Visualisasi DNA

9
TEKNIK PENGGUNAAN MARKA RAPD DENGAN PCR ZULQOYAH LAYLA Balai Penelitian Ternak,Po . Box 221 Bogor 16002 RINGKASAN Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001 PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantai adalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan proses pemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemen dari utas DNA secara simultan . Untuk mengatahui hasil amplifikasi, perlu dilakukan migrasi produk PCR di dalam gel (elektro-foresis) dan diamati dengan UVtransiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanya perbedaan sifat diantara sampel yang diuji berdasarkan pada ukuran DNA yang terseparasi . Salah satu kegunaan proses PCR adalah untuk kajian keragaman molekuler seperti RAPD . Teknik RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) sederhana dalam pengerjaannya, memerlukan sedikit sampel, dan paling cepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal terutama pada enzym Taq polimerase . Dari masing-masing 5 sampel darah domba bangsa Garut, Sumatera, StCroix, Merino, dan Ekor Gemuk, telah berhasil diisolasi sebanyak 25 nomor DNA dengan kemumian berkisar antara 1,440-2,330, serta memiliki konsentrasi antara 87,5ng/ul - 1912,5 ng/ul . Dari hasil separasi produk PCR dengan primer OPH-03, muncul pita-pita dengan jumlah berfariasi antara 2-4 . Hal ini menunjukkan bahwa bangsa domba yang diperiksa memiliki sifat polimorfis . PENDAHULi1AN PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantai adalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan proses pemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemen dari utas DNA secara simultan . Proses pemanjangan nukleotida merupakan proses polimerase yang dilakukan oleh DNA karena adanya "primer" yang berkomplemen dengan DNA utas tunggal .(SUHARSONO, 2000) . Pengulangan dari siklus berdasarkan pada perubahan suhu yang terdiri dari tahap "denaturasi", "annealing " dan "extension" . Tahap "denaturasi" merupakan tahap awal dimana pada tahap ini DNA yang merupakan rantai utas panda akan terlepas sehingga membentuk rantai utas tunggal . Tahap "annealing" merupakan tahap dimana terjadi perlekatan primer pada ikatan DNA Was tunggal_ Primer yang memiliki sekuens basa tertentu akan mengenali sekuens basa DNA utas tunggal . Tahap selanjutnya adalah tahap "extension" atau pemanjangan , dimana pada tahap ini terjadi pemanjangan primer dengan 147

description

Jurnal yang mngandunng koten mengenai visualisasi DNA

Transcript of Visualisasi DNA

Page 1: Visualisasi DNA

TEKNIK PENGGUNAAN MARKARAPD DENGANPCR

ZULQOYAH LAYLA

Balai Penelitian Ternak,Po . Box 221 Bogor 16002

RINGKASAN

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantaiadalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan prosespemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemendari utas DNA secara simultan . Untuk mengatahui hasil amplifikasi, perludilakukan migrasi produk PCR di dalam gel (elektro-foresis) dan diamatidengan UVtransiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanyaperbedaan sifat diantara sampel yang diuji berdasarkan pada ukuran DNA yangterseparasi . Salah satu kegunaan proses PCR adalah untuk kajian keragamanmolekuler seperti RAPD. Teknik RAPD (Random Amplified PolimorphicDNA) sederhana dalam pengerjaannya, memerlukan sedikit sampel, dan palingcepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal terutama pada enzymTaq polimerase . Dari masing-masing 5 sampel darah domba bangsa Garut,Sumatera, StCroix, Merino, dan Ekor Gemuk, telah berhasil diisolasi sebanyak25 nomor DNA dengan kemumian berkisar antara 1,440-2,330, serta memilikikonsentrasi antara 87,5ng/ul - 1912,5 ng/ul . Dari hasil separasi produk PCRdengan primer OPH-03, muncul pita-pita dengan jumlah berfariasi antara 2-4 .Hal ini menunjukkan bahwa bangsa domba yang diperiksa memiliki sifatpolimorfis .

PENDAHULi1AN

PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantaiadalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan prosespemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemendari utas DNA secara simultan . Proses pemanjangan nukleotida merupakanproses polimerase yang dilakukan oleh DNA karena adanya "primer" yangberkomplemen dengan DNA utas tunggal.(SUHARSONO, 2000) .

Pengulangan dari siklus berdasarkan pada perubahan suhu yang terdiridari tahap "denaturasi", "annealing " dan "extension" . Tahap "denaturasi"merupakan tahap awal dimana pada tahap ini DNA yang merupakan rantai utaspanda akan terlepas sehingga membentuk rantai utas tunggal . Tahap"annealing" merupakan tahap dimana terjadi perlekatan primer pada ikatanDNA Was tunggal_ Primer yang memiliki sekuens basa tertentu akan mengenalisekuens basa DNA utas tunggal . Tahap selanjutnya adalah tahap "extension"atau pemanjangan , dimana pada tahap ini terjadi pemanjangan primer dengan

147

Page 2: Visualisasi DNA

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/

bantuan enzym Taq DNA polimerase . Hasil produk ini berfungsi sebagaitemplate (cetakan) pada siklus berikutnya . PCR sangat sensitive, dapatmengamplifikasi sampai lebih dari sejuta kali, sehingga dapat menghasilkanDNA dalam jumlah yang sangat besar . Karena dapat mengamplifikasi demikianbanyak, maka DNA cetakan (template) dibutuhkan dalam jumlah yangsedikit.(SUHARSONO, 2000) .

Untuk mengetahui hasil amplifikasi maka perlu dilakukan migrasiproduk PCR di dalam gel (elektroforesis) dan diamati dengan UVtransiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanya perbedaan sifatdiantara sampel yang diuji , berdasarkan pada ukuran DNA yang terseparasi .

Proses PCR dapat dipergunakan untuk berbagai keperluan diantaranyauntuk identifikasi suatu gen atau DNA yang spesifik ; untuk identifikasi adanyasuatu patogen penyebab suatu penyakit, seperti HepatitisB, TBC, AIDS, ataukelainan lainnya ;perbanyakan gen untuk berbagai keperluan ; untuk kajiankeragaman molekuler seperti RAPD(Random Amplified Polimorphic DNA) ;untuk pengurutan DNA, dll .

RAPD merupakan salah satu teknik yang paling luas dipergunakankarena kesederhanaannya . . Primer yang digunakan adalah primeroligonukleotida dimana urutan basanya dibuat secara random (acak) . DalamRAPD diperlukan sedikit sampel DNA untuk analisa . Teknik ini merupakanteknik yang paling cepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal,tenitama untuk enzym Taq DNA polimerase .(WILLIAM at al, 1990) .

Tujuan penulisan ini adalah untuk mengemukakan salah satu metodeisolasi DNA, pelaksanaan metode marka RAPD yang digunakan dilaboratorium Genetika Balitnak Bogor terhadap sampel darah domba .

Alat dan bahan yang digunakan

Mikropipet, tips, tabung eppendorf 1500 ul, tabung eppendorf 200 ul,mikrosentrifus, spektrofotometer double beam UV150-02 Shimadzu, tangkielektroforesis, cetakan gel + sisir mesin PCR MJ Research, kamera Polaroid .,UV transiluminator, sarung tangan latex .

Larutan yang digunakan

BAHAN DAN METODA

Penyangga TE, penyangga TBE, NP-40, SDS, alkohol 70 %, alkoholabsolut, NaOAc 3M, Proteinase-K , buffer PCR(Promega), dATP(Promega),dCTI'(Promega), dGTP(Promega), dTTP(Promega), MgCl z(Promega), DNATaq polimerase(Promega), primer OPH-03(Operon), dd HZO. Penanda ukuranmolekuler 1 Kb dan 100 bp .

Page 3: Visualisasi DNA

Metode

Isolasi DNA

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 100/

DNA cetakan diisolasi dari darah domba berdasarkan metodeSAMBROOK at al, (1989) yang telah dimodifikasi . Sebanyak 5 ekor darimasing masing domba bangsa Ekor gemuk, Merino, Garut, StCroix danSumatra diambil darahnya secara aseptis melalui vena jugularis . Pengambilandarah sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung vacutainer yang telah berisianti koagulant EDTA. Sebanyak 350 ul plasma darah dimasukkan ke dalamtabung eppendorf 1500ul, ditambah sebanyak 70 ul larutan NP40, 350 ullarutan SDS dan 10 ul Proteinase K . Tabung divortex, kemudian diinkubasipada suhu 50°C semalam . Keesokan harinya ditambah 350ul larutan fenol,disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit . Fase atas diambil untukdipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru, ditambah 1/10 bagian larutanNaOAc 3M dan 2 bagian larutan alkohol absolut dingin . Tabung digoyangperlahan ( dasar tabung di jentik jentik ) hingga terbentuk endapan putih(DNA). Tabung disimpan pada suhu --20°C semalam . Keesokan harinyatabung disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit . Cairanyang ada di dalam tabung di buang dengan hati hati hingga yang tersisaberupa endapan (DNA) berwarna putih . Ke dalam tabung yang berisi DNAtersebut ditambahkan sebanyak 1 ml larutan alkohol 70 %, campur perlahan,sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit . Cairan alkoholdibuang, tabung diinkubasi pada suhu 50°C selama 1 jam , atau dikeringanginkan hingga terbentuk pelet DNA didasar tabung . Ke dalam tabung yangberisi pelet DNA diisikan sebanyak 200 ul larutan TE untuk melarutkankembali DNA, diinkubasi pada suhu 65°C sampai DNA larut . Ke dalam DNAditambahkan 5 ul larutan RNAse, diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C,kemudian direbus selama 5 menit untuk menghentikan reaksi . DNA yangdihasilkan selanjutnya diukur kualitas dan kuantitasnya .

Kuantitas DNA dapat dilihat dengan UVspektrofotometer padapanjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Adapun prosedurnya yaitumemasukkan sebanyak 5 ul DNA ke dalam tabung cuvet ditambah 2495 ul TEsebagai pengencer, dilihat (dibaca) nilai optikal densitinya padaUVspektrofotometer dengan panjang gelombang 260nm dan 280 nm. Sebagailarutan standar dipakai larutan penyangga TE. Dari hasil pengecekkan tersebutdidapat data kemurnian DNA yang dapat dihitung dengan melihatperbandingan bacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 260nm dan 280 nm . Selanjutnya dari hasil pengukuran tersebut dapat ditentukanjumlah DNA sampel yang diperoleh dengan rumus : Jumlah DNA = [ 260 x2500/5 x 50 ]/1000 . Informasi kuantitas ini dapat digunakan untuk menentukanperhitungan dalam pengenceran DNA agar dapat diketahui secara tepatkonsentrasi DNA diinginkan .

Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis . DNA basilisolasi diambil sebanyak 3 ul dan dicampur dengan larutan blue juice(pemberat/penanda migrasi), lalu diisikan ke dalam sumuran gel yang

149

Page 4: Visualisasi DNA

mengandung 1 % agarose . Pada sumuran lain, diisi penanda DNA berukuran1Kb . Gel dielektroforesis dengan tegangan 90 volt selama 1,5 jam, kemudiandirendam dalam larutan Ethidium Bromida selama 10 menit, dibilas denganmerendam gel di dalam air suling, diamati dengan bantuan UV transiluminator,bila perlu selanjutnya difoto dengan kamera Polaroid .

Metode RAPD dengan PCR

1 . Sampel DNA yang akan diuji

masing-masing diencerkan dengankonsentrasi 5 ng/ul .dalam larutan penyangga TE. Untuk setiap bangsadibuat larutan gabungan (bulk) 10 ul DNA 5ng/ul setiap individu dijadikansatu .

2 . Membuat larutan campuran(cocktail) untuk tiap sampel bulk DNA kedalam tabung eppendorf isi 200 ul dengan komposisi :

150

Buffer PCR [ Promega]

2,5 uldATP [Gibco]

0,5 uldCTP

[ Gibco]

0,5 uldGTP

[ Gibco]

0,5 uldTTP

[ Gibco]

0,5

ulMgC12 [ Promega]

1,5 ulPrimer [Operon] H-03

1,25 ulTaq DNA Polimerase [Promega]

1,2 ulddHZ0

7,5 ulTemplat DNA 5ng/ul

10 ulTotal volume

25

ul

"Cocktail "yang sudah dibuat, kemudian disentrifugasi dengankecepatan 6000 rpm agar bahan- bahan dalam "cocktail" dapat tercampursempurna . Untuk menghindari terjadinya penguapan pada saat prosesamplifikasi berlangsung, diatas permukaan larutan "cocktail "dilapisi minyakmineral sebanyak 25 ul .

"Cocktail" dibuat dengan tujuan untuk memudahkan cara kerja . BufferPCR berfungsi sebagai larutan penyangga pada proses amplifikasi . SedangkandATP dCTP dGTP, dTTP, digunakan untuk pemanjangan primer dalammembentuk utas DNA baru . Primer yang digunakan adalah OPH-03 buatanOperon yang mempunyai urutan basa 5'-AGACGTCCAC-3' . Enzim TaqDNA polimerase berfungsi untuk memanjangkan primer pada tahap"elongasi/extension (BUDIARTI.P,1993) .

Amplifikasi DNA dengan PCR

Temu Teknis Fungsionnl Non Peneliti 2001

Setelah "cocktail" selesai dibuat maka tahap selanjutnya adalahmengamplifikasi DNA sample dengan mesin PCR (MJ Research Inc ) .

Page 5: Visualisasi DNA

Mengetahui hasil amplifkasi [separasil

Hasil amplifikasi dapat dilihat dalam gel agarose yang diamati denganUVtransiluminator. Tahapannya adalah sebagai berikut :1 . Membuat larutan agarose 1,2% dalam larutan penyangga 0,5x TBE

dengan cara memanaskannya hingga larut, menuangkannya ke dalamcetakan husus dengan sisir terpasang, biarkan sampai beku. Sisirselanjutnya dilepas .

2 . Cetakan yang berisi gel beku dimasukkan ke dalam tangki elektroforesisyang sudah diisi larutan penyangga 0,5xTBE hingga terendam.

3 .

Sebanyak 3ul sampel DNA hasil amplifikasi dicampur dengan 2ul larutanpemberat , diaduk hingga homogen . Tujuan pemberian larutan pemberatadalah sebagai indikator warna dan juga sebagai pemberat sehingga ketikasampel DNA dimasukkan ke dalam sumuran gel, dapat turun kedasarsumuran . Sumuran paling kanan diisi penanda ukuran molekuler 100 bybuatan Promega dengan isi yang sama . .

4 . Proses separasi (elektroforesis) dilakukan pada tegangan 90 volt selamasekitar 2jam .

5 . Separasi dihentikan apabila sampel DNA telah bergerak hampirmendekati akliir gel .

Visualisasi fragmen DNA dalam gel

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/

Amplifikasi dilakukan sebanyak 45 siklus . Setiap siklus terdiri daritiga tahap yaitu tahap "denaturasi" dengan suhu 94°C selama 1 menit, tahap"annealing" dengan suhu 36°C selama 1 menit dan tahap "elongasi" dengansuhu 72°C selama 2 menit . Setelah siklus selesai, selanjutnya PCR akanmelakukan proses inkubasi pada suhu 72°C selama 5 menit . Waktu inkubasi inidimaksudkan untuk memastikan bahwa DNA yang diamplifikasi telahmengalami renaturasi . Setelah proses amplifikasi selesai selanjutnya tabungeppendorf disimpan pada suhu 0°C sampai saatnya untuk melakukan separasidalam gel agarose .

Setelah proses separasi selesai, selanjutnya gel direndam dalam larutanEthidium Bromida dengan konsentrasi 0,5 ul /ml selama 10 menit . Tujuanperendaman ini diharapkan Ethidium Bromida dapat menyisip pada DNA,sehingga pita- pita DNA yang terseparasi dapat terlihat dengan bantuan sinarUV dart UV transiluminator .

Selanjutnya gel direndam dalam dH,O selama 10 menit, untukmenghilangkan senyawa Ethidium Bromida yang terikat secara lion spesifikpada bagian gel yang tidak ada DNAnya . Bila tidak dilakukan perendaman,maka pita-pita DNA akan tampak pucat karena pendaran latar belakang gelyang mengikat Ethidium Bromida .

Gel dikeluarkan dart rendaman air suling dan diletakkan diataspennukaan UVtransiluminator untuk diarnati ada tidaknya pita-pita DNA, danbisa dilanjutkan pemotretan dengan menggunakan kamera Polaroid.

Page 6: Visualisasi DNA

LIsolasi DNA

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dari sebanyak masing-masing lima nomor darah yang berasal daridomba Garut, St.Croix, Merino, Sumatera, dan Ekor Gemuk, denganmenggunakan metode Sambrook yang telah disempurnakan, telah diisolasisebanyak 25 nomor DNA.

2Xualifikasi DNA

Gambar l . Isolasi DNA

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

Kualitas DNA yang dihasilkan dapat diamati pada gambar 1 .

Kemurnian DNA berdasarkan basil bagi nilai absorbensi pada panjanggelombang 260 terhadap nilai absorbensi pada panjang gelombang 280 darisampel DNA bangsa Ekor Gemuk, Sumatera, Garut, St.Croix dan Merino,berada antara 1,440-2,330 . Menurut standard yang ditetapka kemurnian DNAsebaiknya berada pada kisaran 1,8 (SAMBROO at al, 1989) . Karena untukpengerjaan RAPD sifatnya adalah random (acak), maka DNA dengan kisarantrilai 1,44-2,33 masih dapat digunakan .

KeteranganI So' 108 6 Ekor Gemuk M1 11 . Merino 1003 16 . Garut 3579 21 . St Croix 40015

2.Sumateraa=

I I I 7. Ekor Gemuk 111 12 . Merino 1023 17 . Garut 3613 22 . St Croix32257

3 . Sumtera 119 8. Ekor gemuk Sus 4 13 . Merino 1249 18 . Garut 9062 23 . St .Croix 201134 . Sumatera 120 9. Ekor Gemuk Sus2 14 . Merino1036 19 . Garut 1094 24- St . Croix 519

5 . Sumatera 128 10 Fkor Gemuk Isa 2 15 . Merino 1109 20. Garut 9105 25 . St.Croix 603

Page 7: Visualisasi DNA

3. Kuantifikasi DNA

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

Dari hasil kuantifikasi DNA dengan spektrofotometer, didapatkonsentrasi DNA seperti terdapat pada tabel 1 . Konsentrasi DNA total yangdihasilkan berkisar antara 87,5 ng/ul - 1912,5 ng/ul .

Tabel 1 .

Kuantifikasi DNA Domba pada panjang gelombang 260 nm

4. Visualisasi produk PCRHasil visualisasi yang dapat dilihat pada gambar 2, menunjukkan

bahwa pita-pita DNA terlihat jelas untuk setiap bangsa domba dengan jumlah

153

No. Spesimen X11 C7 XE 0KonsentrasiDNA ng/ul Kemumian

1 EG Ml 0,018 0,011 225 1,6402 H1 0,020 0,012 250 1,6703 Sus4 0,034 0,019 430 1,8004 SUS2 0,036 0,019 450 1,8905 ISA2 0,013 0,007 163 1,8606 Mer 1003 0,013 0,006 162,5 2,1707 1023 0,040 0,022 500 1,8208 1249 0,008 0,004 100 2,0009 1036 0,007 0,003 87,5 2,33010 1109 0,014 0,006 175 2,33011 Smt 108 0,040 0,025 500 1,60012 120 0,062 0,0036 775 1,72013 119 0,113 0,063 1912,5 1,80014 111 0,026 0,018 325 1,44015 128 0,067 0,038 837,5 1,76016 Grt 3579 0,031 0,017 387,5 1,82017 3613 0,013 0,007 162,5 1,86018 9062 0,043 0,025 537,5 1,72019 1094 0,020 0,012 250 1,67020 9105 0,016 0,008 200 2,00021 StCr40015 0,047 0,029 587,5 1,62022 32257 0,036 0,022 450 1,64023 20113 0,015 0,008 187,5 1,88024 519 0,053 0,027 662,5 1,96025 603 0,055 0,029 687,5 1,900

Page 8: Visualisasi DNA

pita yang muncul berkisar antara 2-4 pita . Jumlah pita yang muncul bervariasi,yaitu 4 dari domba bangsa StCroix, Sumatera, dan Garut dan 2 buah padadomba bangsa Merino dan Ekor Gemuk.

Dengan terbentuknya pita DNA dengan primer OPH-03, maka primerini dapat digunakan untuk analisis keragaman bangsa-bangsa domba. Pada hasilvisualisasi menunjukkan sifat polimorfis, artinya antar bangsa memiliki ukuranDNA yang berbeda berdasarkan ukuran pasangan basa . Hal ini menunjukkanadanya perbedaan sifat diantara bangsa domba yang diamati yang dapat dilihatdari ukuran DNA yang terseparasi . Sifat polimorfis inilah yang diharapkanmuncul dari analisa RAPD ini .

Tabel 2. .

Larutan untuk proses persiapan sampel

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

Nama larutan Komposisi Pelarut/volume akhir1 M TrisCl . pH 8,5 6,06 gr(40 ml air bebas ion + air bebas ion/50 ml

1ml HCI pekat)1 M TrisCl . pH 7,5 6,06 gr(40 ml air bebas ion + air bebas ion/50 ml

2ml HCI pekat5M Nacl 14,61 gr Nacl air bebas ion/50 mlTBE buffer 5x tris base 54 gr air bebas ion/1000 ml

boric acid 27,5 gr0,5 M EDTA pH 8,0 20 ml

TE buffer 1MTris Hcl pH 8,0 10 ml air bebas ion/1000 ml0,5 M EDTA pH 8,2 ml

NaOAc 3M 62,52 gr NaOAc anhydrous air bebas ion/150 ml102,02 gr NaOAc 3H20pH 5,2 (acetat glasial)

Penyangga NP-40 5M Nacl 2,80 ml air bebas ion/100 ml1M MgC12 0,15 mllM Tris Hcl pH 8,5 10 ml

SDS 10% SDS 6ml air bebas ion/50 ml0,5M EDTA 1,2m15M Nacl 1,2 ml

Blue juice 0,125 gr blue juice + air bebas ion/50 ml20 gr sucrose

70 %alkohol 70 ml alkohol absolut air bebas ion/100 mlProteinase K 1M TrisCI pH 7,5 50u1 air bebas ion/ 10 ml

Proteinase K 100mg(18 unit/mg)glyserol 100% 5 ml

Page 9: Visualisasi DNA

KESIMPi1LAN

DAFTAR BACAAN

Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001

Ekor GemulGarutMerino

Surnatera

St. Croix

100 by

Gambar 2 . Hasil separasi amplifikasi dengan primer 01H-03

Dari hasil amplifikasi DNA yang dihasilkan dengan teknik RAPDmenggunakan mesin PCR memperlihatkar_ bahwa munculnya pita-pita denganjutnlah yang bervariasi yaitu antara 2-4 . Ini menunjukkan bahwa primer OPH03 dapat mengenali DNA domba, sehingga primer ini dapat melakukanpembentukan komplemen sekuen DNA. Perbedaan ukuran pasangan basa antarbangsa domba yang terlihat pada gambar, menunjukkan sifat polimorfis daribangsa domba yang diperiksa .

BUDIARTI S . 1993 . Tehnik PCR dan aplikasinya, Kursus Singkat BiologiMolekuler PAU. Bioteknologi IPB .

SAMBROOK J.E.F, FRITISCH AND T.MANIATIS . 1989 . Molecular Cloning . ALaboratory manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press .Analysis and Cloning of Eukaryotic Genomic DNA,9.19 .

SUHARSONO S . 2000 . Prinsip Amplifikasi DNA dengan PCR . PelatihanPeningkatan Pengetahuan dan Ketrampilan Teknisi Tentang TeknikLaboratonum Biologi Molekuler.PAU . IPB .

WILLIAM J.G.K, A.R.KUBELIC, K.J . LIVAK J .A . RAFALSKI AND S.V . TINGEY,1990 . DNA Polymorphis Amplified by Arbitary Primer are usefull asGenetic Marker, Nucleic Acid-Res . 18 :6531-6535 .