LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI

PEWARNAAN GRAM

NAMA : ASRI BUDI YULIANTI

NPM : 260110140110

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM : RABU , 23 SEPTEMBER 2015

ASISTEN : BETHARY K

HIMMMATUL ULYA

LABORATORIUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR

2015

PEWARNAAN GRAM

I. Tujuan

1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram positif dan Gram

negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram.

2. Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam

prosedur tersebut.

II. Prinsip

1. Teknik Pewarnaan Diferensial

Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba

atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007).

2. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram-positif dan

gram-negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri (Karman,

2008).

3. Zat Warna

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah

satu di antaranya berwarna (Volk dan Wheeler, 1993).

III. Teori Dasar

Bakteri adalah organisme golongan prokariotik. Berbeda dengan

organisme eukariotik seperti manusia, organisme ini tidak memiliki membran

inti sehingga informasi genetik berupa DNA yang dimiliki, tidak terlokalisasi

dalam tempat khusus (nukleus). DNA pada bakteri berbentuk sirkuler, panjang,

dan biasa disebut nukleoid. Bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal

berbentuk kecil dan sirkuler yang tergabung menjadi plasmid (Al Hanif, 2009).

Pewarnaan gram ini didasarkan pada nama Hans Christian Gram, seorang

dokter Denmark yang mengembangkan suatu teknik untuk membedakan antara

dua jenis dinding sel bakteri yang berbeda. Bakteri diwarnai dengan suatu zat

warna violet dan yodium, dibilas dengan alcohol, dan kemudian diwarnai sekali

lagi dengan zat warna merah. Struktur dinding sel akan menentukan respons

pewarnaan (Campbell et al, 2003).

Pewarnaan gram ini untuk menunjukkan ukuran, morfologi (Kokus atau

batang), dan sifat pewarnaan bakteri (Gram positif atau negative) memberi

petunjuk spesies bakteri namun jarang bisa dilakukan identifikasi definitif

(Davey, 2005).

Pewarnaan dilakukan dengan membuat bekasan isolat di gelas obyek,

kemudian diwarnai dengan larutan Kristal violet dan yodium secara bergantian

selama beberapa menit dan dicuci dengan aqauades, selanjutnya dicuci dengan

alkohol dan ditetesi dengan larutan cat penutup safranin. Pengamatan dilakukan

dengan menggunakan mikroskop, bakteri Gram positif akan nampak berwarna

ungu, sedangkan Gram negatif berwarna merah (Purwohadisantoso, 2009).

Pewarnaan Gram ini merupakan teknik pewarnaan diferensial digunakan

untuk mengkarakteristikkan bakteri Gram positif dan sebagai Gram negatif .

Bakteri dikenakan ke Crystal Violet , Yodium Solusi , Alkohol (decolorizing

agent) dan Safranin. Bakteri gram positif mempertahankan kristal violet dan

karenanya muncul warna violet yang mendalam , sementara bakteri gram

negatif kehilangan kristal violet oleh karena itu pada gram negatif muncul

warna merah (Mhulu et al, 2010).

Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A,

iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal

sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus

dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan

asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci

dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada

manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis (Pelczar dan Chan,

2007).

IV. Alat dan Bahan

4.1 Alat

1) Bak pewarna

2) Botol semprot

3) Kaca objek

4) Kapas

5) Kertas saring

6) Mikroskop cahaya

7) Ose

8) Pembakar spirtus

4.2 Bahan

1) Air fuksin

2) Air suling

3) Alkohol 95% dan alkohol 70%

4) Lugol

5) Minyak celup

6) Suspensi campuran bakteri E.coli dan S. aureus

7) Suspensi campuran bakteri E.coli dan B. subfilis

8) Zat warna karbol gentian violet

Gambar Alat

Bak Pewarnaan

Botol Semprot

Kaca Objek

Kapas

Kertas Saring

Mikroskop

Cahaya

Ose

Pembakar

Spiritus

V. Prosedur

Untuk praktikum pewarnaan gram ini pertama-tama, kaca objek disediakan

terlebih dahulu kemudian dioleskan suspensi bakteri ke kaca objek

menggunakan ose, setelah dioleskan suspense bakteri selanjutnya kaca objek

yang telah diolesi suspensi difiksasi. Setelah difiksasi, selanjutnya kaca objek

tersebut diletakkan di atas bak pewarna. Bakteri digenangi dengan karbol

gentian violet selama sati menit, zat warna yang berlebih dari pewarn karbol

gentian violet dibuang dan dibilas dengan air suling. Kemudian, bakteri

digenangi kembali dengan lugol selama dua menit, lugol yang berlebih dibuang

dan dibilas dengan air suling. Setelah itu, olesan bakteri tersebut ditetesi alcohol

95% sebagai zat pemucat selama 30 detik, lalu dibilas menggunakan air suling.

Kemudian olesan bakteri tersebut digenangi air fuksin selama 30 detik, air

fuksin yang berlebih dibuang dan dibilas menggunakan air suling dan

dikeringkan menggunakan kertas saring. Sebelum olesan bakteri tersebut

diamati di bawah mikroskop maka olesan bakteri tersebut ditetesi minyak

emersi pada preparat. Olesan bakteri tersebut diamati di bawah mikroskop

dengan pembesaran yang berbeda-beda.

VI. Data Pengamatan

No. Perlakuan Hasil

1 Disediakan kaca objek yang bersih

dan dibuat olesan dari masing-

masing campuran bakteri.

Didapatkan isolate bakteri di kaca

objek.

2 Dilakukan fiksasi pada kaca objek

yang telah diolesi suspensi bakteri.

Didapatkan bakteri yang menempel

pada kaca objek dan lebih steril.

3 Kaca objek diletakkan di atas rak

kawat di atas bak pewarna.

Genangi bakteri dengan karbol

gentian violet selama 1 menit.

Diperoleh bakteri dalam kaca objek

berwarna ungu.

4 Buang zat warnayang berlebih, lalu

bilas dengan air suling.

Zat warna menjadi luntur.

5 Genangi olesan dengan lugol

selama 2 menit.

Olesan bakteri berubah warna

menjadi kekuningan.

6 Lugol yang berlebih dibuang dan

dibilas dengan air suling.

Lugol menjadi luntur.

7 Olesan dicuci dengan pemucat

alcohol 95% selama 30 detik

Zat warna menjadi memucat dan

luntur.

8 Dibilas menggunakan air suling. Zat warna semakin luntur.

9 Olesan digenangi dengan air fuksin

lalu didiamkan selam 30 detik.

Olesan pada kaca objek berubah

warna menjadi merah keunguan.

10 Sisa air fuksin dibuang dan dibilas

dengan air suling.

Air fuksin pada olesan luntur

11 Olesan dikeringkan menggunakan

kertas saring.

Olesan menjadi kering dan terbebas

dari daerah yang basah.

12 Olesan ditetesi minyak emersi Indeks bias cahaya semakin kecil

13 Olesan bakteri pada kaca objek

dapat diamati menggunakan

mikroskop.

Diperoleh hasil identifikasi bakteri

gram negatif dan gram positif.

Hasil Pengamatan

No Gambar Keterangan Spesies

1.

Perbesaran : 40x

Jenis Bakteri : Gram

negatif

Identifikasi :

- warna merah

- bentuk batang

Pewarnaan :

- CGV

- Lugol

- Alkohol

- Air fuksin

Escherichia coli

2.

Perbesaran : 40x

Jenis Bakteri : Gram

positif

Identifikasi :

- warna biru

- bentuk kokus

Pewarnaan :

- CGV

- Lugol

- Alkohol

- Air fuksin

Staphylococcus

aureus

VII. Pembahasan

Pada praktikum ini dilakukan pengamatan terhadap bakteri dengan

menggunakan teknik pewarnaan gram. Pewarnaan gram ini merupakan salah

satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.

Pewarnaan gram ini termasuk ke dalam pewarnaan diferensial dimana tujuan

dari pewarnaan diferensial ini adalah untuk membedakan dua jenis bakteri yaitu

bakteri gram positif dan gram negatif. Pewarnaan gram ini merupakan

pewarnaan untuk identifikasi awal, pada pewarnaan gram ini mikroorganisme

akan memberikan ciri kekhasan dari morfologi mikroskopiknya terhadap zat

pewarna.

Pada praktikum ini sampel yang diamati merupakan suspensi campuran

bakteri, sehingga pada praktikum ini harus bisa mengidentifikasi bakteri yang

ada dalam suspensi tersebut.

Pada praktikum pewarnaan gram ini, pertama-tama dilakukan

pembersihan kaca objek dengan alkohol hal ini bertujuan agar kaca objek bersih

dan bebas dari lemak serta debu. Selanjutnya, isolate bakteri diambil dari

tabung reaksi yang berisikan suspense bakteri menggunakan ose. Pengambilan

isolate bakteri ini tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan

sulit diratakan dan apabila isolat bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka

bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu

per satu menjadi tidak jelas.

Setelah kaca objek dibersihkan selanjutnya adalah fiksasi kaca objek

dengan cara melewatkan kaca objek yang telah diolesi isolate bakteri di atas

api. Proses fiksasi kaca objek ini bertujuan untuk menjaga bakteri agar benar-

benar menempel dan tidak terhapus ketika dilakukan pencucian.

Setelah dilakukan fiksasi selanjutnya adalah pewarnaan menggunakan

carbol gentian violet sebanyak satu atau dua tetes, kemudian didiamkan selama

satu menit. Setelah satu menit, kemudian kaca objek dibilas menggunakan

aquades. Pencucian menggunakan aquades ini bertujuan untuk mengurangi

kelebihan zat warna CGV yang ada dalam kaca objek.

Selanjutnya kaca objek ditetesi dengan lugol, tujuan ditambahkannya

lugol ini adalah untuk meningkatkan afinitas pengikatan warna sehingga bakteri

dapat mengikat warna lebih kuat. Setelah penambahan lugol dan dilakukan

pembilasan pada kaca objek, selanjutnya adalah penambahan alkohol.

Penambahan alkohol ini bertujuan untuk pemucatan warna, dimana pemucatan

warna ini bertujuan untuk melarutkan lemak dan dapat membawa zat warna

yang tidak terserap pada bakteri gram negatif sehingga memperbesar pori-pori

sel dan meningkatkan daya larut dari zat pewarna tersebut. Tapi hal ini berbeda

dengan bakteri gram positif, pada bakteri gram positif akan tetap

membertahankan warna violet atau warna birunya karean bakteri gram positif

ini mengandung peptidoglikan.

Setelah diberikan beberapa perlakuan, selanjutnya kaca objek ditetesi air

fuksin tujuannya adalah sebagai larutan pembanding sehingga memudahkan

analisa pada masing-masing pewarnaan gram. Pada gram positif, air fuksin ini

tidak memberikan perubahan karena Kristal violet pada CGV tetap terikat

dengan dinding sel, sedangkan pada bakteri gram negatif menyebabkan warna

bakteri berubah menjadi warna merah karena pewarna sebelumnya telah luntur

karena membrane sel mengalami lisis. Hal inilah yang menyebabkan bakteri

menyerap warna merah dari air fuksin.

Sebelum dilakukan pengamatan di bawah mikroskop alangkah lebih baik

jika preparat ditetesi dengan minyak emersi untuk mengurangi indeks cahaya.

Setelah dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop diperoleh hasil

bahwa isolat bakteri yang diamati adalah bakteri Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus. Penentuan jenis bakteri ini berdasarkan identifikasi

yang dilakukan dimana pada sampel pertama diperoleh hasil pengamatan

berwarna merah dengan bentuk basil (batang) sehingga dapat diidentifikasi

bahwa sampel pertama ini merupakan bakteri gram negatif dimana bakteri gram

negatif yang terkandung di dalam suspense bakteri tersebut adalah Escherichia

coli. Pada sampel kedua diperoleh hasil pengamatan berwarna biru dengan

bentuk kokus sehingga dapat diidentifikasi bahwa sampel kedua ini merupakan

bakteri gram positif dilihat dari pewarnaannya dan untuk spesiesnya ditinjau

dari suspense bakteri yang dibuat maka bakteri yang berwarna biru dan

berbentuk kokus ini adalah Staphylococcus aureus.

Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang dalam sel

tunggal atau berpasangan, merupakan anggota family Enterobacteriacea dan

flora normal intestinal yang mempunyai kontribusi pada fungsi normal intestine

dan nutrisi tetapi bakteri ini akan menjadi pathogen bila mencapai jaringan di

luar jaringan intestinal. Spesies E.coli bersifat motil dengan flagel peritrik yang

dimilikinya, tetapi beberapa ada yang nonmotil. Selain itu, E. coli adalah

penyebab utama infeksi saluran kemih (urinary tract infection/UTI) dan juga

dapat menyebabkan meningitis akut, pneumonia, infeksi intra-abdominal,

infeksi enterik, dan lain-lain (Noviana, 2004).

Sedangkan, Staphylococcus aureus bersifat non-motil, nonspora, anaerob

fakultatif, katalase positif dan oksidase negatif. Staphylococcus aureus tumbuh

pada suhu 6,5-46º C dan pada pH 4,2-9. Koloni tumbuh dalam waktu 24 jam

dengan diameter mencapai 4 mm. Koloni pada perbenihan padat berbentuk

bundar, halus, menonjol dan berkilau. Staphylococcus aureus membentuk

koloni berwarna abu-abu sampai kuning emas tua. Staphylococcus aureus

membentuk pigmen lipochrom yang menyebabkan koloni tampak berwarna

kuning keemasan dan kuning jeruk. Pigmen kuning tersebut membedakannya

dari Staphylococcus epidermidis yang menghasilkan pigmen putih (Dewi,

2013).

VIII. Simpulan

1. Dengan menggunakan metode pewarnaan gram dapat diketahui dari

suspensi bakteri yang diamati terdapat dua jenis bakteri yaitu bakteri gram

positif (Staphylococcus aureus) dan bakteri gram negatif (Escherichia coli).

2. Berdasarkan percobaan pewarnaan gram ini dapat diketahui reaksi-reaksi

yang terbentuk ketika masing-masing zat ditambahkan ke dalam preparat.

Daftar Pustaka

Al Hanif, M. Shidiq. 2009. Pola Resistensi Bakteri dari Kultur Darah terhadap

Golongan Penisilin. Jakarta. : Universitas Indonesia.

Campbell et al. 2003. Biologi Edisi Kelima Jilid 2. Jakarta : Erlangga.

Davey, Patrick. 2005. At a glance Medicine. Jakarta : Erlangga.

Dewi, Amalia Krishna. 2013. Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas Staphylococcus

aureus terhadap Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing Peranakan Ettawa

(PE) Penderita Mastitis di Wilayah Girimulyo, Kulonprogo, Yogyakarta.

Jurnal Sain Veteriner ISSN : 0126 – 0421 Vol. 31 No. 2 Hal. 140.

Karman, Oman . 2008. Biologi untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas. Bandung:

Grafindo Media Pratama.

Mhulu et al. 2010. Journal of Microbial & Biochemical Technology : Isolation and

Identification of Bacterial Strains and Study of their Resistance to Heavy

Metals and Antibiotics. Vol. 2. Issue 3. India : National Institute of

Technology.

Noviana, Hera.2004. Pola Kepekaan Antibiotika Escherichia Coli yang Diisolasi

Dari Berbagai Spesimen Klinis. Jurnal Kedokteran Trisakti Vol. 23 No. 4

Hal. 123.

Pelczar, M. J., dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York : Mc

Graw Hill Book.

Purwohadisantoso, Kristian., dkk. 2009. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Sayur

Kubis yang memiliki Kemampuan Penghambatan Bakteri Patogen

(Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, dan

Salmonella thypimurium). Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 10. No. 1 Hal.

21.

Volk dan Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.