Bab III

Metodologi Penelitian

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental, yaitu dengan

melakukan praktikum mulai dari penentuan simplisia yang akan digunakan hingga

identifikasi komponen dalam ekstrak.

3.2 Alur Penelitian

Penelitian dilakukan seperti yang terlihat pada bagan berikut:

Penentuan simplisia yang akan digunakan, yaitu simplisia temu giring (Curcuma heyneana val)

Pembelian rimpang segar temu giring (Curcuma heyneana val) di Pasar Mester, Jatinegara

Pembuatan simplisia secara sederhana

Identifikasi kandungan senyawa aktif pada simplisia

Pemekatan Ekstrak dengan Vacum Rotary Evaporator

Fraksinansi dengan corong pisah dan kromatografi kolom

Ekstraksi simplisia temu giring (Curcuma heyneana val) dengan metode maserasi

Pemisahan komponen-komponen yang ada dalam

ekstrak dengan kromatografi lapis tipis.

Hasil identifikasi

3.3 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Fiokimia Fakultas Farmasi dan Sains

Uhamka pada bulan September – Desember 2012.

3.4 Alat dan Bahan Penelitian

I. Isolasi simplisia

A. Alat:

1. Pisau/cutter

2. Tabung reaksi

3. Pipet

4. Kertas perkamen,

spatel

5. Kertas saring

6. Corong

7. Waterbath

8. Timbangan

B. Bahan:

1. Rimpang temu

Giring (Curcuma

heyneana val.)

2. Aquadest

3. CHCl3

4. Metanol

5. Etanol

6. Amoniak

7. H2SO4 2N dan

H2SO4 P

8. HCl dan HCl P

9. FeCl3

10. Logam Mg

11. Pereaksi Mayer

12. Pereaksi

Bouchardat

13. Pasir

II. Ekstraksi dan pemekatan

A. Alat:

1. Toples

2. Botol cokelat

3. Pipet

4. Batang pengaduk

5. Corong

6. Gelas ukur

7. Vacum Rotary

Evaporator

B. Bahan:

1. Rimpang segar

Temu Giring

(Curcuma

heyneana val.)

2. Metanol

3. Es batu

III. Fraksinasi

A. Alat:

1. Corong pisah

2. Kolom

kromatografi

3. Gelas ukur

4. Beaker glass

5. Erlenmeyer

6. Batang pengaduk

7. Kapas

8. Pipet

9. Botol vial

B. Bahan:

1. Ekstrak Temu

Giring (Curcuma

heyneana val.)

2. Metanol

3. Pelarut n-heksan

4. Pelarut etil asetat

5. NH4OH

6. Eluen (n-

heksan:etil asetat

= 1:1)

7. Adsorben silika

gel GF 60

8. H2SO4

9. CHCl3

IV. Kromatografi

A. Alat:

1. Chamber

2. Lempeng

aluminium

3. Pipa kapiler

4. Kertas saring

5. Lampu UV

6. Penggaris

B. Bahan:

1. Fraksi-fraksi hasil

kromatografi

kolom

2. Eluen ( n-butanol:

asam asetat : air =

4:1:5)

3. Silika gel F 254

3.5 Prosedur Kerja Penelitian

I. Isolasi Simplisia

Prosedur Kerja:

A. Pengumpulan simplisia

1. Pengumpulan simplisia Temu Giring (Curcuma heyneana val.)

2. Sortasi simplisia

3. Perajangan

4. Pengeringan.

B. Uji pendahuluan

1. Pemeriksaan alkaloid dengan cara Calvenor dan Fitzgerald

1 gram sampel segar dipotong halus, digerus dengan pasir

secukupnya dan 1 ml CHCl3

Tambahkan 1 ml amoniak, saring ke dalam tabung reaksi

Tambahkan 5 tetes H2SO4 2N, kocok selama 1 menit. Diamkan

Ambil lapisan asam dibagi dua :

1) Lapisan asam pertama ditambahkan pereaksi Mayer 2 tetes,

maka timbul endapan putih

2) Lapisan asam kedua tambahkan pereaksi Bouchardat 2 tetes,

maka timbul endapan putih.

2. Pemeriksaan flavonoid

2 gram sampel ditambahkan 2 ml methanol, kemudian

dipanaskan lalu disaring dalam keadaan panas dan pekatkan di

waterbath

Tambahkan HCl (pekat) dan logam Mg, hasil positif berwarna

merah.

3. Pemeriksaan terpen/steroid, fenol, dan saponin

2 gram sampel ditambahkan 2 ml etanol kemudian dipanaskan

selama 25 menit

Saring dalam keadaan panas, kemudian filtrat diuapkan di

waterbath sampai kering. Tambahkan 2 ml CHCl3

Bagian yang tidak larut dalam kloroform tambahkan 1 ml

aquadest

Ambil 2 ml lapisan air:

1) lapisan air dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kocok, jika

terbentuk busa mantap dan tidak hilang selama 3 menit positif

saponin

2) lapisan air ditambahkan 2 ml HCl dan 1-2 tetes FeCl3 jika

terbentuk warna merah positif fenol

Ambil lapisan kloroform, tambahkan pereaksi Bouchardat dan

2-3 tetes H2SO4 pekat maka akan terbentuk warna hijau sampai

biru untuk terpen dna warna merah untuk steroid.

4. Pemeriksaan tanin

2 gram sampel ditambahkan 10 ml aquadest, dipanaskan di

waterbath

Saring dalam keadaan dingin, tambahkan FeCl3 akan terbentuk

warna biru tua positif tanin.

II. Ekstraksi

Prosedur Kerja Ekstraksi dengan Metode Maserasi:

1. Masukkan 62,16 gram rimpang segar Temu Giring (Curcuma

heyneana val.) ke dalam toples sebagai bejana maserasi, kemudian

rendam dengan pelarut metanol sebanyak 200 ml

2. Tutup toples dengan kertas pembungkus berwarna gelap

3. Didiamkan selama 3 hari sambil sesekali diaduk

4. Setelah 3 hari, pisahkan antara sari dengan ampasnya

5. Sari/ekstrak dihitung volumenya kemudian ditampung dalam botol

cokelat, ditutup rapat kemudian disimpan didalam lemari es.

Prosedur Kerja pemekatan dengan Vacum Rotary Evaporator:

1. Masukkan maserat ke dalam labu

2. Masukkan aqua ke dalam waterbath secukupnya, atur suhu aqua di

waterbath di atas titik didih pelarut

3. Nyalakan speaker evaporator dengan menekan tombol ON pada stop

kontak

4. Tekan tombol pengatur untuk memutar labu

5. Tunggu sampai proses berakhir dan cairan penyari sampai habis,

usahakan tidak terlalu pekat agar memudahkan dalam proses

pengambilan ekstrak kental dalam labu

III. Fraksinasi

Prosedur Kerja :

A. Corong pisah

1. Cara kerja seperti pada bagan :

2. Semua proses dilakukan dalam corong pisah

3. Setelah didapat beberapa fraksi, fraksi-fraksi tersebut disimpan

dalam botol vial

4. Simpan di lemari es.

B. Kromatografi Kolom

1. Siapkan kolom kromatografi, lalu bagian bawah kolom

dimampatkan dengan kapas secukupnya

2. Masukkan adsorben ke dalam kolom dengan cara kering yaitu

dengan memasukkan silika gel GF 60 sedikit demi sedikit ke dalam

kolom sampai padat

3. Masukkan pelarut/eluen n-heksan:etil asetat (1:1) sebanyak 9 ml ke

dalam kolom perlahan-lahan jangan sampai terbentuk rongga

4. Kemudian masukkan ekstrak ke dalam kolom, akan terjadi elusi

hingga senyawa terpisahkan dan terbentuk pita-pita senyawa yang

berwarna

5. Pita senyawa dikeluarkan dari kolom kemudian tampung ke dalam

vial masing-masing sebanyak 3 ml

6. Simpan di lemari es.

IV. Kromatografi

Prosedur Kerja :

1. Fraksi-fraksi yang ada msaing-masing di ambil dengan pipa kapiler

2. Totolkan pada plat silica gel lalu diamkan hingga mongering

3. Kemudian masukkan ke dalam bejana atau chamber yang sudah jenuh

dengan eluen sampai silica gel sedikit terendam, tutup chamber

4. Biarkan sampai eluen merambat naik hingga garis akhir

5. Setelah itu angkat dan di biarkan mongering

6. Lakukan pendeteksian yaitu dengan di sinari oleh lampu UV untuk

melihat bercak yang timbul dan setiap bercak yang timbul atau

terdeteksi di lingkari

7. Amati warna yang ditimbulkan

8. Hitung harga Rf dengan rumus

Rf =

Lampiran 1

Bagan ekstraksi dengan corong pisah

Lapisan BawahMasukkan ke dalam Erlenmeyer untuk

cek pH.(lapisan air-asam)

Basakan sampai pH=10 (±1-2 ml) dengan NH4OH. Tambahkan n-heksan (15 ml) dan methanol (5 ml). perbandingan 3:1. Kocok selama 15 menit.

Lapisan Bawah(lapisan air-asam)

Ekstrak Polar

Maserat 20 ml dalam corong pisah

Asamkan dengan H2SO4 5 tetes.Tambahkan n-heksan 5 ml dan etil asetat 5 ml.Kocok selama 15 menit.

Lapisan Atas(Ekstrak n-heksan) lapisan hijau tua/gelap

Terpenoid/Fenol(Non polar)

Masukkan ke dalam vial.Fraksi I

Masukkan ke dalam vialFraksi III

Lapisan Atas(ekstrak n-heksan-metanol)

Ekstrak Basa(alkaloid/semipolar)

Masukkan ke dalam vialFraksi II

Uapkan, dengan diangin-anginkan