MAKALAH FARMAKOLOGI MOLEKULERRESEPTOR DARI DNA REKOMBINAN

OLEH :KELOMPOK 4 1. MUH. ADHA

(F1F1110 )

2. YULI ANGGREANI LENA

(F1F112009)3. RIFANDI AZIS TEBA

(F1F112018)

4. CHICHI FAUZIYAH

(F1F112028)5. ST. RAODAH NURULJANNAH(F1F112041)

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2015KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat kesehatan dan kesempatan yang dilimpahkan-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini dengan baik. Doa keselamatan kami panjatkan pula pada pembawa risalah kebenaran, nabi Muhammad SAW beserta segenap keluarga, sahabat dan seluruh manusia yang mengikuti ajarannya sampai akhir zaman.

Ucapan terima kasih diberikan kepada semua pihak yang telah mendukung penyusunan makalah ini. Semoga makalah ini, dapat memberikan manfaat dan sumbangan yang berarti bagi dunia pendidikan.

Penyusun menyadari bahwa dalam penyusunan makalah ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, sangat diharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca agar dapat menyempurnakan makalah ini.

Kendari, 7 Juni 2015

Penyusun

DAFTAR ISI2KATA PENGANTAR

3DAFTAR ISI

BAB I 4PENDAHULUAN

4A.LATAR BELAKANG

4B.RUMUSAN MASALAH

5C.TUJUAN

BAB II 6PEMBAHASAN

6A.SISTEM REKOMBINAN

9B.KLONING GEN RESEPTOR UNTUK MANUSIA

21C.EKSPRESI KLONING RESEPTOR

24D.DNA TC PROTEIN ATAU KODE GENETIKA

30E.POLIMERASI CHAIN REACTION (PCR)

BAB IV 44PENUTUP

44A.KESIMPULAN

44B.SARAN

45DAFTAR PUSTAKA

BAB IPENDAHULUANA. LATAR BELAKANG

Penggunaan biologi molekuler salah satunya digunakan untuk penciptaan sistem reseptor manusia. Dalam beberapa tahun mendatang, kurangnya akses terhadap reseptor manusia telah mengharuskan penggunaan sistem reseptor hewan dalam farmakologi dan penemuan obat. Dengan munculnya tehnik memungkinkan pengenalan materi genetik manusia pengkodean untuk reseptor dalam baris sel pengganti telah datang era baru dalam farmakologi. Materi genetik diperkenalkan, melalui operator (vektor), ke dalam sel bakteri, di mana bahan yang dipisahkan menjadi koloni murni (klon) dan ulangan. Produk genetik yang dihasilkan kemudian tranfeksi ke sel pengganti untuk membentuk sel klon mengandung reseptor manusia yang cocok untuk penelitian farmakologi. Sehingga, dibutuhkan suatu pembelajaran mengenai penciptaaan reseptor manusia dengan menggunakan DNA rekombinan. B. RUMUSAN MASALAH

Rumusan masalah pada makalah ini adalah sebagai berikut.

1. Mengapa menggunakan sistem rekombinan ?2. Apa yang dimaksud dengan kloning gen reseptor untuk manusia ?3. Apa yang dimaksud dengan ekspresi kloning dari reseptor ?4. Bagaimana kode genetik pada urutan protein DNA ? 5. Apa yang dimaksud dengan Polymerase chain reaction (PCR) ?6. Bagaimana sistem reseptor rekayasa genetika ?C. TUJUAN

Tujuan pada makalah ini adalah sebagai berikut.

1. Untuk memahami tentang penggunaan sistem rekombinan. 2. Untuk mengetahui kloning gen reseptor untuk manusia.3. Untuk mengetahui ekspresi kloning dari reseptor.4. Untu mengetahui kode genetik pada urutan protein DNA. 5. Untuk memahami tentang Polymerase chain reaction (PCR).6. Untuk memahami sistem reseptor rekayasa genetika. BAB IIPEMBAHASAN

A. SISTEM REKOMBINANKemajuan dalam bidang biologi molekuler telah dilengkapi kemampuan fisik untuk membangun sistem reseptor untuk pengujian obat-obatan serta untuk pembelajaran rinci reseptor manusia. Sebelumnya, farmakologi dibatasi untuk mempelajari sistem reseptor hewan, alasan untuk korespondensi dengan sistem manusia bahwa banyak molekul mediasi tanggapan melalui reseptor tersebut (misalnya, neurotransmitter seperti asetilkolin, hormon seperti epinefrin) adalah sama pada hewan dan pada manusia. Oleh karena itu, korespondensi diantisipasi antara situs pengakuan untuk molekul-molekul (reseptor) dalam dua spesies. Meskipun sebagian besar obat terapi yang dikenal digunakan saat ditemukan menggunakan sistem tersebut, jelas bahwa mereka adalah faksimil dari sistem target terapi. Tabel 4.1 menunjukkan berbagai sistem reseptor obat yang dapat digunakan untuk penemuan obat. Pengembangan obat baru jauh dikemukakan oleh kemampuan untuk menggunakan reseptor target manusia dalam sistem pengujian terkontrol.Dengan munculnya kloning dari bacteriorhodopsin pertama kali pada 1980-an telah muncul kemampuan untuk memperkenalkan materi genetik yang mengkode reseptor manusia ke dalam sel inang pengganti yang sesuai untuk studi dalam isolasi. Selain itu, sistem host pengganti dapat menjadi sel manusia, untuk menyediakan lingkungan yang lebih fisiologis. Namun, dalam banyak kasus, jenis sel tertentu dimana reseptor manusia berada di alam memberikan pengaruh penting pada perilaku dan reseptor ini hilang dalam sistem pengganti. Selain itu, proses patologis penting dan dalam beberapa kasus, pengaruh yang dominan pada fungsi reseptor manusia. Oleh karena itu, meskipun rekayasa genetika dapat membantu dalam memperbaiki desain sistem reseptor, masih sering berbeda dari tujuan yaitu menghasilkan reseptor manusia dalam sel manusia yang asli di bawah kontrol patologis.Pada dasarnya ada tiga alasan untuk membangun sistem reseptor dengan biologi molekuler. Yang pertama adalah akses yang jelas untuk manusia, bukan hewan, bahan reseptor. Yang kedua adalah bahwa banyaknya desain sistem fisiologis. TABEL 4.1 Kronologi Sistem Obat Reseptor yang Digunakan dalam Penemuan Obat

Kontrol pengembalian dari sistem reseptor untuk respon terhadap bahan kimia. Dengan demikian, banyak sel yang mengekspresikan campuran dari subtipe reseptor yang berbeda secara halus satu sama lain sehubungan dengan pengakuan dan terjemahan informasi farmakologis dan fisiologis. Hal ini menjadi masalah praktis bagi mereka yang ingin mempelajari interaksi obat-reseptor, karena respon yang dimediasi oleh beberapa hal, bukan tunggal, populasi reseptor. Rekayasa genetika dari sistem reseptor dapat menghilangkan ini dengan mengekspresikan populasi reseptor tunggal dalam sel pengganti yang dinyatakan tidak mengandung reseptor, sehingga memungkinkan studi tentang efek obat pada populasi reseptor tunggal.

Alasan ketiga untuk membangun sistem genetik reseptor adalah untuk mendapatkan kemampuan dalam menjawab pertanyaan tentang reseptor itu sendiri. Salah satu daerah yang jelas adalah produksi bahan reseptor untuk isolasi dan karakterisasi dengan cara biokimia (reseptor yang ditemukan dalam jumlah menit di alam). Alasan lain adalah kontrol rasio stoikiometri antara reseptor dan interaksinya yang terikat membran. Dengan biologi molekuler, komponen dari sistem heterotrimerik dapat dimanipulasi, sehingga menyediakan informasi yang belum pernah diakses. Hal ini dapat membantu menentukan sejauh mana aktivitas obat adalah karena interaksinya dengan komponen sistem dan sampai sejauh mana sifat unik molekul reseptor dan obat. Hal ini penting karena hanya fitur yang terakhir (dinyatakan sebagai afinitas reseptor terkait dan kemanjuran) dapat ditransfer antara sistem. Karena sistem yang digunakan untuk skrining obat tentu berbeda dalam terapi, kejutan lebih sedikit akan menghasilkan peningkatan pengetahuan sistem karakteristik obat.

B. KLONING GEN RESEPTOR UNTUK MANUSIAInformasi genetik disimpan dalam bentuk kode dalam heliks terstruktur asam deoksiribonukleat (DNA). Urutan tertentu dari nukleotida yang membentuk molekul DNA dibaca oleh mekanisme inti dalam sel, dan transkripsi dan translasi informasi kode ini menghasilkan sintesis protein. Untuk keperluan farmakologi molekuler obat dan reseptor, fokus diskusi ini akan menjadi penggunaan gen (bagian dari kromosom yang berisi informasi yang cukup untuk membuat protein tertentu) yang kode untuk reseptor manusia. Gen-gen ini dapat dikloning (produksi gen identik dari satu individu dengan proses aseksual) dan transfer ke sel inang untuk menghasilkan sistem reseptor manusia yang layak sesuai untuk pengujian.

Langkah pertama adalah kloning gen reseptor. Secara umum, perpustakaan materi genetik terbuat dari sel target, dan komponen perpustakaan ini dimanipulasi menjadi bentuk yang sesuai untuk penanganan. Secara khusus, materi genetik ditempatkan ke dalam vektor DNA dengan sifat khusus. Reseptor DNA gen dan DNA rekombinan bentuk DNA vektor, yaitu cocok untuk kloning sel (biasanya bakteri seperti Escherichia coli). DNA rekombinan diperbanyak sebagai sel-sel membentuk klon (koloni). Setiap sel dalam koloni operator salinan identik dari DNA rekombinan; sehingga gen dikatakan kloning. Koloni disaring untuk pemilihan DNA rekombinan yang menarik, dan ini digunakan selanjutnya untuk menghasilkan sistem reseptor seluler. Prosedur umum secara skematis diperlihatkan pada gambar 4.1.

GAMBAR 4.1. Skema diagram yang menggambarkan proses kloning gen. Baik DNA genomik atau mRNA (yang dikonversi menjadi cDNA) yang diisolasi dari jaringan dan diikat menjadi vektor. DNA rekombinan yang dihasilkan ditempatkan ke dalam sel bakteri, dan bakteri sehingga berubah dipilih dari sel bukan tranformasi.1. PerpustakaanDNA lengkap dari suatu organisme dapat diukur dalam hal pasangan basa asam nukleat, anak tangga pada kode tangga DNA untuk protein. Jumlah pasangan basa untuk organisme bervariasi dari 4 juta untuk E.coli. 700 juta untuk tomat, dan 3 miliar untuk manusia. Dalam hal kloning gen reseptor manusia terdiri dari satu bagian dalam 2 juta. Kunci untuk mendapatkan gen tertentu adalah untuk memastikan populasi besar bagian DNA yang mewakili setiap gen dari organisme (atau setidaknya setiap ditranskripsi gen) dalam jaringan target. Langkah pertama dalam proses ini adalah pembangunan perpustakaan (fragmen DNA) dari materi genetik dari sel yang tepat. Sebagai contoh, jika suatu reseptor tertentu untuk diabetes pada manusia adalah target, daripada sel yang sesuai dari yang membuat perpustakaan mungkin sel pankreas manusia (sekresi insulin). Gen DNA terdiri dari DNA lengkap dari sel terputus dalam potongan-potongan acak dengan endonuklease restriksi. Meskipun kode genetik lengkap dari organisme yang terkandung di perpustakaan ini (genom), gen yang diinginkan mungkin sulit untuk diisolasi.

Ada beberapa alasan praktis untuk membuat jenis lain dari perpustakaan DNA komplementer (cDNA) perpustakaan dari materi genetik sel inang. Pembahasan perpustakaan memerlukan diskusi tentang proses transkripsi DNA. Sintesis protein terjadi ketika kode genetik dari sebagian heliks DNA yang digunakan oleh enzim RNA polimerase untuk membuat molekul kode yang sesuai disebut asam ribonukleat (RNA). Karena kode berasal dari coding gen tertentu untuk protein tertentu dan RNA mentranskripsi kode ini dan operator ke mesin molekul subselular besar dan kompleks yang dikenal sebagai ribosom untuk diterjemahkan ke dalam urutan protein, RNA ini disebut sebagai RNA messenger (mRNA). Dari catatan, terdapat fakta bahwa untuk setiap protein disintesis dalam sel (termasuk reseptor), ada juga mRNA. Dalam sel-sel yang sangat dibedakan, mRNA untuk protein tertentu dapat mewakili sampai 10% atau lebih dari total RNA, sedangkan pesan mungkin ada dalam rasio hanya 1 dalam 1 juta.

Hanya sebagian kecil dari total genom ditranskripsi menjadi RNA. Namun, ada keuntungan untuk kloning perpustakaan cDNA untuk isolasi reseptor tertentu. Pertama, ada mRNA untuk protein aktif disintesis oleh sel. Oleh karena itu, jika reseptor yang menarik diketahui ada secara alami dalam sel dari mana perpustakaan akan dilakukan, maka mRNA untuk protein yang mungkin ada dalam jumlah tinggi (lebih besar dari gen tunggal dalam genom). Selain itu, ada pertimbangan praktis, seperti kemudahan pemurnian dan isolasi mRNA, yang mendukung produksi perpustakaan cDNA.Salinan potongan DNA dimana mRNA ditranskripsikan dapat dibuat dari mRNA. Pertama, untai tunggal DNA dibuat dari mRNA oleh enzim reverse transkriptase. Dihasilkan DNA beruntai tunggal membentuk struktur jepit rambut, sehingga memberikan primer untuk sintesis untai komplementer DNA yang akan dibuat oleh DNA polimerase. Cara lain untuk membuat cDNA dari mRNA adalah dengan enzim R nase H, dari E.coli, yang RNA-DNA dan RNA dicerna menjadi potongan-potongan pendek. Potongan-potongan ini tetap dihibridisasi ke untai DNA pertama dan berfungsi sebagai hibrida untuk E.coli DNA polimerase I, yang mensintesis DNA beruntai ganda dari template DNA asli. Hasil baik dari proses ini adalah bagian dari cDNA beruntai ganda yang mengandung materi genetik untuk menghasilkan protein yang menarik.2. Vektor DNA Setelah cDNA diproduksi maka harus dimasukkan ke dalam carrier, atau vektor, yang akan menyebabkan masuk ke inti sel inang. Penemuan endonuklease restriksi dan ligases, dua enzim yang memotong dan menyisipkan masing-masing segmen DNA, telah memungkinkan fragmen DNA yang akan dimanipulasi dan menyatu dengan DNA lain untuk menghasilkan porsi kecil melingkar DNA untai ganda yang disebut plasmid. Dengan demikian, fregment DNA yang menarik (yang akan disebut DNA penumpang) terkait dengan pembawa vektor DNA (yang sendiri memiliki sejumlah gen) untuk membentuk unit (DNA rekombinan) dengan sifat khusus untuk kloning DNA penumpang. Vektor yang berguna mengandung wilayah DNA mampu berfungsi sebagai asal replikasi yang akan memungkinkan untuk berkembang biak secara mandiri dalam host. Vektor juga mengandung promotor, yaitu urutan DNA yang mengarahkan sintesis dalam jumlah besar mRNA sesuai dengan gen. Selain itu, mereka dapat mencakup urutan untuk meningkatkan efisiensi penggunaan mRNA yang diterjemahkan. Akhirnya, mereka mengandung satu atau lebih gen untuk resistensi antibiotik untuk host. Ini properti terakhir yang berfungsi sebagai penanda untuk sel yang mengandung plasmid diisolasi (yaitu, sel-sel budaya diperlakukan dengan antibiotik dan hanya sel-sel berhasil transfeksi akan hidup karena mereka memiliki resistensi antibiotik). Idealnya, mereka harus mengandung gen dipilih kedua yang tidak aktif oleh penyisipan DNA penumpang, karena hal ini sangat membantu dalam proses seleksi. Ini memungkinkan untuk pemisahan sel diubah oleh plasmid yang tidak memiliki DNA penumpang berhasil dimasukkan (gambar4-2a).

3. Transformasi Sel Bakteri dan SeleksiLangkah berikutnya dalam prosedur kloning plasmid yang mengandung DNA penumpang ke dalam sel yang akan memungkinkan untuk direplikasi. Sel bakteri, dan khususnya E. coli, secara ideal cocok untuk ini karena mereka mudah untuk dimanipulasi dan dapat tumbuh dengan cepat di media yang murah. Kebanyakan bakteri mengambil hanya dalam jumlah terbatas dari DNA; Oleh karena itu, mereka harus diperlakukan secara fisik atau kimia untuk memberikan sifat ditingkatkan untuk penyerapan DNA (yaitu, sel-sel harus diubah). Sel-sel yang dibuat kompeten untuk mengambil DNA dengan merendam dalam, 50-mM kalsium klorida (atau rubidium klorida) solusi dingin. Hal ini menyebabkan DNA untuk mematuhi dinding sel luar. Sebuah kejutan panas singkat (misalnya, 42oC selama 2 menit) menyebabkan DNA yang akan diangkut kedalam sitoplasma.Sel ditransfer dengan coliection plasmid dari perpustakaan cDNA pada konsentrasi tersebut untuk memungkinkan hanya satu plasmid untuk memasukkan sel singel. pada dasarnya, DNA penumpang sekarang di pabrik kecil sendiri di mana, karena itu sel tertentu membagi menjadi koloni, banyak salinan penumpang akan membagi dengan itu dan tiruan dari DNA rekombinan akan dibuat dengan koloni. Dengan demikian, beberapa nanogram DNA rekombinan dapat menjadi beberapa mikrogram (ribuan kali lipat kenaikan) dari bakteri tunggal. Namun, meskipun 1.000-10,000 transfor dapat dibuat dalam suatu kultur, ini hanya mewakili sebagian kecil dari populasi total sel. Langkah selanjutnya adalah amplifikasi sel berubah lebih sel tidak berubah, yang dicapai dengan gen seleksi dibangun ke dalam vektor kloning. Dengan demikian, sel-sel yang mengandung vektor yang memiliki gen untuk memberikan resistensi terhadap obat antibakteri (misalnya, RP4 plasmid mengandung gen untuk memberikan resistensi terhadap ampisilin, kanamisin, dan tetrasiklin) akan kebal terhadap obat ini. Oleh karena itu, pengobatan kultur lengkap dengan tetrasiklin akan membunuh sel-sel tidak yang kontaminasi dengan plasmid, dimana akan meninggalkan rekombinan (yang berhasil ditransformasi dengan plasmid) untuk berkembang.Fitur lain dari vektor, yang dikenal sebagai inaktivasi insersional, dapat dipilih lebih lanjut untuk rekombinan. Hal ini berguna untuk memilih keluar sel-sel yang mengambil plasmid hanya dengan tidak ada yang sesuai (dimana DNA, plasmid menghapus berubah dibandingkan DNA rekombinan berubah). Untuk mencapai hal ini, vektor dapat memiliki lebih dari satu gen untuk resistensi antibiotik, dengan salah satu gen yang memiliki situs restriksi yang unik cocok untuk membuka dan memasukkan DNA penumpang. Jika hal ini dilakukan, maka rekombinan DNA penumpang dengan plasmid akan kehilangan resistensi tertentu sesuai dengan gen terganggu, yang memungkinkan untuk pemilihan tidak hanya sel-sel yang diubah oleh plasmid tetapi juga sel-sel yang membawa DNA penumpang berhasil dimasukkan ke dalam plasmid dengan proses yang dikenal sebagai pengulangan (Gambar 4-2B).

GAMBAR 4.2. Clone Selection4. Transfeksi Sel

Dalam hal memproduksi sistem reseptor manusia rekombinan cocok untuk pengujian obat-obatan dan untuk investigasi mekanisme reseptor, gen reseptor harus dikloning ke host selular pengganti. Langkah pertama dalam proses ini adalah transfeksi DNA rekombinan ke dalam sel inang. Kebanyakan vektor transfeksi mamalia menggunakan cDNA fragmen sebagai lawan DNA genom. Vektor berguna berisi beberapa elemen untuk asal amplifikasi, promotor yang efisien untuk tingkat tinggi transkripsi, dan warna yang cocok untuk seleksi. Vektor juga dapat berisi sistem ekspresi diinduksi yang dapat dikendalikan oleh rangsangan eksternal. Dalam keadaan ini, rangsangan seperti -interferon, kejutan panas, ion logam berat, dan steroid dapat digunakan untuk mengontrol tingkat ekspresi protein dikodekan oleh gen penumpang. Sejumlah metode yang ada untuk memperkenalkan vektor transfeksi ke dalam sel mamalia seperti pengobatan sel dengan kalsium fosfat, transtek DEAE-dekstran, elektroporasi (tegangan tinggi medan listrik yang membentuk lubang sementara di membran), dan liposom dimediasi transfeksi.

Selain plasmid transfeksi DNA rekombinan ke dalam sel, transfer virus juga dapat dicapai. Virus seperti virus SV40 rekombinan, retrovirus, dan virus vaccinia dapat menginfeksi berbagai jenis sel dan dengan demikian memungkinkan kesempatan untuk menyuntikkan gen asing secara efisien. Beberapa sistem ini (baculovirus, virus vaccinia) memproduksi ekspresi protein yang lebih dan sehingga dapat digunakan untuk mencapai tingkat ekspresi yang tinggi. Baculovirus, khususnya adalah berguna karena menggunakan sel-sel serangga yang memproses protein dalam banyak cara yang sama seperti sel-sel eukariotik yang lebih tinggi (myristylation, palmitoylation, glikosilasi, dll). Termasuk dalam genom virus ini, yang tidak menginfeksi vertebrata, adalah gen untuk protein yang ada di host di Boodles kristal besar, yang membentuk 50% dari sel. Penggantian gen ini dengan yang asing memungkinkan produksi yang sama dari protein dengan relatif mudah.

Secara umum, proses kloning gen selesai ketika sebuah gen tunggal telah diidentifikasi, terisolasi, dan diperkuat. Kloning gen tertentu dapat dianggap sebagai isolasi bagian tertentu dari DNA (penyerapan DNA penumpang diligasi ke vektor kloning ke dalam sel tunggal), replikasi gen tertentu dalam lingkungan yang terisolasi, dan identifikasi dari klon tertentu yang menarik melalui seleksi.5. Translent dan Clones StabilDua jenis transfeksi, sementara dan stabil, biasanya dilakukan dalam sistem mamalia. Transfeksi sementara memungkinkan analisis produk protein dalam 1 sampai 4 hari transfeksi. Efisiensi transfeksi sementara tergantung pada jumlah sel-sel yang teke atas DNA asing, jumlah copy gen, dan tingkat ekspresi gen per. Secara umum, sebanyak 50% dan sesedikit 50% dari sel-sel mengambil DNA rekombinan secara sementara. Karena sel-sel yang mengambil DNA asing tumbuh lebih lambat dari sel-sel lain, akhirnya mereka hilang dari populasi. Oleh karena itu, bahwa sel-sel transiently transfected membawa sinyal DNA rekombinan untuk periode beberapa hari sampai maksimal beberapa minggu. Transfeksi sementara sulit untuk meningkatkan produksi dalam jumlah besar protein, tetapi metode yang nyaman untuk menguji fungsi plasmid dan, sangat relevan untuk mempelajari reseptor obat manusia, digunakan untuk ekspresi kloning (vide infra).

GAMBAR 4.3. Kloning gen. Fragmen DNA A hingga E disisipkan ke dalam vector dan digunakan untuk merubah sel bakteri. Setiap sel mengambil plasmid tunggal. Sel cloning mengandung plasmid membuat banyak salinan plasmid dan bereplikasi ke dalam koloni. Proses seleksi isolate koloni sel mengandung banyak sekali kopian DNA. Gen ini sehingga terisolasi dan direplikasi.

Sekitar 1 dari 104 sel (dalam beberapa sistem, sebanyak 1 dari 1000) dalam transfeksi yang stabil akan mengintegrasikan DNA asing ke dalam DNA kromosom mereka dan dengan demikian mengekspresikan protein sebagai natif sepanjang siklus hidupnya. Tidak seperti ekspresi transien di mana efisiensi tergantung pada penyerapan DNA, efisiensi transfeksi stabil tergantung pada frekuensi integrasi DNA. Jika seleksi untuk sel-sel secara stabil transfek dibuat, maka koloni mengekspresikan gen yang diinginkan dapat diperoleh setelah sekitar 10 kali; koloni individu dapat dipilih dan tumbuh menjadi garis sel stabil. Garis sel ini kemudian akan secara konsisten mengungkapkan produk dari gen kloning sebagai bagian dari riasan alami. Seleksi menggunakan prinsip konferensi resistensi obat untuk host kekurangan dalam kegiatan tertentu yang dipilih. Oleh karena itu, jika gen penanda yang kontras ke dalam sel dengan gen rekombinan kepentingan dalam rasio 1:5 (satu bagian penanda dan lima bagian gen rekombinan), ini secara efektif memastikan bahwa setiap sel yang mengandung gen penanda juga akan berisi gen yang diinginkan. Hal ini juga dapat dicapai dengan membangun gen penanda ke dalam plasmid yang mengandung gen yang diinginkan.Penanda seleksi dapat sangat bervariasi. Sebagai contoh, gen penanda dapat kode untuk enzim adenosin deaminase (ADA), yang mendetoksifikasi Xyl-A (9-bp-xylofuranosyl adenin) ke inosin turunannya. Jika Xyl-A tidak didetoksifikasi, waktunya akan diubah ke Xyl-ATP, yang merupakan racun bagi sel. Oleh karena itu, ADA-defient sel CHO dapat digunakan untuk memilih untuk transfeksi. Demikian pula, gen untuk aminoglikosida phosphotransferase (APH) dapat menghasilkan sel resisten terhadap protein sintesis blocker G418. Dalam keadaan ini, sel-sel transfected tumbuh di G418 akan bertahan hidup, sedangkan sel bukan transfeksi akan mati.Sel transfek dan berkultur melalui fase transien. Dengan kultur lanjut, sel transien transfek mati meninggalkan pelengkap jauh lebih rendah dari sel-sel (1-104) yang telah memasukkan DNA asing ke dalam kromosom mereka (stabil transfek). Kemudian, media seleksi (Xyl-A untuk penanda ADA, G418 untuk penanda APH, dll.) ditambahkan, yang membunuh sel-sel bukan transfek, meninggalkan sel-sel secara stabil transfek untuk berkembangbiak.

GAMBAR 4.4. Garis sel stabil yang mengandung reseptor manusia adalah tujuan akhir dari biologi molekuler yang dijelaskan dalam bab ini. Namun, sejumlah isu yang terkait dengan farmakologi reseptor dapat diatasi dengan biologi molekuler.C. EKSPRESI KLONING RESEPTORPembahasan sebelumnya melibatkan kloning gen dan penciptaan sistem selular pengangkutan jumlah murni produk dari gen tersebut. Namun, jika kode untuk reseptor tertentu tidak diketahui, satu-satunya penanda yang tersedia untuk mendeteksi kloning gen yang tepat adalah aktivitas reseptor itu sendiri. Dengan kondisi tersebut, perpustakaan cDNA ditransfer ke sel yang kemudian menjadi sasaran analisis farmakologis untuk fungsi reseptor; hal ini disebut sebagai ekspresi kloning. Sebagai contoh, reseptor untuk hormon otak saraf hipotetis dapat diketahui sangat lokal di daerah tertentu dari otak (misalnya, hipotalamus). Dalam hal ini, akan masuk akal untuk mengasumsikan bahwa sel-sel hipotalamus akan memiliki jumlah tertentu dari mRNA untuk reseptor itu, sebagai reseptor diketahui dilokalisasi dalam sel-sel. Oleh karena itu, perpustakaan cDNA bisa dibuat dan digunakan untuk transfect sel inang. Perpustakaan kemudian bisa dibagi ke dalam kolam dari cDNA dan digunakan untuk transfect beberapa kultur seluler mamalia. Pada gilirannya, dapat disaring untuk reseptor oleh radioligan mengikat atau fungsi reseptor. Untuk tujuan diskusi ini, proses ini hanya salah satu pilihan dari kolam positif. Penentuan sinyal reseptor positif dalam salah satu piring berarti bahwa hanya satu dari ribuan atau lebih gen itu adalah benar. Proses ini diulang untuk mempersempit pilihan ke sinyal gen. Plasmid cDNA yang dikumpulkan dari pelat kultur positif dan digunakan untuk kultur. Agen plat positif terisolasi, dan proses ini diulang sehingga satu kali dibagi menjadi daerah koloni dan kemudian menjadi koloni tunggal sampai klon diperoleh (Gambar 4-5). Plasmid cDNA dari klon tunggal ini berisi gen untuk reseptor tertentu yang menarik. Dari sini, dapat diperkenalkan ke sejumlah host selular untuk penelitian eksplorasi dan ke baculovirus untuk produksi tinggi protein reseptor. Selain itu, DNA dapat diurutkan dan urutan asam amino reseptor reseptor ditentukan.

GAMBAR 4.5, Proses pengeluaran kloning. Sebuah perpustakaan dibangun dari jaringan target, dibuat menjadi DNA rekombinan, dan dibagi kedalam kelompok. Pembagian kelompok digunakan untuk transfect memisahkan kultur sel, dan masing-masing diuji untuk produk gen (yaitu kehadiran reseptor oleh radio ligand mengikat, respon fungsional untuk agonis). DNA dari kultur aktif digunakan untuk transfect kultur segar, yang kemudian dibagi menjadi beberapa bagian dan di uji kembali. Proses berlanjut sampai koloni sel tertentu yang mengandung sel-sel mengeluarkan produk gen yang diisolasi. D. DNA TC PROTEIN ATAU KODE GENETIKA

Seperti disebutkan dalam bab sebelumnya, DNA berisi urutan kode dari asam nukleat yang memberikan resep untuk penggabungan asam amino menjadi protein. DNA terdiri dari empat asam nukleat, timin, adenin, sitosin, dan guanin bahwa dari pasangan hybrid stabil satu sama lain (timin dengan adenin dan sitosin dengan guanin, Gbr.4-6A). Urutan yang tepat dari asam amino menentukan sifat struktur protein, dan urutan yang tepat terkandung dalam susunan asam nukleat dari molekul DNA heliks (lihat Gambar 4-6B). Basa harus mengkode 20 asam amino yang berbeda. Hal ini dapat dilihat dari pengaturan bahwa asam nukleat tunggal tidak bisa mengkode 1 protein (hanya dapat mengkode 4), pasangan asam nukleat hanya bisa mengkode 16 asam amino, dan 3 asam amino dapat mengkode 64 asam amino. Kode tersebut adalah triplet (ditunjukkan pada Gambar 4-7), dan dapat dilihat bahwa sejumlah triplet dikode lebih dari satu asam amino, sedangkan beberapa triplet adalah kodon stop (signal akhir sintesis). Relevansi untuk penelitian reseptor pada kenyataan bahwa pengetahuan tentang urutan asam nukleat dari cDNA reseptor dapat digunakan untuk menerjemahkan kembali asam amino urutan reseptor. Oleh karena itu, pengetahuan tentang urutan gen reseptor mengarah ke pengetahuan tentang urutan protein.

Aspek penting lain dari korespondensi antara nukleat dan asam amino dalam penggabungan probe oligonukleotida untuk mengisolasi penggabungan dan mencari subtipe dan mutans dari reseptor. Sebuah metode yang kuat untuk mengisolasi dan mengidentifikasi klon tertentu yang menarik adalah dengan hibridisasi asam nukleat (hibridisasi koloni). Koloni sel, tersebar di piring agarosa, yang dicetak dengan nitroselulosa atau membran nilon sedemikian rupa sehingga replika piring dibuat dengan beberapa sel. Membran diperlakukan untuk menghapus semua materi tetapi DNA, yang terhubung dengan membran dalam posisi axact koloni dari proses pemanasan. Penyelidikan kemudian digunakan untuk mengidentifikasi koloni yang mengandung rekombinan. Beberapa probe bersifat radioaktif dan dapat dideteksi oleh autoradiografi, tetapi probe jenis lain menggunakan biotin, yang dapat dideteksi dengan ketat mengikat ke avidin protein (dideteksi dengan pewarna fluorescent seperti Texas red).

Prinsip dasar bahwa struktur asam nukleat komplementer akan mengikat lain dan dari struktur hibrida seperti dalam DNA heliks (vide infra). Oleh karena itu, jika sebagian dari urutan asam nukleat dari gen yang diinginkan diketahui, maka koleksi koloni sel bakteri dapat dipilih (yaitu, baik yang mengandung radioaktif atau biotin) Probe complementarry dan memungkinkan identifikasi koloni yang mengandung gen. Elemen kunci dalam proses ini adalah memiliki probe yang benar, hibridisasi koloni membutuhkan urutan nukleotida radioaktif yang unik yang akan berhibridisasi ke bagian unik dari cDNA dan memungkinkan isolasi. Sebagai contoh, Gambar 4-8A menunjukkan urutan DNA dari gen reseptor dan urutan asam amino yang sesuai untuk dikode. Dengan mmempertimbangkan masalah sebaliknya, bentuk probe asam nukleat untuk urutan ini asam amino tertentu. Karena degenerasi dalam kode genetik (misalnya, banyak asam amino yang dikodekan oleh lebih dari urutan triplet), urutan asam nukleat yang mungkin ditampilkan (lihat Gambar 4-8B); dalam kasus ini, empat. Hibrida terbentuk antara adenin asam nukleat dan timin dan juga antara guanin dan sitosin. Keempat probe yang akan berhibridisasi ke empat urutan ditunjukkan pada Gambar 4-8C. Untuk hibridisasi koloni, campuran dari empat oligonukleotida akan dibuat dan digunakan untuk screen untuk gen reseptor tertentu. Clearly, degenerasi dalam kode genetik dapat menyebabkan ambiguitas yang cukup besar jika urutan asam amino yang dipilih banyak kemungkinan kode asam nukleat. Contoh, urutan -VAL-LEU-ARG-LEU- memiliki 864 urutan oligonukleotida. Secara umum, urutan mengandung asam amino yang dikodekan untuk histidin atau asparagines berguna karena hanya kode triplet tunggal untuk asam amino ini.

Probe bisa kurang ketat untuk urutan oleh desain. Sebagai contoh, daerah bagian reseptor yang berbeda dari homologi (urutan asam amino yang sama). Sehingga kesempatan untuk menggunakan oligonukleotida untuk satu jenis reseptor untuk menyelidiki untuk gen untuk jenis lain dari reseptor. Demikian pula, urutan asam amino yang terbatas dapat memilih gen untuk subtipe reseptor, satu diproduksi oleh sel yang hilang, yang memiliki asam amino yang sedikit berbeda dari reseptor normal (Gambar 4-9). Reseptor tersebut dapat dihasilkan oleh proses patologis (misalnya, kanker atau penyakit lainnya). Penemuan-penemuan semacam ini bisa sangat penting karena dapat memberikan kesempatan untuk merancang obat selektif untuk reseptor baru.

GAMBAR 4.6. Molekul DNA. A) pasangan basa komplemen tertentu pada untai DNA. Timin mengikat adenin, dan sitosin mengikat guanin. B) pasangan basa individual di dua untai DNA mengarah ke struktur alphahelix.

Gambar 4.7. Kode genetik. Basa triplet sepanjang untai DNA kode untuk asam amino tertentu. Degenerasi terjadi (yaitu, empat triplet semua kode untuk prolin) dan sinyal kodon langkah ketika terjemahan selesai.

Gambar 4.8. Probe oligonukleotida. Sebuah urutan 12 kode dasar untuk empat asam amino dalam gen yang diinginkan. B. urutan protein ini dapat dikodekan untuk empat urutan oligonukleotida yang berbeda sesuai dengan kode genetik (bukan degenerasi untuk ALA). C. Probe pelengkap yang dapat mengikat urutan kepentingan disintesis dan dapat digunakan untuk mendeteksi gen asli.

GAMBAR 4.9. Kegunaan urutan homologi untuk mendeteksi reseptor yang sama. Dua reseptor yang berbeda kecuali untuk peregangan tertentu asam amino yang sama (daerah homolog). Oligonukleotida Probe mengkode untuk daerah ini dapat digunakan untuk mengisolasi reseptor asli (A) dan reseptor lain yang mengandung urutan yang sama (reseptor B).

E. POLIMERASI CHAIN REACTION (PCR)

Teknik lain dalam biologi molekuler, polymerase chain reaction (PCR), sangat berguna untuk mendeteksi gen di perpustakaan dan, oleh karena itu, untuk pemetaan gen untuk reseptor pada jaringan yang berbeda. Seperti disebutkan sebelumnya, DNA ada sebagai double helix pasangan basa hibridisasi (adenin dengan timin dan guanin sitosin untuk). Namun, alur tersebut dapat terdenaturasi kimia atau dengan panas menjadi untai tunggal. Dari alur tunggal, salinan baru DNA yang sesuai dapat dibuat oleh DNA polimerase enzim. Alur melengkapi setiap helai terpisah dibuat, sehingga ketika ini terdenaturasi lagi, salinan hasil untai DNA asli. Pengulangan reaksi dapat menghasilkan salinan yang luar biasa dari satu bagian dari DNA. Teknik ini membuat kita dari fakta bahwa DNA polimerase enzim memerlukan primer (string kecil nukleotida) yang dapat menambah basis harus diperkuat, dan sintesis DNA baru dimulai dari titik ini. Oleh karena itu, jika titik awal yang tepat dari urutan gen yang diketahui, maka primer dapat disintesis untuk mengikat ke titik yang tepat untuk memulai sintesis. Jadi, dengan denaturasi sampel DNA dan penambahan jumlah kelebihan dua primer yang mewakili urutan membingkai gen yang diinginkan, beberapa salinan gen dapat diproduksi (ditunjukkan secara skematis dalam Gambar 4-10). Jumlah salinan gen sama (2) / 4, di mana n adalah jumlah kali pcr dijalankan. Sebagai contoh, gen dapat dibuat menjadi 1 juta kopi dengan melakukan reaksi 22 kali. Ini memberikan kekuatan yang luar biasa dari deteksi gen karena pcr dapat dijalankan dengan primer yang tepat untuk reseptor yang berbeda dan adanya gen yang sama dalam jaringan apapun dapat dideteksi.

PCR adalah teknik yang sangat kuat, mampu mendeteksi satu bagian dari DNA di perpustakaan yang lengkap. Salah satu aplikasi dari teknologi ini adalah deteksi reseptor mutan. informasi genetik tentang mutans seperti itu sering jarang karena mutasi dapat membatasi produksi tuan rumah. Namun reseptor mutan dapat menjadi penting dalam perubahan struktural dan fungsional yang menyertai beberapa penyakit, dan pengujian entitas obat baru pada reseptor mutan yang diinginkan. Dengan PCR, pengkodean daerah pembatas untuk reseptor dapat didefinisikan, dan semua DNA sesuai dengan kode antara mereka mulai kodon akan diperkuat. Jika mutasi titik reseptor hadir, ini akan diperkuat, sehingga jumlah besar dapat dibuat dan diikuti (gambar 4-11). Ekspresi kloning dari reseptor mutan maka akan mungkin dengan pengujian farmakologis berikutnya

GAMBAR 4.10. Reaksi rantai polymerase. DNA didenaturasi untuk memisahkan kelebihan rantai primer yang akan mengikat dua wilayah pada DNA yang menentukan gen dari kepentingan ditambahkan. Primer mengikat ke daerah batas gen dan berfungsi sebagai cetakan untuk polimerase DNAuntuk memulai sintesis untai komplementer. Rantai dipisahkan dengan pemanasan dan prosesnya diulangi sehingga setiap DNA disintesis menjadi untaian yang baru berfungsi sebagai cetakan untuk salinan lanjut. Dengan setiap proses berulang, DNA baru terakumulasi.

GAMBAR 4.11. Menggunakan reaksi rantai polymerase (PCR) untuk mendeteksi mutasi reseptor. Primer menentukan gen yang mungkin memiliki titik mutasi. Gen bermutasi ini masih akan diperkuat oleh tehnik PCR.F. SISTEM REKAYASA GENETIK RESEPTOR

Kemampuan mengungkapkan produk gen dalam berbagai jenis sel telah menciptakan sebuah revolusi pada penelitian reseptor. hal ini karena reseptors tidak berfungsi secara tersendiri melainkan merupakan bagian dari sistem saling bergantung kompleks (yaitu, meninjau model kompleks kubik terner, Bab 3). Dalam situasi seperti ini, sifat molekul komponen dan stoichiometries relatifnya mempengaruhi perilaku serta perilaku obatnya. sistem reseptor yang dikontrol ketat sesuai dengan kebutuhan sel dan kekuatan input kimia untuk sel-sel. Oleh karena itu, sedikit lintang telah memungkinkan peneliti yang harus bergantung pada pilihan bijaksana sistem alam untuk kondisi optimum untuk pengujian obat. dengan munculnya biologi molekuler, sistem pengujian dapat dibuat untuk memenuhi kebutuhan para peneliti. Manipulasi genetik komponen seluler menawarkan metode baru menyelidiki sistem pengujian

1. Aplikasi sistem reseptor dikendalikan secara genetik

Ada tiga aplikasi yang berbeda dari kontrol genetik sistem reseptor karena berkaitan dengan reseptor penelitian. Yang pertama adalah untuk mengontrol sistem tanggap untuk mendeteksi khasiat obat. Hal ini terkenal bahwa obat dengan efikasi rendah mungkin tidak menghasilkan respon dalam sistem reseptor efisien digabungkan. Hal ini dapat distimulasi jika obat ini dimaksudkan untuk digunakan sebagai antagonis dan menghasilkan respon agonis pada jaringan yang digabungkan dalam tubuh manusia. Salah satu metode untuk mengendalikan respon sistem reseptor adalah untuk mengontrol stoikiometri reaktan. Dengan demikian, promotor yang berbeda dapat digunakan untuk mengekspresikan berbagai tingkat protein reseptor atau protein-G. coexpression kedua reseptor dan protein-G dapat digunakan untuk membuat sistem reseptor responsif. Reaksi antara reseptor (R) , protein-G (G), dan obat (A) dapat disederhanakan sebagai berikut.

di mana kmaju dan kkembali mengacu pada konstanta laju untuk reaksi maju dan mundur kimia, masing-masing. respon agonis dimediasi oleh pembentukan kompleks terner ARG yang pada gilirannya diatur oleh produksi ARG oleh kmaju (A) (R) dan bahwa ARG oleh kmaju (G) (AR). dapat dilihat dari reaksi-reaksi kinetik yang meningkatkan dalam jumlah reaktan (R) dan (G) akan meningkatkan produksi respon memproduksi elemen ARG. Angka 4.12 menunjukkan efek peningkatan baik reseptor tingkat ekspresi atau tingkat G-protein dalam sistem ekspresi pada (ARG) kemampuan respon pembentuk suatu agonis. dua tahap, dalam hal perubahan yang dihasilkan oleh manipulasi tersebut, dapat diamati. yang pertama adalah peningkatan asimtot maksimal kurva dosis-respons (tahap I). perlu dicatat bahwa, tergantung pada sifat dan jumlah intervensi langkah antara respon yang diamati dan produksi ARG, mungkin atau mungkin tidak perubahan parameter lokasi (konsentrasi afektif median (EC50I) dari kurva pada fase I. di tahap kedua, asimtot maksimal mencapai dataran tinggi dan dosis-respons, kurva bergeser ke kiri, dengan meningkatkan ekspresi reseptor baik atau G-protein. hal ini karena satu atau lebih komponen dari sistem jenuh. Misalnya, jika tingkat G-protein yang meningkat melebihi setara stoikiometri dari reseptor, maka tidak ada maksimal A-R-G lanjut dapat dibentuk (jumlah R Batas ini), tetapi kemungkinan membentuk meningkat kompleks karena peningkatan ketersediaan dosis-respons kurva. Contoh dari perubahan kepekaan terhadap agonis dengan meningkatnya konsentrasi G-protein dalam sistem dengan jumlah yang tetap dari reseptor diberikan dalam bab 3 (lihat gbr 3-5).

GAMBAR 4.12. Efek dari peningkatan kemampuan respon dalam sistem fungsional. Pengamatan pertama adalah peningkatan respon asimtot maksimal, yang mungkin atau mungkin tidak disertai dengan pergeseran ke kiri EC50 kurva dosis-respons (tahap 1). Setelah kejenuhan satu atau lebih komponen dari sistem, pergeseran sinistral kurva dosis-respons dengan tidak ada perubahan dalam respon maksimal diamati (fase II).

Alasan lain untuk memanipulasi stoikiometri sistem reseptor adalah untuk membuatnya konstitutif aktif. Reseptor adalah protein reaktif dengan banyak konformasi tersier. Beberapa konformasi ini G-protein aktif, dengan demikian, mereka telegraf kehadiran mereka. Dalam sistem alami yang paling, jumlah reseptor spontan diaktifkan sangat rendah, sebagai sinyal tunduk terhadap rangsangan eksternal lebih terkontrol dalam keadaan fisiologis normal. Namun, jika stoikiometri dari reseptor dan G-protein yang ditinggikan cukup, melampaui batas alam atau dalam sel inang khusus, maka tingkat diamati dari reseptor spontan diaktifkan akan diproduksi. Ini akan, pada gilirannya, menghasilkan sinyal yang terukur dalam sel karena tingkat abnormal tinggi reseptor secara spontan aktif. Dengan demikian, sistem disederhanakan untuk koeksistensi yang tidak aktif (Ri) dan aktif (Ra) reseptor di hadapan G-protein (G) dinyatakan sebagai berikut:

KG

[Ri]+[G]

[RiG]

L

[Ra]+[G]

[RaG]

KDi mana L adalah alosterik konstan asosiasi didefinisikan oleh [Ra]/[Ri], KG asosiasi konstan untuk reseptor dan protein-G dan b adalah faktor penggali yang menunjukkan perbedaan dalam afinitas aktif dengan bentk tidak aktif dari reseptor untuk protein-G. diasumsikan bahwa tidak ada respon seluler berasal dari kompleks nonproduktif reseptor inaktif dan protein-G (R,G) , hanya dari reseptor aktif kompleks protein-G (RaG).Level RaG (dari beberapa reseptor sistem dan karena aktivasi konstitutif) dari setiap sistem reseptor terganting pada seberapa baik reseptor membentuk keadaan aktif (nilai L) dan rasio relatif protein-G. Gambar 4.13 menunjukkan tingkat spontan membentuk RaG untuk reseptor tertentu (dengan karakteristik nilai L). Seperti yang bisa dilihat dari kurva yang berkaitan kepadatan reseptor untuk aktivasi spontan, peningkatan reseptor/ protein-G rasio dalam konstitutif aktif. Pada tingkat reseptor rendah, tidak ada diamati aktivitas basal dan obat-obatan tidak merespon atau respon positif (lihat gambar 4.13). Pada tingkat reseptor hasil aktivasi konstitutif lebih tinggi. Sistem tersebut memiliki potensi untuk menyaring ligan karena secara teoritis, bahan kimia yang berinteraksi dengan reseptor akan mengubah kesetimbangan mikroskopis antara tempat reseptor dan mengubah basal (tetapi stabil) tinggi level RaG. Karenanya setiap gangguan kimia kesetimbangan stabi didirikan dalam sistem konstitutif aktif akan dideteksi. Deteksi interaksi reseptor ligan dapat digunakan sebagai alat skrining dalam mencari obat baru. Ligan yang mengikat deferensial ke susunan reseptor baik dapat menurunkan atau meningkatkan aktivasi reseptor konsitutif (lihat gambat 4.13).Aplikasi kedua dari sistem kontrol reseptor genetik adalah untuk mendeteksi obat yang mengganggu spontan reseptor yang sama. Obat tersebut memiliki khasiat negatif dan disebut sebagai agonis terbalik. Dampak agonis terbalik belum diketahui, namun mereka memiliki potensi untuk menenangkan spontan aktif fokus patologis seperti bidang berlebih reseptor dopain ditemukan di daerah otak pada pasien dengan schizopherenia.

GAMBAR 4.13 Efek dari aktivitas reseptor konstitutif pada profil respon pada profil respon obat. Saling ketergantungan kepadatan reseptor ([R]) dan Konsentrasi protein-G ([G]) pada jumlah spontan kompleks reseptor aktif/ protein-G yang dihasilkan dalam sistem reseptor ditampilkan di panel tengah. Untuk menetapkan jumlah protein-G, peningkatan kadar reseptor menyebabkan konstitutif respon spontan terhadap berbagai jenis obat dalam sistem dengan dan tanpa (diam) aktivitas konstitutif. Agonis terbalik dan antagonis yang bisa dibedakan dalam sistem diam, sedangkan mereka menghasilkan efek berbeda dalam sistem konstitutif aktif.Sebuah aplikasi ketiga sistem reseptor rekayasa genetika dalam pengendalian pasangan reseptor/G-protein. Hal ini diketahui bahwa reseptor yang kacau sehubungan dengan G-protein yang mereka berinteraksi. Dengan demikian, salah satu diaktifkan reseptor mungkin beberapa dua atau lebih G-protein di membran dalam menanggapi aktivasi oleh agonis. Tidak jelas apakah semua agonis meningkatkan produksi negara diaktifkan tunggal. Sebaliknya ada bukti bahwa beberapa negara diaktifkan untuk reseptor mungkin ada. Oleh karena itu, muncul pertanyaan; Apakah agonis yang berbeda mempromosikan spektrum yang berbeda dari negara-negara aktivasi mengarah ke diferensial aktivasi G-protein? Ada bukti bahwa stimulus beberapa agonis lalu lintas ke jalur G-protein yang berbeda. Pertanyaan ini mungkin sangat penting dalam desain agonis khusus untuk terapi. Untuk contoh, jika efek terapi agonis tergantung pada satu jalur G-protein dan efek samping tergantung pada yang lain, secara teoritis akan ada kemungkinan untuk menghilangkan efek samping dengan merancang agonis serupa yang memperdagangkan hanya untuk jalur menguntungkan. Rekayasa genetika sistem reseptor memungkinkan untuk penciptaan sistem host selular dengan bias populasi G-protein. Pengujian agonis dalam sistem tersebut secara teoritis memungkinkan untuk mendeteksi perdagangan agonis stimulus dan deteksi agonis lebih selektif. Gambar 4-14 menunjukkan wakil skematik

GAMBAR 4.4. Perdagangan agonis stimulus reseptor. Agonis a menghasilkan keadaan aktif (atau berbagai negara aktif) yang sembarangan mengaktifkan (s) dua G-protein, sehingga menimbulkan efek yang berguna dan efek samping yang tidak diinginkan. Agonis B lebih selektif dan menghasilkan keadaan aktif reseptor yang mengaktifkan hanya jalur berguna. Dipilih tes rekayasa genetika mampu membedakan di antara profil yang berbeda dari agonis.

2. Saturasi Mutagenesis AcakSebagaimana dicatat sebelumnya, fakta bahwa reseptor bias eksis dalam berbagai negara konformasi tersier dan bahwa beberapa negara ini konstitutif aktif memiliki aplikasi praktis dalam pemutaran entitasobat baru. Ada juga bukti bahwa bagian-bagian tertentu dari lingkaran intra seluler ketiga reseptor tujuh trans membrane mengaktifkan G-protein dan bahwa bentuk tidak aktif dari reseptor menghalangi akses kedaerah ini (gambar 4-15). Sebaliknya, bentuk aktif dari reseptor ekspose daerah kritis untuk aktivasi G-protein. Ada bukti bahwa mutasi titik reseptor menghasilkan konformasi menyimpang yang abstrak keadaan tidak aktif dan pada kenyataannya, cenderung untuk membentuk keadaan aktif. Mutasi ini sering aktif dan dengan demikian berharga dalam skrining obat.

GAMBAR 4.15. Reseptor tujuh transmembran di inaktif (Ri) dan diaktifkan (Ra) bentuk. Hal ini diyakini bahwa sebagian dari lingkaran intra seluler ketiga (yang ditunjuk oleh bar horisontal) sangat penting dalam mengaktifkan G-protein bahwa daerah ini dari reseptor tersembunyi dalam bentuk reseptor aktif dan terbuka dalam bentuk aktif. Mutan reseptor (R) dengan sifat komposisi asam amino diubahnya, lebih mudah membentuk keadaan aktif, dan system pengolahan reseptor mutan ini konstitutif diaktifkan.Sebuah prasyarat untuk penggunaan situs-diarahkan mutagenesis adalah pengetahuan tentang wilayah mana reseptor sangat penting untuk kopling G-protein. Namun, metode alternatif adalah dengan membuat perpustakaan acak cDNA yang bermutasi di wilayah umum kopling G-protein dan untuk memperkuat cDNA melalui PCR dan layar untuk reseptor aktif konstitutif. Teknik ini, yang dikenal sebagai saturasi mutagenesis acak, memperkenalkan mutasi asam amino di daerah reseptor tanpa prasangka. Kemampuan untuk mendeteksi aktivitas konstitutif (misalnya, melalui tes wartawan, vide infra) memungkinkan pemilihan reseptor konstitutif. CDNA kemudian dapat diperkuat melalui PCR dan reseptor sequencing untuk menentukan urutan reseptor mutan.

G. SINOPSIS

Ide-ide berikut disajikan dalam bab ini:

Sistem Reseptor dapat dibuat dengan memasukkan reseptor manusia ke dalam sistem sel pengganti, sehingga menghindari kekurangan menggunakan jaringan hewan.

Gen untuk reseptor tertentu dapat dikloning menyebabkan banyak salinan gen dalam dari yang dapat dimanipulasi.

Entah genom cDNA perpustakaan dapat dibangun, dan potongan-potongan DNA penumpang dapat diperkenalkan ke vektor. Ini dapat dilakukan untuk mereplikasi dalam sel bakteri. Klon yang menarik dapat dipilih dan diperkuat.

Gen dapat transfected ke sel mamalia untuk menciptakan sistem pengujian reseptor. Sistem ini dapat bersifat sementara (transient transfeksi) atau permanen (transfections stabil).

Gen untuk produk yang tidak diketahui dapat dikloning dan produk diuji untuk fungsi atau keberadaan (ekspresi kloning). Hal ini dapat menghasilkan cukup bahan untuk ditandai.

Kode genetik untuk produk protein (yaitu, reseptor) dapat digunakan untuk menentukan urutan asam amino reseptor. Atau, penggunaan urutan homolog antara reseptor memungkinkan menyelidik perpustakaan gen untuk mendeteksi reseptor terkait struktur yang berbeda.

Reaksi berantai polimerase memungkinkan amplifikasi gen tunggal. Hal ini dapat digunakan untuk mendeteksi gen reseptor dan gen reseptor mutan dalam jaringan. Rekayasa genetika dapat digunakan untuk sistem reseptor custom-membangun untuk skrining yang lebih baik dari obat-obatan dan deteksi kegiatan obat lemah. BAB IVPENUTUPA. KESIMPULAN

Berdasarkan pembahasan diatas, dapat disimpulkan bahwa :B. SARANDAFTAR PUSTAKAGossel, T.A., dan J.D., Bricker, 2001, Principles Of Clinical Toxicology Third Edition, Selwood Printing Ltd., Burgess Hill, West Sussex.Gunawan, S. G., 2012, Farmakologi dan Terapi, Balai Penerbit FKUI, Jakarta. Priyanto, 2010, Farmakologi Dasar, Leskonfi, Jakarta.Gen reseptor kloning

Seleksi

E. coli

(Transformasi untuk E. Coli dalam in vitro)(Transformasi untuk kemasan in vitro

DNA rekombinan

Vektor

Ligasi

Perpustakaan cDNA

Perpustakaan gen DNA

mRNA

Ektrak, mencerna DNA genom fractionale

Jaringan target (mengandung reseptor)

Reseptor Hewan, Jaringan Hewan

Hewan atau sel manusia dalam kultur

Materi reseptor genetik hewan, sel-sel pengganti

Materi reseptor genetik manusia, sel-sel pengganti

Reseptor manusia, sel target manusia

Reseptor manusia, sel target manusia (kontrol patologis yang sesuai)

2