Cutting and JoiningDNA MoleculesCutting and JoiningDNA Molecules

Outline Presentasi

Enzim Restriksi

Ligasi

Elektroforesis Dasar

Secara klasik, analisis molekuler protein dan materigenetik lainnya dari kebanyakan organisme ternyatatidak mudah untuk dilakukan, karena adanya kesulitanuntuk memurnikannya dalam jumlah besar.

Sejak tahun 1970-an, berkembang suatu teknologi yangdapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasimasalah tersebut, melalui isolasi dan manipulasi genyang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentuatau pembentukan suatu produk.

Teknologi tersebut dikenal sebagai TeknologiRekombinasi atau Rekayasa Genetika.

PendahuluanPendahuluan

Teknologi Rekombinasi merupakan pembentukan kombinasimateri genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNAke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untukterintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu selorganisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai 2 manfaat, yaitu:

1. Dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing genakan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanismekontrolnya.

2. Teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gentertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besardaripada produksi secara konvensional.

PendahuluanPendahuluan

Beberapa tahapan dalam Teknologi Rekombinan, yaitu:

1. Isolasi DNA/RNA/kromosom yang akan diklon.

2. Pemotongan molekul DNA menjadi sejumlahfragmen dengan berbagai ukuran.

3. Isolasi DNA vektor.

4. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untukmenghasilkan molekul DNA rekombinan.

5. Transformasi ke sel inang (E. coli) menggunakanmolekul DNA rekombinan.

6. Re-isolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang.

7. Analisis DNA rekombinan.

PendahuluanPendahuluan

Enzim Restriksi

Enzim restriksi: enzim yang digunakan untuk memotongmolekul DNA secara spesifik.

Memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa.

Mempunyai urutan pengenalan yang unik pada utas DNA, danhanya mampu memotong pada urutan basa DNA tertentu (sisirestriksi).

Restriksi endonuklease: memotong DNA pada urutan basayang spesifik dan menghilangkan residu nukleotida dari ujung3 untai DNA.

Restriksi eksonuklease: memotong DNA pada urutan basayang spesifik dan menghilangkan residu nukleotida dari ujung5 untai DNA untuk membuka ujung untai tunggal.

Enzim Restriksi

Enzim restriksi yang digunakan untuk memotong plasmidharus sama dengan pemotong DNA asing, agar urutanbasanya bisa sesuai, sehingga antara plasmid dan DNA asingyang disisipkan bisa bersatu.

Plasmid: molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yangberantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luarkromosom, serta tidak mengandung gen-gen esensial.

Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalamimodifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasigenetik.

Plasmid terdapat pada organisme prokariot (plasmid pUC 19dan pBR 322) maupun eukariot (plasmid Ti).

Fungsi plasmid: pembawa sifat rekombinan pada organismeyang akan direkayasa.

Plasmid

Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harusmemiliki syarat-syarat sebagai berikut:

1. Ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding selinangnya.

2. Mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yangdapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam selinang.

3. Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapatdigunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing.

4. Memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukanreplikasi dalam sel inang.

Enzim restriksi tipe I: memotong DNA pada jarak 1000 pb(pasang basa) atau lebih dari sisi pengenalan.

Enzim restriksi tipe II: memotong pada bagian tengah sisipengenalan.

Memotong DNA untai ganda pada titik yang sama, sehinggamenghasilkan ujung tumpul (blunt end).

Memotong DNA pada titik yang berbeda sehinggamenghasilkan ujung lancip (sticky end).

Enzim RestriksiEnzim Restriksi

Sticky End Blunt End

1. Hasil pemotongan DNA berujunglancip.

1. Hasil pemotongan DNAberujung tumpul/rata.

2. Potongan yang dihasilkanmemiliki bagian DNA yang tidakberpasangan dan ada yangberantai tunggal.

2. Potongan yangdihasilkan masihmemiliki semua bagianDNA-nya.

3. Apabila hendak disambungkanakan menghasilkan ikatan yanglebih kuat.

3. Hasil sambungan DNAmenghasilkan ikatanyang kurang kuat.

Enzim Restriksi

Enzim Restriksi

Jumlah pb (pasang basa) menentukan kemungkinan untukmenemukan sisi pemotongan.

Untuk menghasilkan fragmen DNA yang lebih panjang digunakanenzim restriksi dengan sisi pengenalan enam atau lebih pb (pasangbasa).

Aturan dalam pemberian nama untuk enzim restriksi, yaitu:

1. Huruf pertama adalah huruf pertama dari nama genus bakterisumber isolasi enzim.

2. Huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertamadan kedua dari nama spesies bakteri (sumbernya).

3. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri,dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yangberbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.

Enzim RestriksiEnzim Restriksi

Enzim RestriksiEnzim Restriksi

Ligasi

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzimrestriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yangkompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinyaharus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektoryang sudah berbentuk linear.

Enzim ligase: enzim yang berfungsi untuk menyambung duaujung potongan DNA.

Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E.Coli dan DNA ligase dari bakteriofag T4.

Ligasi

Prinsip kerja enzim ligase, yaitu:

1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulaterpotong.

2. Penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3OH dariutas satu dengan ujung 5P dari utas yang lain.

3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatanfosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga keduafragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatumenjadi satu.

4. DNA Ligase bekerja lebih efisien pada sticky enddibanding pada blunt end.

Ligasi

Ligasi

Ligasi

Ligasi

Ligasi

Elektroforesis (untuk visualisasi DNA/RNA), merupakanperpindahan DNA/RNA bermuatan negatif terhadapmedium agarosa dibawah pengaruh arus listrik.

Komponen:

1. Gel agarosa 0.8-1% untuk mengecek genom,

1.5-2% untuk fragmen DNA berukuran 200 pb,

poliakrilamid 40% untuk 1-300 pb.

2. Buffer (TAE= Tris-Acetat-EDTA; TBE=Tris-Borat-EDTA;TPE=Tris-Fosfat-EDTA)

3. Loading dye (sukrosa/gliserol dan bromofenol biru)

4. Sampel DNA/RNA/Protein

ELEKTROFORESIS DASARELEKTROFORESIS DASAR

ELEKTROFORESIS DASAR

Aliran listrik untuk elektroforesis50-100 V dengan arah dari () ke(+) selama sekitar 30 menit.

DNA akan bermigrasi berdasarkanukuran, yang paling kecil akan lebihcepat bermigrasi.

Ukuran fragmen DNA ditentukandengan standar yang sudahdiketahui ukurannya.

Visualisasi DNA dengan etidiumbromida (EtBr) yang akanberpendar di bawah sinar UV.

EtBr

(Deoxyribonucleic acid)

TEKNIK ELEKTROFORESIS DNATEKNIK ELEKTROFORESIS DNA

Elektroforesis gel merupakan prosedur untuk memisahkanmolekul berdasarkan kecepatan bergerak melalui geldibawah pengaruh medan listrik .

Elektroforesi gel agarosa juga digunakan untukmenetapkan adanya dan ukuran hasil PCR.

TEKNIK ELEKTROFORESIS DNATEKNIK ELEKTROFORESIS DNA

DNA bermuatan negatif. Jika diletakan pada medan

listrik, DNA bergerak kekutub positif (anode).

Gel agarosa digunakanuntuk memperlambatgerakan DNA danmemisahkan DNAberdasarkan ukurannya.

Scanning Electron Micrograph

of Agarose Gel (1x1 m)

Gel agarosa berpori-pori, DNA bergerak

melewatinya.

TEKNIK ELEKTROFORESIS DNA

Cutting and Joining DNA MoleculesOutline PresentasiEnzim RestriksiEnzim RestriksiLigasi