21

BAB 3KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

Tikus Jantan(Umur 1 bulan)3.1 Kerangka Konsep

Susu Kedelai

Phytoestrogen

Sistem ReproduksiEndocrine Disruptor

Histopatologi Vesika Seminalis

Sel epitel yang apoptosis

Fertilitas Tikus Jantan Dewasa

Keterangan:: kandungan : diberikan kepada: mempengaruhi: menghambat : susu kedelai atau phytoestrogen: variabel yang dipelajari: variabel yang tidak dipelajari

3.2. Uraian KonsepGonadotropin meliputi dua hormon hipofisis anterior yaitu Hormon LH (Luteinizing Hormone) dan FSH (Folicle Stimulating Hormone) dimana hormon ini mempengaruhi fungsi normal pada sistem reproduksi. Masing-masing hormon ini memiliki fungsi khusus yang berbeda dan dan hormon-hormon ini sangat diperlukan oleh tubuh. LH akan menstimulasi sel leydig untuk memproduksi testosteron yang nantinya akan digunakan untuk pembentukan sperma. Sedangkan FSH akan menstimulasi sel sertoli untuk mengeluarkan zat yang diperlukan untuk maturasi sperma dan salah satunya yaitu estrogen (Corwin, 2009). . Susu kedelai merupakan minuman yang bergizi tinggi, terutama karena kandungan proteinnya. Selain itu susu kedelai juga mengandung lemak, karbohidrat, kalsium, phosphor, zat besi, provitamin A, Vitamin B kompleks (kecuali B12), dan air (Gregory, 2005). Susu kedelai itu sendiri merupakan salah satu sumber terbanyak yang memiliki kandungan isoflavon. Isofalvon sendiri merupakan senyawa fenolik, dan dapat menimbulkan efek seperti estrogen. Karena isoflavon dapat berikatan dengan reseptor estrogen, isoflavon dapat dikategorikan sebagai phytoestrogen (Wood, 2008). Selain meningkatkan afinitas zat aktif fitoestrogen terhadap reseptor estrogen. Fitoestrogen dapat mengganggu fungsi hormon estrogen dengan cara berikatan dengan reseptor estrogen itu sendiri sehingga menghambat ikatan hormon estrogen dengan reseptornya ( Ziegler., 2005 ).Meskipun estrogen dibutuhkan dalam proses spermatogenesis, estrogen dapat menimbulkan efek yang kurang menguntungkan apabila diberikan pada periode fetus atau neonatus seperti menurunnya fungsi reproduksi tikus jantan. Pemberian estrogen dalam jangka waktu yang lama dapat menurunkan jumlah sperma (Odonnell et la., 2001). Serta perlu diperhatikan disamping manfaat yang banyak dari susu kedelai, ternyata ada efek samping yang perlu dipikirkan yaitu peran fitoestrogen di dalam susu kedelai sebagai endocrine disrupture.

3.3. HipotesisApakah susu kedelai mempunyai efek infertilitas dilihat dari histopatologi vesika seminalis pada tikus putih sejak umur 1 bulan hingga dewasa?

BAB 4METODE PENELITIAN

4.1 Desain PenelitianPenelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan rancangan true experimental-post test only control group design yang bertujuan untuk mengetahui efek dari fitoestrogen yang terdapat pada susu kedelai yang diberikan sejak umur satu bulan terhadap fungsi dari sistem reproduksi tikus jantan (Rattus nevergicus strain Wistar) yang dilihat dari histopatologi vesika seminalis.

4.2 Populasi Dan Sampel Penelitian4.2.1 PopulasiPopulasi penelitian ini adalah tikus Rattus norvegicus strain Wistar yang memenuhi syarat seperti di bawah ini:1. Sehat 2. Umur 1 bulan 3. Tikus jantan4. Berat badan 100 gram4.2.2 SampelJumlah sampel tikus Wistar yang digunakan adalah 24 ekor untuk total semua perlakuan. 4.2.3 Estimasi Besar SampelTikus dimasukkan dalam kandang sebanyak 1 ekor per kandang dengan menggunakan kriteria tikus berumur 1 bulan. Penelitian ini menggunakan 4 perlakuan yang terdiri dari:1. Kontrol (-) yang diberikan diet normal.2. Kontrol (+) yang diberikan diet normal dan susu kedelai dengan dosis 16 mg/kg.3. Kontrol (+) yang diberikan diet normal dan susu kedelai dengan dosis 32 mg/kg.4. Kontrol (+) yang diberikan diet normal dan susu kedelai dengan dosis 64 mg/kg.Perkiraan jumlah pengulangan tersebut dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: (t-1) (r-1) 15 (4-1) (r-1) 15 3 (r-1) 15 3r-3 15 3r 15+3 r 18/3 r 6Keterangan:t = perlakuanr = pengulanganDari rumus tersebut, jika banyak perlakuan adalah 4 maka jumlah pengulangan yang dibutuhkan untuk tiap-tiap kelompok perlakuan adalah 6. Jadi setidaknya dibutuhkan 6 tikus untuk setiap kontrol di atas. 4.3 Lokasi Dan Waktu Penelitian4.3.1 LokasiPenelitian ini dikerjakan di lab. Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.4.3.2 WaktuPenelitian ini dilakukan mulai bulan Juni 2013 sampai September 2013.

4.4 Variabel Penelitian4.4.1 Variabel bebasVariabel bebas pada studi ini adalah susu kedelai dengan berbagai macam konsentrasi.4.4.2 Variabel TergantungVariabel tergantung pada studi ini adalah histopatologi vesika seminalis dari tikus Wistar jantan yang diberi diet susu kedelai.

4.5 Instrumen Penelitian4.5.1 Susu KedelaiAlat yang dibutuhkan membuat susu kedelai yaitu :1. Timbangan2. Botol erlenmeyer3. Corong4. Batang pengaduk 5. Sendok takar Dan bahan yang dibutuhkan yaitu :1. Bubuk susu kedelai2. Air Pemberian susu kedelai menggunakan probe tube.

4.5.2 Diet NormalAlat yang dibutuhkan yaitu alat timbangan, analytic weights measurement device, wadah/tempat makanan. Bahan yang dibutuhkan yaitu tepung terigu, dedak jagung, lobak, copra meal, vitamin, dan air secukupnya.4.5.3 Pembedahan dan Persiapan Slide HistopatologisAlat yang dibutuhkan yaitu :1. Satu pasang slide preparat2. Pisau operasi3. Kapas4. Gunting5. Pinset6. Mikroskop7. Mikrotom8. Kamera. Dan bahan yang diperlukan yaitu kloroform, balok parafin, formalin 10%.4.5.4 Pemeliharaan TikusAlat pengukur berat Sartorius, kandang tikus, penutup kandang, jerami/serbuk kayu, botol minuman, selang plastik

4.6 Definisi Operasional1. Sistem reproduksi pria di pengaruhi oleh sistem endokrin. Hormon yang berperan dalam produksi sperma adalah LH, FSH dan testosteron (Guyton, 2005). 2. Hormon estrogen berperan dalam sistem reproduksi wanita, dan juga berperan pada sistem reproduksi pria yaitu dalam produksi hormon testosteron. Menurunnya estrogen pada pria juga akan menurunkan testosteron (Dickerson, 2007). 3. Fitoestrogen yang berasal dari tanaman, mempunyai potensi yang rendah dibanding estrogen. Fitoestrogen dalam tubuh akan berikatan dengan reseptor estrogen, dan bersifat sebagai endocrine disrupture, sehingga dapat menurunkan testosteron dan menurunkan fungsi dari vesika seminalis.4. Sekarang semakin marak penggunaan susu kedelai di kalangan masyarakat sangat meningkat, karena di informasikan dengan berbagai manfaatnya, misalnya mencegah penyakit kardiovaskular, osteoporosis DLL. Manfaat susu kedelai ini dihubungkan dengan kandungan fitoestrogen dengan efek lainnya.

4.7 Prosedur Penelitian4.7.1 Persiapan Susu KedelaiSusu kedelai dibuat dengan mencampur susu kedelai bubuk dengan air secukupnya atau dengan takaran yang pas dan sesuai konsentrasi yang diperlukan.4.7.2 Persiapan Tikus WistarSelama proses adaptasi, semua kelompok tikus diberi diet normal. Masing-masing tikus mendapatkan 40 gram dari campuran bahan tersebut dan diberikan secara ad libitum. Semua tikus mendapatkan sinar matahari yang cukup selama 12 jam dan berada pada kegelapan selama 12 jam. Mereka dipertahankan dalam kondisi ini pada laboratorium selama 7 hari sebelum percobaan dilakukan.4.7.3 Pemberian Susu KedelaiPemberian susu kedelai dilakukan per oral. 3 dosis berbeda diberikan kepada 3 kelompok tikus. Awalnya tikus akan diberi diet standar sehingga beratnya bertambah, selama masa adaptasi yang dilakukan selama satu minggu. Kemudian pengambilan sampel akan dilakukan dengan teknik randomisasi, sehingga setiap tikus akan mempunyai kesempatan yang sama dalam mendapatkan dosis susu kedelai. Setelah itu, tikus akan dibagi menjadi 4 kelompok.Kelompok 1 Akan diberikan diet normal.Kelompok 2 Akan diberikan diet normal dan susu kedelai 16 mg/kg.Kelompok 3 Akan diberikan diet normal dan susu kedelai 32 mg/kg.Kelompok 4 Akan diberikan diet normal dan susu kedelai 64 mg/kg.4.7.4 Membedah Tikus WistarTikus di bedah dengan diberikan anestesi terlebih dahulu. Kloroform diberikan dengan menggunakan metode inflasi pada kontainer tertutup. Tikus yang telah teranastesi diletakkan di balok parafin, afiksasi dan di bedah, dimulai dari abdomen.4.7.5 Persiapan Slide HistopatologisJaringan kelenjar vesika seminalis di fiksasi dalam 10% cairan formalin netral hasil buffer untuk mencegah autolisis jaringan dan pembusukan. Setelah fiksasi, spesimen dipotong kecil supaya dapat diolah menjadi bagian mikroskopis tipis dengan cara dehydration, clearing, dan embedding. Dehydration merupakan proses merendam spesimen dalam alkohol untuk menghilangkan air dan formalin, sementara clearing dilakukan untuk membersihkan spesimen dari alkohol. Langkah terakhir yaitu embedding, dengan landasan menggunakan balok parafin supaya terbentuk matriks yang memungkinkan pemotongan yang tipis. Langkah selanjutnya menggunakan mikrotom untuk memotong jaringan menjadi bagian yang sangat tipis. Kemudian dilakukan pengecatan hematoksilin dan eosin setelah itu spesimen dapat diamati di mikroskop. Kemudian di ambil gambar mikroskopis menggunakan kamera.4.7.6 Alur Penelitian

24 Tikus Wistar

Random Sampling

Kelompok 4Diet Normal + Susu Kedelai 32 mg/kgKelompok 1Diet NormalKelompok 5Diet Normal + Susu Kedelai 64 mg/kgKelompok 2Diet Normal + Susu Kedelai 16 mg/kg

Observasi setelah 3 bulan

Dissection Vesika seminalis

Histopatologi Vesika Seminalis

Analisis data

4.7.7 Pengolahan Dan Analisis DataSpesimen dibuat dalam bentuk sediaan preparat histo PA dari vesica seminalis, yang dilakukan pengecatan HE, dan dilakukan pemeriksaan abnormalitas kelenjar vesika seminalis, sel Leydig, germ cell dan sperma. Data yang didapatkan pada penelitian akan dianalisis dengan berbagai cara. Pertama, tes homogenitas varian dilakukan untuk mengetahui apakah data ini homogen atau tidak. Kedua, untuk mengetahui perbedaan di setiap intervensi, dilakukan tes one way ANOVA digunakan dengan menggunakan software SPSS (Statistical Product and Service Solution). Dalam hubungannya dengan ANOVA, post-hoc analysis (Turkeys range test) dilakukan untuk melihat perbandingan dari setiap intervensi. Langkah ketiga menggunakan uji korelasi untuk mengetahui apakah ada kekuatan yang signifikan dari hubungan antara peningkatan konsentrasi dari susu kedelai dengan kondisi abnormalitas histopatologi vesika seminalis dan sperma pada tikus Wistar jantan. Yang terakhir simple linear regression dihitung untuk memprediksi nilai variabel tergantung dari variabel bebas. Selain itu, pengujian hipotesis dilakukan dengan cara mencari nilai confidence level dan p value.