antara senyawa alkaloid SA2014 dan

protein p53 adalah leusin dan fenilalanin. Senyawa SA2014

memiliki kemampuan sebagai senyawa antikanker melawan

kanker payudara T47D melalui interaksi asam amino leusin dan

fenilalanin.

5.2 Saran

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat

diajukan saran untuk penelitian selanjutnya sebagai berikut:

1) Perlu dilakukan metode in vitro untuk membuktikan

bahwa senyawa SA2014 memiliki potensi sebagai

senyawa antikanker terhadap kanker payudara T47D.

2) Perlu dilakukan docking dengan database protein lainnya

yang dapat menginduksi apoptosis untuk memvalidasi

hasil yang lebih baik.

3) Perlu pengembangan software docking untuk

menghasilkan skor interaksi protein dan ligan yang lebih

baik.

65

DAFTAR PUSTAKA

Agarwal, M.L., Agarwal, A., Taylor, W.R., and Stark, G.R. 1995.

p53 controls both the G2/M and the G1 cell cycle checkpoints and

mediates reversible growth arrest in human fibroblasts. Proc Natl

Acad Sci. 92: 8493-8497.

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K.,and

Walter, P. 2008. Molecular Biology of The Cell fifth edition.

Oxford: Garland Science.

Anderson, R.M., and Weindruch, R. 2010. Metabolic

reprogramming, caloric restriction, and aging. Trends in

Endocridal Metabolism ;21(3) 134-141

Anonim1. 2007. SIRS Data penderita breast cancer di

Indonesia. Dinas Kesehatan Nasional.

<http://www.depkes.go.id/> [9 September 2015].

Anonim2. 2006. Informasi Dasar Tentang kanker Cetakan ke-

4. Jakarta: Yayasan Kanker Indonesia:

Anonim3. 2004. Survei Kesehatan rumah Tangga (SKRT)

Sudut Pandang Masyarakat Mengenai Status, Cakupan,

Ketanggapan dan Sistem Pelayanan Kesehatan. Jakarta: Badan

Litbangkes.

Anonim4 2008. Cell Biology. <http://www.atcc.org>[9 September

2015].

Anonim5. 2015. Struktur Tiga Dimensi p53 Supresor Tumor

Kompleks dengan DNA. <http://www.rcsb.org>[1 Nopember

2015].

Anonim6. 2015. Struktur Doxorubicin.

<http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov>[1 Nopember 2015].

66

Bai, L., and Zhu, G. 2006. p53: Structure, Function and

Therapeutic Applications, [cited 2010 august.11] available from

<http://mupnet.com/>[1 Nopember 2015].

Bai, Ling and Wei Ghuo Zhu. 2006. p53: Structure, function and

therapeutic applications. Journal of Cancer Molecules. 2(4):

141-153.

Barnard, M.J., and Drowns, M.G., 1998. Model-ling scene

illumination colour for computer visi-on and image reproduction:

A survey of com-putational approach. J. Chem. Inf. Comput.

Sci. Vol. 38. pp.983-996.

Bender, A., and Glen, C.R. 2005. A discussion of measure of

enrichment in virtual screening: Comparing the information

content of descriptors with increasing levels of sophistication. J.

Chem. Inf. Model. Vol 45. pp. 1369-1375.

Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N.,

Weissig, H., Shindyalov, I.N., and Bourne, P.E. 2000. The

Protein Data Bank. Nucleic Acids Res.Vol 28 235–242.

Bosman. 1999. Onkologi Edisi Kelima.Yogyakarta: UGM Press.

Botchkarev, V.A. 2003. Molecular mechanism of chemotherapy-

induced hair loss. Journal of Investigative Dermatology 8:72-5.

Bruton, L., Lazo, J. S., and Parker, K. L. 2005. Goodman &

Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics 11th

Edition. Lange: McGrawHill.

Burgess, J.G., Jordan, E.M., Bregu, M., Mearns-Spragg, A., and

Boyd, K.G. 1999. Microbial antagonism: a neglected avenue of

natural product research. Journal Biotechnology 70: 27-32.

67

Cardenas P. 2015. World Porifera Database. <http://www.

marienspecies.org/porifera/porifera.php>[14 Desember 2015].

Charfare, H., Limongelli, S., and Purushotham, A.D. 2006.

Neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Br J Surg

92(92):14-23.

Chen, C.Y., Oliner, J.D., Zhan, Q., Fornace, A.J., Jr., Vogelstein,

B., and Kastan MB. 1994. Interaction between p53 and MDM2 in

mammalian cell cycle checkpoint pathway. Proc Natl Acad Sci.

Chicco, A.J., and Sparagna, G.C. 2007. Role of cardiolipin

alterations in mitochondrial dysfunction and disease. Am J

Physiol Cell Physiol 292(1):C33-44.

Childs, A.C., Phaneuf, S.L., Dirks, A.J., Phillips, T., and

Leeuwenburgh. 2002. Doxorubicin treatment in Vivo causes

cytochrome C release and cardiomyocyte apoptosis as well as

increased mitochondrial efficiency, superoxide dismutase

activity, and Bcl-2:Bax Ratio. Cancer Research, 62:4592-4598.

Claire, A.S., Rittschof, D., Gerhart, D.J., Hooper, I.R., and

Bonaventura, J. 1999. Anti-settlement and narcotic action of

analogues of diterpene marine natural product antifoulant from

octocarals. Marine Biotechnology 1: 427-436.

Clarke. 2000. Breast Cancer Metastasis, Molecular and

Cellular Mechanism and Clinical Intervention. Kluwer

academic Publisher.

Coley, H.M. 2008. Mechanisms and strategies to overcome

chemotherapy resistance in metastatic breast cancer. Cancer

Treat Rev. 34, 378-90.

68

Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer.

1996. Breast cancer and hormonal contraceptives: collaborative

reanalysis of individual data on 53,297 women with breast cancer

and 100,239 women without breast cancer from 54

epidemiological studies. Lancet. 347, 1713-27.

Crawford, J.M., Kumar, V., and Robbins. 2002. Neoplasia. In:

vinay kumar, Cotran S., Stanley L., and Robbins: Robbins Basic

pathology 7edition. Philadelphia: Saunders.

De Goeij, J.M., Van den Berg, H., Van Oostveen, M.M., Epping,

E.H.G., and Van Duyl, F.C. 2008. Major bulk dissolved organic

carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges.

Mar Ecol Prog Ser. 357: 139–151.

De Vos, L., Rutzler, K., Boury-Esnault, N., Donadey, C., and

Vacelet, J. 1991. Atlas of Sponge Morphology. Atlas de

morphologie des e´ponges. Washington & London: Smithsonian

Institution Press. 117 p.

Demain, A.L. 1998. Introduction of Microbial Secondary

Metabolism. Review Article. Int. Microbiol 1: 259-264.

Djide, N., Sartini, and Kadir. 2007. Dasar- dasar Mikrobiologi.

Bioteknologi Farmasi. Makassar: Unhass Press.

Does, A., Jhonson, N.A., and Thiel, T. 2007. Rediscovering

Biology: Cell biology cancer.

<http://www.learner.org/courses/biology.html> [13 Juli 2014].

Donehower, L.A, Harvey, M., Slagle, B.L., McArthur, M.J.,

Montgomery, C.A.Jr., Butel, J., and Bradley, A. 1992. Mice

deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to

spontaneous tumor. Nature; 356:215-21.

69

Faulkner, D.J. 2001. Marine Natural Product. Nat. Prod. Rep.

18: 1- 49.

Filhiol, T. M. 2012. The Effects of Leucine on Mitochondrial

Biogenesis and Cell Cycle in A-375 Melanoma Cells. Thesis.

University of Tennessee. KnoxvilleTrace.

Finlay, C.A., Hinds, P.W., and Levine, A.J. 1989. The p53 proto-

oncogene can act as a suppressor of transformation, Cell.

57:1083-1093.

Fruman, D.A., Edinger, A.L.2008. Cancer therapy: staying

current with AMPK. Biochem J 412:e3-5.

Gewirtz, D.A. 1999. A critical evaluation of the mechanisms of

action proposed for the antitumor effects of the anthracycline

antibiotics adriamycin and daunorubicin. Journal Biochem.

Pharmacol.. 57:727-741.

Gibbs, J.B. 2000. Anticancer drug target: Growth factors and

growth factor: Signalling J Clin Invest. 105 (1): 9-13.

Gondhowiardjo. 2004. Proliferasi sel dan Keganasan. Majalah

Kedokteran indonesia 54(7).

Gottlieb, E., and Vousden, K.H. 2010. p53 regulation of

metabolic pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol.

Grosovsky, A.J., De Boer, J.G., De Jong, P.J., Drobetsky, E.A.,

and Glickman, B.W. 1988. Base substitution, frameshift, and

small deletions constitute ionizing radiation -induced point

mutations in mammalian cells. Proceeding Natl. Acad. Sci.

USA; 85:185-188.

70

Han, X., Pan, J. Ren, D., Cheng, Y., Fan, P., and Lou., H. 2008.

Naringenin- 7-O glucoside protects against doxorubicin-induced

toxicity in H9c2 cardiomyocites by induction of endogenous

antioxidant enzymes. Food and Chemical Toxicology 46: 3140-

3146.

Hanahan, D. 2011. Hallmarks of Cancer: the next generation.

Cell. 144, 646–674.

Haufner, B. 2003. Drug Discover Today (8): 536 – 44.

Hentschel, U., Fieseler, L., Wehrl, M., Gernert, C., and Steinert,

M. 2003. Microbial diversity of marine sponges. Progr Mol

Subcell Biol 37: 59–88.

Hondermarck, H. 2003. Breast cancer when proteomics

challenges biological complexity. Molecullar and cellular

proteomics: MCP 2(5) 281-91.

Hudis, CA. 2007. Trastuzumab–mechanism of action and use in

clinical practice. N Engl J Med. 357 (1): 39–51. Jul 5;357(1):39-

51.

Hunt, J.D., and Jay, D. 1998. An introduction to Cancer.<

http://www.medschool.lsuhsc.edu/genetics_center/louisiana

/article_cancer.htm/> [22 juni 2015].

Iwamaru, A., Iwado, E., and Kondo, S. 2007. Eupalmarea acetate,

a novel anticancer agent from carribean gorgonian octocorals,

induces apoptosis in malignant glioma cells via the c-jun NH2

terminal kinase pathway. Molecular Cancer Therapeutics vol. 6

No.1 pp. 184-192.

Jain, A. N., and Nicholls, A. 2008. Recommendation for

evaluation of computational methods, Journal Compt. Aidded

Mol. Des. 22: 133-139.

71

Jha, R.K., and Zi- Rong. 2004. Biomedical compounds from

marien organism. Mar. Drugs. 2, 123-146.

Johnson, D.G., and Walker, C.L. 1999. Cyclins and cell cycle

checkpoints: Cell cycle review. Annu Rev Pharmacol Toxicol

;39:295-312.

Jong, W.D., and Sjamsuhudijat, R. 2005. Payudara dalam Buku

Ajar Ilmu Bedah Ed. ke-2. Jakarta: Buku kedokteran EGC.

Joseph, B., and Sujatha. 2011. Pharmacologically important

natural products from marine sponges. Journal of natural

products Vol 4 p: 5-12.

Knapp, B. 2012. An introduction into docking and molecular

dynamics simulations. Medical University of Vienna / AKH

(General Hospital).

Kroemer, R.T. 2003. Molecular Modelling Probes : Docking and

Scoring. J. Biochemical Socie-ty, 31(5). pp.980-981.

Kumariya, R.,, Amit, K. B., and Smita, S. 2012. p53-Cells Inbuilt

Mechanism to Inhibit Cancer through Apoptosis. Journal

Cancer Science and Therapy 4:10.

Kurumbail, R.G. 1996. Cyclooxygenase-2 (Prostaglandin

Synthase-2 Complexed with a Selective Inhibitor), SC-558 IN

I222 Space Goup. <http://www.pdb.org/

pdb/explore/explore.do?structureId=6COX> [1 Oktober 2015].

Kute, T., Lack, C.M., Willingham, M., Bishwokama, B.,

Williams, H., Barrett, K., Mitchell, T., and Vaughn, J.P. 2004.

Development of herceptin resistance in breast cancer cells.

Cytometry 57A (2): 86–93.

72

Lane, D.P., and Crawford, L.V. 1979. T antigen is bound to a

host protein in SV40-transformed cells. Nature. 278, 261-263.

Leao, M., Clara, P., Alessandra, B., Yari C., Ana, M. P., Neuza

M., Andreia, P., Miguel, X., Fernandes, Madalena P., Alberto, I.,

Luci´lia, S., and Emilia, S. 2013. Discovery of a new small-

molecule inhibitor of p53–MDM2 interaction Using a yeast-based

approach. Biochemical Pharmacology 85:1234–1245.

Lehman, T.A., Reddel, R., Pfeifer, A.M.A., Spillare, E., Kaighn,

E., Weston, A., Gerwin, B.I., and Harris, C.C. 1991. Oncogenes

and tumor-suppressor genes. Env. Health. Persp. 93:133-144.

Leontieva, O.V., Gudkov, A.V., Blagosklonny, M.V. 2010. Weak

p53 permits senescence during cell cycle arrest. Cell Cycle

;9(21):4323-7

Lodish, H., Arnold, B., Christ. A., Kaiser, M.K., Anthony, D.,

Hidde, P., and Angelika, A. 2000. Molecular Cell Biology

Seventh Edition. New York: WH Freeman & Company.

Long, R.A. & Azam, F. 2001. Antagonistic Interactions among

marine pelagic bacteria. Appl Environ Microbiol 67: 49754983.

Love, R.L., Leventhal, H., Easterling, D.V., and Nerenz. D.R.

1989. Side Effects and Emotional Distress During Cancer

Chemotherapy. Wisconsin Clinical Cancer Center. 63:604-12.

Lowe, S.W., Schmitt, E.M., Smith, S.W., Osborne, B.A., and

Jacks, T. 1993. p53 is required for radiation-induced apoptosis in

mouse thymocytes, Nature. 362:847-9.

Lumongga, F. 2008. Invasi Sel Kanker. Departemen Patologi

Anatomi UMS.

73

Luo, Z., Zang, M., and Guo, W. 2010. AMPK as a metabolic

tumor suppressor: control of metabolism and cell growth. Future

Oncol ;6:457-70.

Lyskov, S., and Gray, J.J. 2008. The Rosetta Dock server for local

protein-protein docking. Nucleic Acids Res. 36: 233-238.

Macdonald, F., and Ford, C. H. J. 1997. Molecular Biology of

Cancer. Oxford: Bio Scientific Publisher.

Machida, K., Abe, T., Arai, Okamoto, D., and Shimizu, M. 2014.

cinanthrenol a, an estrogenic steroid containing phenanthrene

nucleus from marine sponge Cinachyrella sp. Organic letters

16(6) : 1539- 1541.

Maddocks, O.D., and Vousden, K.H. 2011. Metabolic regulation

by p53. J Mol Med (Berl) ;89:237-45.

Makwane, N., and Alpana, S. 2009. Study of mutations in p53

tumour suppressor gene in human sporadic breast cancers. Indian

Journal of Clinical Biochemistry 24(3) 223-228.

Mardiana, L. 2004. Kanker Pada Wanita Pencegahan dan

Pengobatan dengan Tanaman Obat. Jakarta: Penebar Swadaya.

Marshall, G.R. 1987. Computer aided drug design. Annual

review of Pharmacology and Toxicology 27(1): 193- 213.

Maximov, G.K., 2008. The Role of p53 Tumor-Supressor Protein

in Apoptosis and Carcinogenesis. Biotechnol Review 22:664-

668.

Maxwell, P. 2001. Global Cancer Statistic in The Year 2000. The

Lancet Oncology Vol. 2 No.9, pp 533-543.

74

Michel, S., Wanet, A., De Pauw, A., Rommelaere, G., Arnould,

T., and Renard, P. 2011. Crosstalk between mitochondrial

(dys)function and mitochondrial abundance. J Cell Physiol ;

227:2297-2310.

Miettinen, S. 2009. Targetting the Growth of Ovarian Cancer

Cell. Dissertation. Finland: University of Tampere.

Minotti, G., Menna, P., Salvatorelli, E., Cairo,G., and Gianni, L.

2004. Anthracyclins: molecular advances and pharmacologic

developments in antitumor activity and cardiotoxicity.

Pharmacol Rev; 56:185-228.

Moittesier, N., Englebienne, P. L., and Corbeil. 2008. Toward the

development of universal, fast and highly accurate docking

/Scoring methods: a long way to go: Journal Pharmacology.

153: S7-S26.

Motiejunas, D.& Wade, R. 2006. Structural, energetics, and

dinamic aspects of ligand-receptor interaction In J B. Taylor &

D.J Triggle (Eds) Comprehensive medicinal chemistry II vol 4:

Computer-assisted drug design. Elsevier.

Muller, W.E.G., Schroder, H.J. & Wiens, M. 2004. Approaches

for a sustainable exploitation of biodiversity

(secondarymetabolites ans biomaterials from sponses) in

traditional and modern biomedical prospecting:part ii-the

benefits. eCAM 1:133-144.

Nigro, J.M., and Baker, S.J. 1989. Mutations in p53 gene occur in

diverse tumour types. Nature; 342: 705-8.

Nofiani, R. 2008. Urgensi dan Mekanisme Biosintesis Metabolit

Sekunder Mikroba Laut. Jurnal Natur Indonesia 10(2) : 120-

125.

75

Nomura, T., Kamada, R., Ito, I., Sakamoto, K., Chuman, Y.,

Ishimori, K., Shimohigashi, Y., and Sakaguchi, K. 2011. Probing

Phenylalanine Environments in Oligomeric Structures with

Pentafluorophenylalanine and Cyclohexylalanine. Article

Biopolymers 95(6):410-9 ·

Noorwati, S. 2007. Kemoterapi, Manfaat dan Efek Samping.

Dharmais Cancer Hospital. Jakarta.

Nurhayati, A.P.D; Rarastoeti, P., Subagus, W., Istriyati and

Nichole, J. De Voogt. 2014. The Anticancer Activity of Marine

Sponge Cinachyrella sp. (Family Tetillidae) IPTEK. The Journal

for Technology and Science. Vol. 25, No. 3.

Nurhayati, A.P.D, Pratiwi, Wahyuono, Istriyati, and Syamsudin.

2015. Cellular mechanism of anti-cancerous activity in active

marine sponge Cinachyrella anomala against T47D cell.

International Journal of Current Microbiology and Applied

Sciences. Vol 4 No3 pp 785-791.

Nurhayati, A.P.D, Pratiwi, Wahyuono, Istriyati, Fadlan and

Syamsudin. 2014. Isolation and identification of alkaloid

compound of marine sponge Cinachyrella sp. (Family Tetillidae).

Jounal of Advanced Botany and Zoology.

Nurhayati, A.P.D, Rarastoeti, P., Subagus W., Istriyati, Hari P.,

and Syamsudin A. 2015. In vitro test and molecular docking of

alkaloid compound in marine sponge Cinachyrella anomala

against T47D cell cycle. Journal Marine Science Research and

Development Vol5 Issue 2. Olivier, M., Langerod, A., and Carrieri, P. 2006. The clinical

value of somatic TP53 gene mutation in 1,794 patients with

breast cancer. Clin Cancer res. 12: 1157-1167.

76

Parada, L.F., Tabin, C., Shih, C.J., and Weinberg, R.A. 1982.

Human EJ bladder carcinoma oncogene is homologue of Harvey

sarcoma virus ras gene. Nature; 297: 474-8.

Partridge, A.H., Burstein, H.J., and Winer, E.P. 2001. Side effects

of chemotherapy and combined chemohormonal therapy in

women with breast cancer. Journal of the National Cancer

Institute Monographs. 30:135-42.

Poedjiadi, Anna. 2005. Dasar – dasar Biokimia. Jakarta:

Penerbit Universitas Indonesia (UI Press).

Proksch, P., Edrada, R. and Ebel, R. 2002. Drugs from The sea :

Current status and microbiological implications, J Appl.

Microbiol. Biotechnol. 59: 125-134.

Purnomo, H. 2011. Kimia Komputasi: Molecular Docking

Plants Penambatan Molekul Plants [Protein-Ligand-Ant-

System] (Ilmu Semut). Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Quinion, M. 2011. World Wide Words : In Silico. [Serial on the

internet]. <http://www.worldwidewords.org/weirdwords/ww-ins1.html> [1 Oktober 2015].

Santoyo, A.H., Aldo, Y., Victor, A., Héctor, V., and Claudia, M.

B. 2013.Protein-Protein and Protein-Ligand Docking DOI:

10.5772/56376. <http://www.intechopen.com/books/protein-

engineering-technology-and-application/protein-protein-and-

protein-ligand-docking> [9 Oktober 2015].

Schafer. 2000. Pencegahan Infeksi dan Praktek yang Aman.

Jakarta.

Schapira, M. 2003. Making virtual screening a reality. PNAS.

Vol. 100.pp.7354–7359.

77

Schroder, H.C., Ushijima, H., Krasko, A., Gamulin, V., Shut ze,

J. & Muller, I . M. 2003. Emergence and disappearance of an

immun molecule, an antimicrobial lectin, in basal metazoa: the

achylectin family. J Biol Chem 278: 32810-32817.

Schroer, T. A. 2005. Cell cycle 2 molecular mechanisms of cell

cycle progression.

<http://www.pha.jhu.edu/~ghzheng/old/webct/note7_3.files/F13-

31.gif > [9 Oktober 2015].

Seyfried L, Shelton L. 2010. Cancer as a Metabolic Disease.

Nutri Metab ;7:7 .

Sheen, J.H., Zoncu, R., Kim, D., and Sabatini, D.M. 2011.

Defective Regulation of Autophagy upon leucine deprivation

reveals a targetable liability of human melanoma cells in vitro and

in vivo. Cancer Cell ;19:613-62.

Shimogawa, H., Kuribayashi,S., Teruya,T., Suenaga, K., and

Kigoshi, H. 2006. Tetrahedron Letters, 47: 1409–1411.

Shoichet, B.K. 2004. Virtual screening of chemical libraries.

Nature. Vol.432. pp. 862-865 .

Siswandono. 2000. Kimia Medisinal. Surabaya.: Universitas

Airlangga Press.

Sjogren, S., Inganas, M., and Norberg, T. 1996. The p53 gene in

breast cancer: prognostic value of complementary DNA

sequencing versus Immunohistochemistry. Journal of the

National Cancer Institute 88:173-182.

Smith, M.L., and Fornace. 1996. Abnormality on the P53

pathway. Cancer research.

78

Sokolosky, M.L., Stadelman, K.M., and Chappell, W.H. 2011.

Involvement of Akt-1 and mTOR in Sensitivity of Breast Cancer

to Targeted Therapy. Oncotarget.

Solomon, H. 2011. Mutant p53 gain of function is interwoven

into the hallmarks of cancer. J. Pathol.225, 475–478.

Soussi, T, 2004. Analysis of p53 Gene Alterations in Cancer: a

Critical Review. In: Hainaut, P., Wiman, K.G. editors. 25 Years

of p53 Research. Netherlands: Springer, p. 259-288.

Stansfield, W., Jaime, S.,and Raul, J. 2006. Biologi Molekuler

dan Sel. Jakarta.: Penerbit Erlangga.

Sukandar, E. Y. 2014. Tren dan Paradigma Dunia Farmasi:

Industri-Klinik-Teknologi Kesehatan. Bandung: Departemen

Farmasi, FMIPA ITB.

Sun, X., and Zemel, M.B. 2009. Leucine Modulation of

Mitochondrial Mass and Oxygen Consumption in Skeletal Muscle

Cells and Adipocytes. Nutri Metab ;6: 26.

Syaifudin, M. 2010. Perubahan Molekuler Gen Penekan Tumor

p53 Akibat Pajanan Radiasi Pengion. Seminar Nasional VI

SDM Teknologi Nuklir.

Tambunan, U., Bramantya, N., and Arli, A.P. 2011. In silico

modification of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) as

potential inhibitor for class II histone deacetylase (HDAC). BMC

Bioinformatics. 12(Supply 13) : S23 doi: 1186/ 1471-2105-12-

S13-S23.

Taylor, M.W., Radax, R., Steger, D., and Wagner, M. 2007.

Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology and

79

biotechnological potential. Microbiol Mol Biol Rev. 71: 295–

347.

Tegar, M and Hari, P. 2013. Tea leaves extractted as anti malaria

basedon molecular docking PLANTS. Procedia Environmental

Sciences. 17: 188-194.

Thakur, and Muller, W. 2004. A Review Marine Biotechnology.

6: 105- 117.

Thakur, N.L., Hensschel, U., Krasko, A., Anil, A.C. and Muller,

W.E.G. 2003. Antibcterial activity of the sponse suberites

domuncula and its primmorphs: potential basis for chemical

defense. Aquatic Microbiol Ecol 31: 77-83.

Tucci, P. 2012. Caloric restriction: is mammalian life extension

linked to p53? Aging (Albany NY) ;4(8):525-34.

Ullah, M. F and M. Aatif. 2009. Hot Topic. The footprints of

cancer development: cancer biomarker. Cancer Treatment

Reviews. 35: 193-200.

Van Soest, Rob, W. M., Nicole B-E., Jean V., Martin D., Dirk E.,

Nicole J. D V., Nadiezhda S., Bart V., Michelle K., and John N.

A. 2012. Global Diversity of Sponges (Porifera). PLoS ONE.

7(4): e35105.

Verma, S.P. Goldin, B. R., and Lin, P.S. 1998. The inhibition of

The Estrogenic Effects of Pesticides and environmental Chemicals

by Curcumin and Isoflavonoid, Envir. Health Presp, 106(12)

807- 812.

Vogelstein, B., Lane, and D., Levine, A.J. 2000. Surfing the p53

Network. Nature 408: 307-310.

80

Vousden, K. H. 2000. p53: death star. Cell 103:691-694.

Vousden, K. H and C. Prives. 2009. “Blinded by the light: the

growing complexity of p53. Cell vol. 137, no. 3, pp. 413–431.

Walerych, D., Marco, N., Licio Collavin; dan Giannino Del Sal.

2012. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in

breast cancer. Carcinogenesis.Vol.00 p. 1-11.

Westinga, E., and Hoetjes, P. 1981. The intrasponge fauna of

Spheciospongia vesparia (Porifera, Demospongiae) at Curac¸ao

and Bonaire. Mar Biol. 62: 139–150.

Wiens, M., Luckas, B., Brummer, F., Ammar, M.S.A., Steffen, R.

and Batel, R. 2003. Okadaic acid: a potential defense molecule

for the sponse Suberites domuncula. Mar Biol 142: 213-223.

Williams, D.E. and Andersen, R.J. 2006. Coral reefs toclinical

trials: bio prospecting for drugs from the sea. report on

international seminar and workshop on marine biodiversity and

their potential fordeveloping bio-pharmaceutical industry in

Indonesia. Research Center for Marine and Fisheries Product

Processing and Biotechnology Book 2. Jakarta. p. 80–92.

Wishart, D.S., Knox, C., Guo, A.C., Shrivastava, S., M.

Hassanali, P. Stothard, Z. Chang, and J.Woolsey. 2006. Drug

Bank: a comprehensive resource for in silico drug discovery and

exploration. Nucleic Acids Res. 1: 34–36.

Wozniak, M.A and Keely, P.J. 2005. Use of three dimensional

collagen gels to study mechanotransduction in t47d breast

epithelial cell. biol. Proced. Online. 7(1): 144-161.

Wullschleger, S., Loewith, R., and Hall, M.N. 2006. mTOR

signaling in growth and metabolism. Cell;124:471-84.

81

Xue, W, L., Zender, C., and Miething. 2007.Senescence and

tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver

carcinomas. Nature vol. 445, no. 7128, pp. 656–660.

Yi, J., and Luo, J. 2010. SIRT1 and p53, effect on cancer,

senescence and beyond. Biochim Biophys Acta ;1804(8):1684-9

Zampieri, L., Bianchi, P., Ruff, P., and Arbuthnot, P. 2002.

Differential modulation by estradiol of P-glycoprotein drug

resistance protein expression in cultured MCF and T47D breast

cancer cells. Anticancer Res. 22(4) 2253-9.

83

LAMPIRAN

1.Prosedur docking menggunakan PLANTS

1.1 Instalasi Co- pendrivelinux KDE

1.1.1 Buka link http://www. pendrivelinux.com/run-

pendrivelinux-2009-in-windows.

1.1.2 Buat folder baru di drive C sebagai tempat instalasi

program misalnya “docking_plants”. Kopi file Co-

pendrivelinux- KDE ke folder docking_plants di hardisk

C.

1.1.3 Salin file Co- pendrivelinux – KDE.exe ke dalam foler

C:/docking_plants

84

1.1.4 Double klik ikon co-pendrivelinux-KDE akan muncul

tampilan berikut. Klik “extract”

1.1.5 Saat proses ekstraksi selesai, akan muncul folder baru

Co-pendrivelinux-KDE. Masuk ke dalam folder tersebut,

kopi file bernama “start- pendrivelinux” sebagai shortcut

ke desktop dengan cara klik kanan > copy > ke desktop >

paste shortcut.

1.1.6 Masuk ke desktop. Klik kanan shortcut dan pilih run as

administrator”. Akan muncul pertanyaan apakah aplikasi

ini boleh atau tidak dijalankan. Klik “yes”.

Muncul tampilan berikut:

1.1.7 Silahkan klik sembarang tombol untuk melanjutkan.

1.1.8 Toolbar linux distro Debian akan muncul di bagian atas

desktop.

1.1.9 Co- Pendrivelinux KDE siap untuk digunakan

85

1.2 Download dan Instalasi PLANTS

1.2.1 Buka link http://www.tcd.uni .de/research/plants.php jika

ingin mendownload program PLANTS.

1.2.2 Klik kanan link PLANTS 1.1 (32 bit demo version) dan

pilih “save target as… “ ke C\ docking_plants.

1.2.3 Buka console di Co-pendrivelinux – KDE (ikon nomor 7

dari toolbar Debian)

1.2.4 Klik perintah berikut untuk mengcopi file dari folder

PLANTS ke Co pendrivelinux KDE:

Pendrivelinux:-# cp/ mnt/win/docking_plants/PLANTS

PLANTS

1.2.5 Ketik perintah berikut untuk membuat PLANTS menajdi

file yang dapat dijalankan:

Pendrivelinux:-# chmod u+ x PLANTS

1.2.6 Ketik perintah berikut untuk mencoba apakah PLANTS

sudah dapat berfungsi atau belum:

Pendrivelinux:-# ./PLANTS

1.2.7 Jika muncul tampilan seperti dibawah ini, maka PLANTS

sudah dapat digunakan.

86

1.3 Download dan Instalasi ChemAxon

1.3.1 Buka link http://www.chemaxon.com/marvin/download-

user.html

1.3.2 Klik “ I accept the terms of the license agreement”,

kemudian double click “Windows Installer with Java”.

Anda akan diarahkan ke halaman login.

1.3.3 Klik “registration” lalu pilih “I agree to these terms”. Isi

formulir registrasi yang disediakan dan submit.

1.3.4 Login dan download “Windows Installer With Java”

(marvinbeans -5_2_06-windows_with_jre.exe) ke

C:\docking_plants.

1.3.5 Ikuti petunjuk instalasi dari windows hingga selesai (klik

Next…

1.3.6 Saat anda selesai melakukan instalasi, amak desktop anda

akan muncul ikon MarvinSketc. Klik ikon tersebut.

1.3.7 Jika muncul jendela seperti dibawah ini, maka

MarvinSketch dapat digunakan.

87

1.4 Download dan Instalasi YASARA

1.4.1 Buka link http://www. Yasara.org/viewdl.htm

1.4.2 Isi formulir yang sesuai dengan anda. Gunakan alamat

email yang valid, link untuk download akan dikirimkan

oleh YASARA ke email tersebut.

1.4.3 Masuk ke alamat email anda. Download YASARA sesuai

petunjuk di email anda. Simpan dalam C:\docking_plants

1.4.4 Double click di ikon file YASARA dan klik “run”.

1.4.5 Folder baru YASARA akan muncul saat proses ekstraksi

selesai dilakukan. Masuk ke folder tersebut, temukan file

bernama “yasara.exe”. Kopi file tersebut sebagai shortcut

ke desktop (klik kanan file> copy> ke desktop > paste

shortcut).

1.4.6 Klik ikon tersebut dan muncul tampilan berikut:

88

1.4.7 Tampilan akan segera berubah menjadi:

1.4.8 YASARA sudah siap digunakan

2.1 Preparasi Protein

2.1.1 Buka link berikut: http://rcsb.org/pdb/explore

.do?structure=1YCR

2.1.2 Download file 1YCR.pdb

2.1.3 Buka YASARA (Klik shortcut YASARA di desktop).

Load file 1YCR.pdb ke YASARA (YASARA| File >

load> PDB File.. cari direktori tempaty menyimpan file

tersebut klik “OK”)

89

2.1.4 Hapus bagian dari sistem yang tidak diperlukan dalam

protocol docking (dibutuhkan hanya satu protein,

termasuk air jika esensial dan satu ligan).

2.1.5 Hidrogen ditambahkan ke dalam sistem dengan bantuan

YASARA sebab resolusi struktur kristal tidak mampu

memprediksi keberadaan hidrogen (Edit > Add>

Hydrogens to: all).

2.16 Simpan file sebagai YASARA Object ( File> Save as>

YASARA Object). Ligan asli di hapus sehingga hanya

menyisakan protein target saja dengan pocket untuk

docking (Edit > Delete > Residue).

90

2.1.7 Hasilnya disimpan dalam bentuk berkas protein.mol2

(File > Save as > Other format).

2.1.8 Koordinat pocket dapat diketahui dengan merujuk pada

koordinat ligan 3D asli, sehingga dibutuhkan file mol2

yang berisi ligan asli. Ketik File > New dan klik “Yes”.

2.1.9 Buka File > Yasara Object lalu pilih Edit > Delete >

Residue). Pilih nama 1YCR atau Belongs to or has All,

opsi "negate name" diaktifkan kemudian klik “OK".

Hasil disimpan sebagai ref_ligand.mol2.

2.2 Preparasi Ligan

2.2.1 Buka MarvinSketch dan gambarkan senyawa SA2014

secara manual di jendela MarvinSketch.

2.2.2 Menggambar manual struktur dibawah ini

91

2.2.3 Cek protonasi di Ph 7,4 (Tools > protonation > major

Microspesies| klik “OK” dijendela yang baru terbuka)

2.2.4 Klik kanan dijendela yang memunculkan major species

pilih “ Save as”

2.2.5 Simpan di C:/ docking_plants sebagai ligand_2D.mrv lalu

ditutup jendela marvinSketch.

2.2.6 Jendela marvinSketch yang baru dibuka (File>

Open…ligand_2D.mrv

2.2.7 Konformasi dicari (Tools> Conformation> Conformers)

dan klik “OK” untuk diperlihatkan dalam bentuk 3-

dimensi, berkas disimpan dalam bentuk mol2.

2.3 Input File Preparation

2.3.1 Jalankan command berikut di pendrivelinux

2.4 Simulasi Docking PLANTS

2.4.1 Jalankan pendrivelinux dan tunggu prosesnya hingga

selesai.

2.5 Interpretasi Hasil Docking

2.5.1 Jalankan pendrivelinux dan ketik sebagai berikut:

92

2.5.2 Ketik Pendrivelinux:-# cd results

Pendrivelinux:-# results #more bestranking.csv

akan muncul hasil berikut:

Dari hasil diatas diketahui 10 input konformasi yang

disubmit ke simulasi, lalu diseleksi skor terendah dan file

dikopi di c:/docking_plants.

Pendrivelinux:-#results# cp*entry_00007_conf_01.mol2

/mnt/win/docking_plants/

2.5.3 Jalankan YASARA. Load ref_ligand.mol2 dan file hasil

docking yang dikopikan di C:/docking_plants ke

YASARA. Disimpan sebagai YASARA scene di

C:/PLANTS dengan nama align.sce, delete atom

hydrogen (YASARA| Edit > Delete > Hydrogens) dan

hitung RMSD pose hasil docking dengan hasil

eksperimen.

93

2.5.4 Analyze > RMSD of > Molecules… akan muncul jendela

seperti berikut dua kali. Pada saat muncul pertama pilih

sequence dengan kolom 3 bernomor 1. Pada kemunculan

kedua pilih sequence atas atau sequence dengan kolom 3

bernomor 2. Sementara Name dan Belongs to or has

dibiarkan apa adanya.

2.5.5 Lalu akan muncul jendela dibawah ini

2.5.6 Pastikan semua opsi unchecked kecuali opsi dibawah

tulisan “ molecule” sehingga menjadi:

dan klik “ OK”

2.5.7 akan muncul jendela command line dari YASARA

dibagian bawah akan menampakkan kalkulasi RMSD.

2.6 Membuat file PDB dari Hasil Docking

2.6.1 Buka YASARA

File.. Load.. other file format

Akan tampak format klik mol.2-Sybyl.mol2

Browse: tempat file kita berada

Klik. Protein.mol2 … lalu OKE.

2.6.2 File… load… other file format

Akan tampak format klik mol.2 Sybyl.mol2

Browse: tempat file kita berada

94

Klik.ligand entry_00001conf_01.mol2… lalu OKE.

2.6.3 Sorot Edit… join.. obyek

Lalu klik baris 2 Sequen

Klik baris 1 Name

Klik belong to All, klik OK

Klik baris ke 1 sequen

Klik baris ke 2 Name

Klik belong to All, klik OK

2.6.4 Sorot file… save as… PDB File, lalu klik 1 protein pada

sequence dan klik protein pada Name > OK.

2.6.5 Simpan file di folder yang diinginkan, mislnya

valid_1YCR.PDB.

3.1 Visualisasi Hasil Docking Menggunakan YASARA

3.1.1 Buka YASARA

3.1.2 Klik file> load> PDB file > cari PDB yang akan dibuka,

misal SA2014_1YCR.

3.1.3 Klik F6, Klik kiri pada SA2014_1YCR > klik molekul

baris ke 3 > klik non> klik kanan > stick maka akan

tampak sebagai berikut

3.1.4 Untuk mengetahui asam amin klik Effects > label >residu

kemudian klik non 0 pada sequence > Unk pada name >

95

oke > set label color (centang residu name dan residu

number) > pilih warna putih seperti berikut

3.1.5 Klik kiri untuk memutar gambar, klik kanan untuk

mengatur jarak jauh dekat gambar, sehingga dapat

diketahui asam amino disekitar ligan yang ditambatkan.

97

BIODATA PENULIS

Penulis dilahirkan di

Kediri, 24 Desember 1993. Penulis

merupakan anak ketiga dari tiga

bersaudara dari pasangan H. Misdi

dan Hj. Katemi. Penulis memulai

pendidikan dasar di SDN Kedung

Malang, Papar. Kemudian penulis

melanjutkan jenjang selanjutnya di

MTsN 1 Pare. Setelah lulus, penulis

melanjutkan jenjang selanjutnya di

SMAN 2 Pare.

Penulis melanjutkan

jenjang pendidikan S1 Biologi

Institut Teknologi Sepuluh

Nopember Surabaya. Penulis aktif mengikuti organisasi seperti

UKM Teater Tiyang Alit sebagai anggota aktif pada tahun 2012

sampai sekarang dan sebagai wakil ketua pada tahun 2014-2015,

Redaksi Majalah BIOGONAL sebagai anggota pada tahun 2013

dan Pimpinan redaksi tahun 2014-2015. Penulis Penulis juga aktif

mengikuti pelatihan seperti Pelatihan Karya Tulis Ilmiah (PKTI)

HIMABITS, Latihan Ketrampilan Manajemen Mahasiswa Pra

Tingkat Dasar (LKMM Pra-TD) ITS serta mengikuti kegiatan

PKM (Program Kreativitas Mahasiswa) dan berhasil didanai pada

tahun 2015. Penulis juga aktif sebagai panitia Big Event Biologi

ITS (BOF) yang dihelat setiap setahun sekali. Penulis juga pernah

mewakili ITS dalam ajang lomba Monolog PEKSIMINAL

(Pekan Seni Mahasiswa regional di Malang). Penulis yang

menyukai puisi dan teater ini pernah menjadi aktris, sutradara

sekaligus tata rias dalam berbagai event di ITS maupun diluar

ITS.