Post on 06-Aug-2015
Bab III
Metodologi Penelitian
3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental, yaitu dengan
melakukan praktikum mulai dari penentuan simplisia yang akan digunakan hingga
identifikasi komponen dalam ekstrak.
3.2 Alur Penelitian
Penelitian dilakukan seperti yang terlihat pada bagan berikut:
Penentuan simplisia yang akan digunakan, yaitu simplisia temu giring (Curcuma heyneana val)
Pembelian rimpang segar temu giring (Curcuma heyneana val) di Pasar Mester, Jatinegara
Pembuatan simplisia secara sederhana
Identifikasi kandungan senyawa aktif pada simplisia
Pemekatan Ekstrak dengan Vacum Rotary Evaporator
Fraksinansi dengan corong pisah dan kromatografi kolom
Ekstraksi simplisia temu giring (Curcuma heyneana val) dengan metode maserasi
Pemisahan komponen-komponen yang ada dalam
ekstrak dengan kromatografi lapis tipis.
Hasil identifikasi
3.3 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Fiokimia Fakultas Farmasi dan Sains
Uhamka pada bulan September – Desember 2012.
3.4 Alat dan Bahan Penelitian
I. Isolasi simplisia
A. Alat:
1. Pisau/cutter
2. Tabung reaksi
3. Pipet
4. Kertas perkamen,
spatel
5. Kertas saring
6. Corong
7. Waterbath
8. Timbangan
B. Bahan:
1. Rimpang temu
Giring (Curcuma
heyneana val.)
2. Aquadest
3. CHCl3
4. Metanol
5. Etanol
6. Amoniak
7. H2SO4 2N dan
H2SO4 P
8. HCl dan HCl P
9. FeCl3
10. Logam Mg
11. Pereaksi Mayer
12. Pereaksi
Bouchardat
13. Pasir
II. Ekstraksi dan pemekatan
A. Alat:
1. Toples
2. Botol cokelat
3. Pipet
4. Batang pengaduk
5. Corong
6. Gelas ukur
7. Vacum Rotary
Evaporator
B. Bahan:
1. Rimpang segar
Temu Giring
(Curcuma
heyneana val.)
2. Metanol
3. Es batu
III. Fraksinasi
A. Alat:
1. Corong pisah
2. Kolom
kromatografi
3. Gelas ukur
4. Beaker glass
5. Erlenmeyer
6. Batang pengaduk
7. Kapas
8. Pipet
9. Botol vial
B. Bahan:
1. Ekstrak Temu
Giring (Curcuma
heyneana val.)
2. Metanol
3. Pelarut n-heksan
4. Pelarut etil asetat
5. NH4OH
6. Eluen (n-
heksan:etil asetat
= 1:1)
7. Adsorben silika
gel GF 60
8. H2SO4
9. CHCl3
IV. Kromatografi
A. Alat:
1. Chamber
2. Lempeng
aluminium
3. Pipa kapiler
4. Kertas saring
5. Lampu UV
6. Penggaris
B. Bahan:
1. Fraksi-fraksi hasil
kromatografi
kolom
2. Eluen ( n-butanol:
asam asetat : air =
4:1:5)
3. Silika gel F 254
3.5 Prosedur Kerja Penelitian
I. Isolasi Simplisia
Prosedur Kerja:
A. Pengumpulan simplisia
1. Pengumpulan simplisia Temu Giring (Curcuma heyneana val.)
2. Sortasi simplisia
3. Perajangan
4. Pengeringan.
B. Uji pendahuluan
1. Pemeriksaan alkaloid dengan cara Calvenor dan Fitzgerald
1 gram sampel segar dipotong halus, digerus dengan pasir
secukupnya dan 1 ml CHCl3
Tambahkan 1 ml amoniak, saring ke dalam tabung reaksi
Tambahkan 5 tetes H2SO4 2N, kocok selama 1 menit. Diamkan
Ambil lapisan asam dibagi dua :
1) Lapisan asam pertama ditambahkan pereaksi Mayer 2 tetes,
maka timbul endapan putih
2) Lapisan asam kedua tambahkan pereaksi Bouchardat 2 tetes,
maka timbul endapan putih.
2. Pemeriksaan flavonoid
2 gram sampel ditambahkan 2 ml methanol, kemudian
dipanaskan lalu disaring dalam keadaan panas dan pekatkan di
waterbath
Tambahkan HCl (pekat) dan logam Mg, hasil positif berwarna
merah.
3. Pemeriksaan terpen/steroid, fenol, dan saponin
2 gram sampel ditambahkan 2 ml etanol kemudian dipanaskan
selama 25 menit
Saring dalam keadaan panas, kemudian filtrat diuapkan di
waterbath sampai kering. Tambahkan 2 ml CHCl3
Bagian yang tidak larut dalam kloroform tambahkan 1 ml
aquadest
Ambil 2 ml lapisan air:
1) lapisan air dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kocok, jika
terbentuk busa mantap dan tidak hilang selama 3 menit positif
saponin
2) lapisan air ditambahkan 2 ml HCl dan 1-2 tetes FeCl3 jika
terbentuk warna merah positif fenol
Ambil lapisan kloroform, tambahkan pereaksi Bouchardat dan
2-3 tetes H2SO4 pekat maka akan terbentuk warna hijau sampai
biru untuk terpen dna warna merah untuk steroid.
4. Pemeriksaan tanin
2 gram sampel ditambahkan 10 ml aquadest, dipanaskan di
waterbath
Saring dalam keadaan dingin, tambahkan FeCl3 akan terbentuk
warna biru tua positif tanin.
II. Ekstraksi
Prosedur Kerja Ekstraksi dengan Metode Maserasi:
1. Masukkan 62,16 gram rimpang segar Temu Giring (Curcuma
heyneana val.) ke dalam toples sebagai bejana maserasi, kemudian
rendam dengan pelarut metanol sebanyak 200 ml
2. Tutup toples dengan kertas pembungkus berwarna gelap
3. Didiamkan selama 3 hari sambil sesekali diaduk
4. Setelah 3 hari, pisahkan antara sari dengan ampasnya
5. Sari/ekstrak dihitung volumenya kemudian ditampung dalam botol
cokelat, ditutup rapat kemudian disimpan didalam lemari es.
Prosedur Kerja pemekatan dengan Vacum Rotary Evaporator:
1. Masukkan maserat ke dalam labu
2. Masukkan aqua ke dalam waterbath secukupnya, atur suhu aqua di
waterbath di atas titik didih pelarut
3. Nyalakan speaker evaporator dengan menekan tombol ON pada stop
kontak
4. Tekan tombol pengatur untuk memutar labu
5. Tunggu sampai proses berakhir dan cairan penyari sampai habis,
usahakan tidak terlalu pekat agar memudahkan dalam proses
pengambilan ekstrak kental dalam labu
III. Fraksinasi
Prosedur Kerja :
A. Corong pisah
1. Cara kerja seperti pada bagan :
2. Semua proses dilakukan dalam corong pisah
3. Setelah didapat beberapa fraksi, fraksi-fraksi tersebut disimpan
dalam botol vial
4. Simpan di lemari es.
B. Kromatografi Kolom
1. Siapkan kolom kromatografi, lalu bagian bawah kolom
dimampatkan dengan kapas secukupnya
2. Masukkan adsorben ke dalam kolom dengan cara kering yaitu
dengan memasukkan silika gel GF 60 sedikit demi sedikit ke dalam
kolom sampai padat
3. Masukkan pelarut/eluen n-heksan:etil asetat (1:1) sebanyak 9 ml ke
dalam kolom perlahan-lahan jangan sampai terbentuk rongga
4. Kemudian masukkan ekstrak ke dalam kolom, akan terjadi elusi
hingga senyawa terpisahkan dan terbentuk pita-pita senyawa yang
berwarna
5. Pita senyawa dikeluarkan dari kolom kemudian tampung ke dalam
vial masing-masing sebanyak 3 ml
6. Simpan di lemari es.
IV. Kromatografi
Prosedur Kerja :
1. Fraksi-fraksi yang ada msaing-masing di ambil dengan pipa kapiler
2. Totolkan pada plat silica gel lalu diamkan hingga mongering
3. Kemudian masukkan ke dalam bejana atau chamber yang sudah jenuh
dengan eluen sampai silica gel sedikit terendam, tutup chamber
4. Biarkan sampai eluen merambat naik hingga garis akhir
5. Setelah itu angkat dan di biarkan mongering
6. Lakukan pendeteksian yaitu dengan di sinari oleh lampu UV untuk
melihat bercak yang timbul dan setiap bercak yang timbul atau
terdeteksi di lingkari
7. Amati warna yang ditimbulkan
8. Hitung harga Rf dengan rumus
Rf =
Lampiran 1
Bagan ekstraksi dengan corong pisah
Lapisan BawahMasukkan ke dalam Erlenmeyer untuk
cek pH.(lapisan air-asam)
Basakan sampai pH=10 (±1-2 ml) dengan NH4OH. Tambahkan n-heksan (15 ml) dan methanol (5 ml). perbandingan 3:1. Kocok selama 15 menit.
Lapisan Bawah(lapisan air-asam)
Ekstrak Polar
Maserat 20 ml dalam corong pisah
Asamkan dengan H2SO4 5 tetes.Tambahkan n-heksan 5 ml dan etil asetat 5 ml.Kocok selama 15 menit.
Lapisan Atas(Ekstrak n-heksan) lapisan hijau tua/gelap
Terpenoid/Fenol(Non polar)
Masukkan ke dalam vial.Fraksi I
Masukkan ke dalam vialFraksi III
Lapisan Atas(ekstrak n-heksan-metanol)
Ekstrak Basa(alkaloid/semipolar)
Masukkan ke dalam vialFraksi II
Uapkan, dengan diangin-anginkan