Post on 27-Jun-2019
27
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan,
Fakultas Pertanian-Peternakan Universitas Muhammadiyah Malang. Waktu
pelaksanaan dimulai pada bulan maret 2017 sampai bulan september 2017.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, pompa
vakum, pengering (sinar matahari), thermometer, kertas whatman No. 42, ayakan
100 mesh, beaker gelas 100 ml, 600 ml, 2000 ml, cawan porselen, mortal martil,
oven, hotplate stirer, magnetic stirer, spatula kaca, pompa vakum, sendok.
Sedangkan alat yang digunakan untuk analisis adalah labu kjeldahl, lemari asam,
erlenmayer, pipet, krus porselen, desikator, spektroakopi UV, petridish, tabung
reaksi, rak tabung, spirtus, korek api dan alat-alat gelas.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cangkang rajungan
(portunus pelagicus) yang diperoleh dari Mini Plan Grand Pelangi Tongas
Probolinggo, bahan kimia yang digunakan untuk penelitian adalah, H2SO4,
indikator metil merah, asam asetat 0,5%; 1%; 1,5% dan 2%, asam borat, HCl 1 N,
HCL 0,2 N, aquades, NaOH 20%; 30%; 3,5%; 40% dan 50%, NA, pH universal
dan fillet ikan Nila.
28
3.3 Metode Penelitian
Metode penelitian terdiri dari dua tahapan yaitu penelitian 1 yaitu pembuatan
kitosan dan penelitian 2 yaitu aplikasi kitosan terhadap umur simpan fillet ikan
Nila. Penelitian tahap 1 ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) yang
disusun secara faktorial. Faktor perlakuan yang dicobakan terdiri dari 2 macam dan
masing-masing perlakuan diulang 3 kali. Faktor yang dicobakan adalah faktor 1
konsentrasi NaOH (4 level), dan faktor 2 waktu (2 level). Pengaplikasian
konsentrasi NaOH pada saat proses deasetilisasi dan waktu pengadukan pada saat
proses deasitilisasi.
Faktor I : konsentrasi NaOH
K0 : Konsentrasi NaOH 20%
K1 : Konsentrasi NaOH 30%
K2 : Konsentrasi NaOH 40%
K3 : Konsentrasi NaOH 50%
Faktor II : waktu ekstraksi deasetilasi
A1 : Waktu 30 menit
A2 : Waktu 45 menit
Tabel 3. Perlakuan perbedaan konsentrasi NaOH dan waktu ekstraksi deastilasi
pada pembuatan kitosan
K
A
K0 K1 K2 K3
A1 K0A1 K1A1 K2A1 K3A1
A2 K0A2 K1A2 K2A2 K3A2
Keterangan :
K0A1 = konsentrasi NaOH 20%, waktu ekstraksi 30 menit
K1A1 = konsentrasi NaOH 30%, waktu ekstraksi 30 menit
29
K2A1 = konsentrasi NaOH 40%, waktu ekstraksi 30 menit
K3A1 = konsentrasi NaOH 50%, waktu ekstraksi 30 menit
K0A2 = konsentrasi NaOH 20%, waktu ekstraksi 45 menit
K1A2 = konsentrasi NaOH 30%, waktu ekstraksi 45 menit
K2A2 = konsentrasi NaOH 40%, waktu ekstraksi 45 menit
K3A2 = konsentrasi NaOH 50%, waktu ekstraksi 45 menit
Analisa data pada penelitian ini menggunakan Analisis Ragam (ANOVA)
dan apabila terjadi perbedaan nyata atau ada interaksi pada masing-masing
perlakuan maka data yang diperoleh akan dilanjutkan dengan uji pembeda dengan
menggunakan Uji DMRT (Duncan’s Multiple Rnage Text). Selanjutnya kitosan dari
perlakuan terbaik akan diaplikasikan pada fillet ikan Nila untuk mengetahui
pengaruhnya terhadap umur simpan fillet ikan Nila.
Penelitian tahap 2 ini menggunakan Rancagan Acak kelompok (RAK)
sederhana dengan 1 faktor , dimana faktor 1 adalah perbedaan konsentrasi
penambahan kitosan yang dilarutkan dalam 100 ml asam asetat 1% serta periode
waktu penyimpanan 0 hari, 1 hari dan 2 hari. Kemudian diulang sebanyak 5 kali
ulangan, dengan perlakuan sebagai berikut:
N1 = Penambahan kitosan dengan konsentrasi 0% (kontrol)
N2 = Penambahan kitosan dengan konsentrasi 1%
N3 = Penambahan Kitosan dengan konsentrasi 1,5%
N4 = Penambahan Kitosan dengan konsentrasi 2%
Untuk menentukan hubungan antara konsentrasi kitosan dengan umur
simpan fillet ikan Nila dilakukan dengan cara Analisis Ragam (ANOVA) dan
apabila terjadi perbedaan nyata atau ada interaksi pada masing-masing perlakuan
30
maka data yang diperoleh akan dilanjutkan dengan uji pembeda dengan
menggunakan Uji BNT (Beda Nyata Terkecil).
3.4 Pelaksanaan Penelitian
3.4.1 Pembuatan Kitosan
3.4.1.1 Tahap Persiapan (Tanasae, et al., 2006)
Limbah cangkang rajungan dicuci menggunakan air sampai bersih, lalu
dikeringkan dengan sinar matahari selama hingga kering, selanjutnya di tumbuk
dan diayak dengan ukuran 100 mesh.
3.4.1.2 Tahap Deproteinasi (Tanasae et al., 2006)
1. Ditimbang sebanyak 50 gram serbuk cangkang rajungan dimasukkan kedalam
gelas beaker 600 ml dan ditambahkan larutan NaOH 3,5% perbandingan 1:10
(gr serbuk/ml NaOH)
2. Campuran dipanaskan pada suhu 65 0C selama 2 jam sambil diaduk dengan
kecepatan pengadukan 50 rpm kemudian dikeringkan dan didinginkan
3. Padatan dicuci menggunakan aquades dan disaring menggunakan kertas saring
hingga pH netral
4. Endapan dikeringkan dalam oven pada suhu 100 0C selama 15 jam.
3.4.1.3 Tahap Demineralinasi (Tanasae et al., 2006)
1. Endapan kering hasil proses deprotenasi dimasukkan dalam gelas beker 600 ml
dan ditambahkan HCl 1 N dengan perbandingan 1:15 (w/v)
2. Kemudian dilakukan pemanasan dengan pengadukan menggunakan magnetic
stirer selama 1 jam pada suhu 750C
3. Padatan dicuci menggunakan aquades dan disaring menggunakan kertas saring
untuk menghilangkan sisa-sisa HCl hingga berpH netral.
31
4. Setelah kondisi netral tercapai, residu yang diperoleh kemudian dikeringkan
pada suhu 100 0C 15 jam.
3.4.1.4 Tahap Deasetilasi (Tanasae et al., 2006)
1. Kitin yang telah terbentuk pada proses demineralisasi, ditambahkan
konsentrasi larutan NaOH yang berbeda-beda yaitu 20%, 30%, 40% dan 50
% sesuai dengan perlakuan dengan perbandingan 1:10
2. Dipanaskan dan diaduk pada suhu 100 0C dengan menggunakan waktu yang
berbeda-beda yaitu selama 30 menit dan 45 menit dengan kecepatan
pengadukan 50 rpm.
3. Larutan didinginkan kemudian dicuci menggunakan aquades dan disarig
menggunakan kertas saring dengan dibantu pompa vakum untuk
mempercepat proses penyaringan dilakukan hingga pH netral.
4. Kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 100 0C selama 15
jam, selanjutnya terbentuk bubuk kasar kitosan dan dilakukan penggerusan
sehingga didapat kitosan.
3.4.2 Pembuatan Larutan Kitosan
Prosedur pembuatan larutan edible coating dari kitosan pada penelitian ini
menggunakan metode dari Butler et al (1996). Konsentrasi kitosan yang digunakan
adalah 0; 0,5; 1; 1,5 dan 2%. Edible coating dengan konsentrasi 0,5% dibuat dengan
melarutkan masing-masing sampel menimbang 1 gram kitosan ke dalam 0,5 mL
asam asetat, kemudian ditambah 99,5 mL aquades. Pelarut kitosan dalam asam
asetat 0,5% dilakukan agar kitosan dengan larutan dapat homogen. Larutan
dihomogenkan dengan pengaduk magnetic stirer pada suhu 500C selama 60 menit
sampai larutan coating terlarut dengan sempurna.
32
3.4.3 Pem fillettan Ikan
Tahap pertama proses pemfilletan yaitu membersikan sisik ikan sampai
bersih dan membersihkan isi perut kotoran dalam ikan. Memotong bagian daging
ikan sampai terpisah dari tulangnya menjadi lembaran lalu memotong daging ikan
berbentuk persegi, kemudian mencuci daging ikan dengan air.
3.4.4 Aplikasi Larutan Kitosan pada Fillet Ikan Nila
Setelah pembersihan ikan dan pemotongan ikan kemudian melakukan proses
pelapisan dengan memasukkan fillet ikan Nila ke dalam larutan coating selama 30
detik, lalu ditiriskan sampai larutan edible coating yang menempel pada fillet ikan
Nila agak mengering. Tiriskan ikan yang telah direndam dalam larutan edible
coating, kemudian letakkan dalam wadah dan simpan pada suhu ruang.
3.5 Prosedur Analisis Penelitian
3.5.1 Analisis Kitosan
1.5.1.1 Perhitungan Rendemen (Kyoon No et al., 2000)
Rendemen kitin dihitung berdasarkan perbandingan antara berat kitosan
dengan berat limbah cangkang rajungan menggunakan rumus:
Rendemen = (Berat kitosan/Berat Limbah Cangkang Rajungan) x 100 %
1.5.1.2 Analisis Derajat Deasetilasi Kitosan (Liu et al., 2006)
1. Ditimbang kitosaan sebanyak 6,1 mg
2. Dilarutkan dalam 5 ml HCl 0,1 M
3. Disiapkan spektrofotometer UV dan masukan blanko yaitu HCl 0,1 M dalam
kuvetdengan rentang bilangan gelombang 201 nm
4. Dimasukan ke dalam kuvet larutan kitosan yang sudah dilarutkan dalam HCl
0,1 M
33
5. Dicatat nilai absorbansinya
6. Dihitung derajat deasetilasi dengan rumus:
DA : (161,1 x A x V)-(0,0128 x m)
(3,3615 x m)-(42,1 x A x V)
DD : 1 – (DA) x 100%
Keterangan :
DA = Derajat Asetilasi
DD = Derajat Deasetilasi
A = Absorban
V = Volume Larutan Kitosan (L)
M = Berat Kitosan (mg)
3.5.1.3 Pengujian Kadar Abu (Sudarmadji dan Suhardi, 1994)
1. Menimbang sampel sebanyak l-2 g dalam krus porselin yang kering dan telah
diketahui massanya.
2. Memasukkan dalam tanur pada suhu 6000C selama ± 24 jam sampai diperoleh
abu berwarna keputih-putihan.
3. Kemudian krus dan abu didinginkan dalam desikator selama 30 menit.
4. Setelah dingin abu ditimbang.
Perhitungan kadar abu dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut:
% kadar abu = a – b x 100%
c
Keterangan:
a : massa cawan dan sampel awal (g)
b : massa cawan dan sampel setelah menjadi abu (g)
c : massa sampel awal (g)
34
3.5.1.4 Pengujian Kadar Protein (Sudarmadji, 1989)
1. Menimbang 0,1 g bahan, masukkan ke dalam labu kjeldahl. Menambahkan
katalisator sepucuk dan H2SO4 pekat 2 ml.
2. Mencampur pada labu kjeldahl dipanaskan dalam almari asam sampai
berhenti berasap, dipanaskan sampai cairan menjadi jernih dan kemudian
dinginkan.
3. Menyiapkan asam borat 15 ml didalam erlenmeyer pada setiap sampel.
Memanaskan alat destilasi, erlenmeyer destilat yang sudah berisi aquades
dipanaskan menggunakan hotplate.
4. Sampel yang sudah dingin ditambahkan dengan aquades 15ml. Kemudian
dimasukkan kedalam alat destilasi menggunakan corong kaca lalu
menambahkan 10 ml NaOH 50% dan aquades 10ml
5. Setelah dimasukkan ditutup dan erlenmeyer yang berisi asam borat
diletakkan dipenampung bawah hingga berubah menjadi hijau mudah.
6. Hasil destilat tersebut kemudian dititrasi menggunakan HCl 0,2 N hingga
berubah warna menjadi merah mudah.
Perhitungan kadar protein dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut :
Kadar Nitrogen = m HCl x N HCl x 14,008 x 100%
berat bahan (g) x 100
Kadar Protein = Fk x Kadar Nitrogen
3.5.1.4 Kelarutan (Kyoon No et al., 2000)
Berat kitosan 0,1% (b/v) dilarutkan dalam asam asetat 2% (v/v),
lalu difiltrasi. Persentase kelarutan kitin ditunjukkan dengan kitosan yang tersisa
dibandingkan dengan kitosan awal.
35
3.5.1.6 Viskositas (Hwang et al., 1997)
Masukkan 1 gram sampel dalam 100 ml asam asetat 1% dan diaduk hingga
homogen. Kemudian diukur menggunakan alat viskositas, catat waktu putar (1 kali
putaran) menggunakan stopwatch.
3.5.1.7 Pengujian Kadar Air (Sudarmadji dkk., 1994)
1. Timbang sampel sebanyak 1-2 gr dala cawan porselin yang telah diketahui
beratnya
2. Masukkan dalam oven pada suhu 100-1050C selama 1-2 jam tergantung
bahannya. Kemudian didinginkan dalam desikator selama kurang lebih 30
menit dan ditimbang
3. Panaskan lagi dalam oven, didinginkan dalam desikator dan diulangi hingga
konstan
Perhitugan kadar air dapat dilakukan dengan rumus sebagai berikut :
% kadar air = a – b x 100%.
c
Keterangan :
Sampel : kitin dan kitosan
a : Berat cawan dan sampel awal (g)
b : Berat cawan dan sampel setelah kering (g)
c : Berat sampel awal (g)
3.5.2 Analisis Kitosan sebagai Pengawet Alami Fillet Ikan Nila
3.5.2.1 Uji Organoleptik (SNI 01-2346-2006)
Metode yang digunakan untuk uji organoleptik yaitu dengan menggunakan
score sheet. Pengujian dilakukan oleh 15 panelis yang ada di Laboatorium Ilmu
danTeknologi Pangan. Pengujian bersifat subjektif dengan menggunakan indera
36
yang ditujukan pada kenampakan, aroma dan tekstur. Skor yang diperoleh pada
pengujian organoleptik berdasarkan SNI 01-2729.1-2006 dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Kategori skor uji organoleptik
Uji Organoleptik Score sheet
Tekstur 1 = lunak, daging mudah sobek
2 = tidak elastis, jaringan daging longgar
3 = kurang elastis, jaringan daging agak
longgar
4 = kurang padat, jaringan daging masih
melekat kuat
5 = kompak, padat, elastis
Aroma 1 = aroma busuk
2 = aroma mengarah ke busuk
3 = tidak beraroma
4 = sedikit segar
5 = aroma segar
Kenampakan 1 = perubahan warna seluruh permukaan
2 = warna daging kecoklatan, kusam
3 = warna daging krem kecoklatan, agak
kusam
4 = warna cerah dan kurang mengkilap
5 = warna daging cerah dan mengkilap
3.5.2.2 Pengujian Uji Total Plate Count (TPC) (SNI 01-2332-3-2006)
1. Semua peralatan dan bahan seperti aquades dan NA yang digunakan
disterilkan terlebih dahulu menggunakan autoclaf
2. Ambil sampel sebanyak 1g kemudian dihaluskan.
3. Menyiapkan NA (Natrium Agar) dan NA dimasukkan kedalam setiap
cawan petridish
4. Sampel yang telah halus dimasukkan kedalam tabung reaksi pertama yang
berisi aquades steril dan disentrifuse kemudian dilakukan pengenceran
hingga 10-5
37
5. Selanjutnya sampel yang telah diencerkan diambil sebanyak 1 ml dan
dituangkan kedalam cawan petri steril kemudian dituangkan media NA
(Nutrient Agar).
6. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C setelah itu dilakukan pengamatan
koloni dan dihitung jumlah koloni.
3.5.3 Analisis Data
Data hasil pengamatan penelitian tahap pertama kemudian dilakukan analisa
secara deskriptif dan kedua dilakukan analisa dengan menggunakan uji analisis
statistik (analisis ragam /ANOVA). Hasil analisa statistik jika memberikan
pengaruh akan dilakukan uji jarak ganda Duncan 𝛼 5%.
38
Gambar 6. Diagram alir pembuatan tepung rajungan (Tanasae et al., 2006)
Cangkang rajungan
matang
Pencucian
Penjemuran sinar matahari
3hari
Penghalusan
Tepung rajungan
Pengayakan 100 mesh
Air Air kotor
39
Gambar 7. Diagram Alir Proses Deproteinasi dan Demineralisasi (Tanasae et al.,
2006, telah dimodifikasi)
Ekstraksi deproteinasi
Tepung rajungan
Larutan NaOH 3,5%
, T =650C, t = 2jam
Pendinginan suhu ruang
Penyaringan dengan kertas saring
Pencucian sampai pH 7
Pengeringan (T = 1000C, t = 15 jam)
Hasil deproteinasi
Aquades
Filtrat
Ekstraksi demineralisasi
Pendinginan suhu ruang
Penyaringan dengan kertas saring
Filtrat
Larutan HCl 1 N T=
750C, t= 1jam
Pencucian sampai pH 7
Pengeringan (T= 1000C, t= 15 jam)
Kitin
Aquades
40
Pengujian
1. Rendemen
2. Derajat
deasetilasi
3. Kelarutan
4. Viskositas
5. Kadar
protein
6. Kadar air
7. Kadar abu
8. Struktur
mikroskopi
Keterangan : * = konsentrasi larutan NaOH (20%, 30%, 40% dan 50%)
** = waktu ekstraksi (30 menit dan 45 menit)
Gambar 8. Diagram Alir Proses Pembuatan Kitosan (Tanasae et al., 2006, telah
dimodifikasi)
Kitin
Ekstraksi deasetilasi
Penyaringan dengan kertas
saring
Pendinginan suhu ruang
Pencucian sampai pH 7
Larutan NaOH*
dan waktu **
Kitosan
Aquades
Pengeringan (T=1000C, t=15
jam)
Kitosan
41
Gambar 9. Diagram Alir Aplikasi Kitosan pada fillet ikan Nila
Kitosan 0,5 gram
Mencampurkan bahan
Pengadukan dengan
magnetic stirer (t = 500C, T
= 60 menit )
Asam asetat
0,5%
Larutan Kitosan
Pengenceran dengan
aquades hingga mencapai
100 ml
Coating 3 menit Larutan
Kitosan
Penyimpanan suhu ruang
42
Gambar 10. Diagram Alir Uji Total Plate Count (TPC)
Ikan nila (1 g)
Dihaluskan
Dimasukan dalam 1 tabung reaksi
Divortex sampel dalam tabung
reaksi
Diambil sampel (1 ml)
Dilakukan pengenceran
(10-1 – 10-5)
Diambil ke dalam cawan petri
steril
Dituangkan media NA (Nutriet
Agar)
Diinkubasi
(24 jam dan suhu 370C)
Total koloni