ISOLASI PROTEIN DAN WESTERN BLOT

KELOMPOK 7 :1. AYU ANASTASYA (F1C1 13

086)2. NURSAN (F1C1 13

028)3. KEKE AWALIYAH (F1C1 13

020)4. RISNAWATI (F1C1 13 066) JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HALU OLEOKENDARI2016

Pokok Bahasan1

Definisi Protein1

Sifat dan Jenis Protein

2

Definisi Westren Blot

Teknik Westren Blot

Teknik Isolasi Protein

3

4

5

Definisi Protein

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida yang mengandung unsur-unsur C, H, O, N dan ada pula yang mengandung unsur S dan P.

Definisi Protein

Protein terletak didalam sel makhul hidup, terutama dalam membran sel baik itu pada sel hewan maupun pada sel tumbuhan.

Sifat – Sifat Protein

Mempunyai titik lebur besar dibanding senyawa karboksilat dan amina

1. Dalam larutan dapat membentuk ion zwitter

Mempunyai momen dipol besar

Bersifat amfoter

Bersifat elektrolit yaitu kurang basa dibanding amina dan kurang asam dibanding karboksilat

1

2

3

4

5 Mempunyai kurva titrasi yang khas6 Mempunyai pH isoelektrik yaitu pH pada saat asam amino tidak bermuatan7

Struktur Protein

Struktur Dasar Asam Amino

Protein intra seluler merupakan jenis protein yang di produksi dari dalam sel

Protein ekstra seluler merupakan jenis protein yang di produksi dari dalam sel dan kemudian dikeluarkan, sehingga protein tersebut berada di luar selcontohnya: enzim α-amilase pada bakteri

Tipe Protein Berlainan

Protein from cells or tissue

Microbial cells or tissue

Break cells, tissue, or organ

Blender, homogenizer, sonication,pressure,osmotic shock

Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins

Supernatant withSoluble protein

Separated by centrifugationpurification

Choose a suitable clone INOCULATION in fermenter

ExtractionINTRACELLULAR

EXTRACELLULARDesiredcells

STEPS INVOLVED IN EXTRACTION OF PROTEINS

Isolasi Protein

Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dari protein lain yang tidak diinginkan.

Secara sederhana, proses dari isolasi protein konsepnya sama dengan isolasi DNA, hanya saja isolasi protein menggunakan buffer lysis untuk melisiskan sel.

Faktor-faktor yang mempengaruhi isolasi protein

SuhupHRadiasiPelarut Organik Ion LogamEnzim-enzimPerlakuan mekanisPenambahan garam

Isolasi Protein Intraseluler Secara Umum

Sel

Lisis

Sentrifugasi

Pelet Supernatan

Pelisisan Sel

Mekanik1

Kimiawi2

Metode Pelilisan Sel

Homogenisasi tingkat tinggiEkstruksi tekanan tinggi

Metode blendingPenggerusan

Sonikasi

Larutan bufferDetergenKelator

Inhibitor protease

Pelisisan Sel

PengerusanMekanik

1

Untuk memecah dinding sel dan memperluas permukaan sampel agar dapat mempermudah proses ekstraksi sehingga Interaksi antara sampel dan pelarut akan semakin luas.

Pelisisan Sel

Kimiawi2

Penambahan Larutan Buffer

Penambahan buffer ekstrak selama penggerusan bertujuan untuk mempertahankan agar kondisi komponen sel tetap optimum seperti keadaan yang sebenarnya dan tidak mengalami perubahan.

Pelisisan Sel

Kimiawi2

Detergen

P

O

O

O

OH2C

HC

O

H2C

O

CCO O

R R Fosfolipid

Penambahan detergen selama penggerusan bertujuan Untuk memecah membran sel yang penyusun utamanya fosfolipid sehingga akan terjadi reaksi saponifikasi antara fosfolipid dan detergen pada sel.

Pelisisan Sel

Kimiawi2

Klasifikasi Detergen

Detergen Ionik : dapat memecah interaksi protein-protein

a Detergen Nonionik : dapat memecah interaksi lipid-lipid dan interaksi lipid-protein

b

Pelisisan Sel

Kimiawi2

Kelotor

Penambahan kelator selama penggerusan bertujuan untuk menghilangkan ion-ion aktivator enzim protease. Misalkan EDTA dapat berperan sebagai chelating agent dalam isolasi protein. EDTA dapat mengkelat ion Ca2+ yang dapat berperan sebagai aktivator enzim protease.EDTA (Etilen Diamin Tetraasetat)

Pelisisan Sel

Kimiawi2

Inhibitor Protease

Enzim protease adalah enzim yang dapat memutuskan ikatan peptida antara asam amino satu dengan asam amino yang lain.

Untuk mencegah proses pemutusan ikatan peptida pada protein, yaitu dengan cara : Isolasi protein dilakukan pada temperatur rendah (4 oC) dan penambahan inhibitor seperti EDTA

Pada sel hewan, enzim protease berasal dari lisosom.

Sedangkan, pada sel tumbuhan enzim protease berasal dari

vakuola

Sebelum Sentrifuge

Ditambahkan Amonium Sulfat

NH4+

2S

O

O

O

O

Untuk presipitasi garam secara salting out, sehingga menyebabkan interaksi hidrophobik antar molekul protein. Interasi hidrophobik antar molekul protein akan mengakibatkan kelarutan protein menjadi rendah dan akan mengakibatkan penggumpalan, sehingga mudah dapat dipisahkan dengan sentrifuse. Penggunaan amonium sulfat lebih didasarkan pada sifat kelarutannya yang tinggi, tidak merusak struktur protein.

SentrifugePrinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.

Supernatan

Pelet

Memiliki bobot lebih rendah

Memiliki bobot lebih tinggi

Siap untuk di deteksi

Pemurnian Protein

• Secara umum proses pemurnian protein dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi kolom penukaran ion

Pemisahan dengan kromatografi penukar ion didasarkan atas interaksi muatan ionik yang berbeda dari komponen sampel terhadap sisi aktif muatan pada matrik penukar ion

Definisi Western Blot

W. Neal Burnette

1. Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran

2. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi

3. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder

TujuanWestern Blot

1. Mengetahui keberadaan & berat Molekul protein sampel pada campuran

2. Membandingkan reaksi silang antar protein

3. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis

Teknik Western Blot

Elektroforesis1

Elektrotransfer2

Deteksi3

Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik tertentu

Pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong

Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat spesifik

Teknik Western Blot

Elektroforesis1. Dalam elektroforesis, sampel yang

mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS (sodium dodecyl sulfat)

2. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi.

3. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya

4. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik

5. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul

Elektrotransfer

Blotting semi kering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer

1 Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer

2

Gel transfer yang umum digunakan pada WB ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon.

Deteksi ProteinBerdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode deteksi, yaitu:

Metode langsung menggunakan antibodi primer yang telah

terkonjugasi dengan molekulmarker

1Metode tidak langsung

menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder

2

• Antibodi primer berfunsi mengikat protein target • Antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan

terkonjugasi dengan molekul penanda• Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah

enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase (HRP), immunogold, dan 125I

TERIMA KASIH