I. PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Ikan memiliki kadar protein yang sangat tinggi yaitu sekitar 20 %. Protein yang

terkandung dalam ikan mempunyai mutu yang baik, sebab sedikit mengandung

kolesterol dan sedikit lemak. Ikan memiliki kelemahan yakni mudah membusuk. Ikan

relatif lebih cepat mengalami pembusukan daripada daging unggas dan mamalia

karena pada saat ditangkap ikan selalu berontak sehingga banyak kehilangan glikogen

dan glukosa. Glikogen dan glukosa pada hewan yang mati dapat mengalami glikolisis

menjadi asam piruvat yang selanjutnya diubah menjadi asam laktat. Apabila ikan

terlalu banyak berontak pada saat ditangkap maka akan banyak kehilangan glikogen

dan glukosa sehingga kandungan asam laktat ikan menjadi rendah. Dengan demikian

nilai pH-nya relatif mendekati normal. Nilai pH yang mendekati normal ini sangat

cocok untuk pertumbuhan bakteri, sehingga ikan segar harus segera diolah dengan

baik agar layak untuk dikonsumsi (Nuraini, 2007).

Pengolahan ikan agar lebih awet perlu dilakukan agar ikan dapat tetap

dikonsumsi dalam keadaan yang baik. Pada dasarnya pengawetan ikan bertujuan

untuk mencegah bakteri pembusuk masuk ke dalam ikan. Nelayan biasanya

memberi es sebagai pendingin agar memperpanjang masa simpan ikan sebelum

sampai pada konsumen. Demikian pula dengan maraknya penggunaan bahan

tambahan sebagai pengawet yang tidak diijinkan untuk digunakan dalam makanan

seperti formalin yang membahayakan bagi kesehatan (Mahatmanti, et al, 2009).

Bakteri penyebab pembusukan pada ikan antara lain adalah Aeromonas,

Enterobactericeae, Pseudomonas, Shewanella, Vibrio, dan lain-lain. Menurut

Purwani et al (2008) dalam Dewi (2010), beberapa bakteri yang terdapat pada

daging ikan segar, yaitu Acinetobacter calcoaciticus, Bacillus alvei, Bacillus

cereus ATCC 1178, Bacillus licheniformis, Klebsiella oxytoca ATCC 49131,

Klebsiella pneumoniae ATCC 33495, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305, Enterobacter aerogenes ATCC

13048, Escherichia coli ATCC 11229. Bakteri tersebut berpotensi menyebabkan

pembusukan karena aktivitasnya dalam mendegradasi protein, sebab daging ikan

mempunyai kandungan protein yang tinggi. Protein digunakan bakteri untuk

aktivitas metabolismenya.

Penelitian untuk mendapatkan antibakteri alami, perlu dilakukan karena

sebagian besar bahan antibakteri yang beredar merupakan zat kimia dan sifatnya

tidak aman bagi tubuh. Antibakteri alami adalah suatu senyawa yang dihasilkan

oleh bahan alam, yang dapat menekan pertumbuhan dan perkembangan bakteri.

Salah satu bahan alam yang berpotensi mempunyai aktivitas sebagai pengawet

alami adalah Teripang Pasir (Holothuria scabra), karena ekstrak teripang telah

terbukti sebagai agen antimikroba yang potensial dalam beberapa penelitian.

Potensi ekstrak antimikroba dari Teripang Pasir dapat berasal dari adanya agen

antimikroba yaitu steroidal sapogenin (Bordbar et al, 2011). Senyawa bioaktif

pada Teripang pasir yang berperan sebagai antibakteri selain steroid dan

sapogenin adalah saponin (Abraham et al, 2002). Agen antibakteri yang

dihasilkan dari hasil ekstraksi Teripang pasir yaitu triterpene glycoside (Farouk et

al, 2007).

Menurut penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa teripang genus

Holothuria, Stichopus, dan Cucumaria dapat berpotensi sebagai antibakteri alami.

Farouk, et al (2007) telah melakukan penelitian tentang aktivitas antimikroba dari

Teripang spesies Holothuria scabra yang terbukti berpotensi sebagai antibakteri

terhadap bakteri pembusuk diantaranya Pseudomonas aeruginosa, Bacillus

cereus, Klebsiella pneumonia, dan Escherichia coli.

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui bagaimana aktivitas dan potensi

antibakteri ekstrak Teripang Pasir terhadap bakteri pembusuk pada daging ikan,

antara lain, Bacillus cereus ATCC 1178 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853, sehingga dapat digunakan sabagai bahan antibakteri alami.

I.2. Perumusan dan Pendekatan Masalah

I.2.1. Perumusan masalah

Ikan segar sangat mudah mengalami kemunduran mutu yang ditandai

dengan proses pembusukan yang disebabkan karena protein dalam ikan yang

terdegradasi oleh bakteri pembusuk dan kondisi lingkungan yang optimal untuk

pertumbuhan bakteri. Bakteri pembusuk yang sering mengkontaminasi ikan segar

yaitu Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa. Salah satu cara yang biasa

dilakukan untuk menghambat kontaminasi atau pertumbuhan bakteri yaitu dengan

menggunakan bahan kimia berbahaya dan tidak aman untuk dikonsumsi seperti

formalin. Penelitian untuk mendapatkan senyawa alami baru sebagai antibakteri

alami perlu dilakukan. Salah satu upaya yang dilakukan yaitu dengan

memanfaatkan Teripang pasir yang memiliki senyawa metabolit sekunder sebagai

antibakteri. Oleh karena itu, dalam penelitian ini akan diuji apakah Teripang pasir

berpotensi sebagai antibakteri alami dan apakah perbedaan pelarut polar, semi

polar dan non polar berpengaruh pada aktivitas antibakteri terhadap bakteri

pembusuk ikan segar?

I.2.2. Pendekatan masalah

Salah satu hasil laut yang memiliki senyawa bioaktif yang berpotensi

sebagai antibakteri alami adalah Teripang pasir. Teripang jenis ini banyak

ditemukan di perairan Indonesia seperti di pantai utara Jawa, Madura, dan Bali.

Penelitian diawali dengan ekstraksi Teripang pasir menggunakan pelarut

yang berbeda-beda, yaitu polar, semi-polar, dan non polar. Kajian mengenai

aktivitas antibakteri Teripang pasir terhadap bakteri pembusuk ikan segar ini

hanya dilakukan dalam satu tahap yaitu penelitian utama.

Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi yaitu n-heksan, etil asetat,

dan etanol. Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini yaitu 10 mg/ml.

Waktu inkubasi yang digunakan yaitu selama 2 x 24 jam. Hal ini sesuai dengan

penelitian yg dilakukan oleh Abraham et al (2002) tentang potensi biomedical

penting sebagai sustansi antibakteri dari spesies-spesies Holothuria.

Pengujian dilanjutkan dengan menanam kultur Bacillus cereus dan

Pseudomonas aeruginosa pada media Nutrient Agar (NA) kemudian diberi

ekstrak Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa lalu diukur zona

hambatnya. Parameter pendukung yang diteliti yaitu uji skrinning fitokimia dan

identifikasi senyawa bioaktif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada

ekstrak Teripang pasir.

I.3. Tujuan dan Manfaat

I.3.1. Tujuan

Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Mengetahui potensi bioaktif ekstrak Teripang pasir sebagai antibakteri alami;

2. Mengetahui pengaruh plarut yang berbeda terhadap aktivitas antibakteri

ekstrak Teripang pasir.

I.3.2. Manfaat

Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini adalah memberikan

informasi tentang aktivitas antibakteri ekstrak Teripang pasir terhadap bakteri

pembusuk ikan segar sehingga dapat menjadi suatu alternatif sumber antibakteri

alami.

I.4. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari-April 2012. Rumput

laut diambil dari perairan pantai utara, Rembang, Jawa Tengah. Pengeringan

sampel dan ekstraksi sampel di Laboratorium Teknologi Pangan, Universitas

Katolik Soegijapranata, Semarang. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan di

Laboratorium Kesehatan, Semarang. Sedangkan untuk uji Kromatografi Lapis

Tipis dan uji skrinning fitokimia dilakukan di Laboratorium Kimia, Fakultas

Sains dan Matematika, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.

Gambar 1. Skema Pendekatan Masalah

Input

Proses

Output

Permasalahan

1. Ikan segar sering terkontaminasi bakteri Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa

2. Penggunaan bahan kimia berbahaya digunakan untuk menghilangkan bakteri pembusuk pada ikan segar.

3. Teripang pasir dapat menghasilkan bioaktif yang berpotensi sebagai antibakteri alami

Data

Analisis Data

Kesimpulan

Penelitian 1. Penanganan sampel dan proses ekstraksi.2. Parameter utama : Uji kontrol negatif dan uji aktivitas antibakteri

dengan pelarut berbeda (n-heksan, etil asetat, dan etanol)3. Parameter pendukung : Uji skrining fitokimia ekstrak Teripang

pasir

Potensi Teripang pasir sebagai antibakteri alami dengan studi pustaka

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Teripang Pasir (Holothuria scabra)

II.1.1. Klasifikasi Teripang pasir

Klasifikasi dari Teripang pasir (Martoyo et al, 2000) adalah sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Filum : Echinodermata

Sub-filum : Echinozoa

Kelas : Holothuroidea

Sub-kelas : Aspidochirotacea

Ordo : Aspidochirotida

Famili : Holothuriidae

Genus : Holothuria

Spesies : Holothuria scabra

Gambar 2. Teripang Pasir

Sumber : Dewi et al (2010)

II.1.2. Morfologi Teripang pasir

Teripang pasir merupakan salah satu anggota hewan filum

Echinodermata. Teripang pasir bertubuh lunak, berdaging dan berbentuk silindris

memanjang seperti buah ketimun, oleh karena itu hewan ini dinamakan ketimun

laut. Gerakan teripang pasir sangat lambat sehingga hampir seluruh hidupnya

berada di dasar laut. Warna tubuh teripang pasir bermacam-macam, mulai dari

hitam, abu-abu, sampai putih (Martoyo et al, 2000).

Menurut Suryanti (2011), bentuk badan dari Teripang pasir yaitu bulat

panjang, seluruh bagian tubuh apabila diraba akan terasa kasar seperti ada butiran.

Warna Teripang pasir sewaktu masih segar putih kekuningan, terdapat sekat yang

melintang berwarna putih dan diantara sekat terdapat garis hitam. Adapun nama-

nama daerah dari Teripang pasir adalah sebagai berikut:

a) Menado : Teripang gamat betul

b) P. Bangka : Teripang taikucing

c) Lampung : Teripang buang kulit

d) Kep. Seribu : Teripang pasir

e) Indonesia timur : Teripang putih atau Teripang kapur

II.1.3. Habitat Teripang pasir

Teripang pasir hidup di habitat lumpur berpasir dan berbahan organik

tinggi serta di sela-sela tumbuhan lamun. Selain dipengaruhi tipe habitat, secara

umum keberadaan Teripang pasir juga dipengaruhi oleh kelimpahan makanan

yang tersedia, yaitu plankton dan detrirus. Daerah persebaran Teripang pasir di

Indonesia adalah Jawa Tengah, Jawa Timur, Bali, Nusa Tenggara Barat, Nusa

Tenggara Timur, Irian, Sulawesi Tenggara, Sulawesi Selatan, Pantai Barat

Sumatra, Sumatra Utara, dan Aceh (Hartati et al, 2005).

Teripang pasir banyak ditemukan pada perairan yang dasarnya pasir halus,

tetapi Teripang pasir lebih menyukai perairan karang. Selain itu, Teripang pasir

juga ditemukan kurang lebih 20 m dari pinggir pantai, dimana terdapat lumpur

pasir dan padang lamun (Suryanti, 2011).

II.1.4. Kandungan tubuh Teripang pasir

Teripang pasir mempunyai nilai ekonomis penting karena kandungan atau

kadar nutrisinya yang tinggi. Dari hasil penelitian, kandungan nutrisi teripang pasir

dalam kondisi kering terdiri dari protein sebanyak 82%, lemak 1,7%, kadar air 8,9%,

kadar abu 8,6%, dan karbohidrat 4,8%. Selain itu, Teripang pasir juga mengandung

fosfor, besi, iodium, natrium, vitamin A dan B (thiamin, riboflavin, dan niasin).

Kandungan kimia teripang pasir dalam keadaan basah yaitu 44 - 45% protein, 3 - 5%

karbohidrat, dan 1,5% lemak (Kustiariyah, 2006).

Kandungan bioaktif atau metabolit sekunder pada Teripang pasir diantaranya

steroid, sapogenin, saponin, triterpene glycoside, Glycosaminoglycan, Lectin,

Phenols dan flavonoid (Bordbar et al, 2011).

a. Steroid

Steroid adalah triterpen yang kerangka dasarnya cincin siklopentana

perhidrofenantren. Inti steroid dasar sama dengan inti lanosterol dan triterpenoid

tetrasiklik lain. Istilah sterol dipakai khusus untuk steroid alkohol. Sterol biasanya

mempunyai gugus hidroksil pada atom C-3 dan suatu ikatan rangkap pada posisi 5

dan 6. Kerangka dasar dan sistem penomoran steroid (Purwanti, 2008) dapat dilihat

pada gambar berikut ini:

Gambar 3. Kerangka Dasar Steroid

Sumber : Purwanti (2008)

b. Saponin

Saponin mula-mula diberi nama demikian karena sifatnya yang khas menyerupai

sabun (bahasa latin sapo = sabun). Saponin adalah glikosida yang aglikonnya disebut

sapogenin. Keberadaan saponin sangat mudah ditandai dengan pembentukan larutan

koloidal dengan air yang apabila dikocok menimbulkan buih yang stabil. Saponin

juga bersifat menghancurkan butir darah merah lewat reaksi hemolisis. Berdasarkan

struktur dari aglikonnya, saponin dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu saponin

steroid dan saponin triterpenoid. Saponin steroid mudah larut dalam air dan alkohol,

tetapi tidak larut dalam eter. Saponin steroid tersusun dari suatu aglikon steroid

(sapogenin) yang terikat pada suatu oligosakarida yang biasanya heksosa dan

pentosa. Sebaliknya, hasil hidrolisisnya, yaitu sapogenin steroid mudah larut dalam

pelarut organik (seperti kloroform, eter, n-heksan) dan tidak larut dalam air

(Purwanti, 2008).

c. Phenol

Senyawa phenol terdiri atas molekul-molekul besar dengan beragam

struktur, karakteristik utamanya adalah adanya cincin aromatik yang memiliki

gugus hidroksil. Kebanyakan senyawa phenol termasuk ke dalam kelompok

flavonoid. Phenol bersifat asam, karena sifat gugus –OH yang mudah melepaskan

diri. Karakteristik lainnya adalah kemampuan membentuk senyawa kelat dengan

logam, mudah teroksidasi dan membentuk polimer yang menimbulkan warna

gelap. Timbulnya warna gelap pada bagian tumbuhan yang terpotong atau mati

disebabkan oleh reaksi ini, hal ini sekaligus menghambat pertumbuhan tanaman

(Pratt dan Hudson, 1990).

d. Flavonoid

Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa phenol yang terbesar

yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah,

ungu, dan biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-

tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15

atom karbon, dimana dua cincin benzen (C6) terikat pada suatu rantai propana (C3)

sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6 (Lenny, 2006).

II.2. Bacillus cereus

Menurut Todar (2008) dalam Dewi (2010), klasifikasi dari Bacillus cereus

adalah sebagai berikut:

Kingdom : Prokaryota

Divisio : Firmicutes

Class : Bacilli

Ordo : Bacillales

Family : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus cereus

Bacillus cereus merupakan bakteri gram positif, bersifat aerob fakultatif, dan

motil. Beberapa bakteri gram positif seperti genus Bacillus, Sporolactobacillus,

Clostridium, Sporosarcina, dan Thermoactinomyces merupakan bakteri yang

mampu membentuk endospora. Pembentukan endospora bagi bakteri sangat

penting, karena struktur endospora yang tebal dapat berfungsi sebagai pelindung

panas (Dewi, 2010).

Menurut Todar (2008) dalam Dewi (2010), Bacillus cereus motil,

berkemampuan untuk menghancurkan sel darah merah (hemolytic). Bakteri ini

dapat menyebabkan keracunan makanan, ada dua tipe penyakit yang

diakibatkannya, yaitu tipe emetik dan tipe diare. Tipe emetik ditandai dengan

mual dan muntah, muncul gejala setelah masa inkubasi sekitar 1-6 jam. Tipe diare

ditandai dengan rasa sakit perut dan buang air besar, muncul gejala setelah masa

inkubasi sekitar 6-24 jam.

II.3. Pseudomonas aerugenosa

Menurut Mayasari dan Evita (2006), klasifikasi dari Pseudomonas aeruginosa

adalah sebagai berikut:

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma, Proteobacteria

Order : Pseudomonadales

Family : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Species : Pseudomonas aeruginosa

Bakteri ini bersifat gram negatif, berbentuk batang lurus dan tidak

membentuk spora, dapat bergerak, umumnya mempunyai flagel polar tunggal,

tipe metabolism bersifat oksidatif. Umumnya bakteri ini berukuran kecil dengan

lebar 0,5-1,0 m dan 1,5-4,0 m. Pseudomonas aeruginosa termasuk dalam suku

Pseudomonadaceae dan merupakan salah satu jenis bakteri yang menimbulkan

kerusakan berbagai jenis makanan sehingga menyebabkan kebusukan (Fardiaz,

1992).

Pseudomonas aeruginosa merupakan salah satu bakteri yang sering

menimbulkan kebusukan makanan seperti pada susu, daging, dan ikan. Pseudomonas

aeruginosa mudah tumbuh dan menyebabkan kerusakan pada beragam produk

pangan karena kemampuannya yang dapat memproduksi enzim yang dapat memecah

komponen lemak dan protein dalam makanan (Jawetz, 1996).

II.4. Ekstraksi Maserasi

Ekstraksi adalah teknik pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan

distribusi zat terlarut diantara dua pelarut yang saling bercampur. Pada umumnya

zat terlarut yang diekstrak bersifat tidak larut atau larut sedikit dalam suatu pelarut

tetapi mudah larut dengan pelarut lain. Metode ekstraksi yang tepat ditemukan

oleh tekstur kandungan air bahan-bahan yang akan diekstrak dan senyawasenyawa

yang akan diisolasi (Harborne dalam Dewi, 2010).

Proses pemisahan senyawa dalam simplisia, menggunakan pelarut tertentu

sesuai dengan sifat senyawa yang akan dipisahkan. Pemisahan pelarut

berdasarkan kaidah like dissolved like artinya suatu senyawa polar akan larut

dalam pelarut polar. Ekstraksi dapat dilakukan dengan bermacam-macam metode,

tergantung dari tujuan ekstraksi, jenis pelarut yang digunakan dan senyawa yang

diinginkan. Metode ekstraksi yang paling sederhana adalah maserasi (Noerono

dalam Dewi, 2010).

Maserasi adalah perendaman bahan alam yang dikeringkan (simplisia)

dalam suatu pelarut. Metode ini dapat menghasilkan ekstrak dalam jumlah

banyak, serta terhindar dari perubahan kimia senyawa-senyawa tertentu karena

pemanasan (Rusdi dalam Dewi, 2010).

II.5. Antibakteri

Antibakteri merupakan bahan atau senyawa yang khusus digunakan untuk

kelompok bakteri. Antibakteri dapat dibedakan berdasarkan mekanisme kerjanya,

yaitu antibakteri yang menghambat pertumbuhan dinding sel, antibakteri yang

mengakibatkan perubahan permeabilitas membran sel atau menghambat

pengangkutan aktif melalui membran sel, antibakteri yang menghambat sintesis

protein, dan antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel. Aktivitas

antibakteri dibagi menjadi 2 macam yaitu aktivitas bakteriostatik dan aktivitas

bakterisidal. Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi. Disc

diffusion test atau uji difusi disk dilakukan dengan mengukur diameter zona

bening (clear zone) yang merupakan petunjuk adanya respon penghambatan

pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa antibakteri dalam ekstrak (Dewi, 2010).

III. METODOLOGI

III.1.Hipotesis Penelitian

Hipotesis dalam penelitian ini adalah diduga bahwa pelarut yang berbeda

pada konsentrasi yang sama dari ekstrak Teripang pasir berpengaruh terhadap

daya hambat Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa, sehingga dapat

diketahui potensi dan aktivitas antibakteri terbaik.

III.2. Perumusan Hipotesis

Perumusan hipotesis penelitian adalah sebagai berikut:

H0 : Perbedaan pelarut ekstrak Teripang pasir tidak memberikan pengaruh

terhadap daya hambat Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa pada

pengujian sensitivitas antibakteri.

H1 : Perbedaan pelarut ekstrak Teripang pasir memberikan pengaruh terhadap

daya hambat Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa pada pengujian

sensitivitas antibakteri.

Kaidah pengambilan keputusan adalah sebagai berikut:

Fhitung < Ftabel (taraf uji : 1% dan 5%) maka terima H0 tolak H1

Fhitung ≥ Ftabel (taraf uji : 1% dan 5%) maka terima H1 tolak H0

III.3. Materi Penelitian

III.3.1.Bahan

Bahan yang digunakakan adalah Teripang pasir yang diambil dari perairan

Utara Jawa, Rembang, Jawa Tengah. Bahan lain yang digunakan pada penelitian

ini terdapat pada Tabel 1.

Tabel 4. Bahan yang Digunakan pada PenelitianNo Bahan Fungsi

1. Teripang pasir Sebagai bahan baku

2. n-heksan (teknis) Sebagai pelarut

3. Etil asetat (teknis) Sebagai pelarut

4. Etanol (teknis) Sebagai pelarut

5. Aquadest Untuk membuat media agar

6. Nutrient Agar (NA) Sebagai media tumbuh bakteri

7. Nutrient Broth (NB) Sebagai media tumbuh bakteri

8. Kultur jamur Sebagai bakteri uji

9. Alumunium foil Untuk menutup erlenmeyer saat ekstraksi

dan sterilisasi

10. Kertas tisu Untuk membersihkan alat

11. Kertas saring Menyaring ekstrak setelah maserasi

12. Paper disc Sebagai indikator pengamatan diameter

zona hambat jamur

13. Kapas Menutup tabung dan Erlenmeyer

14. Plastik wrap Untuk membungkus petridish

15. Kertas label Untuk menulis keterangan pada sampel

ataupun perlakuan

16. Alkohol 70% Sterilisasi

III.3.2.Alat

Alat yang digunakan pada penelitian adalah sebagai berikut:

Tabel 2. Alat yang Digunakan pada PenelitianNo Alat Ketelitia

n

Fungsi

1 Autoclave 1 atm Untuk sterilisasi alat gelas dan media

agar

2 Petridish - Sebagai tempat pembiakan jamur

3 Gelas ukur 1 ml Mengukur pelarut

4 Inkubator 0,5o C Menginkubasi biakan

5 Jangka sorong 0,05 mm Untuk mengukur zona hambat jamur

6 Labu Erlenmeyer 10 ml Untuk tempat merendam sampel dan

membuat media agar

7 Labu Round bottom

Flask

- Tempat sampel saat evaporasi

8 Magnetic stirrer - Untuk mengaduk saat pemasakan media

agar

9 Mikropipet 1 µL Mengambil ekstrak

10 Rotary evaporator - Untuk menguapkan pelarut

11 Tabung reaksi - Kultur isolate

12 Timbangan analitik 0,0001 g Untuk menimbang sampel

13 Laminary air flow - Tempat untuk inokulasi

14 Vortex mixer - Untuk menghomogenkan sampel

15 Vial - Tempat ekstrak

16 Gelas rod - Untuk meratakan bakteri uji pada media

agar

17 Pinset - Meletakkan paperdish pada ekstrak

18 Solar Tunnel Dryer - Sebagai pengering sampel

19 Pisau - Memotong sampel

20 Jarum ose - Inokulasi bakteri

III.4. Prosedur Penelitian

Prosedur kerja yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:

1. Tahap penanganan bahan baku yang meliputi penanganan sampel dan proses

ekstraksi dengan menggunakan tiga pelarut yaitu n-heksan, etil asetat, dan

etanol. Proses ekstraksi menggunakan rotary evaporator.

2. Uji kontrol negatif dan uji aktivitas antibakteri ekstrak Teripang pasir dari

tiga pelarut yaitu n-heksan, etil asetat, dan etanol.

3. Uji skrining fitokimia yang meliputi senyawa steroid, phenol, saponin,

triterpenoid, dan flavonoid.

Secara ringkas diagram alir prosedur penelitian disajikan pada diagram alir

sebagai berikut:

Gambar 4. Diagram Alir Prosedur Penelitian

Penanganan sampel

Proses ekstraksi menggunakan rotary

evaporator

Ekstrak Teripang pasir

1. Uji kontrol negatif dengan pelarut n-heksan, etil asetat, dan etanol.

2. Uji aktivitas antibakteri ekstrak Teripang pasir dengan n-heksan, etil asetat, dan etanol.

3. Uji skrinning fitokimia

3.4.1. Penanganan sampel

Teripang yang digunakan adalah Teripang Pasir yang berasal dari Pantai

Utara Jawa, Rembang, Jawa Tengah. Teripang yang akan diekstrak terlebih

dahulu dikarakterisasi jenis dan umurnya berdasarkan criteria bobot dan panjang

teripang. Bobot dan panjang teripang menggambarkan umur teripang yang sudah

dewasa atau matang gonad yang dapat diamati dari bobot (200-500 gram) dan

panjangnya (25-35 cm). Teripang yang telah memenuhi kriteria, dibersihkan dan

dipisahkan antara daging dan jeroan, dicuci dan digiling, selanjutnya dilakukan

ekstraksi.

3.4.2. Ekstraksi ampel

Ekstraksi sampel dilakukan dengan metode maserasi. Metode maserasi

yang digunakan adalah maserasi bertingkat yaitu maserasi satu sampel dengan

tiga jenis pelarut secara berurutan. Tiga jenis pelarut yang digunakan adalah n-

heksan, etil asetat, etanol.

Sampel Teripang pasir yang telah digiling, direndam dengan masing-

masing pelarut dengan perbandingan 1:2 (w/v), kemudian dilakukan sonikasi

selama 10 menit dan dilanjutkan dengan maserasi selama 24 jam pada suhu ruang

(28oC), kemudian disaring dengan kertas penyaring. Residu kembali dimaserasi

lagi dengan cara yang sama, sampai 3x. Ekstrak hasil maserasi atau filtrat yang

dihasilkan, ditampung menjadi satu dan diuapkan, untuk memisahkan pelarutnya.

Penguapan dilakukan dengan menggunakan alat rotary vacuum evaporator,

sampai pelarut habis menguap, sehingga didapatkan ekstrak teripang. Hasil

ekstrak ditempatkan dalam vial kosong selanjutnya dilakukan penimbangan

ekstrak. Ekstrak dalam vial disimpan dalam lemari pendingin. Ekstrak Teripang

pasir digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.

3.4.3. Uji kontrol negatif pelarut n-heksan, etil asetat, dan etanol

Uji kontrol negatif bertujuan untuk mengetahui pengaruh pelarut pada

ekstrak Teripang pasir terhadap daya hambat Bacillus cereus dan Pseudomonas

aeruginosa. Prosedur dalam uji kontrol negatif adalah pelarut ekstrak dengan

kuantitas 20 µl diteteskan pada paper disc kemudian diletakkan pada biakan

bakteri uji dan diinkubasi selama 48 jam. Idealnya pelarut tidak boleh mempunyai

pengaruh terhadap bakteri uji. Apabila kontrol negatif membentuk zona hambat

maka hasil pengukuran diameter zona hambat pada perlakuan dikurangi dengan

zona hambat dari pelarut tersebut.

3.4.4. Uji aktivitas antibakteri ekstrak Teripang pasir dengan pelarut n-

heksan, etil asetat, dan etanol

a. Sterilisasi alat dan bahan

Sterilisasi alat dan bahan dilakukan untuk mendapatkan kondisi yang aseptis.

Adapun tahapan sterilisasi alat dan bahan sebagai berikut :

1. Alat-alat yang akan disterilisasi dibersihkan dengan alkohol dan dibungkus

dengan menggunakan kertas coklat;

2. Air secukupnya dituang kedalam autoclave, kemudian alat yang dibungkus

kertas dimasukkan kedalam autoclave dan ditutup rapat dengan

mengencangkan baut secara silang;

3. Kemudian disterilisasi dilakukan dengan suhu 1210 C, tekanan 1 atm, selama

15 menit;

4. Autoclave dimatikan dan katup dibuka untuk mengurangi tekanan. Tunggu

beberapa saat sampai termometer dan monometer menunjukkan angka nol lalu

buka penutup autoclave; dan

5. Alat yang sudah disterilkan diambil dari autoclave.

b. Pembuatan media Nutrient Agar (NA)

1. untuk membuat 100 ml larutan nutrient agar dibutuhkan 27 gram nutrient

agar.

2. larutan nutrient agar dipanaskan di atas hot plate dan diberi stirrer sehingga

dapat larut homogen. Pemanas dihentikan jika larutan nutrient agar sudah

larut sempurna.

3. Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan aluminium foil kemudian disterilkan

dalam autoclave dengan suhu 121°C, tekanan 1 atm, selama 15 menit.

4. Nutrient agar dituang kedalam petridisk sekitar 10 ml per petridisk

5. Petridisk yang telah berisi media agar diinkubasi selama 24 jam untuk

memastikan bahwa media agar yang digunakan tidak terkontaminasi oleh

bakteri sebelum digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.

6. Nutrient agar yang tidak langsung dipakai disimpan dalam lemari es.

c. Pembuatan media Nutrient Broth (NB)

1. untuk membuat 100 ml larutan nutrient broth dibutuhkan 1,3 gram nutrient

broth kering.

2. Nutrient broth kering dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan selanjutnya

dicampur dengan 100 ml aquades.

3. Larutan nutrient broth dipanaskan di atas hot plate dan diberi stirrer sehingga

dapat larut sempurna dan berwarna bening.

4. Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan aluminium foil kemudian disterilkan

dalam autoclave dengan suhu 121°C, tekanan 1 atm, selama 15 menit.

5. Nutrient broth yang akan dipakai didinginkan terlebih dahulu hingga

mencapai suhhu 30°C. bakteri akan mati jika diinokulasikan pada nutrient

broth yang masih panas.

6. Nutrient broth yang tidak langsung dipakai disimpan dalam lemari es.

d. Pembuatan kultur bakteri di dalam Nutrient Broth

1. Masukkan NB masing-masing sebanyak 4 ml ke dalam 2 tabung reaksi

dengan menggunakan pipet gondok.

2. Diambil biakan bakteri masing-masing sebanyak 5 ose.

3. Bakteri dimasukkan ke incubator selama 24 jam dan atur pada suhu 37°C.

e. Metode Difusi

1. Pada uji aktivitas antibakteri ini menggunakan ekstak antibakteri teripang

dengan pelarut yang berbeda masing-masing sebanyak 10 mg/ml.

2. Bakteri yang sudah ditumbuhkan dalam NB (Bacillus cereus dan

Pseudomonas aeruginosa), masing-masing diambil dengan menggunakan

pipet steril sebanyak 1 ml kemudian di spread secara merata ke dalam

petridisk yang berisi NA

3. Tiap petridisk ditempatkan 4 buah paper disc (D = 5 mm).

4. Paper disc pertama ditetesi aquadest sebagai kontrol negatif, paper disc kedua

ditetesi larutan ekstrak dengan pelarut n-heksan, paper disc ketiga ditetesi

larutan ekstrak dengan pelarut etil asetat, dan paper disc keempat ditetesi

larutan ekstrak dengan pelarut etanol masing-masing sebanyak 20 µl dengan

konsentrasi 10 mg/ml.

5. Kemudian diinkubasi selama 2x24 jam, setiap 24 jam dilakukan pengamatan

dan pengukuran daya hambat sampel terhadap bakteri. Pengukuran dilakukan

menggunakan jangka sorong.

3.4.5. Uji skrinning fitokimia

Metode skrining fitokimia digunakan untuk mengetahui kandungan

metabolit sekunder, makromolekul serta penggunaan data yang diperoleh untuk

menggolongkan tumbuhan. Pemeriksaan secara kualitatif senyawa steroid,

phenol, saponin, triterpenoid, dan flavonoid adalah sebagai berikut:

a. Uji senyawa steroid dan triterpenoid ekstrak Teripang pasir

1. Pipet pasteur yang didalamnya telah dimasukkan arang sebanyak 5 g

disiapkan;

2. Lapisan kloroform diambil dan dimasukkan dalam pipet pasteur;

3. Filtrat yang keluar dari pipet pasteur dimasukkan dalam 3 buah lubang pada

plat tetes dan dibiarkan sampai kering;

4. Tiap-tiap lubang pada plat tetes ditambahkan satu tetes asam asetat anhidrat

dan satu tetes asam sulfat pekat; dan

5. Terbentuknya warna biru hingga ungu menunjukkan sampel positif

mengandung senyawa steroid sedangkan warna merah menunjukkan sampel

positif mengandung senyawa triterpenoid.

b. Uji senyawa phenol ekstrak Teripang pasir

1. Sebanyak 1 ml lapisan air diambil dan dimasukkan ke dalam plat tetes;

2. Ditambahkan ferri klorida pada tiap plat tetes yang telah diberi sampel; dan

3. Terbentuknya warna biru atau ungu menandakan adanya senyawa phenol.

c. Uji senyawa saponin ekstrak Teripang pasir

1. Sebanyak 1 ml lapisan air dari tahap preparasi diambil dan dimasukkan ke

dalam tabung reaksi;

2. Larutan dikocok kuat-kuat; dan

3. Sampel positif mengandung senyawa saponin apabila terbentuk busa yang

permanen yang tidak hilang dalam waktu 15 menit.

d. Uji senyawa flavonoid pada ekstrak Teripang pasir

1. Sebanyak 1 ml lapisan air dari tahap preparasi diambil dan dimasukkan ke

dalam tabung reaksi;

2. Ditambahkan 1-2 butir logam magnesium dan 3 tetes asam klorida pekat; dan

3. Sampel positif mengandung senyawa flavonoid jika terbentuk warna orange

hingga merah.

III.5. Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode experimental laboratories yaitu suatu

metode yang digunakan untuk mendapatkan data-data yang dilakukan

dengan percobaan dilaboratorium dan pengamatan secara langsung, sistematis

terhadap kejadian-kejadian obyek yang diteliti (Sudjana, 1989).

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui jenis pelarut yang efektif dari

Teripang pasir Rancangan dasar yang digunakan adalah Rancangan Acak

Lengkap (RAL). Hasil ekstrak dengan tiga macam pelarut yang berbeda dan

masing-masing perlakuan diulang 3 kali. Bakteri uji yang digunakan adalah

Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa. Rancangan penelitian uji aktivitas

antibakteri Teripang pasir tersaji pada tabel berikut ini:

Tabel 3. Matrix Rancangan PenelitianJenis pelarut

(10 mg/ml)

Ulangan

1 2 3

Kontrol negatif (P1) P11 P12 P13

n-heksan (P2) P21 P22 P23

Etil asetat (P3) P31 P32 P33

Etanol (P4) P41 P42 P43

Keterangan:

P1 : Kontrol negatif

P2 : n-heksan

P3 : Etil asetat

P4 : Etanol

III.6. Analisa Data

Data yang diperoleh dari hasil penelitian dianalisa dengan sidik ragam atau

analysis of varian (ANOVA). Berdasar analisis tersebut, diperoleh hasil uji F

untuk mengetahui pengaruh sumber keragaman dan perbedaan variabel-variabel

yang diamati karena perlakuan yang berbeda. Berdasarkan analisis tersebut maka

diperoleh hasil uji F dengan rumus:

F hitung =

KTSKTE

Keterangan : KTS = Kuadrat Tengah Perlakuan

KTE = Kuadrat Tengah Galat

F hitung digunakan untuk mengetahui pengaruh sumber keragaman dan

perbedaan variabel-variabel yang diamati karena perlakuan yang berbeda. Jika

analisis tersebut menunjukkan hasil yang berbeda nyata, maka akan dilanjutkan

dengan uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) dengan bantuan tabel Q pada taraf uji

99%, untuk mengetahui perbedaan antar nilai tengah perlakuan dan menentukan

perlakuan yang terbaik. Formula uji BNJ adalah sebagai berikut:

BNJ = qa x (p, n2)√ KTGr

Keterangan:

KTG = nilai kuadrat tengah galat (error)

r = jumlah ulangan p = jumlah perlakuan n2 = derajat bebas galat acak

DAFTAR PUSTAKA

Abraham, T.J., J. Nagarajan, dan S.A. Shanmugan. 2002. Antimicrobial Substances of Potential Biomedical Importance from Holothurian Species. [Indian Journal of Marine Science]. Tamil Nadu Veterinary and Animal Sciences University, India. 161-164 hlm.

Bordbar, S., Farooq A., dan Nazamid S. 2011. High-Value Components and Bioactives from Sea Cucumbers for Functional Foods—A Review. [Marine Drugs Journal]. Universiti Putra Malaysia, Malaysia. 1761-1805 hlm.

Dewi, F.K., 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar. [Skripsi]. Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Fardiaz, s. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Farouk, A.E., Faizal A.H.G., dan B.H. Ridzwan. 2007. New Bacterial Species Isolated from Malaysian Sea Cucumbers with Optimized Secreted Antibacterial Activity. [American Journal of Biochemistry and Biotechnology]. International Islamic University Malaysia, Malaysia. 64-69 hlm.

Hartati, R., Widianingsih, dan Delianis P. 2005. Teknologi Penyediaan Pakan Bagi Teripang Putih (Holothuria scabra). [Laporan Kegiatan]. Universitas Diponegoro, Semarang.

Jawetz. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. EGC. Jakarta.

Kustiariyah. 2006. Isolasi dan Uji Aktivitas Biologis Senyawa Testosteron dari Teripang sebagai Aprodisiaka Alami [Thesis]. Sekolah Pascasarjana, IPB, Bogor.

Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, Fenolpropanoida dan Alkaloida. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

Mahatmanti, F.W., Warlan S., dan Wisnu S. 2009. Sintesis Kitosan dan Pemanfaatannya sebagai Antimikrobia Ikan Segar. [Jurnal Ilmiah]. Universitas Negeri Semarang, Semarang.

Martoyo, J., Nugroho A.H., Tjahyo W. 2000. Budaya Teripang. Penebar Swadaya, Jakarta.

Mayasari, Evita, 2006, Pseudomonas aeruginosa; Karakteristik, Infeksi, dan Penanganan, http :// library.usu.ac.id.

Nuraini, A. D. 2007. Ekstraksi Komponen Antibakteri dan Antioksidan dari Biji Teratai (Nymphaea pubescens Willd). [Skripsi]. Institut Pertanian Bogor, Bogor, 94 hlm.

Pratt, D. E. Dan B. J. R. Hudson. 1990. Natural Antioxidants Not Exploited Commercially. Di dalam Hudson, B. J. F. (ed). Food Antioxidants. Hal. 171-192. Elsevier Applied Science, New York.

Purwanti, E. 2008. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Sapogenin dari Teripang holothuria sp. [Skripsi]. Universitas Sumatra Utara, Medan.

Sudjana, 1989. Desain dan Analisis Eksperimen Edisi Ketiga. Tarsito, Bandung. 273 hlm.

Suryanti. 2011. Teripang (Holothuroidea). Universitas Diponegoro, Semarang.

AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI TERIPANG PASIR (Holothuria scabra) TERHADAP BAKTERI

PEMBUSUK IKAN SEGAR

PROPOSAL SKRIPSI

Oleh:SHOFIATUN NIMAH

K2F 008 058

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTANUNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG2012