Post on 03-Feb-2016
description
1 *) victoria@uny.ac.id
BIOTEKNOLOGI Victoria Henuhili, MSi *)., Jurdik Biologi FMIPA UNY
Sub Topik : FUSI PROTOPLAS
KULTUR PROTOPLAS
Berkembang pada tahun1960, setelah diketemukan cara
menghilangkan dinding sel secara enzimatis
FUSI PROTOPLAS
Memfusikan 2 macam protoplasma yang sama atau berbeda,
sehingga menghasilkan hibrida sel yang diharapkan dapat
mengadakan regenerasi menjadi tanaman baru dengan sifat yang
baru
Semua informasi genetik yang dikehendaki tidak berada dalam
protoplasma yang sama
SUMBER PROTOPLAS
- Jaringan daun, kalus, kultur suspensi sel, kotiledon, bunga dsb
FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KEBERHASILAN & VIABILITAS PROTOPLAS
- Kondisi jaringan donor Sehat, kecepatan pertumbuhan,
keadaan sitoplasma yang menyusun jaringan
- Larutan enzim yang digunakan isolasi protoplasma
- Waktu inkubasi & agitasi lama waktu inkubasi dan agitasi untuk
hidrolisa dinding sel bervariasi, tergantung jaringan serta
konsentrasi larutan enzim
- Prosedur pencucian dan cara infiltrasi
- Faktor lingkungan Cahaya, temperatur, kelembaban tanah dan
kesuburan tanah dari tanaman yang akan diisolasi
protoplasmanya
- Penyimpanan jaringan pada tempat yang gelap 24 - 72 jam
2 *) victoria@uny.ac.id
KEBERHASILAN ISOLASI PROTOPLAS
Diketahui dengan menggunakan pewarnaan evan biru
- Protoplas yang tidak berwarna = viabel Menghambat masuknya
zat warna ke dalam protoplas
- Yang berwarna biru = mati
UJI VIABILITAS MENGGUNAKAN PEWARNA FLOURESEIN DIACETATE (FDA)
Dapat dilihat pada mikroskop flouresensi
- Sel-sel yang hidup akan nampak memancarkan cahaya
flouresensi kuning atau hijau
- Biasanya untuk menghitung sel yang hidup / mati secara simultan
digunakan zat warna ganda yaitu FDA dan PI (Propidium Iodise)
KULTUR PROTOPLAS
- Protoplas dikultur pada media cair
- Suspensi protoplas dikultur pada tetes cairan dalam cawan petri,
kemudian disegel dengan parafilm
- Kultur diinkubasi pada temperatur 25 - 28oC dengan intensitas
cahaya 100 - 500 Lux (gelap)
- Setelah regenerasi dinding sel dan pembelahan telah dimulai
dalam medium cair tersebut, sel dapat dipindahkan ke medium
padat
FUSI PROTOPLAS
- Spontan
- Induksi
INDUKSI FUSI SECARA KIMIA / ELEKTRIK
1. NaNO3
2. Ca++ konsentrasi tinggi & Ph tinggi
Contoh : Fusi protoplas 2 jenis tanaman tembakau pada larutan
dengan konsentrasi ion Ca++ ( 50 Mm/liter CaCl2.2H2O) & Ph
10,1
3. Polietilen Glikol (PEG)
PEG dipakai dengan konsentrasi 25% - 30% dan BM 1000 - 6000
4. Fusi Elektrik
- Kontak membran
- Pemulihan bentuk, fusi inti dll
3 *) victoria@uny.ac.id
KONDISI KULTUR & LINGKUNGAN PROTOPLAS
Syarat Faktor Lingkungan :
- PH 5,5 – 5,8
- Osmolaritas 0,35 – 0,70 M
- Temperatur 22O C – 28
O C
- Intensitas cahaya rendah > 2000 LUX
MEDIUM KULTUR PROTOPLAS
Medium kultur protoplas terdiri dari :
- Osmotic stabilizer (Manitol & Sorbitol untuk menjaga osmolaritas kedua
senyawa ini digunakan bersama-sama atau terpisah. Sorbitol digunakan
sebagai sumber karbon
- Nutrien anorganik Terdiri dari amonium dan nitrat. Untuk menghilangkan
pengaruh toksis dari ammonium ditambahkan asam suksinat..
- Sumber karbon Glukose (dapat juga ditambahkan sukrose dengan
perbandingan yang sama. Penggunaan sukrose saja tidak cocok untuk
medium protoplas)
- Vitamin Thiamin, asam nikotianat dan peridoksin
- Nitrogen organik Yang sering digunakan: 0,01-0,25% asam casamino,
atau kasein hidrolisat. Dapat juga ditambah 1– 5 Mm/L Glutamin atau 1–5 %
air kelapa
- Zat pengatur tumbuh Auksin dan sitokinin dibutuhkan untuk menginduksi
pembelahan sel dan regenerasi.
- Auksin yang dipakai: 2,4D & NAA
- Sitokinin yang dipakai : Kineti, Bensiladenin & Zeatin
ISOLASI, FUSI dan KULTUR PROTOPLAS
- BAHAN : Mesofil daun muda seedling
- LARUTAN ENZIM :
1% enzim selulosa
0,1% maserosim
15% air kelapa (pengganti MES)
0,5 M sukrosa
Garam : CaCl2.2H2O 10Mm
4 *) victoria@uny.ac.id
- STERILISASI BAHAN SAMPEL
1. 1–3 gr bahan (mesopil daun) dicuci sampai bersih
2. masukkan dalam Etanol 70% 1 mnt
Kemudian sodium hipoklorit 1 – 5% + Tween 20 selama 10 mnt
3. Bilas dengan air steril 3 kali
- ISOLASI PROTOPLAS & PENCUCIAN
1. Sayat epidermisbawah daun dengan pinset
2. Iris daun & hilangkantulang daun
3. Masukkan irisan daun dalam preplasmolysing agent selama 1 jam,
goyang dengan shaker (40 rev/mnt), pada keadaan gelap dan
temperatur 25OC
4. Preplasmolysing agent dibuang, ganti larutan enzim
5. Inkubasikan selama 18 Jam
6. Saring bahan dengan filter nilon 200 Mm
7. Saring lagi dengan filter nilon 80 Mm
8. Pindahkan bahan ke tabung sentrifuse
9. Sentrifus selama 3 mnt dengan kecepatan 100 x g
10. Buang supernatan dengan menggunakanpipet
11. Tambahkan larutan pencuci
12. Protoplas di atas permukaan, dipipet diamati di atas gelas benda di
bawah mikroskop
- FUSI PROTOPLAS
1. Protoplas viabel dipindah ke tabung yang lain
2. Suspensi dengan larutan pencuci (0,5 M Sukrosa & 5 – 10 mM
CaCl2.2H2O)
3. Ganti larutan pencuci 1X
4. Protoplas siap difusi
- PEG dengan BM 6000 konsentrasi 25 – 35%
- 0,3 M Glukosa
- 50 Mm CaCl2.H2O
5 *) victoria@uny.ac.id
- Ph 5,8
5. Ambil 0,5 ml protoplas yang viabel
6. Tambahkan 1,0 ml larutan PEG
7. Diamkan selama 5 – 20 menit
8. Lihat di bawah mikroskop
9. Apabila sudah banyak terjadi fusi, larutan PEG dipipet dikeluarkan
10. Ganti dengan larutan PEG + CaCl2 konsentrasi tinggi dengan
perbandingan 1 : 2
11. Biarkan 10 menit
12. Keluarkan larutan PEG dengan pipet
13. Ganti dengan larutan pencuci suspensi
14. Inkubasi 5 mnt
15. Sentrifuse 3 mnt
16. Cuci dengan larutan pencuci
17. Kulturkan protoplas dalam medium kultur
18. Regenerasi dinding dapat diamati dengan menggunakan
mekroskop UV