LAPORANAKHIRKEGIATAN PENELITIAN

HIBAH DISERTASI DOKTOR

PEMANFAATAN GEN PENUMBUH TUNAS KNAT1 DALAMORGANOGENESIS TANAMAN ANGGREK Vanda tricolor Lind!.

RINDANG DWIYANI

DILAKSANAKANATAS BIAYA:Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan

Nasional,sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Penelitian Disertasi Doktor

Nomor: 481/SP2H/PP/DP2MNI/2010,tanggal11 Juni 2010

LEMBAGAPENELITIANDAN PENGABDIANKEPADAMASYARAKATUNIVERSITAS GADJAH MADA

NOVEMBER2010

r

RINGKASAN

Oi dalam mikropropagasi tanaman, tingginya daya regenerasi sel

merupakan suatu fakt?r yang penting. Overekspresi gen KNAT1 (Knotted1-

like Arabidopsis thaliana) pada beberapa spesies tanaman dapat

menstimulasi pertumbuhan tunas. Penelitian ini terdiri dari 3 eksperiment

yang dikerjakan secara simultan yang secara keseluruhan menggunakan gen

kunci penumbuh tunas KNAT1 sebagai topik utama. Tujuan dari penelitian ini

adalah menghasilkan transgenik KNAT1 tanaman anggrek Vanda tricolordan

mengeksplorasi pemanfaatan gen KNAT1 dalam sistem mikropropagasi

melalui kultur organ tanaman transgenik KNAT1.

Penelitian menggunakan bahan tanam berupa protokorm dan seedling

Vanda tricolor Lindl serta tanaman transgenik dan Wild Type (VVT) dari

anggrek Phalaenopsis amabilis. Overekspresi gen KNAT1 dilakukan melalui

dua penelitian transformasi menggunakan Agrobacterium, dengan target

transformasi berupa protokorm dan irisan seedling berupa badan protokorm

anggrek V.tricolor, keduanya menggunakan perlakuan acetosyringone.

Penelitian ketiga adalah organogenesis yang dilakukan dengan bahan

eksplan yang diambil dari tanaman transgenik KNA T1 P. amabilis dan WT.

Hasilnya mendapatkan bahwa pada transformasi melalui

Agrobacterium tumefaciens, acetosyringone dibutuhkan pada target

transformasi berupa protokorm pada saat inokulasi, namun tidak pada target

irisan seedling yang berupa badan protokorm. Transgenik KNAT1 anggrek

efektif digunakan sebagai bahan perbanyakan pada sistem mikropropagasi.

iii

SUMMARY

Abilityof plant cell to regenerate shoot is the main factor that should be

concern with micropr~pagation through organogenesis. Overexpression of

KNAT1 (Knotted1-like Arabidopsis thaliana) gene had been done previously

by other researchers in some plant species and resulted in plant phenotype of

multiple shoots.

This research concerning with the use of KNAT1 gene in

micropropagation. We did three different experiments simultaneously which

the main goals were to produce transgenic KNAT1 of Vanda tricolororchid

with Agrobacterium-mediated transformation (2 expriments) and to explore the

use of transgenic KNAT1 in micropropagation (1 .experiment). Experiment 1

used protocorms as target of transformation, while experiment 2 used body of

protocorms. Both experiments used acetosyringone (AS) as treatments,

applied or did not apply in inoculation and co-cultivation. Experiment 3 was

micropropagation of transgenic Phalaenopsis amabilis orchid by in-vitro

culturing its organ.

The results showed that AS was required when inoculated orchid

protocorms with bacterium liquid, but it was not necessary in co-cultivation

step. However, when we used body of protocorms as target of

transformation, AS was not required. In micropropagation of P.amabilis,

shoots were produced in almost explants of transgenic KNAT1, but only

explant from slices of shoot produced shoots inWT.

iy

PEMANFAATAN GEN KUNCI PENUMBUH TUNAS KNATI (KNOTTEDI-LlKE Arabidopsis thaliana)DALAM MIKROPROPAGASI TANAMAN ANGGREK

Dwiyani, R1).,A.PurwantoroZ), A.Indrianto3\ dan E.Semiarti3)

1) Mahasiswa Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pasea Sarjana, UGM; Staf pengajar Faku1tas Pertanian Universitas Udayana2) Staf pengajar Faku1tas Pertanian Universitas Gadjahmada, Yogyakarta

3) Stafpengajar Faku1tas Biologi dan Program Studi Bioteknologi Universitas Gadjahmada, Yogyakarta

ABSTRAKTujuan dari penelitian ini adalah menghasilkan transgenik KNATI tanaman anggrek dan mengeksplorasi pemanfaatan gen KNATI dalam sistem

mikropropagasi.Overekspresi gen KNATI dilakukan melalui dua penelitian, dengan target transformasi berupa protokorm dan irisan seedling bempa badan protokorm,

keduanya menggunakan perlakuan acetosyringone. Penelitian ketiga adalah organogenesis yang dilakukan dengan bahan eksplan yang diambil dari tanamantransgenik KNATI dan tanaman Wild Type. dari anggrek Phalaenopsis amabi/is

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens, acetosyringone dibutubkan pada target transformasi bempaprotokorm ,namun tidak Pada target irisan seedling yang bempa badan protokorm. Transgenik KNATI anggrek efektif digunakan sebagai bahan perbanyakan padasistem mikropropagasi.

LATAR BELAKANGDaya regenerasi sel rang tinggi merupakan suatu faktor yang penting dalam mikropropagasi tanaman. Overekspresi gen KNAT! pada beberapa spesies

tanaman dapat menstimulasi pertumbuban tunas. Tiga penelitian yang dilakukan seeara simultan ini bertujuan untuk menghasilkan transgenik KNAT! tanamananggrek dan mengeksplorasi pemanfaatan gen KNATI dalam sistem mikropropagasi.

METODE PENELITIANOverekspresi gen KNATI dilakukan dengan transformasi melalni Agrobacterium tumefaciens Strain LBA4404 dengan plasmid biner PGreen yang membawa

gen KNATI dan gen NPTII (Neophospotransferase TI)dengan promoter CaMV (Caulifower Mosaic Virus).Target transformasi adalah protokorm anggrek Vanda tricolor Lindl. serta irisan seedling yang berupa badan protokorm. Transformasi dilakukan dengan

metode Semiarti, et al. (2007) yang dimodiflkasi dengan pemberian acetosyringone. Mikropropagasi tanaman transgenik KNATI anggrek Phalaenopsis amabi/isdilakukan dengan menumbubkan irisan organ ke media New PhalaeonopsisINP (Islam, et al., 1998) dengan memberi 511M2iP dan 0.15 11MNAA untuk shootinduction (organogenesis).

HASIL DAN PEMBAHASANHasil penelitian memperlihatkan adanya perbedaan kebutuban acetosyringon.e dengan adanya perbedaan target transformasi. Transformasi dengan target

protokorm membutubkan acetosyringone pada saat perendaman (inokulasi) dengan atau tanpa acetosyringone pada saat kokultivasinya, dimana persentase kandidattransforman tertinggi diperoleh pada perlakuan dengan acetosyringone pada saat inokulasi namun tanpa acetosyringone pada saat kokultivasi (Tabel I). Sedangkanpada target transformasi berupa irisan badan protokorm, persentase kandidat transforman diperoleh pada perlakuan tanpa acetosyringone, baik pada saat inokulasimaupun kokultivasi (Tabel I). Acetosyringone dalam proses transformasi menggnnakan Agrobacterium dibutubkan untuk mengaktifkan gen Vir yang ada dalamAgrobacterium dan produk dari gen Vir(protein) ini akan membantu proses T-DNA transfer (yang membawa gene of interest) dari bakteri ke sel tanaman (Zupan danZambryski, 1995;dan Gelvin, 2003).

Tahel 1. Persentase kandidat transforman pada transformasi dengan menggunakan target transformasi herupa protokorm dan badan protokorm padaperlakuan dengan Acetosyringone

Gambar I. Perkembangan eksplan pangkal akar bingga menjadi plandet;!!!!! dari kiri ke kanan: 1,2,3,4 dan 7 minggu setelah tanam; bawahdari kiri ke kanan: 9,10,12 dan 15 minggu setelab tanam. Bar=5mm

Gambar 2 Perkembangan eksplan pangkal daun bingga menjadi plandet: !!!!! darikiri ke kanan: I, 2,3, 5 minggu setelab tanam; bawab. dari kiri ke kanan : 7,9,12minggu setelab tanam, paling kanan (besar) 15 minggu setelab tanam. Bar=5mm

Pada mikropropagasi tanaman transgenik KNATI semua kultur organ menghasilkan tunas, kecuali pada kultur ujung daun dan ujung akar (Gambar I dan 2).Sedangkan pada tanaman WT(Wild Type, bukan transgenik), hanya pada irisan batang yang menghasilkan tunas. Adanya perturnbuhan tunas adventifpada daun danakar menunjukkan tetjadinya ectopic expression dari gen KNATI pada tubub tanaman transgenik.KESIMPULAN

Pada transfonnasi melalni Agrobacterium tumefaciens, acetosyringone dibutubkan pada target transformasi bempa protokorm , namun tidak pada target irisanseedling yang berupa badan protokorm. Transgenik KNATI anggrek efektif digunakan sebagai bahan perbanyakan pada sistem mikropropagasi.UCAPAN TERIMAKASIH

Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada LPPM Universitas Gadjahmada serta Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi DepartemenPendidikan Nasional Republik Indonesia yang telah memfasilitasi serta mendanai penelitian ini.PUSTAKAGelvin, sa. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microb. and Mol. Biol.Reviews. 1: 16-37Semiarti, E., Ari Indrianto, A. Purwantoro, S. Isminingsih, N. Suseno, T. Ishikawa, Y. Yoshioka, Y. Machida, and C. Machida. 2007. Agrobacterium-mediated

transformation of the wild orchid species Phalaenopsis amabl/is. Plant Biotechno1..24:265-272Zupan, JR., and Zambryski. 1995. Transfer ofT-DNA 1T0mAgrobacterium to the plant cellI. Plant Physiol. 107: 1041-1047

Perlakuan Acetosyringone Protokorm hijau Protokorm coklat/hitam/putih % kandidat transforman(ppm) (hidup) (mati)

Transformasi Saat Saat Badan Badanlnokulasi Kokultivasi

Protokorm Protokorm Protokorm Protokorm Protokorm Badan Protokorm

PGreen 0 0 15 49 312 51 0.5 490 25 7 6 286 94 2.4 625 0 49 12 427 88 11.67 1225 25 2 5 222 95 0.9 5

PKNATI 0 0 6 11 232 89 1.67 110 25 20 0 343 100 5.83 025 0 19 0 256 100 7.42 025 25 11 0 258 100 4.26 0