1 *) victoria@uny.ac.id

BIOTEKNOLOGI Victoria Henuhili, MSi *)., Jurdik Biologi FMIPA UNY

Sub Topik : FUSI PROTOPLAS

KULTUR PROTOPLAS

Berkembang pada tahun1960, setelah diketemukan cara

menghilangkan dinding sel secara enzimatis

FUSI PROTOPLAS

Memfusikan 2 macam protoplasma yang sama atau berbeda,

sehingga menghasilkan hibrida sel yang diharapkan dapat

mengadakan regenerasi menjadi tanaman baru dengan sifat yang

baru

Semua informasi genetik yang dikehendaki tidak berada dalam

protoplasma yang sama

SUMBER PROTOPLAS

- Jaringan daun, kalus, kultur suspensi sel, kotiledon, bunga dsb

FAKTOR YANG MEMPENGARUHI KEBERHASILAN & VIABILITAS PROTOPLAS

- Kondisi jaringan donor Sehat, kecepatan pertumbuhan,

keadaan sitoplasma yang menyusun jaringan

- Larutan enzim yang digunakan isolasi protoplasma

- Waktu inkubasi & agitasi lama waktu inkubasi dan agitasi untuk

hidrolisa dinding sel bervariasi, tergantung jaringan serta

konsentrasi larutan enzim

- Prosedur pencucian dan cara infiltrasi

- Faktor lingkungan Cahaya, temperatur, kelembaban tanah dan

kesuburan tanah dari tanaman yang akan diisolasi

protoplasmanya

- Penyimpanan jaringan pada tempat yang gelap 24 - 72 jam

2 *) victoria@uny.ac.id

KEBERHASILAN ISOLASI PROTOPLAS

Diketahui dengan menggunakan pewarnaan evan biru

- Protoplas yang tidak berwarna = viabel Menghambat masuknya

zat warna ke dalam protoplas

- Yang berwarna biru = mati

UJI VIABILITAS MENGGUNAKAN PEWARNA FLOURESEIN DIACETATE (FDA)

Dapat dilihat pada mikroskop flouresensi

- Sel-sel yang hidup akan nampak memancarkan cahaya

flouresensi kuning atau hijau

- Biasanya untuk menghitung sel yang hidup / mati secara simultan

digunakan zat warna ganda yaitu FDA dan PI (Propidium Iodise)

KULTUR PROTOPLAS

- Protoplas dikultur pada media cair

- Suspensi protoplas dikultur pada tetes cairan dalam cawan petri,

kemudian disegel dengan parafilm

- Kultur diinkubasi pada temperatur 25 - 28oC dengan intensitas

cahaya 100 - 500 Lux (gelap)

- Setelah regenerasi dinding sel dan pembelahan telah dimulai

dalam medium cair tersebut, sel dapat dipindahkan ke medium

padat

FUSI PROTOPLAS

- Spontan

- Induksi

INDUKSI FUSI SECARA KIMIA / ELEKTRIK

1. NaNO3

2. Ca++ konsentrasi tinggi & Ph tinggi

Contoh : Fusi protoplas 2 jenis tanaman tembakau pada larutan

dengan konsentrasi ion Ca++ ( 50 Mm/liter CaCl2.2H2O) & Ph

10,1

3. Polietilen Glikol (PEG)

PEG dipakai dengan konsentrasi 25% - 30% dan BM 1000 - 6000

4. Fusi Elektrik

- Kontak membran

- Pemulihan bentuk, fusi inti dll

3 *) victoria@uny.ac.id

KONDISI KULTUR & LINGKUNGAN PROTOPLAS

Syarat Faktor Lingkungan :

- PH 5,5 – 5,8

- Osmolaritas 0,35 – 0,70 M

- Temperatur 22O C – 28

O C

- Intensitas cahaya rendah > 2000 LUX

MEDIUM KULTUR PROTOPLAS

Medium kultur protoplas terdiri dari :

- Osmotic stabilizer (Manitol & Sorbitol untuk menjaga osmolaritas kedua

senyawa ini digunakan bersama-sama atau terpisah. Sorbitol digunakan

sebagai sumber karbon

- Nutrien anorganik Terdiri dari amonium dan nitrat. Untuk menghilangkan

pengaruh toksis dari ammonium ditambahkan asam suksinat..

- Sumber karbon Glukose (dapat juga ditambahkan sukrose dengan

perbandingan yang sama. Penggunaan sukrose saja tidak cocok untuk

medium protoplas)

- Vitamin Thiamin, asam nikotianat dan peridoksin

- Nitrogen organik Yang sering digunakan: 0,01-0,25% asam casamino,

atau kasein hidrolisat. Dapat juga ditambah 1– 5 Mm/L Glutamin atau 1–5 %

air kelapa

- Zat pengatur tumbuh Auksin dan sitokinin dibutuhkan untuk menginduksi

pembelahan sel dan regenerasi.

- Auksin yang dipakai: 2,4D & NAA

- Sitokinin yang dipakai : Kineti, Bensiladenin & Zeatin

ISOLASI, FUSI dan KULTUR PROTOPLAS

- BAHAN : Mesofil daun muda seedling

- LARUTAN ENZIM :

1% enzim selulosa

0,1% maserosim

15% air kelapa (pengganti MES)

0,5 M sukrosa

Garam : CaCl2.2H2O 10Mm

4 *) victoria@uny.ac.id

- STERILISASI BAHAN SAMPEL

1. 1–3 gr bahan (mesopil daun) dicuci sampai bersih

2. masukkan dalam Etanol 70% 1 mnt

Kemudian sodium hipoklorit 1 – 5% + Tween 20 selama 10 mnt

3. Bilas dengan air steril 3 kali

- ISOLASI PROTOPLAS & PENCUCIAN

1. Sayat epidermisbawah daun dengan pinset

2. Iris daun & hilangkantulang daun

3. Masukkan irisan daun dalam preplasmolysing agent selama 1 jam,

goyang dengan shaker (40 rev/mnt), pada keadaan gelap dan

temperatur 25OC

4. Preplasmolysing agent dibuang, ganti larutan enzim

5. Inkubasikan selama 18 Jam

6. Saring bahan dengan filter nilon 200 Mm

7. Saring lagi dengan filter nilon 80 Mm

8. Pindahkan bahan ke tabung sentrifuse

9. Sentrifus selama 3 mnt dengan kecepatan 100 x g

10. Buang supernatan dengan menggunakanpipet

11. Tambahkan larutan pencuci

12. Protoplas di atas permukaan, dipipet diamati di atas gelas benda di

bawah mikroskop

- FUSI PROTOPLAS

1. Protoplas viabel dipindah ke tabung yang lain

2. Suspensi dengan larutan pencuci (0,5 M Sukrosa & 5 – 10 mM

CaCl2.2H2O)

3. Ganti larutan pencuci 1X

4. Protoplas siap difusi

- PEG dengan BM 6000 konsentrasi 25 – 35%

- 0,3 M Glukosa

- 50 Mm CaCl2.H2O

5 *) victoria@uny.ac.id

- Ph 5,8

5. Ambil 0,5 ml protoplas yang viabel

6. Tambahkan 1,0 ml larutan PEG

7. Diamkan selama 5 – 20 menit

8. Lihat di bawah mikroskop

9. Apabila sudah banyak terjadi fusi, larutan PEG dipipet dikeluarkan

10. Ganti dengan larutan PEG + CaCl2 konsentrasi tinggi dengan

perbandingan 1 : 2

11. Biarkan 10 menit

12. Keluarkan larutan PEG dengan pipet

13. Ganti dengan larutan pencuci suspensi

14. Inkubasi 5 mnt

15. Sentrifuse 3 mnt

16. Cuci dengan larutan pencuci

17. Kulturkan protoplas dalam medium kultur

18. Regenerasi dinding dapat diamati dengan menggunakan

mekroskop UV