AKTIVITAS PENGHAMBATAN PEMBENTUKAN BIOFILM EKSTRAK … › 34751 › 2 › 158114107_full.pdf ·...
Transcript of AKTIVITAS PENGHAMBATAN PEMBENTUKAN BIOFILM EKSTRAK … › 34751 › 2 › 158114107_full.pdf ·...
AKTIVITAS PENGHAMBATAN PEMBENTUKAN BIOFILM EKSTRAK
ETANOL PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban)
TERHADAP Staphylococcus aureus
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Felicita Eka Putri S
NIM: 158114107
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
AKTIVITAS PENGHAMBATAN PEMBENTUKAN BIOFILM EKSTRAK
ETANOL PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban)
TERHADAP Staphylococcus aureus
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Felicita Eka Putri S
NIM: 158114107
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
ABSTRAK
Banyak infeksi yang disebabkan oleh bakteri Staphylococcus aureus seperti
infeksi saluran kencing, saluran darah, jaringan lunak, serta saluran pernapasan.
Kasus infeksi bakteri semakin parah dengan meningkatnya kasus resistensi S.
aureus terhadap antibiotik. Pembentukan biofilm pada S. aureus menjadi salah satu
penyebab resistensi. Tanaman pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) merupakan
tanaman yang banyak tumbuh di Indonesia dan memiliki manfaat sebagai
antimikroba. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas ekstrak etanol pegagan
terhadap penghambatan pembentukan biofilm S. aureus dan penentuan persen (%)
penghambatan pembentukan biofilm untuk masing-masing konsentrasi ekstrak
etanol pegagan. Metode yang digunakan adalah microtiter plates antibiofilm assay
dengan pewarnaan menggunakan crystal violet 1%. Selain itu juga dilakukan
skrining fitokimia menggunakan uji tabung.
Penelitian diawali dengan uji pertumbuhan biofilm. Hasilnya menunjukkan
bahwa penambahan glukosa 1% dapat meningkatkan pertumbuhan biofilm dan
termasuk dalam strong-biofilm former. Uji aktivitas ekstrak etanol herba pegagan
menggunakan konsentrasi 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml, 16 mg/ml, dan 32 mg/ml.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki aktivitas
antibiofilm dengan persentase penghambatan untuk masing – masing konsentrasi
secara berturut-turut adalah 47,13%, 55,90%, 63,13%, 67,68%, dan 70,94%.
Berdasarkan skrining fitokimia, ekstrak etanol herba pegagan mengandung
alkaloid, fenol, tanin, flavonoid, saponin, dan terpenoid.
Kata kunci : Staphylococcus aureus, antibiofilm, herba, Centella asiatica (L) Urban
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
ABSTRACT
Many infections are caused by Staphylococcus aureus bacteria such as
urinary tract, blood vessels, soft tissue, and respiratory tract infections. Cases of
bacterial infection are getting worse by the increase of S. aureus resistance to
antibiotics cases. Biofilm formation in S. aureus is one of the causes of resistance.
Gotu kola (Centella asiatica (L.) Urban) is a plant that is widely grown in Indonesia
and has function as an antimicrobial. In this study, the activity test of gotu kola
ethanol extract was conducted to inhibit S. aureus biofilm formation and determine
the percent (%) inhibition of biofilm formation for each concentration of gotu kola
ethanol extract. The method used is microtiter plate antibiofilm assay by staining
using crystal violet 1%. In addition, phytochemical screening was also done using
a tube test.
The study began with a biofilm growth test. The result showed that the
addition of 1% glucose can increase biofilm growth and is included in the strong-
biofilm former. The activity test of the ethanol extract of gotu kola herb uses a
concentration of 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml, 16 mg/ml, and 32 mg/ml. The result
showed that gotu kola ethanol extract had antibiofilm activity with inhibitory
percentages for each concentration of 47.13%, 55.90%, 63.13%, 67.68%, and
70.94%, respectively. Based on phytochemical screening, ethanol extract of gotu
kola herb contains alkaloids, phenols, tannins, flavonoids, saponins, and terpenoids.
Keywords: Staphylococcus aureus, antibiofilm, herb, Centella asiatica (L) Urban
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………....iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI …………………….v
ABSTRAK ............................................................................................................. vi
ABSTRACT .......................................................................................................... vii
DAFTAR TABEL ................................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
METODE PENELITIAN ........................................................................................ 3
Alat dan Bahan .................................................................................................... 3
Pengumpulan Bahan ............................................................................................ 3
Determinasi Tanaman .......................................................................................... 4
Pengukuran Kadar Air ......................................................................................... 4
Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Pegagan ......................................................... 4
Kultur Bakteri Uji ................................................................................................ 5
Pembuatan Larutan Uji ........................................................................................ 5
Pembuatan Larutan Streptomycin ........................................................................ 5
Pembuatan Media Biofilm/TSB + Glukosa 1% (TSBG) .................................... 5
Pembuatan Suspensi Bakteri Uji ......................................................................... 5
Uji Pertumbuhan Biofilm .................................................................................... 6
Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm ........................................... 6
Uji Kualitatif Fitokimia ....................................................................................... 8
Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia menggunakan uji tabung yang
bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terkandung pada
ekstrak etanol pegagan. Metode uji tabung yang dilakukan pada penelitian ini
mengacu pada metode yang digunakan oleh Tiwari et al. pada 2011. ................ 8
Analisis data ........................................................................................................ 8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 9
Determinasi, Uji Kadar Air, dan Ekstraksi Herba Pegagan ................................ 9
Uji Pertumbuhan Biofilm .................................................................................. 10
Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm ......................................... 13
KESIMPULAN ..................................................................................................... 22
SARAN ................................................................................................................. 22
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 23
LAMPIRAN .......................................................................................................... 32
BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Analisis Post-Hoc Tukey terhadap kelompok perlakuan …..…… 16
Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Pegagan……………………. 20
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Grafik Pembentukan Biofilm pada Staphylococcus aureus.. 10
Gambar 2. Uji Pertumbuhan Biofilm pada 96-well plate Setelah
Pencucian dan Pewarnaan CV 1% ........................................
11
Gambar 3. Uji Penghambatan Pembentukkan Biofilm pada 96-well
plate Setelah Pewarnaan menggunakan CV 1%....................
15
Gambar 4. Grafik Pengukuran Optical Density Konsentrasi Ekstrak
Etanol Pegagan pada 595nm……………………………….
15
Gambar 5. Grafik Persen Penghambatan Pembentukan Biofilm
Ekstrak Etanol Pegagan dengan Berbagai Konsentrasi pada
Staphylococcus aureus……………………………………..
17
Gambar 6. Simplisia Centella asiatica (L.) Urban…………………….. 35
Gambar 7. Pengukuran Kadar Air Serbuk Centella asiatica (L.) Urban
dengan Destilasi Toluen……………………………………
35
Gambar 8. Ekstrak Kental Centella asiatica (L) Urban……………….. 36
Gambar 9. Larutan Ekstrak Etanol Centella asiatica (L) Urban dengan
konsentrasi 2, 4, 8, 16, dan 32 mg/ml……………………….
36
Gambar 10. Uji Tabung………………………………………………… 37
Gambar 11. Endapan Berwarna Merah pada uji Alkaloid……...……….. 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Pengesahan Determinasi Tanaman Centella asiatica
(L) Urban………………………………………………….
32
Lampiran 2. Certificate of Quality Staphylococcus aureus ATCC
25923……………………………………………………...
33
Lampiran 3. Surat Legalitas Analisis Data oleh Pusat Kajian Clinical
Epidemiology & Biostatistics Unit Faculty of Medicine
Gadjah Mada University ….................................................
34
Lampiran 4. Bahan yang Digunakan Untuk Penelitian………………… 35
Lampiran 5. Pengukuran Kadar Air Serbuk Centella asiatica (L)
Urban……………………………………………………..
35
Lampiran 6. Hasil Ekstraksi…………………………………………… 35
Lampiran 7. Larutan Ekstrak Etanol Pegagan………………………… 36
Lampiran 8. Hasil Pengukuran Optical Density 595nm………………. 36
Lampiran 9. Perhitungan Persen Penghambatan Pembentukan Biofilm.. 37
Lampiran 10. Skrining Fitokimia ……………………………………… 37
Lampiran 11. Hasil Analisis Statistik…………………………………… 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Otajevwo (2013) menyatakan bahwa 13,9% infeksi saluran kencing di
Senegal, Ghana, dan Nigeria disebabkan oleh Staphylococcus aureus. Menurut
Alabi et al. (2013) bakteri ini juga menyebabkan infeksi lain seperti infeksi saluran
darah (9,5-39%), infeksi kulit dan jaringan-jaringan lunak (62,8-90%), infeksi
telinga, hidung, dan tenggorokan (16,7-29%), serta infeksi pasca operasi (20,4-
32%). Rosalina dkk (2010) mengatakan bahwa S. aureus merupakan penyebab
tertinggi dermatosis vesikobulosa yaitu sebesar 42,1%.
Saat ini resistensi S. aureus menjadi masalah yang sangat serius. Pada tahun
2013, Falagas melakukan penelitian di Afrika terhadap Methicillin Sensitive
Staphylococcus aureus (MSSA) hasilnya menunjukkan bahwa 73,7%-100%
sampel Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) tersebut telah resisten
terhadap penicillin, 15-89,1% terhadap co-trimoxazole, dan 21,8-92% terhadap
tetrasiklin. Di Indonesia kasus resistensi S. aureus terhadap vancomycin di Rumah
Sakit Margono Soekarjo Purwokerto sebesar 15,6% (Anjarwati, 2010). Di Rumah
Sakit Dr. Mohammad Hoesin Palembang pada periode Oktober 2011-September
2012, kasus resistensi S. aureus terhadap vancomycin sebesar 2,4% (Syaiful, 2013).
S. aureus memiliki kemampuan adaptasi yang luar biasa. Salah satu bentuk
adaptasi bakteri S. aureus adalah dengan membentuk biofilm atau kolonisasi
(Afifurahman dkk, 2014). Biofilm merupakan proses pengembangan kehidupan
bakteri dari tahap uniseluler nomaden (planktonik) menjadi tahap multiseluler yang
menetap, dimana kemudian berkembang menjadi komunitas terstruktur dan
dilanjutkan diferensiasi seluler (Otto, 2008). S. aureus dapat membentuk biofilm
melalui tiga proses yaitu penempelan, pematangan, dan pelepasan. Pembentukan
biofilm dapat memicu resistensi bakteri, salah satu penyebabnya adalah antibiotik
gagal penetrasi menyerang koloni bakteri (Paraje, 2011). Biofilm dapat
meningkatkan resistensi bakteri hingga 1000 kali lipat dibandingkan bakteri dalam
bentuk planktonik (Olsen, 2015).
Wu et al (2014) mengatakan bahwa pengobatan infeksi dengan biofilm bisa
dilakukan menggunakan antibiotik yang sensitif dan mampu menembus biofilm,
seperti antibiotik golongan aminoglikosida. Hal ini didukung oleh Ciofu et al
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
(2017) yang menyatakan bahwa tobramycin 300 mg digunakan sebagai pilihan
terapi infeksi paru-paru dengan biofilm dan gentamycin 2 mg/ml digunakan pada
terapi infeksi dengan biofilm pada pasien operasi ortopedi. Streptomycin yang
termasuk dalam golongan aminoglikosida juga menjadi pilihan terapi biofilm,
menurut Ahn et al (2018) penggunaan streptomycin mampu menghambat
pembentukkan biofilm.
Saat ini sudah ada penelitian penggunaan tanaman sebagai agen antibiofilm.
Penelitian yang telah dilakukan oleh Quave et al. (2008) menunjukkan bahwa
beberapa tanaman herbal asal Italia memiliki aktivitas penghambatan pembentukan
biofilm pada Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Di Indonesia,
penelitian yang dilakukan oleh Kinning dkk (2016), menyatakan bahwa ekstrak air
daun pepaya yang mengandung tanin dan flavonoid mampu menghambat dan
mendegradasi biofilm pada Pseudomonas aeruginosa. Namun penelitian tentang
penggunaan tanaman sebagai agen antibiofilm di Indonesia masih sedikit.
Wilayah hutan Indonesia memiliki keanekaragaman hayati tertinggi ke-2 di
dunia. Sebanyak 40.000 jenis flora yang ada di dunia, 30.000 jenis diantaranya
dapat dijumpai di Indonesia (Kemenhut, 2010). Salah satu tanaman yang mudah
ditemukan di Indonesia adalah pegagan. Tumbuhan yang memiliki nama latin
Centella asiatica (L.) Urban, sering dijumpai di tempat yang terbuka, pada tanah
yang lembab dan subur seperti di pematang sawah, di padang rumput, di pinggir
parit, dan di pinggir jalan (BPOM, 2010). Taemchuay et al. (2009) menyatakan
ekstrak etanol pegagan memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri S. aureus.
Menurut Hayati et al. (2013), ekstrak etanol daun pegagan yang mengandung tanin
dan flavonoid memiliki aktivitas antibakteri. Namun, di Indonesia belum ada
penelitian berkaitan pemanfaatan ekstrak etanol pegagan sebagai antibiofilm.
Slobodnikova (2016) mengatakan bahwa senyawa yang berperan sebagai
antibiofilm adalah fenol, termasuk di dalamnya adalah flavonoid dan tanin.
Penelitian Lestari dkk (2015) menunjukkan bahwa ekstrak etanol 75% pegagan
mengandung fenol total yang paling tinggi. Selain itu Biradar dkk (2013)
melakukan skrining fitokimia ekstrak etanol pegagan. Hasil penelitian tersebut
menyatakan bahwa ekstrak etanol pegagan mengandung senyawa flavonoid.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Berdasarkan latar belakang di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui aktivitas penghambatan pembentukan biofilm ekstrak etanol pegagan
terhadap S. aureus dan persen penghambatan dari masing – masing konsentrasi
ekstrak etanol 75% herba pegagan yang diperoleh dengan maserasi. Selain itu pada
penelitian ini juga dilakukan skrining fitokimia kualitatif dengan uji tabung untuk
mengetahui kandungan senyawa aktif pada ekstrak etanol herba pegagan dan untuk
memperkirakan senyawa yang mungkin berperan dalam penghambatan
pembentukan biofilm bakteri S. aureus.
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini : 96-well plate flat bottom (Iwaki),
Erlenmeyer (pyrex), tabung reaksi (pyrex), labu takar 10 ml (Iwaki), pipet ukur
(pyrex), gelas ukur (pyrex), gelas beker (pyrex), lempeng form shaker (Innova
2100), rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-210), destilator (M. Topo tipe MS.
E. 103), autoclave (ALP. Co. Ltd KT.40), inkubator (Memert), microbiology safety
cabinet (LA2 – 3A1-E Class II serial 2016-95067), neraca analitik (Ohaus PA213),
vortex (Gallenkamp spinmix), nephelometer (BD PhoenixSpec), micropipette
(Gilson), microplate reader (Benchmark).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini : Bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923 (Oxoid), simplisia herba pegagan dari B2P2TOOT, media Nutrien
Agar (Oxoid), media Nutrien Broth (Merck), media Trypticase soy Broth (BD),
glukosa 1% (Merck), etanol 96% (Merck), aquadest steril, toluen (Merck), crystal
violet (Merck).
Pengumpulan Bahan
Simplisia herba pegagan diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu.
Simplisia tersebut kemudian diserbuk dan diayak menggunakan ayakan nomor
mesh 40.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman pegagan dilakukan oleh Dyah Subositi, M.Sc yang
merupakan penanggungjawab identifikasi di Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu.
Pengukuran Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode destilasi toluen. Serbuk
ditimbang dengan seksama sejumlah 10 gram, dimasukkan ke dalam labu yang
kering. Labu dihubungkan dengan tabung penerima dan pendingin, kemudian lebih
kurang 200 mL toluen p.a dimasukkan ke dalam labu. Labu dipanaskan perlahan-
lahan selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, dilakukan penyulingan dengan
kecepatan lebih kurang 2 tetes per detik hingga sebagian besar air tersuling,
kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Setelah
penyulingan, tabung penerima dibiarkan dingin hingga suhu kamar dan diusahakan
seluruh tetesan air turun. Volume air dibaca setelah toluen dan air terpisah
sempurna. Kadar air dinyatakan dalam persen.
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑖𝑟
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 100%
Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Pegagan
Pembuatan ekstrak diawali dengan membuat etanol 75% dengan melarutkan
3,906 ml etanol 96% dalam labu takar 1 liter kemudian ditambahkan aquadest
sampai batas tanda. Tahapan maserasi yaitu dengan merendam 25 gram serbuk
herba pegagan dalam 250 ml etanol 75%. Maserasi dilakukan selama 48 jam dengan
bantuan shaker. Hasil maserat disaring menggunakan corong Buchner dengan
bantuan pompa kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50oC
untuk menghilangkan pelarut yang mungkin masih ada dalam ekstrak (Lestari,
2015). Ekstrak yang didapat merupakan ekstrak kental dengan bobot tetap yang
telah dipersyaratkan. Selanjutnya dihitung rendemen ekstrak dengan rumus :
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘
𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑥 100%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Kultur Bakteri Uji
Staphylococcus aureus diinokulasikan pada media Nutrien Agar (NA)
dengan metode streak dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah
inkubasi, ambil 2-3 ose bakteri kemudian inokulasikan ke media Nutrien Broth dan
diinkubasi selama 24 jam.
Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak kental ditimbang sebanyak 5,12 gram kemudian dilarutkan
menggunakan aquadest steril dalam labu ukur 10 ml sehingga didapatkan larutan
stok dengan konsentrasi 512 mg/ml. Dari larutan stok diambil 625 µl kemudian
dilarutkan menggunakan aquadest dalam labu takar 10 ml sehingga menjadi larutan
dengan konsentrasi 32 mg/ml. Kemudian larutan tersebut diambil 5 ml lalu
dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, ditambahkan aquadest steril sampai batas
tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 16 mg/ml. Langkah tersebut
dilakukan berulang sampai mendapatkan larutan dengan konsentrasi terkecil yaitu
2 mg/ml.
Pembuatan Larutan Streptomycin
Serbuk streptomycin ditimbang sebanyak 0,00256 g kemudian dilarutkan
dalam 5 ml aquadest menggunakan labu takar 5 ml sehingga didapatkan larutan
streptomycin dengan konsentrasi 0,512 mg/ml yang setara dengan 512µg/ml.
Pembuatan Media Biofilm/TSB + Glukosa 1% (TSBG)
Pembuatan media TSBG diawali dengan melarutkan 2,4 gram serbuk media
TSB dalam 30 ml aquadest dengan cara dipanaskan dan dihomogenkan. Larutan
disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Setelah media dingin ditambahkan glukosa 1%.
Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Kultur bakteri uji disetarakan dengan MacFarland 0,5 menggunakan media TSB +
Glukosa 1%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Uji Pertumbuhan Biofilm
Bakteri yang digunakan disuspensikan dalam media TSB tanpa tambahan
glukosa dan TSB + Glukosa 1%. Suspensi bakteri sebanyak 110 µL dimasukkan ke
dalam 96-well microplate. Kontrol negatif yang digunakan sebagai pembanding
merupakan media TSB tanpa suspensi bakteri. 96-well microplate ditutup dan
diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, 96-well microplate
dicuci dengan aquadest steril. 96-well microplate selanjutnya diberikan pewarna
dengan cara dimasukkan 125 µL larutan kristal violet 1% dan diinkubasi selama 15
menit pada suhu ruang. Pewarna dicuci dengan aquadest steril dan dibiarkan kering
pada suhu ruang. Setelah kering, 200 µL etanol 96% ditambahkan ke dalam 96-well
microplate kemudian diinkubasi 15 menit pada suhu ruang. Kemudian 96-well
microplate diukur menggunakan microplate reader pada optical density 595nm
(Pratiwi, 2015).
Denah penggunaan 96-well plate :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Keterangan :
= media TSB + bakteri = media TSB (K. negatif)
= media TSB + glukosa 1% + bakteri
Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm
Sebanyak 110 µl suspensi bakteri uji dan 90 µl ekstrak etanol herba pegagan
dimasukkan ke dalam 96-well microplate. Pada 96-well microplate juga terdapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
kontrol pelarut berisi 110 µl suspensi bakteri uji dan 90 µl aquadest steril, kontrol
positif berisi 110 µl suspensi bakteri uji dan 90 µl streptomycin, kontrol
pertumbuhan berisi media 110 µl suspensi bakteri uji, dan kontrol media. Kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah diinkubasi, 96-well microplate
dicuci dengan aquadest steril. Kemudian dilakukan pewarnaan dengan
menggunakan 125 µL larutan crystal violet 1% dan diinkubasi selama 15 menit
pada suhu ruang. Pewarna dicuci dengan aquadest steril dan dibiarkan kering pada
suhu ruang. Setelah kering, 200 µL etanol 96% ditambahkan ke dalam 96-well
microplate kemudian diinkubasi 15 menit pada suhu ruang. Kemudian 96-well
microplate diukur menggunakan microplate reader pada optical density 595nm
(Pratiwi, 2015). Kemudian dihitung % penghambatan dari masing-masing
konsentrasi larutan uji dengan rumus :
% penghambatan = 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛−𝑂𝐷 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛
𝑂𝐷 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛 x 100%
(Pratiwi, 2015)
Denah penggunaan 96-well plate :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Keterangan :
= kontrol media = aquadest steril = EEP 8 mg/ml
= streptomycin = EEP 2 mg/ml = EEP 16 mg/ml
= kontrol pertumbuhan = EEP 4 mg/ml = EEP 32 mg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Uji Kualitatif Fitokimia
Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia menggunakan uji tabung yang
bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terkandung pada
ekstrak etanol pegagan. Metode uji tabung yang dilakukan pada penelitian ini
mengacu pada metode yang digunakan oleh Tiwari et al. pada 2011.
a. Alkaloid
Ekstrak dilarutkan dalam asam hidroklorida encer kemudian disaring.
Kemudian filtrat ditambahkan reagen dragendroff. Terbentuknya endapan
berwarna merah menunjukkan adanya alkaloid.
b. Saponin
0,5 gram ekstrak digojok dengan 2 ml aquadest. Busa yang terbentuk dan
bertahan selama 10 menit menunjukkan adanya saponin.
c. Fenol
Ekstrak dilarutkan dalam aquadest kemudian diberikan 3-4 tetes larutan FeCl3.
Terbentuk warna biru kehitaman menunjukkan adanya fenol.
d. Tanin
Ekstrak sebanyak 1 gram ditambahkan 10 ml aquadest kemudian dididihkan.
Setelah dingin filtrat ditambahkan 5 ml FeCl3 1 % (b/v). Apabila terjadi
perubahan warna menjadi biru tua menunjukkan adanya tanin.
e. Flavonoid
Ekstrak dilarutkan dalam aquadest kemudian diberikan lead acetate (Timbal
(II) asetat). Terbentuk endapan berwarna kuning menunjukkan adanya
flavonoid.
f. Terpenoid
0,5 mg (0,0005 gram) ekstrak ditambahkan 2 ml kloroform kemudian
ditambahkan asam sulfat pekat untuk membentuk lapisan. Terbentuk warna
coklat kemerahan antarmuka menunjukkan adanya terpenoid.
Analisis data
Untuk menentukan normalitas distribusi data menggunakan Shapiro-Wilk.
Jika p-value > 0,05 maka data terdistribusi normal dan jika p-value < 0,05 maka
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
data tidak terdistribusi normal. Untuk menentukan homogenitas data menggunakan
Levene’s Test. Untuk data yang terdistribusi normal dan homogen dilanjutkan
menggunakan uji one way ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95%. Jika tidak
terdistribusi normal atau tidak homogen, data diuji menggunakan uji Kruskall
Wallis. Nilai p-value < 0,05 menunjukkan adanya perbedaan signifikan antar
konsentrasi. Apabila ditemukan perbedaan, maka dilanjutkan Post-Hoc Tukey pada
taraf kepercayaan 95%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi, Uji Kadar Air, dan Ekstraksi Herba Pegagan
Determinasi sampel simplisia tanaman herba pegagan yang dilakukan di
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional
(B2P2TOOT) Tawangmangu menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan sudah
benar yaitu C. asiatica yang dikenal dengan nama pegagan. Kebenarannya
dibuktikan dengan surat keterangan dari lembaga terkait (Lampiran 1). Simplisia
disortasi kering kemudian dilakukan penyerbukan dan pengayakan. Serbuk yang
didapatkan sebanyak 2,9 kg. Selanjutnya dilakukan penetapan kadar air
menggunakan metode destilasi toluen, dari 10,6625 gram serbuk pegagan
didapatkan volume air sebanyak 0,8 ml sehingga kadar air dari serbuk simplisia
herba pegagan sebesar 7,5%. Kadar air memenuhi standar yaitu dibawah 10%
(Depkes RI, 1995).
Pada penelitian ini pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi.
Maserasi merupakan cara ekstraksi dingin, cara ini dipilih bertujuan untuk
mempertahankan senyawa yang ingin disari yaitu senyawa fenolik yang tidak tahan
pada suhu tinggi (Dewi, 2008). Jumlah sampel yang diekstrak sebanyak 25,263
gram dalam 250 ml etanol 75% selama 48 jam. Kemudian hasil maserasi disaring
menggunakan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Larutan hasil
maserasi kemudian dievaporasi pada suhu 50oC selanjutnya didapatkan ekstrak
kental dan diukur bobot tetap menggunakan oven dengan cara 2 kali penimbangan
secara berturut-turut tidak lebih dari 0,5 mg. Ekstrak kental yang didapatkan
sebanyak 5,5445 gram sehingga rendemen yang didapatkan sebesar 21,95%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Rendemen yang didapatkan memenuhi standar yang ditetapkan dalam Farmakope
Herbal Indonesia bahwa rendemen ekstrak etanol herba pegagan tidak kurang dari
7,5%. Pada pembahasan selanjutnya ekstrak etanol pegagan akan disebut EEP.
Uji Pertumbuhan Biofilm
Penelitian ini diawali dengan melakukan uji pertumbuhan biofilm terhadap S.
aureus. Uji pertumbuhan biofilm dilakukan dengan membandingkan optical
density dari kelompok kontrol negatif (hanya media TSB) dengan pertumbuhan
biofilm dalam media TSB tanpa tambahan glukosa dan media TSB + glukosa 1%
(Gambar 1).
Gambar 1. Pembentukan biofilm pada Staphylococcus aureus. Pengukuran optical density
pada panjang gelombang 595 nm.
0,091 ± 0,004
1,155 ± 0,049
2,509 ± 0,11
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Media TSB Media TSB tanpa
Glukosa + bakteri
Media TSB + Glukosa
1% + bakteri
Op
tica
l D
esnit
y
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Gambar 2. Uji Pertumbuhan Biofilm pada 96 well plates setelah pencucian dan
pewarnaan menggunakan CV 1%
Keterangan :
A1-A3, B1-B3 = Media TSB tanpa glukosa + bakteri,
A5-A7, B5-B7 = Media TSB + Glukosa 1%,
C1-C3, C5-C7 = Media TSB
Singh (2017) mengklasifikasikan pembentukan biofilm berdasarkan nilai
ODcut menjadi 4 kelompok yaitu :
Klasifikasi Nilai OD
Non-Biofilm-Former (NBF), ODsampel ≤ ODcut
Weak Biofilm-Former (WBF), ODcut < ODsampel ≤ 2 × ODcut
Moderate Biofilm-Former (MBF), 2 × ODcut < ODsampel ≤ 4 × ODcut
Strong Biofilm-Former (SBF). ODsampel ˃4 × ODcut
Nilai ODcut adalah tiga standar deviasi di atas rata-rata optical density kontrol
negatif (ODc) (Shivani, 2014) sehingga untuk mendapatkan nilai ODcut dihitung
dengan rumus :
Pada penelitian ini yang menjadi kontrol negatif adalah pembentukan
biofilm pada media TSB tanpa suspensi bakteri. Berdasarkan rumus di atas nilai
ODcut pada penelitian sebesar 0,103. Kemudian nilai ODcut dibandingkan dengan
𝑂𝐷𝑐𝑢𝑡 = 𝑂𝐷𝑐 + ( 3𝑥𝑂𝐷𝑐)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
nilai OD sampel. Nilai OD sampel pada masing – masing kelompok perlakuan
adalah >4xODcut. Sehingga pembentukan biofilm S. aureus pada media TSB
dengan atau tanpa tambahan glukosa termasuk dalam strong biofilm-former (SBF).
Penambahan glukosa pada media TSB meningkatkan regulasi dari ekspresi
gen dari locus icaABCD. Ekspresi gen tersebut adalah sintesis polysaccharide
intracellular adhesion (PIA). PIA merupakan salah satu komponen dalam biofilm
berperan pada fase maturasi biofilm yaitu penempelan antarsel bakteri planktonik.
Sehingga dengan terjadi peningkatan regulasi dari gen icaABCD maka produksi
PIA akan meningkat dengan demikian proses penempelan antar sel bakteri
planktonik juga akan meningkat dan biofilm yang terbentuk akan semakin tebal
(Ferreira, 2010).
Pada media TSB tanpa tambahan gula dapat membentuk biofilm karena
media TSB sudah mengandung glukosa sebesar 0,25% (Stepanovic, 2007). Namun,
pada penelitian digunakan media TSB dengan penambahan glukosa 1% karena
pada konsentrasi glukosa tersebut terbentuk biofilm yang lebih tinggi daripada
media TSB tanpa tambahan glukosa. Selain itu pada penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh Knobloch et al. (2002) merekomendasikan penggunaan media TSB
dengan tambahan glukosa 1% untuk mendeteksi pembentukan biofilm pada S.
aureus. Penambahan glukosa 1% pada media TSB juga sering digunakan dalam
antibiofilm assay. Shahwany et al (2013) menggunakan penambahan glukosa 1%
untuk menginduksi pertumbuhan biofilm pada S. aureus dan Klebsiella pneumonia.
Shrestha et al (2016) dan Bai et al (2019) juga menggunakan tambahan glukosa 1%
pada media TSB untuk menginduksi pembentukan biofilm pada S. aureus.
Pada penelitian ini menggunakan crystal violet pada proses pengecatan
biofilm untuk mengevaluasi aktivitas dari EEP. Crystal violet merupakan salah satu
metode yang umum digunakan dalam pengujian biofilm. Parameter yang menjadi
tolak ukur dari pengukurannya adalah biomassa dari biofilm (Skogman, 2012).
Pengecatan menggunakan crystal violet akan mewarnai sel yang hidup dan sel yang
mati serta komponen yang menjadi penyusun dari matriks biofilm sehingga cocok
untuk mengukur total biomassa biofilm (Azeredo, 2016). Crystal violet merupakan
pewarna protein yang umum yang mampu berikatan dan mewarnai permukaan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dengan molekul yang bermuatan negatif seperti matriks eksopolisakarida yang
menjadi penyusun dari matrik biofilm (Petrachi, 2017). Penelitian yang dilakukan
oleh Novoa (2018) dan Kodali (2013) menggunakan crystal violet 1% untuk
mengevaluasi efek antibiofilm dari ekstrak tanaman.
Pada pengujian ini dilakukan proses pencucian yaitu sebelum dan sesudah
pengecatan menggunakan crystal violet. Pencucian dilakukan menggunakan
aquadest steril dan dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Pencucian sebelum
pengecatan bertujuan untuk menghilangkan planktonik dan sel-sel yang tidak
menempel pada permukaan well-plate sedangkan pencucian sesudah pewarnaan
bertujuan untuk menghilangkan sel yang terwarnai oleh crystal violet tetapi tidak
menempel pada permukaan well-plate (Azeredo, 2016). Menurut Berlanga et al
(2014) salah satu faktor yang mempengaruhi proses penempelan atau adhesion
pada permukaan well-plate yang terbuat dari polystyrene adalah hidrofobisitas dari
suatu molekul. Hidrofobisitas yang tinggi akan meningkatkan kemampuan suatu
molekul untuk menempel pada permukaan polystyrene. Mirani et al (2018)
mengatakan bahwa sel planktonik S. aureus memiliki hidrofobisitas lebih rendah
dibandingkan dengan biofilm. Sehingga kemampuan menempel pada permukaan
polystyrene lebih rendah dan lebih mudah lepas/deattachment salah satunya melalui
proses pencucian/pembilasan. Dengan demikian sel planktonik tidak mengganggu
proses pengukuran optical density. Menurut Skogman (2012) pengukuran
dilakukan pada panjang gelombang 595nm sesuai dengan panjang gelombang
serapan crystal violet yang digunakan sebagai zat pewarna.
Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm
Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antibiofilm dari ekstrak etanol
herba pegagan. Pada penelitian ini uji aktivitas antibiofilm yang dilihat adalah
penghambatan pembentukan biofilm menggunakan konsentrasi di bawah MIC50.
Hal ini bertujuan agar konsentrasi tersebut tidak bersifat toksik sehingga bakteri
masih mengalami pertumbuhan sehingga dapat membentuk biofilm (Pratiwi, 2015).
Penelitian terkait dengan MIC ekstrak etanol 50% pegagan terhadap S. aureus telah
dilakukan oleh Udoh et al pada tahun 2012 menggunakan metode tube dilution
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
(macrodilution). Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki
nilai MIC 62,5 mg/ml. Schwarz et al. (2010) menyatakan bahwa MIC memiliki
rentang nilai/sebaran MIC mulai dari nilai terendah dan akan bertingkat sampai
nilai tertinggi. MIC50 merupakan median dari rentang nilai MIC sehingga nilai
MIC50 akan lebih besar dari MIC. Berdasarkan data tersebut maka pada penelitian
kali ini menggunakan 5 konsentrasi larutan ekstrak etanol herba pegagan di bawah
nilai MIC yaitu 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml, 16 mg/ml, dan 32 mg/ml.
Selain itu pada pengujian juga digunakan kontrol positif yaitu antibiotik
streptomycin dengan konsentrasi 512 µg/ml. Menurut Ahn et al (2018) penggunaan
streptomycin secara tunggal mampu menghambat pembentukkan biofilm dan
penelitian Hess et al tahun 2014 menunjukkan bahwa penambahan streptomycin
pada penggunaan glycerol monolaurate dalam pengujian antibiofilm menunjukkan
efek yang sinergis dalam menghambat pembentukan biofilm. Konsentrasi
streptomycin yang digunakan sebagai kontrol positif sebesar 512µg/ml. Udo (2003)
mengatakan bahwa streptomycin memiliki MIC >1024 µg/ml terhadap S. aureus.
Antibiotik ini juga digunakan oleh Pratiwi (2015) dengan konsentrasi 512 µg/ml
sebagai kontrol positif pada penelitian efek minyak kayu manis dan mayosi
terhadap pertumbuhan planktonik dan pembentukan biofilm pada bakteri S. aureus
dan Pseudomonas aeruginosa, hasilnya menunjukkan bahwa streptomycin mampu
menghambat pembentukan biofilm. Aquadest steril digunakan sebagai kontrol
pelarut karena aquadest steril merupakan pelarut ekstrak.
Setelah suspensi bakteri uji dan sampel diinkubasi selama 48 jam kemudian
dicuci menggunakan aquadest steril dan dilakukan pengecatan menggunakan
crystal violet 1%, kemudian dilakukan pengukuran optical density. Nilai OD yang
didapatkan menggambarkan ketebalan dari biofilm yang terbentuk. Crystal violet
yang digunakan pada proses pengecatan biofilm akan terikat pada matrik biofilm
(O’Toole, 2011). Gambar 3 merupakan hasil pengecatan menggunakan crystal
violet 1%, terdapat perbedaan intensitas warna biru. Semakin pekat warna biru
berarti semakin banyak crystal violet yang terikat pada matriks biofilm dan jika
diukur akan menghasilkan nilai OD yang tinggi. Semakin tinggi nilai OD
menggambarkan bahwa biofilm yang terbentuk semakin tebal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Gambar 3. Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm pada 96 well plates setelah
pewarnaan CV 1%.
Keterangan :
A1, B1, C1 = Media TSBG1%
A2, B2, C2 = Streptomycin
A3, B3, C3 = Media TSBG1% + bakteri
A4, B4, C4 = Media TSBG1% + bakteri + aquadest steril
A5, B5. C5 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 2 mg/ml
A6, B6, C6 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 4 mg/ml
A7, B7, C7 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 8 mg/ml
A8, B8, C8 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 16 mg/ml
A9, B9, C9 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 32 mg/ml
Gambar 4. Pengukuran optical density masing-masing konsetrasi ekstrak etanol pegagan
pada panjang gelombang 595 nm.
2,213 ± 0,003 2,208 ± 0,018
1,170 ± 0,027
0,976 ± 0,042
0,816 ± 0,0450,713 ± 0,086 0,643 ± 0,067
0,201 ± 0,023
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Op
tica
l D
ensi
ty
Kelompok Perlakuan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Dari gambar 4 diketahui bahwa nilai OD pada konsentrasi ekstrak etanol
pegagan 2, 4, 8, 16, dan 32 mg/ml secara berturut-turut adalah 1,17; 0,976; 0,816;
0,713; dan 0,643. Hasil ini menunjukkan bahwa dengan peningkatan konsentrasi
ekstrak etanol pegagan terjadi penurunan nilai OD. Nilai OD terkecil ditunjukkan
oleh streptomycin sebagai kontrol positif yaitu 0,201. Jika dibandingkan dengan
OD kontrol pertumbuhan yaitu 2,213; ekstrak etanol pegagan dan streptomycin
memiliki nilai OD yang lebih rendah. Penurunan nilai OD ini berarti ada
pengurangan intensitas warna biru yang menunjukkan bahwa ada penurunan
ketebalan matriks biofilm. Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol pegagan mampu
menghambat pembentukan biofilm pada S. aureus.
Nilai OD yang diperoleh kemudian dianalisis secara statistika. Hasil uji
statistik menunjukkan bahwa data penghambatan pembentukkan biofilm
terdistribusi normal (p > 0,05) dan homogen (p>0,05). Oleh karena itu, analisis data
dilanjutkan dengan Annova One Way. Hasil uji Annova One Way (p=0,000)
menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan. Kemudian dilanjutkan
dengan uji Post Hoc Tukey. Tabel 1 menunjukan hasil uji Post Hoc Tukey.
Tabel 1. Analisis Posthoc Tukey terhadap masing – masing kelompok perlakuan.
Keterangan : K.Pertum. = Kontrol Pertumbuhan; KP = Kontrol Positif (Streptomycin 512
µg/ml); K. pel = Kontrol Pelarut (aquadest steril); EEP 2-32 = Ekstrak Etanol Pegagan
Konsentrasi 2-32 mg/ml; BB = berbeda bermakna; BTB = berbeda tidak bermakna
Kelompok K.
Pertum. KP K.Pel
EEP
32
EEP
16
EEP
8
EEP
4
EEP
2
K. Pertum. - BB BTB BB BB BB BB BB
KP BB - BB BB BB BB BB BB
K. Pel BTB BB - BB BB BB BB BB
EEP 32 BB BB BB - BTB BB BB BB
EEP 16 BB BB BB BTB - BB BB BB
EEP 8 BB BB BB BB BB - BB BB
EEP 4 BB BB BB BB BB BB - BB
EEP 2 BB BB BB BB BB BB BB -
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Nilai OD yang diperoleh digunakan untuk menghitung persen
penghambatan pembentukan biofilm dengan membandingkan selisih OD sampel
dan OD kontrol pertumbuhan dengan OD kontrol pertumbuhan. Nilai OD dari
masing – masing kosentrasi dan persentase penghambatan pembentukan biofilm.
Gambar 5 merupakan grafik persen penghambatan dari masing – masing
konsentrasi EEP.
Gambar 5. Persen penghambatan pembentukan biofilm ekstrak etanol herba pegagan
dengan berbagai konsentrasi pada Staphylococcus aureus.
Dari hasil pengujian aktivitas penghambatan pembentukan biofilm yang
telah dilakukan, diperoleh nilai OD pada EEP 2 mg/ml adalah 1,170 ± 0,02. Analisis
statistik menunjukkan adanya perbedaan bermakna terhadap kontrol pertumbuhan
(p= 0,000). Berdasarkan hasil tersebut, EEP 2 mg/ml dapat dinyatakan memiliki
kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan persen penghambatan
sebesar 47,13%. Pengujian EEP menggunakan konsentrasi 4 mg/ml mendapatkan
nilai OD 0,976 ± 0,02 menunjukkan adanya perbedaan bermakna terhadap kontrol
pertumbuhan (p= 0,000). Berdasarkan hasil tersebut, EEP 4 mg/ml dapat
dinyatakan memiliki kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan
persen penghambatan sebesar 55,90%. Perbedaan yang signifikan dengan kontrol
47,13%
55,90%63,13%
67,78% 70,94%
90,92%
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
90,00%
100,00%
Per
sen
(%
) H
am
ba
t
Konsentrasi Ekstrak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
pertumbuhan juga ditunjukkan oleh EEP konsentrasi 8 mg/ml (p=0,000) dengan
nilai OD sebesar 0,816 ± 0,03. Berdasarkan hasil tersebut, EEP 8 mg/ml dapat
dinyatakan memiliki kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan
persen penghambatan sebesar 63,13%. Pengujian terhadap EEP 16 mg/ml
memperoleh nilai OD 0,713 ± 0,05 menunjukkan adanya perbedaan bermakna
dengan kontrol pertumbuhan (p=0,000). Berdasarkan hasil tersebut, EEP 16 mg/ml
dapat dinyatakan memiliki kemampuan menghambat pembentukkan biofilm
dengan persen penghambatan sebesar 67,78%. Konsentrasi terakhir yang
digunakan pada pengujian adalah EEP 32 mg/ml yang memperoleh nilai OD 0,643
± 0,04. Berdasarkan hasil tersebut, EEP 32 mg/ml dapat dinyatakan memiliki
kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan persen penghambatan
sebesar 70,94%.
Secara keseluruhan, kelompok perlakuan EEP memiliki aktivitas
penghambatan pembentukkan biofilm yang berbanding lurus/linier dengan adanya
kenaikan dosis. Hal tersebut didukung oleh hasil analisis statistik antar kelompok
perlakuan/antar peringkat konsentrasi EEP yag menunjukkan perbedaan bermakna
(p<0,05) pada dosis 2 mg/ml (1,170 ± 0,02), 4 mg/ml (0,976 ± 0,02), dan 8 mg/ml
(0,816 ± 0,03). Akan tetapi, uji statistik pada konsentrasi 16 mg/ml (0,713 ± 0,05)
dan 32 mg/ml (0,643 ± 0,04) menunjukkan perbedaan tidak bermakna (p>0,05).
Hasil tersebut menandakan bahwa peningkatan aktivitas penghambatan
pembentukan biofilm yang dimiliki oleh EEP 32 mg/ml belum signifikan terhadap
EEP 16 mg/ml. Ketidakbermaknaan ini disebabkan karena standar deviasi
kelompok EEP 32 mg/ml dan 16 mg/ml yang cukup besar dibandingkan dengan
kelompok uji yang lain.
Data persentase penghambatan pembentukan biofilm S. aureus pada grafik
menunjukkan bahwa penghambatan tertinggi sebesar 70,94% ditunjukkan oleh
konsentrasi 32 mg/ml dan yang terendah sebesar 47,13% ditunjukkan oleh
konsentrasi 2 mg/ml. Dari grafik tersebut juga menunjukkan bahwa peningkatan
konsentrasi ekstrak mampu meningkatkan penghambatan pembentukan biofilm.
Streptomycin merupakan antibiotik yang digunakan sebagai kontrol positif juga
mampu menghambat pembentukan biofilm dengan persentase penghambatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
paling tinggi dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak yaitu 90,92%. Dengan
demikian EEP memiliki aktivitas penghambatan pembentukan biofilm yang lebih
rendah dibandingkan dengan streptomycin.
C. asiatica sudah pernah diteliti aktivitas penghambatan pembentukan
biofilm terhadap Vibrio cholera. Penelitian tersebut dilakukan oleh Jose et al pada
tahun 2012 menggunakan ekstrak metanol dengan konsentrasi 1 mg/ml dan 3
mg/ml yang menunjukkan hasil bahwa ekstrak metanol pegagan dengan konsentrasi
1 mg/ml mampu menghambat pembentukan biofilm sebesar 52% sedangkan
konsentrasi 3 mg/ml memiliki persen penghambatan 75%.
Pembentukan biofilm terdiri dari 3 tahap yaitu penempelan, maturasi, dan
pelepasan. Dari ketiga tahap ini yang menjadi perhatian dalam penghambatan
pembentukan biofilm adalah proses penempelan dan maturasi. Tahap penempelan
dipengaruhi oleh protein – protein adhesi yang berada pada permukaan bakteri
sedangkan proses maturasi dipengaruhi oleh polysaccharide intercellular adhesion
(PIA) yang diproduksi oleh gen intercellular adhesion (ica) (Otto, 2008), sehingga
untuk menghambat pembentukan biofilm dapat dilakukan dengan cara mencegah
proses penempelan dan menghambat maturasi agar tidak terbentuk agregat atau
penumpukan lapisan biofilm bakteri dengan mengganggu komponen-komponen
yang berperan dalam proses tersebut.
Miquel (2016) menyatakan senyawa bioaktif dari tanaman dapat
menunjukkan efek antibiofilm dengan mekanisme menghambat proses penempelan
(adhesi) bakteri pada permukaan solid, mengganggu regulasi quorum sensing, dan
menghambat pertumbuhan eksopolisakarida (EPS). Pernyataan serupa juga
dinyatakan oleh Jagani tahun 2009 yang mengatakan bahwa senyawa fenol mampu
menghambat pembentukan biofilm. Slobodnikova (2016) juga menyatakan bahwa
senyawa fenol mampu menekan pembentukan biofilm. Senyawa tersebut sebagai
senyawa antibiofilm dengan mekanisme menghambat proses penempelan
interseluler (adhesi).
Proses penempelan interseluler pada proses pematangan biofilm
dipengaruhi oleh polisakarida interseluler (PIA) yang merupakan polimer dari beta
1-6 linked N-acetyl glucosamine yang diproduksi melalui regulasi dari operon gen
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
icaABCD (Otto, 2008). Blanco (2005) mengatakan bahwa gen yang paling
berpengaruh dalam pembentukan biofilm adalah gen icaA dan icaD. Slobodnikova
(2016) mengatakan bahwa senyawa tanin dan flavonoid mampu menekan regulasi
dari gen icaA dan icaD sehingga proses produksi polisakarida interseluler menurun.
Dengan berkurangnya produksi PIA maka proses agregasi interseluler pada tahap
pematangan biofilm akan terganggu. Jika biofilm tidak matang maka proses
selanjutnya dalam siklus biofilm akan terganggu.
Beberapa penelitian tentang aktivitas antibiofilm C. asiatica pada bakteri
selain S. aureus menunjukkan bahwa C. asiatica mampu menghambat
pembentukan biofilm dengan mengganggu pembentukan eksopolisakarida dan
regulasi quorum-sensing. Jose (2017) menyatakan bahwa esktrak metanol C.
asiatica mampu menghambat pembentukan biofilm pada Vibrio cholera dengan
menurunkan aktivitas gen vps dan tcp yang berperan dalam pembentukan
eksopolisakarida. Vasavi (2014) menyatakan bahwa ekstrak etanol pegagan mampu
menghambat proses quorum-sensing pada bakteri Chromobacterium violaceum.
Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia secara kualitatif
menggunakan uji tabung untuk mengetahui senyawa dalam EEP yang diperkirakan
berperan dalam aktivitas penghambatan pembentukan biofilm. Hasil dari uji tabung
ditunjukkan pada Tabel 2 sebagai berikut:
Tabel 2. Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Pegagan
Senyawa Pereaksi Hasil Keterangan
Alkaloid Dragendroff + Terbentuk endapan merah
Fenol FeCl3 + Terbentuk warna biru
Tanin FeCl3 1% + Terbentuk warna biru
Saponin - + Terbentuk busa
Terpenoid Timbal(II)
asetat
+ Terbentuk warna coklat pada
antarmuka
Flavonoid H2SO4 pekat + Terbentuk endapan kuning
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Berdasarkan hasil uji tabung di atas ekstrak etanol 75% herba pegagan
mengandung alkaloid, fenol, tanin, saponin, terpenoid, dan flavonoid. Hasil ini
sesuai dengan beberapa penelitian yang telah dilakukan. Hayati et al tahun 2013
yang menyatakan bahwa ekstrak etanol 96% pegagan mengandung tanin dan
flavonoid. Selain itu, Biradar dkk (2013) menyatakan bahwa ekstrak etanol absolut
pegagan mengandung senyawa flavonoid. Kristina dkk pada tahun 2009 juga
melakukan uji fitokimia terhadap tanaman pegagan dan menyatakan bahwa
tanaman pegagan mengandung alkaloid, saponin, tanin, fenol, flavonoid, dan
terpenoid. Penelitian fitokimia secara kuantitatif yang dilakukan Lestari (2015)
menyatakan bahwa ekstrak etanol 75% herba pegagan memiliki kandungan fenol
total paling tinggi dibandingkan pada ekstrak etanol 25%, 50%, dan 100% yaitu
sebesar 60, 958 mg/g.
Skrining fitokimia yang lebih spesifik pada ekstrak etanol pegagan juga
sudah pernah dilakukan oleh beberapa peneliti. Penelitian yang dilakukan oleh
Suresh et al pada tahun 2010 yaitu analisis kandungan senyawa pada ekstrak etanol
pegagan menggunakan Gas Chromatography menunjukkan hasil bahwa ekstrak
etanol pegagan mengandung senyawa fenol yaitu phenol-2,5-bis (1,1-
dimethylethyl) dan asarone yang merupakan golongan phenylpropane. Penelitian
lain yg dilakukan oleh Soumyanath et al. (2012) menganalisis kandungan senyawa
ekstrak etanol pegagan menggunakan HPLC menunjukkan bahwa ekstrak etanol
pegagan mengandung senyawa fenol golongan flavonoid yaitu prenylated flavone,
diacetyl flavone glycoside, diglycosyl flavonoid, dan proanthocyanidin. Senyawa
proantocyanidin juga terdapat dalam esktrak cranberry Amerika (Vaccinium
macrocarpon), senyawa proantocyanidin pada tanaman ini lebih dikenal dengan
active constituent proantocyanidin (PAC) dan telah diketahui mampu menghambat
pertumbuhan dan pembentukan biofilm dari bakteri Gram positif termasuk S.
aureus (Chung, 2014). Perlu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kandungan
senyawa – senyawa tersebut pada ekstrak etanol 75% herba pegagan.
Senyawa fenol yang terkandung dalam ekstrak etanol herba pegagan
diperkirakan merupakan senyawa yang berpengaruh dalam aktivitas penghambatan
pembentukan biofilm S. aureus. Namun perlu penelitian lebih lanjut untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
mengetahui secara pasti senyawa yang berperan dalam aktivitas penghambatan
pembentukan biofilm pada S. aureus.
KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol 75% herba pegagan
memiliki aktivitas penghambatan pembentukan biofilm pada bakteri S. aureus.
Persen penghambatan pembentukkan biofilm pada konsentrasi 2 mg/ml, 4 mg/ml,
8 mg/ml, 16 mg/ml, dan 32 mg/ml berturut – turut adalah 47,13%, 55,90%, 63,13%,
67,78%, dan 70,94%. Berdasarkan hasil uji tabung ekstrak etanol pegagan
mengandung alkaloid, tanin, fenol, saponin, terpenoid, dan flavonoid. Senyawa
fenol yang terdapat dalam ekstrak diduga berperan dalam aktivitas penghambatan
pembentukan biofilm pada S. aureus.
SARAN
Pada penelitian ini belum dilakukan uji antibiofilm yang lain yaitu uji
aktivitas penghancuran biofilm dan identifikasi senyawa aktif secara spesifik
sehingga disarankan untuk penelitian selanjutnya dilakukan uji aktivitas
penghancuran biofilm S. aureus. Selain itu juga dilakukan uji pembentukan,
penghambatan, dan penghancuran biofilm pada S. aureus yang telah resisten serta
dilakukan uji fitokimia secara spesifik untuk mengetahui senyawa yang memiliki
aktivitas penghambatan pembentukan biofilm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
DAFTAR PUSTAKA
Afifurrahman, Samadin, K.H., Aziz S., 2014. Pola Kepekaan Bakteri
Staphylococcus aureus terhadap Antibiotik Vancomycin di RSUP Dr.
Mohammad Hoesin Palembang. MKS., 46 (4), 266-270.
Agfadila, T., Sandhi, P.A., Puspawati, N.N., 2017. Kemampuan Daya Hambat
Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Pertumbuhan
Escherichia coli ATCC 8739. Jurnal ITEPA, 6 (2), 21-29.
Ahn, K.B., Baik, J.E., Yun, C.H., Han, S.H., 2018. Lipoteichoic Acid Inhibits
Staphylococcus aureus Biofilm Formation. Frontier in Microbiology., 9
(327), 1-13.
Alabi, A.S., Frielinghaus, L., Kaba, H., Kosters, K., Huson, M. A. M., Kahl, B. C.,
Peters, G., Grobusch, M. P., Issifou, S., Kremsner, P. G., Schaumburg, F.,
2013. Retrospective analysis of antimicrobial resistance and bacterial
spectrum on infection in Gabon, Central Africa. BMC Infectious Diseasesi.,
13 (455), 1-6
Anjarwati, D.U. dan Dharmawan, A.B., 2010. Identifikasi Vancomycin Resistant
Staphylococcus aureus (VRSA) Pada Membran Stetoskop di Rumah Sakit
Margono Soekarjo Purwoketo. Mandala of Health., 4 (2,). 90
Azeredo, J., Azevedo, N.F., Briandet, R., Cerca, N., Coenye, T., Costa, A.R.,
Desvaux, M., Bonaventura, G.D., Hebraud, M., Jaglic, Z., Kacanovia, M.,
Knochel, S., Lourenco, A., Mergulhao, F., Meyer, R.L, Nuchas, G., Simoes,
M., Tresse, O., Sternberg, C., 2016. Critical Review on Biofilm Methods.
Critical Reviews in Microbiology., 43 (3), 313-351.
Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2008. Acuan Sediaan Herbal. Volume 4,
Edisi 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan, 27.
Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2012. Acuan Sediaan Herbal. Volume 7,
Edisi 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan, 6-8.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Bai, J.R., Wu, Y.P., Elena, G., Zhong, K., Ggao, H., 2019. Insight into the effect of
quinic acid on biofilm formed by Stsphylococcus aureus. The Royal Society
of Chemomistry., 9 (1), 3938-3945.
Berlanga, M., Domenech, O., Guerrero, R., 2014, Biofilm Formation on
polystyrene in detached vs planktonik cells of polyhydroxyalkanoate-
accumulating Halomonas venusta, International Microbiology, 17(4), 205-
212.
Berlanga, M., Guerrero, R., 2016. Living together in biofilm : the microbial cell
factory and its biotechnological implications, Microbial Cell Factories, 15
(165) 1-11.
Biradar, S.R., Rachetti, B.D., 2013. Extraction of Some Secondary Metabolites &
Thin Layer Chromatography From Different Parts of Centella asiatica L.
(URB). American Journal oh Life Sciences., 1(6), 243-247.
Blanco, A.R., Rocarro, A.S., Spoto, G.C., Nostro, A., Rusciano, D., 2005.
Epigallotechin Gallate Inhibits Biofilm Formation by Ocular Staphylococcal
Isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy., 49 (10), 4339-4343.
Bueno, J., 2014. Antibiofilm Drug Suspectibility Testing Methods : Looking for
New Strategies against Resistance Mechanism. Journal of Microbial &
Biochemical Technology., 004, 1-9.
Ching, N.J., Aziz, Z., 2011. A Systematic Review on the Chemical Constituent of
Centella asiatica. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and
Chemical Sciences., 2(3), 445-459.
Chung, P.Y., Toh, Y.S., 2014. Antibiofilm agents : recent breakthrough against
multi-drug resistant Staphylococcus aureus. Pathogens and Disease., 1 (1),
1-9.
Ciofu, O., Molinero, E.R., Macia, M.D., Oliver, A., 2017. Antibiotic Treatment of
Biofilm Infections. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica
Scandinavica (APMIS)., 125 (1), 304-319.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Dewi, Y. S. K., Dominika, 2008. Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Fenol Umbi
Sarang Semut (Hydniphytum Sp.) pada Berbagai Suhu Penyeduhan.
Agritech., 28 (2), 91-96.
Depkes RI, 1995, Materia Medika Indonesia, Jilid IV, Jakarta : Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 50-52.
Falagas, M.E., Karageorgopoulus, D.E., Leptidis, J., Korbila, I.P., 2013. MRSA In
Africa : Filling the Global Map of Antimicrobial Resistance. PLOS ONE., 7
(8), 1-12.
Ferreira,A.A., Tette,P.A.S, Mendonça ,R.C. S, de Souza Soares,A.S, and Carvalho,
M.M., 2014. Detection of exopolysaccharide production and biofilm-related
genes in Staphylococcus spp. isolated from a poultry processing plant. Food
Science and Technology., 34 (4), 710-716.
Habib, F., Rind, R., Daruni, N., Bhutto, A.L., Buriro, R.S., Tunio, A., Aijaz, N.,
Lakho, S.A., Bugti, A.G., Shoaib, M., 2015. Morphological and Cultural
Characterization of Staphylococcus aureus Isolated from Different Animal
Species. Applied and Enviromental Microbiology., 5 (2), 15-26.
Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo, G., Rakes, D.D., 2008. Extraction
Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. Italy: United Nations
Industrial Development Organization and the International Centre for Science
and High Technology, 22, 31.
Hayati Z., Hafdhah, N., Junaidi, 2013. The effect of ethanol extracts of pegagan
(Centella asiatica) Urban in inhibiting the growth of Staphylococcus aureus
and Klebsiella pneumonia that caused pneumonia. In : The 3rd Annual
International Conference Syiah Kuala University., (AIC Unsyiah) 2013, 67-
71.
Hess, D.J., Henry-Stanley, M., Wells, C.L., 2014. Antimicrobial Synergy of
Glycerol Monolaurate and Aminoglycosides in Staphylococcus aureus
Biofilms. Antimircobial Agents and Chemotherapy., 58 (11), 6970-6973.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Interagency Taxonomic Information System, 2012. Staphylococcus aureus,
https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&searc
h_value=369#, diunduh 18 Februari 2018.
Interagency Taxonomic Information System, 2011. Centella asiatica (L.) Urban,
https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&searc
h_value=369#, diunduh 6 Juni 2018.
Jagani, S., Chelikani, R., Kim, D.S., 2009. Effect of phenol and natural phenolic
compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. Biofouling.,
25(4), 321-324.
Jose, D., Lekshmi, N., Goel, A.K., Kumar, R.A., Thomas, S., 2017. Development
of a Novel Herbal Formulation to Inhibit Biofilm Formation in Toxigenic
Vibrio cholera. Journal of Food Protection., 80 (11), 1933-1940.
Kementerian Kehutanan Republik Indonesia (Kemenhut RI), 2010. Artikel
disampaikan pada Lokakarya Nasional Tanaman Obat Indonesia, Jakarta, 28-
30 Juli 2010.
Kementerian Kesehatan RI, 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Jakarta:
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Kementerian Kesehatan
RI. 33, 56.
Kinning, E., Falah, S., Nurhidayat, N., 2016. The In Vitro Antibiofilm Activity of
Water Leaf Extract of Papaya (Carica papaya L.) against Pseudomonas
aeruginosa. Current Biochemistry., 2 (3), 150-163.
Knobloch, J.K.M., Horstkotte, M.A., 2002. Evaluation of different detection
methods of biofilm formation in Staphylococcus aureus. Medicine
Microbilogy and Immunology., 191 (1), 101-106
Kodali, V.P., Karlapudi, A.P., Kotam, M., Kota, R.K., Punati, T., Byri, R.B., 2013.
Plant Extract as Antibiofilm Agents. International Journal of Pharmaceutical
Science Review and Research., 21(1), 325-328.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Kristina, N.N. Kusumah, E.D., Lailani, P.K., 2009. Analisis Fitokimia dan
Penampilam Polapita Protein Tanaman Pegagan (Centella asiatica) Hasil
Konservasi In Vitro. Bul. Littro., 20(1), 11-20.
Lestari, A.B.S., Fudholi, A., Nugroho, A.K., Setyowati, E.P., 2015. Pengaruh
Purifikasi n-Heksana pada Serbuk Simplisia terhadap Kadar Asiatikosida,
Penangkapan Radikal Bebas dan Kadar Fenol Total Ekstrak Etanolik Herba
Pegagan (Centella asistica (L.) Urban). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia.,
13 (1), 10-16.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., Stahl, D.A., 2015.
Brock biology of microorganisms. 14th ed., USA: Pearson Education, 814,
843, 868-869.
Mirani, Z.A., Fatima, A., Urooj, S., Aziz, M., Khan, M.N., Abbas, T., 2018.
Relationship of cell surface hydrophobicity with biofilm formation and
growth rate : A study on Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
and Escherichia coli, Iranian Journal of Basic Medical Sciences., 21 (1), 760-
769.
Miquel, S., Lagrafeuille, R., Souweine, B., Forestier, C., 2016. Antibiofilm Activity
as a Health Issue. Frontiers in Microbiology., 7 (592), 1-4.
Novoa, M.G.A., Moreno, M.I., Velaguez, O.A.S., Gomez, J.P.G., Medina, P.J.G.,
Lomeli, M.G., 2018. Biofilm Formation by Staphyococcus aureus Isolated
from Food Contact Surface in the Dairy Industry of Jalisco, Mexico. Journal
of Food Quality., 1 (1), 1-8.
Olsen, I., 2015. Biofilm Spesific antibiotic tolerance and resistance. Europe Journal
Microbiology Infextion Diseases.
Otajevwo, F.D., 2013. Urinary Tract Infection among Symptomatic Outpatiens
Visiting a Tertiary Hospital Based in Midwestern Nigeria. Canadian Global
Journal og Health Science., 5 (2), 187-199.
Otto, M., 2008. Staphylococcal Biofilms, In : Bacterial Biofilms. New York,
Springer. 208-223.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
O'Toole, G. A., 2011. Microtiter dish biofilm formation assay. Journal of visualized
experiments: JoVE., 47 (1).
Paraje, M.G., 2011. Antimicrobial resistance in biofilms, FORMATEX, 736-744.
Pratiwi, S.U.T., Lagemdijk, E.L., Weert, S., Idroes, R., Hertiani, T., Hondel, C.V.,
2015. Effect of Cinnamum burmannii Nees ex Bl. and Massoia aromatic
Becc. Essential oil on Planctonic Growth and Biofilm formation of
Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus In Vitro. International
Journal of Applied Research in Natural Product., 8 (2). 1-13.
Petrachi, T., Resca, E., Piccino, M.S., Biagi, F., Strusi, V., Dominici, M., Veronesi,
E., 2017. An Alternative Approach to Investigate Biofilm In Medical
Devices : A Feasibility Study. International Journal of Environmental
Research and Public Health., 14 (1), 1-7
Polash, S.A., Saha, T., Hossain M. S., Sarker, S. R., 2017. Phytochemical contents,
antioxidant and antibacterial activity of the ethanolic of Centella asiatica (L.)
Urb leaf and stem. Jahangimagar University J. Biol., 6(1), 51-57.
Quave, C.L., Plano, L.R.W., Pantuso, T., Bennelt, B.C., 2008. Effect of extracts
from Italian medicinal plant on planktonik growth, biofilm formation and
adherence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J.
Enthopharmacol., 118 (3), 418-428.
Rattanakom, S., Yasurin, P., 2015. Chemical Profiling of Centella asiatica under
Different Extraction Solvents and its Antibacterial Activity, Antioxidant
Activity. Oriental Journal of Chemistry., 31(4), 2453-2459.
Rosalina D., Martodihardjo, S., Listiawan, M. Y., 2010. Staphylococcus aureus
sebagai Penyebab Tersering Infeksi Sekunder pada Semua Erosi Kulit
Dermatosis Vesikobulosa. Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin., 22
(2), 102-108.
Schwarz, S., Silley, P., Simjee, S., Woodford, N., Duijkeren, E., Johnson, A.P.,
Gaastra, W., 2010. Editorial : Assessing the antimicrobial suspectibility of
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
bacteria obtained from animals. Journal Antimicrobial Chemotherapy., 65
(1), 601-604.
Seidel, V., 2008, Initial and Bulk Extraction. In: Sarker, S. D., Latif, Z. and Gray,
A. I.,editors, Natural Products Isolation, 2nd Ed, United Kingdom, 33-34.
Shahwany, A. W. A., Tawfeeq, H.K., Hamed, S.E., 2016. Antibacterial and
Antibiofilm Activity of Three Phenolic Plant Extracts and Silver
Nanoparticles on Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumonia.
Biomedicine and Biotechnologi., 4 (1), 12-18.
Shavina, S., Banerjee, G., Garg, R., Singh, M., 2014. Comparative Study of Biofilm
Formation in Pseudomonas aeruginosa Isolates from Patients of Lower
Respiratory Tract Infection. Journal of Clinic and Diagnostic Research., 8
(5), 9-11.
Shrestha, L., Kayama, S., Sasaki, M., Kato, F., Hisatsune, J., Tsuruda, K., Koizimu,
K., Tatsukawa, N., Yu, L., Takeda, K., Sugai, M., 2016. Inhibitory effect of
antibiofilm compound 1 against Staphylococcus aureus biofilm.
Microbiologi and Immunology., 60 (1), 148-159
Singh, A.K., Prakas, P., Achra, A., Singh, G.P., Das, A., Singh, R.K., 2017.
Standarization and Classification of In vitro Biofilm Formation by Clinical
Isolates of Staphylococcus aureus. Journal of Global Infectious Diseases., 9
(3), 93-101.
Singh, N., Patil, A., Ptabhune, A., Goel, G., 2016. Inhibition of quorum-sensing-
mediated biofilm formation in Cronobacter sakazakii strains. Mircobiology.,
162 (1), 1708-1714.
Skogman, M.E., 2012. A Platform for antibiofilm assays combining biofilm
viability, biomass, and matrix quantification in suspectibility assessments of
antimicrobials against staphylococcus aureus biofilm.
Slobodnikova, L., Fialova, S., Rendekova, K., Kovac, J., Mucaji, P., 2016.
Antibiofilm Activity of Plant Polyphenol. Molecules., 21, 1-15.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Soumyanath, A., Zhong, Y.P., Hensin, E., Wadsworth, T., Bishop, J., Gold, B.G.,
Quinn, J.F., 2012. Centella asiatica Extract Inprove Behavioral Deficits in a
Mouse Model of Alzheimer’s Disease : Invertigation of a Possible
Mechanism of Action. International Journal of Alzheimer’s Disease., 1 (1),
1-9.
Stepanovic, S., Vukonic, D., Hola, V., Bonaventur, G.D., Djukic, S., Cirkovic, I.,
Ruzicka, F., 2007. Quantification of biofilm in microtiter plates : overview of
testing conditions and pratical recommendations for assessment of biofilm
production by staphylococci. Journal Compilation APMIS., 115 (1), 891-899.
Suresh, M., Rath, P.K., Panneerselvam, A., Dhanasekaran, D., Thajuddin, N., 2010.
Anti-Mycobacterial Effect of Leaf Extract of Centella asiatica
(Mackinlayaceae). Research J. Pharm and Tech., 3 (3), 872-876.
Syaiful I. 2013. Pola Kepekaan Bakteri Staphylococcus aureus terhadap antibiotik
Vankomisin di RSMH Palembang periode oktober 2011- september 2012. FK
Unsri. 4:50
Taemchuay, D., Rukkwamsuk, T., Sakpuaram, T., Ruangwises, N., 2009.
Antibacterial Activity of Crude Extracts of Centella asiatica against
Staphylococcus aureus in Bovine Mastitis. Kasetsart Veterianrians., 19(3),
120-128.
Tambun R., Limbong, H.P., Pinem, C., Manurung, E., 2016. Pengaruh Ukuran
Partikel, Waktu, dan Suhu Pada Ekstraksi Fenol dari Lengkuas Merah. Jurnal
Teknik Kimia., 5(4), 53-56.
Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011. Phytochemical screening
and extraction : A review. International Pharmaceutical Sciencia., 1(1), 98-
106.
Udo, E.E., Al-Sweih N., Noroba, B.C., 2003. A chromosomal location of the mupA
gene in Staphylococcus aureus expressing high-level mupirocin resistance.
Journal of Antimicrobial Chemotherapy., 50 (1), 1283-1286.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Udoh, D.I., Asamudo, N.U., Bala, D.N., Enwongo O., 2012. Inhibitory Effect of
Varying Concentration of Leaves Extract of Centella asiatica (Gotu Kola) on
Some Microorganisms of Medical Importance. International Journal of
Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research., 3 (2), 142-148.
Vasavi, H.S., Arun, A.B., Rekha, P.D., 2014. Anti-quorum sensing activity of
flavonoid-rich fraction from Centella asiatica L. against Pseudomonas
aeruginosa PAO 1. Journal of Microbiology, Immunology, and Infection., 1
(1), 1-8.
Wu, H., Moser, C., Wang, H.Z., Hoiby, N., Song, Z.J., 2014. Strategies for
Combating Bacterial Biofilm Infections. International Journal of Oral
Science., 1 (7), 1-7.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Determinasi tanaman Centella asistica (L). Urb
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Lampiran 2. Certificate of Quality Staphylococcus sureus ATCC 25923
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Lampiran 3. Surat Legalitas analisis data oleh Pusat Kajian Clinical Epidemiology
& Biostatistics Unit Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Lampiran 4. Bahan yang digunakan
Gambar 6. Simplisia herba Pegagan
Lampiran 5. Pengukuran Kadar air Serbuk Centella asistica (L). Urban
Perhitungan Kadar air
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 = 0,8 𝑚𝑙
10,6625 𝑥 100% =7,5%
Gambar 7. Pengukuran Kadar Air menggunakan Destilasi Toluen
Lampiran 6. Hasil Ekstraksi
Perhitungan Rendemen
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 5,5445 𝑔𝑟𝑎𝑚
25,263 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑥 100% =21,95%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Gambar 8. Ekstrak Kental Centella asiatica (L) Urban
Lampiran 7. Larutan Ekstrak Etanol Pegagan
Gambar 9. Larutan stok ekstrak etanol pegagan dan larutan ektrak etanol pegagan
dengan konsentrasi 2, 4, 8, 16, dan 32 mg/ml
Lampiran 8. Hasil Pengukuran Optical Density 595nm
No. Kelompok Optical Density 595nm
Rata-rata Standar
Deviasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
1. Streptomycin
(K. Positif) 0,228 0,192 0,184 0,201
0,023
2. Aquadest steril
(K. Pelarut) 2,229 2,197 2,199 2,208
0,018
3. Kontrol
Pertumbuhan 2,214 2,210 2,216 2,213
0,003
4. EEP 2 mg/ml 1,185 1,186 1,139 1,170 0,027
5. EEP 4 mg/ml 0,939 0,967 1,022 0,976 0,042
6. EEP 8 mg/ml 0,796 0,785 0,868 0,816 0,045
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
7. EEP 16 mg/ml 0,710 0,628 0,800 0,713 0,086
8. EEP 32 mg/ml 0,632 0,582 0,715 0,643 0,067
Lampiran 9. Perhitungan Persen Penghambatan Pembentukan Biofilm
𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛 𝑝𝑒𝑛𝑔ℎ𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 = 𝑂𝐷𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛−𝑂𝐷𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛
𝑂𝐷𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛 𝑥 100%
OD Kontrol
Pertumbuhan
OD Kelompok Perlakuan ± SD Persen
Penghambatan
2,213
2 mg/ml 1,170 ± 0,027 47,13%
4 mg/ml 0,976 ± 0,042 55,90%
8 mg/ml 0,816 ± 0,045 63,13%
16 mg/ml 0,713 ± 0,086 67,78%
32 mg/ml 0,643 ± 0,067 70,94%
Streptomycin 0,201 ± 0,023 90,92%
Lampiran 10. Skrining Fitokimia
Gambar 10. Uji Tabung Ekstrak Etanol Pegagan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Gambar 11. Endapan merah yang terbentuk pada Uji Alkaloid
Lampiran 11. Uji Statistik
Tests of Normality
Kelompok
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df
Optical Density Kontrol Pertumbuhan .253 3 . .964 3
kontrol pelarut .365 3 . .797 3
kontrol Positif .321 3 . .881 3
Konsentrasi 32 mg/ml .232 3 . .980 3
Konsentrasi 16 mg/ml .179 3 . .999 3
Konsentrasi 8 mg/ml .341 3 . .847 3
Konsentrasi 4 mg/ml .251 3 . .966 3
Konsentrasi 2 mg/ml .366 3 . .796 3
Descriptives
Kelompok Statistic
Std. Error
Optical Density
Kontrol Pertumbuhan
Mean 2.21333 .001764
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
2.20574
Upper Bound
2.22092
5% Trimmed Mean .
Median 2.21400
Variance .000
Std. Deviation .003055
Minimum 2.210
Maximum 2.216
Range .006
Interquartile Range .
Skewness -.935 1.225
Kurtosis . .
kontrol pelarut Mean 2.20833 .010349
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
2.16380
Upper Bound
2.25286
5% Trimmed Mean .
Median 2.19900
Variance .000
Std. Deviation .017926
Minimum 2.197
Maximum 2.229
Range .032
Interquartile Range .
Skewness 1.708 1.225
Kurtosis . .
kontrol Positif Mean .20133 .013532
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
.14311
Upper Bound
.25956
5% Trimmed Mean .
Median .19200
Variance .001
Std. Deviation .023438
Minimum .184
Maximum .228
Range .044
Interquartile Range .
Skewness 1.508 1.225
Kurtosis . .
Konsentrasi 32 mg/ml
Mean .64300 .038786
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
.47612
Upper Bound
.80988
5% Trimmed Mean .
Median .63200
Variance .005
Std. Deviation .067179
Minimum .582
Maximum .715
Range .133
Interquartile Range .
Skewness .717 1.225
Kurtosis . .
Konsentrasi 16 mg/ml
Mean .71267 .049670
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
.49895
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Upper Bound
.92638
5% Trimmed Mean .
Median .71000
Variance .007
Std. Deviation .086031
Minimum .628
Maximum .800
Range .172
Interquartile Range .
Skewness .139 1.225
Kurtosis . .
Konsentrasi 8 mg/ml
Mean .81633 .026028
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
.70434
Upper Bound
.92832
5% Trimmed Mean .
Median .79600
Variance .002
Std. Deviation .045081
Minimum .785
Maximum .868
Range .083
Interquartile Range .
Skewness 1.617 1.225
Kurtosis . .
Konsentrasi 4 mg/ml
Mean .97600 .024379
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
.87111
Upper Bound
1.08089
5% Trimmed Mean .
Median .96700
Variance .002
Std. Deviation .042226
Minimum .939
Maximum 1.022
Range .083
Interquartile Range .
Skewness .916 1.225
Kurtosis . .
Konsentrasi 2 mg/ml
Mean 1.17067 .015857
95% Confidence Interval for Mean
Lower Bound
1.10244
Upper Bound
1.23889
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
5% Trimmed Mean .
Median 1.18500
Variance .001
Std. Deviation .027465
Minimum 1.139
Maximum 1.188
Range .049
Interquartile Range .
Skewness -1.709 1.225
Kurtosis . .
Test of Homogeneity of Variances Optical Density
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.944 7 16 .128
ANOVA Optical Density
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 11.198 7 1.600 737.036 .000 Within Groups .035 16 .002
Total 11.233 23
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable: Optical Density
(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound
Upper Bound
Tukey HSD
Kontrol Pertumbuhan
kontrol pelarut .005000 .038039 1.000 -.12670 .13670
kontrol Positif 2.012000* .038039 .000 1.88030 2.14370
Konsentrasi 32 mg/ml
1.570333* .038039 .000 1.43864 1.70203
Konsentrasi 16 mg/ml
1.500667* .038039 .000 1.36897 1.63236
Konsentrasi 8 mg/ml
1.397000* .038039 .000 1.26530 1.52870
Konsentrasi 4 mg/ml
1.237333* .038039 .000 1.10564 1.36903
Konsentrasi 2 mg/ml
1.042667* .038039 .000 .91097 1.17436
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
kontrol pelarut Kontrol Pertumbuhan
-.005000 .038039 1.000 -.13670 .12670
kontrol Positif 2.007000* .038039 .000 1.87530 2.13870
Konsentrasi 32 mg/ml
1.565333* .038039 .000 1.43364 1.69703
Konsentrasi 16 mg/ml
1.495667* .038039 .000 1.36397 1.62736
Konsentrasi 8 mg/ml
1.392000* .038039 .000 1.26030 1.52370
Konsentrasi 4 mg/ml
1.232333* .038039 .000 1.10064 1.36403
Konsentrasi 2 mg/ml
1.037667* .038039 .000 .90597 1.16936
kontrol Positif Kontrol Pertumbuhan
-2.012000* .038039 .000 -2.14370 -1.88030
kontrol pelarut -2.007000* .038039 .000 -2.13870 -1.87530
Konsentrasi 32 mg/ml
-.441667* .038039 .000 -.57336 -.30997
Konsentrasi 16 mg/ml
-.511333* .038039 .000 -.64303 -.37964
Konsentrasi 8 mg/ml
-.615000* .038039 .000 -.74670 -.48330
Konsentrasi 4 mg/ml
-.774667* .038039 .000 -.90636 -.64297
Konsentrasi 2 mg/ml
-.969333* .038039 .000 -1.10103 -.83764
Konsentrasi 32 mg/ml
Kontrol Pertumbuhan
-1.570333* .038039 .000 -1.70203 -1.43864
kontrol pelarut -1.565333* .038039 .000 -1.69703 -1.43364
kontrol Positif .441667* .038039 .000 .30997 .57336
Konsentrasi 16 mg/ml
-.069667 .038039 .610 -.20136 .06203
Konsentrasi 8 mg/ml
-.173333* .038039 .006 -.30503 -.04164
Konsentrasi 4 mg/ml
-.333000* .038039 .000 -.46470 -.20130
Konsentrasi 2 mg/ml
-.527667* .038039 .000 -.65936 -.39597
Konsentrasi 16 mg/ml
Kontrol Pertumbuhan
-1.500667* .038039 .000 -1.63236 -1.36897
kontrol pelarut -1.495667* .038039 .000 -1.62736 -1.36397
kontrol Positif .511333* .038039 .000 .37964 .64303
Konsentrasi 32 mg/ml
.069667 .038039 .610 -.06203 .20136
Konsentrasi 8 mg/ml
-.103667 .038039 .018 -.23536 .02803
Konsentrasi 4 mg/ml
-.263333* .038039 .000 -.39503 -.13164
Konsentrasi 2 mg/ml
-.458000* .038039 .000 -.58970 -.32630
Konsentrasi 8 mg/ml
Kontrol Pertumbuhan
-1.397000* .038039 .000 -1.52870 -1.26530
kontrol pelarut -1.392000* .038039 .000 -1.52370 -1.26030
kontrol Positif .615000* .038039 .000 .48330 .74670
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Konsentrasi 32 mg/ml
.173333* .038039 .006 .04164 .30503
Konsentrasi 16 mg/ml
.103667 .038039 .018 -.02803 .23536
Konsentrasi 4 mg/ml
-.159667* .038039 .012 -.29136 -.02797
Konsentrasi 2 mg/ml
-.354333* .038039 .000 -.48603 -.22264
Konsentrasi 4 mg/ml
Kontrol Pertumbuhan
-1.237333* .038039 .000 -1.36903 -1.10564
kontrol pelarut -1.232333* .038039 .000 -1.36403 -1.10064
kontrol Positif .774667* .038039 .000 .64297 .90636
Konsentrasi 32 mg/ml
.333000* .038039 .000 .20130 .46470
Konsentrasi 16 mg/ml
.263333* .038039 .000 .13164 .39503
Konsentrasi 8 mg/ml
.159667* .038039 .012 .02797 .29136
Konsentrasi 2 mg/ml
-.194667* .038039 .002 -.32636 -.06297
Konsentrasi 2 mg/ml
Kontrol Pertumbuhan
-1.042667* .038039 .000 -1.17436 -.91097
kontrol pelarut -1.037667* .038039 .000 -1.16936 -.90597
kontrol Positif .969333* .038039 .000 .83764 1.10103
Konsentrasi 32 mg/ml
.527667* .038039 .000 .39597 .65936
Konsentrasi 16 mg/ml
.458000* .038039 .000 .32630 .58970
Konsentrasi 8 mg/ml
.354333* .038039 .000 .22264 .48603
Konsentrasi 4 mg/ml
.194667* .038039 .002 .06297 .32636
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “Aktivitas Penghambatan
Pembentukan Biofilm Ekstrak Etanol Pegagan
(Centella Asiatica (L.) Urban Terhadap Staphylococcus
aureus” memiliki nama lengkap Felicita Eka Putri S, lahir
di Lubuklinggau, 1 Maret 1997. Penulis yang akrab
dipanggil Felis merupakan anak pertama dari 3 bersaudara
dari pasangan Yohanes Subardi dan Paulina Setyaningsih.
Penulis menempuh pendidikan di SD (2003-2009), SMP
(2009-2012) dan SMA (2012-2015) Xaverius Lubuklinggau, Sumatera Selatan.
Pada tahun 2015 melanjutkan pendidikan strata-1 di Program Studi Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarata. Selama menempuh pendidikan sarjana,
penulis aktif mengikuti kegiatan kepanitiaan dan organisasi seperti Inisiasi Fakultas
Farmasi (TITRASI), Seminar Internasional ICPharmP, Pharmacy Performance,
Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi pada tahun 2017/2018 dan
2018/2019, dan Unit Kegiatan Fakultas Paduan Suara Veronika. Selain itu penulis
juga pernah menjadi asisten dosen praktikum Biologi Sel Molekuler, Farmakognosi
Fitokimia, dan Mikrobiologi Farmasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI