7

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Agar

Agar merupakan campuran polisakarida yang diekstraksi dari dinding sel

ganggang merah (Rhodophyta), khususnya genus Gracilaria dan Gelidium. Agar

merupakan sebuah polisakarida kompleks terbarukan yang terdiri dari agarosa

dan agaropektin yang digunakan dalam penyusunan media pertumbuhan

mikroba, permen dan agar jelly. Agarosa memiliki potensi pemanfaatan sebagai

pangan, farmasi dan industri kosmetik seperti penyedia biomassa potensial,

sumber oligosakarida, anti bakteri, anti kanker dan antioksidan, serta dapat

mempengaruhi sel-sel melanoma sehingga dapat melembabkan dan memutihkan

kulit (Kobayashi 1997).

Agarosa memiliki berat molekul di atas 100.000 Daltons dengan kadar

sulfat rendah di bawah 0,15%. Agaropektin memiliki berat molekul lebih ringan

sebesar kurang dari 20.000 Daltons tetapi dengan kadar sulfat tinggi sekitar 5%

sampai 8% (Kim Sang Moo 2010). Kandungan sulfat pada agarosa rendah

sehingga sering dimanfaatkan sebagai media pertumbuhan bakteri. Kandungan

sulfat mempengaruhi gel strength sehingga agar yang mengandung agarosa akan

mudah memadat. Agarosa terdiri dari rantai D-galaktosa yang berikatan secara

1,3 dengan 3,6-anhidro-L-galaktosa dan rantai 3,6-anhidro-L-galaktosa yang

berikatan secara 1,4 dengan D-galaktosa.

Gambar 1. Struktur Agarosa

(Sumber : Moo 2010)

8

Pemanfaatan agarosa dalam bidang bioteknologi (Renn 1990 dalam

Rasyid 1999):

1 Elektroforesis

Gel agarosa digunakan sebagai media elektroforesis untuk pemisah protein,

asam nukleat dan derivat keduanya.

2 Immunologi

Penggunaan agarosa dalam immunologi adalah untuk mendeteksi dan

mempelajari berbagai jenis antigen, terutama indikator penyakit dan

penentuan spesifikasi antibodi.

3 Kromatografi

Agarosa efektif untuk pemisahan senyawa karena bersifat uniform. Cocok

digunakan untuk pemisahan senyawa dengan berat molekul lebih dari

250.000

2.2 Enzim Agarase

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam

amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim

memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein,

enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi,

antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel (Girindra 1986).

Enzim dikatakan sebagai suatu kelompok protein yang berperan dalam

aktivitas biologis. Enzim ini berfungsi sebagai katalisator dalam sel dan sifatnya

sangat khas. Enzim dalam jumlah yang sangat kecil dapat mengatur reaksi

tertentu sehingga dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan hasil

reaksinya. Enzim akan kehilangan aktivitasnya karena panas, asam dan basa kuat,

pelarut organik atau apa saja yang bisa menyebabkan denaturasi protein. Enzim

dinyatakan mempunyai sifat yang sangat khas karena hanya bekerja pada

substrat tertentu (Girindra 1986).

Enzim tersusun atas dua bagian. Apabila enzim dipisahkan satu sama

lainnya menyebabkan enzim tidak aktif. Namun keduanya dapat digabungkan

9

menjadi satu, yang disebut holoenzim. Kedua bagian enzim tersebut yaitu

apoenzim dan koenzim (Girindra 1986).

Agarase adalah enzim yang berperan dalam proses hidrolisis agar.

Agarase digunakan untuk menyiapkan protoplas dari ganggang laut (Araki 1998)

dan untuk mengisolasi asam deoksiribonukleat (DNA) dari gel agarosa (Sugano

1993).

Berdasarkan mekanismenya dalam menghidrolisis agarosa, enzim

agarase diklasifikasikan kedalam dua kelompok yaitu -agarase yang memotong

ikatan -1,3 dari agarosa dan -agarase yang memotong ikatan -1,4 dari

agarosa (Sugano 1993). Bakteri pada kelompok I dapat melembutkan agar

(media) dan membentuk cekungan di sekitar koloni dan kelompok II

menyebabkan pencairan luas agar (media) (Kobayashi 1997).

Gambar 2. Posisi Pemotongan Agarosa oleh Enzim -agarase dan -

agarase

(Sumber : Eckborg 2005)

-agarase yang menghidrolisis ikatan -1,3 dari agarosa akan

menghasilkan rangkaian oligosakarida yang disebut agarobiose. Sedangkan -

agarase yang menghidrolisis ikatan -1,4 dari agarosa akan menghasilkan

rangkaian oligosakarida yang disebut neoagarobiose (Moo 2010).

10

Gambar 3. Struktur Agarobiose (A), Struktur Neoagarobiose (B)

(Sumber : Moo 2010)

Berdasarkan sekuen gen glikosida hidrolase, ada tiga famili -

agarase yaitu GH-16, GH-50 dan GH-86. Famili GH-16 ditemukan sangat

melimpah dengan -agarase yang berasal dari Streptomyces coelicolor A3,

Aeromonas sp., Pseudomonas sp. ND137, Pseudoalteromonas CY24,

Pseudoalteromonas atlantica ATCC 19262 dan dari Zobellia galactanivorans.

Family GH-50 mengandung dua -agarase dari Vibrio sp. JT0107,

sedangkan family GH-86 mengandung -agarase dari P. alantica (Allouch

2003).

Tahapan reaksi degradasi agarosa oleh -agarase terkarakterisasi

dengan baik pada Pseudoalteromonas atlantica ATCC 19262. Pada bakteri ini

terdapat dua jenis -agarase yang bekerja secara sekuensial. Enzim

ekstraseluler endo-- agarase I memiliki aktivitas mendepolimerisasi agarosa

menjadi neoagarotetrosa sebagai produk akhir. Neoagarotetrosa kemudian akan

dihidrolisis lebih lanjut oleh 2 enzim periplasmik, -agarase II (lebih dikenal

dengan sebutan neoagarotetrosa hidrolase) dan neoagarobiose hidrolase, yang

menghasilkan produk akhir berupa 3,6-anhidro-L-galaktosa dan D-galaktosa

(Vera 1998).

Berbeda halnya dengan -agarase yang dihasilkan oleh banyak kelompok

bakteri, enzim -agarase diketahui hanya dihasilkan oleh Alteromonas agaroliticus

GJIB. Sistem agarolitik pada bakteri ini terdiri atas 2 enzim yaitu suatu -

agarase yang memecah ikatan -(1,3) dari agarosa menjadi oligosakarida dalam

bentuk agarobiosa dan enzim -galaktosidase spesifik untuk kehadiran 3,6-

anhidro-L-galaktosa sebagai produk akhir (Vera 1998).

11

Sejauh ini, beberapa agarase telah diisolasi dari mikroorganisme yang

berbeda, termasuk Alteromonas sp. (Kirimura 1999 dan Wang 2006),

Pseudoalteromonas sp. (Vera 1998), Vibrio (Araki 1998), Cytophaga

(Duckworth 1969) dan Thalassomonas (Ohta 2005). Semua mikroorganisme

tersebut merupakan bakteri gram negatif. Di samping itu, agarase juga telah

diisolasi dari beberapa bakteri non-marine, seperti dari tanah (Sampietro 1971),

sungai (Agbo 1979) dan limbah (Hofsten 1975).

Kemampuan mendegradasi agarosa oleh agarase membuat agarase sangat

bermanfaat dalam industri makanan, industri kosmetik, dan medis. Produk

degradasi dari agar, neoagarooligosakarida menghambat pertumbuhan bakteri

dan memperlambat laju degradasi pati. Selain itu, neoagarobiose (NA2),

merupakan suatu senyawa langka karena memiliki kemampuan sebagai

pelembab dan memberikan efek pemutih pada sel melanoma (Kobayashi 1997).

Fraksi polisakarida dari ganggang laut oleh agarase juga memiliki aktivitas

merangsang makrofag (Kirimura 1999 dan Ohta 2005).

2.3 Teknik 16S rRNA

RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti pembentuk protein

pada suatu makhluk hidup. Molekul rRNA bersifat ubikuitus dengan fungsi yang

identik pada seluruh organisme. Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein

yang terdiri atas dua subunit yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar

(large subunit). Terdapat tiga jenis RNA dalam ribosom prokariotik berdasarkan

nilai koefisien sedimentasi, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Gen 16S

rRNA merupakan bagian dari subunit kecil ribosom dan berperan penting

dalam pengenalan ujung 5mRNA serta memposisikan pada letak yang tepat

dalam ribosom (Clarridge 2004).

RNA ribosom pada semua sel memiliki daerah yang urutan basanya

sangat lestari dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Perbandingan

urutan basa yang lestari berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik

karena mengalami perubahan dengan relatif lambat dan mencerminkan

kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif

12

dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur

dalam satu spesies (Pangastuti 2006).

Molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek sehingga tidak

ideal dari segi analisis statistika. Sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur

sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. Sekuens

gen 16S rRNA ini dapat digunakan untuk identifikasi bakteri yang mengalami

penyimpangan strain fenotip. 5S memiliki 120 urutan basa, 16S memiliki 1500

urutan basa, dan 23S memiliki 2900 urutan basa (Pangastuti 2006).

Jadi metode 16s rRNA adalah teknologi analisis secara molekuler dengan

menganalisis sekuen gen 16S rRNA. Gen ini adalah gen yang mengkode RNA

ribosomal sub unit kecil ribosom (16S untuk prokariot) dan memiliki urutan yang

khas dan berbeda pada setiap bakteri sehingga bisa dijadikan penanda molekuler

untuk proses identifikasi (Claridge 2004). Dua bakteri dapat dikelompokkan

dalam satu genus bila memiliki kemiripan maksimum (maximum identity) 93

97%. Sementara dua bakteri dianggap sebagai satu spesies bila memiliki

kemiripan maksimum 97% (Hagstrom 2002).

Analisis gen penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena

molekul ini bersifat ubikuitus, sehingga dapat dirancang suatu primer yang

universal untuk seluruh kelompok. Penentuan spesies baru pun dapat dilakukan

tanpa mengisolasi mikroorganisme yang bersangkutan.

Secara umum, beberapa keuntungan menggunakan metode 16S rRNA

adalah :

Molekul yang dikode oleh gen 16S rRNA ini ditemukan pada semua prokariot

Memiliki jumlah nukleotida yang cukup banyak untuk dibandingkan satu

dengan lainnya

Memiliki basa-basa yang lestari

Memiliki daerah variable yang cukup untuk melihat hubungan kekerabatan

antar mikroorganisme

13

2.4 Identifikasi 16S rRNA dengan Metode Polymerase Chain Reaction

(PCR)

Identifikasi molekuler digunakan untuk mempelajari kesamaan

deoxyribonucleic acid (DNA) atau homologi genetik diantara organisme.

Kesamaan DNA dapat dipelajari dengan sekuensing terhadap basa DNA

atau RNA dan hibridisasi DNA (Malik 2006). Penggunaan untai gen

ribosomal RNA untuk klasifikasi mikroorganisme saat ini merupakan salah

satu analisis yang cukup akurat untuk menentukan kekerabatan diantara

mikroorganisme (Suryadi 2002). Situs DNA molekul 16S rRNA dikenal

mempunyai informasi genetik yang cukup lengkap untuk melihat

kekerabatan bakteri (Leblond 1996).

Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan dengan metode Polymerase

Chain Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode untuk membuat salinan

segmen spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih cepat daripada

pengklon gen dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya

dilakukan in vitro (Campbell 2002).

Gen pengkode 16S rRNA terdapat bagian penyimpan yang berguna

untuk mendesain primer universal PCR yang mampu memperbanyak beberapa

fragmen. Fragmen ini termasuk bagian hipervariable yang tidak mudah

termutasi dan mengandung tanda urutan spesifik spesies yang berguna untuk

mengidentifikasi bakteri hingga ke level spesies (Israhmadini 2008).

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,

annealing dan ekstensi utas DNA oleh enzim DNA polymerase. Setiap siklus

dikondisikan pada temperatur berbeda yang telah diprogram oleh mesin yang

disebut thermal cycler. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus, siklus ini meliputi:

denaturasi (95C), untaian ganda DNA target dipisahkan

annealing (55-60C), primer dibiarkan berikatan dengan ujung-ujung

urutan DNA target yang spesifik, dan

ekstensi (72C) merupakan proses pemanjangan pita DNA setelah berikatan

dengan primer.

14

Taq polimerase menambahkan nukleotida pada ujung 3 primer dengan

menggunakan untai DNA yang lebih panjang sebagai cetakannya. Sedangkan

untuk waktu tergantung pada panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan

sebagai produk amplifikasi. Campuran reaksi PCR terdiri atas komponen-

komponen yaitu template DNA, buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),

primer dan unit taq polimerase (Malik 2006).

2.5 Gracilaria sp.

Gracilaria sp. merupakan penghasil agar (agarofit) yang merupakan

senyawa hidrokoloid dari rumput laut yang mempunyai kekuatan gel yang besar.

Selama ini Gracilaria sp. merupakan bahan baku utama industri makanan untuk

pembuatan agar-agar serta bahan kosmetik. Rumput laut ini digolongkan ke dalam

rumput laut merah (Rhodophyta).

Kingdom : Protista

Divisi : Rhodophyta

Kelas : Rhodophyceae

Ordo : Gigartinales

Famili : Gracilariaceae

Genus : Glacilaria

Spesies : Glacilaria sp.

Gambar 4. Gracilaria sp.

(Sumber : dokumentasi pribadi)

15

Sebanyak 90% Gracilaria sp. hidup di laut dan 10% hidup di air tawar.

Ciri umum dari Gracilaria sp. adalah :

1. Berwarna merah karena mengandung pigmen fikoeritrin

2. Mempunyai bentuk thallus silindris atau gepeng dengan percabangan yang

membentuk garpu

3. Permukaannya halus.

4. Diameter thallus berkisar antara 0,5 2 mm

5. Panjang dapat mencapai 30 cm atau lebih

6. Glacilaria tumbuh di rataan terumbu karang dengan air jernih dan arus

cukup

7. Hidup pada salinitas ideal berkisar 20-28 per mil

Gracilaria merupakan jenis rumput laut yang mempunyai toleransi cukup

luas terhadap faktor-faktor lingkungannya, dapat hidup di perairan yang tenang

dengan substrat berlumpur dan pH berkisar antara 6-9 (Anggadiredja 2006).

Reproduksinya dapat terjadi secara generatif yaitu dengan pembentukan spora

yang selanjutnya tumbuh menjadi ganggang jantan dan betina (Anggadiredja

2006).

2.6 Sargassum sp.

Salah satu jenis dari alga coklat adalah Sargassum sp. Alga ini mampu

tumbuh pada substrat batu karang di daerah berombak (Anggadiredja 2006).

Klasifikasi Sargassum sp. sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisi : Phaeophyta

Kelas : Phaeophyceae

Bangsa : Fucales

Suku : Sargassaceae

Genus : Sargassum

Spesies : Sargassum sp.

16

Gambar 5. Sargassum sp.

(Sumber : dokumentasi pribadi)

Ciri-ciri umum dari jenis ini adalah bentuk thallus umumnya silindris

atau gepeng, cabangnya rimbun menyerupai pohon di darat, bentuk daun melebar,

lonjong, atau seperti pedang, mempunyai gelembung udara (bladder)

yang umumnya soliter, panjang umumnya mencapai 7 meter (di Indonesia

terdapat 3 spesies yang panjangnya 3 meter), warna thalllus umumnya coklat.

Sargassum biasanya dicirikan oleh tiga sifat yaitu adanya pigmen coklat yang

menutupi warna hijau, hasil fotosintesis terhimpun dalam bentuk laminaran

dan algin serta adanya flagel (Tjondronegoro 1989).

Sargassum tersebar luas di Indonesia, tumbuh di perairan yang

terlindung maupun yang berombak besar pada habitat batu. Pada umumnya

Sargassum tumbuh di daerah terumbu karang (coral reef) seperti di Kepulauan

Seribu, terutama di daerah rataan pasir (sand flat). Daerah ini akan kering pada

saat surut rendah, mempunyai dasar berpasir, secara sporadis terdapat pula

pada karang hidup atau mati, rumput laut coklat tumbuh diatasnya (Atmadja dan

Soelistijo 1988). Sargassum sp. mengandung iodium dan senyawa aktif seperti

senyawa fenol.