1.1.Latar BelakangEkstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample (sciencebiotech.net).PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vito untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine) (Muladno, 2010).Secara ringkas, prinsip pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target yang diinginkan melalui teknik PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 950 C, molekul DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai ganda menjadi untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 500 C sampai 600 C, primer, forward yang runutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua primer tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3 nya masing-masing primer pada suhu 720 C. Proses ini disebut ekstensi. Dengan demikian, satu molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA. Setelah itu diulangi proses denatuasi, penempelan, ekstensi yang disebut sebagai satu siklus. Proses PCR biasanya berlangsung 35-40 siklus (Muladno, 2010).Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) merupakan salah satu maka molekuler berbasis PCR yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragaman pada tingkat intraspesies maupun antarspesies (Qian et al,. 2001, Adam et al,.2002, Jena dan Das, 2006). Teknik ini mendeteksi polimorfisme ruas nukleotida pada DNA dengan menggunakan sebuah primer tunggal yang memiliki rangkaian nukleotida acak. Pada reaksi PCR-RAPD ini, sebuah prime menempel pada DNA genomic pada dua tempat berbeda dari DNA komplementer. Jika tempat penempelan primer ini berada pada daerah yang dapat diamplifikasi, maka hasil DNA tertentu yang dihasilkan melalui amplifikasi siklus termal. Umumnya masing-masing primer menyebabkan amplifikasi beberapa lokus (Welsh dan McClelland, 1990, Williams et al ., 1990).Walaupun metode RAPD relatif cepat, murah dan gampang dilaksanakan dibandingkan metode marka DNA lain, konsistensi atau reproducibility hasil PCR menjadi perhatia sejak dipublikasikannya teknik ini. Primer RAPD dapat tidak cocok secara sempurna pada urutan penempelan primer, akibatnya amplifikasi pada beberapa siklus mungkin tidak terjadi, sehingga band tetap samara tau bahkan amplifikasi tidak terjadi jika primer tidak berhasil menempel pada DNA cetakan (Lamboy,1994). Hal tesebut dapat diakibatkan karena tidak tepatnya konsentrasi komponen-komponen PCR-RAPD. Disamping itu, kualitas DNA cetakan juga berpengaruh. Adanya kandungan polifenol dan metabolit akunder lain sepeti tannin, terpen dapat menurunkan kemurnian DNA dan menghambat menempelnya primer (Padmalatha dan Prassad, 2006).

II. HASIL

Berikut ini adalah hasil praktikum anaisis DNA dengan teknik PCR-RAPD pada masing-masing spesies yang diamati :Tabel 1. Pengukuran DNA melalui teknik PCR-RAPDB1B2M1M2G1G2N1N2

Rasio1.722.3581.9911.9911.7241.6391.92.09

DNA (L/ml)264481121122087240200

P (%)961301091109591106110

Keterangan :P : purityB : betokM : masG : gurameN : nilaBerdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa rasio paling tinggi terdapat pada ikan betok 2 sebesar 2.358 dan terendah pada ikan gurame 2 sebesar 2.639. jumlah DNA (L/ml) terbesar pada betok 1 sebesar 264 (L/ml) dan terendah pada ikan nila 1 sebesar 40 (L/ml). Sedangkan purity tertinggi adalah pada ikan betok 2 sebesar 130 % dan terendah pada gurame 2 sebesar.

III. PEMBAHASAN

Perbedan jumlah DNA tiap sampel kemungkinan terjadi ketika pembuatan ekstraksi DNA kuang mendapatkan supernatan DNA. Jumlah DNA pada ikan nila sebesarb 46 , betok belum diketahui secara pasti (kisarannya 99-120), ikan gurame sebanyak 65 dan mas sebanyak (kisarannya 60-100). Rasio muncul ketika terdapat perbedaan jumlah DNA pada spesies yang sama.

IV. KESIMPULAN

DNA dapat di ekstraksi menggunakan PCR-RAPD untuk mendapatkansejumlah supernatan untuk kebutuhan yang lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Geneitika. Bogor : IPB Press

Adam,R.P., C.Hsieh,J.Murata,R.Pandey.2002.Systematics of Junioperus from easter asia based on RAPDs. Biochem.sys. ceool 30:231-241

Anonim1 .2012. http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/

Jena,S.N.,A.B.Das.2006. Interpopulation variation of chomosome and APD markers of Suaeda nudifloa (willid). Moq. a mangrove spesies in India . African J. gric.Res 1 : 137-142.Qian,W., Ge, S.,Hong, D.Y.2001. Genetic Vaiation within and among populaions of a wold rice oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theo . App. Genet. 102:440-449

Welsh J, McClelland.1990. Fingerprint genomes using PCR with arbitary primers.nucleic acid res, 18: 7231-7218