BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kemajuan di bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontroversi yang

melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai contoh, teknologi kloning dan rekayasa

genetika terhadap tanaman pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan.

Rekayasa genetika (Ing. genetic engineering) dalam arti paling luas adalah penerapan

genetika untuk kepentingan manusia. Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaaan hewan

atau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan. Demikian pula

penerapan mutasi buatan tanpa target dapat pula dimasukkan. Masyarakat ilmiah

sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-

teknik genetika molekular untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau

mengubah sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu.

Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai

dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-

tumbuhan. Bidang kedokteran dan farmasi paling banyak berinvestasi di bidang yang

relatif baru ini. Sementara itu bidang lain, seperti ilmu pangan, kedokteran hewan,

pertanian (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah

melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing.

Ilmu terapan ini dapat dianggap sebagai cabang biologi maupun sebagai ilmu-ilmu

rekayasa (keteknikan). Dapat dianggap, awal mulanya adalah dari usaha-usaha yang

dilakukan untuk menyingkap material yang diwariskan dari satu generasi ke generasi

yang lain. Ketika orang mengetahui bahwa kromosom adalah material yang membawa

bahan terwariskan itu (disebut gen) maka itulah awal mula ilmu ini. Tentu saja,

penemuan struktur DNA menjadi titik yang paling pokok karena dari sinilah orang

1

kemudian dapat menentukan bagaimana sifat dapat diubah dengan mengubah komposisi

DNA, yang adalah suatu polimer bervariasi.

Tahap-tahap penting berikutnya adalah serangkaian penemuan enzim restriksi

(pemotong) DNA, regulasi (pengaturan ekspresi) DNA (diawali dari penemuan operon

laktosa pada prokariota), perakitan teknik PCR, transformasi genetik, teknik peredaman

gen (termasuk interferensi RNA), dan teknik mutasi terarah (seperti Tilling). Sejalan

dengan penemuan-penemuan penting itu, perkembangan di bidang biostatistika,

bioinformatika dan robotika/automasi memainkan peranan penting dalam kemajuan dan

efisiensi kerja bidang ini.

Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan

penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom.  Pengetahuan mengenai aktivitas

DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning

DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen

DNA.  Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan

protein dan meneliti fungsinya. Makalah ini membahas tentang DNA Rekombinan.

B. Tujuan

Untuk mengetahui Teknologi DNA Rekombinan.

2

BAB II

PEMBAHASAN

A. Enzim Restriksi

1.Penemuan Enzim Restriksi

Pada tahun 1960an, telah ditemukan sekelompok enzim tertentu yang dapat

mendegradasi DNA dan menghambat (restrict) proses terjadinya infeksi dari bakteriofage

penginfeksi bakteri. Kelompok enzim ini, yang kemudian dikenal sebagai enzim restriksi

(Restriction Enzyme), terbukti berperan sangat penting dalam penerapan teknologi DNA

rekombinan di abad modern ini untuk memanipulasi DNA. Enzim restriksi adalah enzim

yang memotong dsDNA (baca: double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang

dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences).

Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda. Enzim yang dihasilkan oleh

berbagai jenis bakteri dan secara alami berfungsi untuk melindungi bakteri dari

inkorporasi DNA asing.

2. Penamaan Enzim Restriksi

Penamaan enzim restriksi biasanya berdasarkan inangnya, misalnya EcoRI

berasal dari bakteri E. coli. Dalam biologi molekuler, enzim restriksi biasanya digunakan

untuk analisis kekerabatan, rekayasa genetika dan identifikasi suatu molekul DNA.

Enzim restriksi mampu memotong DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang

sangat spesifik (Recognition site).

Dengan demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan yang

lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restrisi tertentu.

Oleh enzim restriksi ini, DNA genomik tanaman yang relatif kompleks organisasi DNA-

nya dapat dipotong-dipotong menjadi populasi potongan DNA dengan berbagai ukuran.

Sampai dengan tahun 1988an, telah diketahui hampir 475 macam enzim restriksi.

3

Situs pengenalan enzim restriksi kebanyakan terdiri dari empat basa atau enam basa,

tetapi ada juga yang selain itu. Pada umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki

situs pengenalan yang berbeda, namun ada beberapa enzim yang diisolasi dari sumber

yang berbeda memiliki situs pengenalan yang sama.

Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan

Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin beda.

Sekuen pengenalan biasanya sama urutan basanya pada kedua utas DNA bila dibaca

dengan arah yang sama. Sekuen ini disebut palindromik. Berdasarkan ujung hasil

pemotongannya, enzim restriksi dapat memotong dengan ujung lengket/lancip

(sticky/cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end).

Enzim yang memotong pada edua utas tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa

menghasilkan potongan dengan ujung lengket sedangkan enzim yang memotong pada

tempat yang berhadapan menghasilkan ujung tumpul contohnya adalah enzim SmaI.

Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh dari berbagai

jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering digunakan adalah

enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI, MspI dan lain-lain. Semua enzim tersebut

dapat dibeli pada perusahaan-perusahaan bioteknologi dengan harga yang sangat

bervariasi seperti Fermentas, Eppendorf, Sigma, Promega, Novagen dan Biogen.

3.Fungsi Enzim Restriksi

Enzim Restriksi terbukti berperan sangat penting dalam penerapan teknologi

DNA rekombinan di abad modern ini untuk memanipulasi DNA.

Enzim Restriksi memiliki fungsi sebagai berikut:

- Digunakan untuk memotong/mendegradasi dsDNA (baca: double stranded

DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut

situs pengenalan enzim (Recognition sequences).

- Menghambat (restrict) proses terjadinya infeksi dari bakteriofage penginfeksi

bakteri.

- untuk melindungi bakteri dari inkorporasi DNA asing.

4

4.Tipe Enzim Restriksi

Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari.

Selanjutnya,enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan

enzim restriksi tipe I.  Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai

spesies bakteri lainnya.

Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke

dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi

enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu

ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri.

Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa

genetika.

Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai

berikut:

1. Mengenali urutan mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh

pasang basa di dalam molekul DNA

2. Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam

molekul DNA

3. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat

tempat pengenalannya

4. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan

basa.Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan

pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi.

5

B. Enzim Ligase

Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA.Pemotongan DNA

genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung

potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus

dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in

vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi

menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4

atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat

digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik

pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah

disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk

menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan

diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA

ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada

suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan

menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. 

Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu

inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).

Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor,

khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid

yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal

ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi.

6

Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain

penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan

enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul

DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau

penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal

homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.

C. Vektor

1. Karakteristik Vektor DNA

Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:

a.     Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA

bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.

b.      Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector

(termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi

c.      Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi.  Hal ini

menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector 

sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.

7

2. Macam-macam Vektor

a. Plasmid

Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan

fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri.Vektor yang paling umum berukuran kecil

(kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid.  Molekul ini biasanya

ditemukan pada banyak bakteri.  Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen

resistensi terhadap antibiotik.

- Bakteriofag

- Kosmid

- Vektor YACs

- Vektor Yeps

- Vektor BAC

D. Teknologi DNA Rekombinan

1. Pengertian Teknologi DNA Rekombinan

Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan

organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk

memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu

teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut

melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi

protein tertentu atau pembentukan suatu produk.

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang

lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di

dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning

gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA

rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan

8

bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang

baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga

memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel

organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi

dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan

mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen

tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara

konvensional.

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui

teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1).

Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon,

pemotongan molekul DNA menja di sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi

DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul

DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan,

reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

2. Teknik DNA Rekombinan

9

Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk: mengisolasi

DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang

berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam

sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan

bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan

teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung

reaksi.

Teknik-teknik tersebut meliputi:

- Teknik untuk mengisolasi DNA

- Teknik untuk memotong DNA

- Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA

- Teknuk untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup

Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-

perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi,

enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak

DNA/RNA.

1. Vektor,berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus.

Gbr. Pembuatan plasmid dan mekanisme penyisipan gen

10

2. Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri.

Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi

3. Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI (pemotong plasmid/ADN) dan enzim

Ligase (penyambung ptongan-potongan ADN)

Gbr. Proses produksi insulin manusia dengan rekayasa genetika

11

E.Isolasi DNA

DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini

sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata.  Tetapi DNA dapat diekstrak dari

ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak.  Tahapan

dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan

pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis,

diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll. Dalam

ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan

Doyle dan Doyle 91989). 

Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang terdiri dari:

1. Elektroforesis DNA

Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel.  Molekul

DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran

listrik.  DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan

bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1).  Molekul yang berukuran besar,

memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel

dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul

DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan

DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

12

Gambar 1.  Elektroforesis DNA dengan gel agarosa

Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa.  Poliakrilamida

memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan

DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat

memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau

bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang

basa saja (dibawah 1000 pasang basa).  Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah

tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.

DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel

agarosa.  DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih

dulu sedang ujung lainnya mengikuti.  Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb)

bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya.  DNA

yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik

diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya.  Teknik

ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).

13

Pulsed field gel electrophoresis

Gambar 2. Pulsed field gel electrophoresis

Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA.  Seperti juga DNA,

RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal

dan memiliki struktur sekunder atau tersier.  Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan

dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan

pasangan basa.  RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau

tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap

ukurannya.  Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip

yang sama.

2. . Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi

Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali

urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah

ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut.  Contohnya adalah enzim EcoRI yang

ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I)

ditemukan pada spesies ini.  Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

14

Gambar 1. Situs pengenalan enzim restriksi

Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda,

misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan  6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong

dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan

fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4).  Jadi sebuah molekul akan

menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu

set enzim restriksi yang berbeda.

15

Gambar 2. Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran

yang bervariasi

Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri

Staphylococcus aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′

sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira

satu kali dalam 250bp.  Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens

oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata

memotong hanya sekali dalam 65 kb.

Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada

pada struktur hasil produk pemotongannya.  Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan

produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan

ujung lengket (Gambar 3).

16

Gambar 3.  Ujung lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil pemotongan DNA

dengan enzim restriksi

3. Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik

DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali

(untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer).  Hal ini

menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang

terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang

sesuai kekuatan ion dan temperaturnya.  Proses perpasangan basa antara polinukleotida

utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi.

Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari

sekuens yang komplementer.  Sebagai contoh, hibridisasi merupakan dasar untuk

mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks.  Dalam hal

ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang

dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia.  Probe digunakan untuk

mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. 

17

DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat

telah menemukan sekuens targetnya.    Campuran yang telah ter=probe dipisahkan

berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of

clones) Gambar 6.

Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui

ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan.  Saat diwarnai dengan

etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast

dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi

‘band’ DNA yang terpisah.  Mereka tampak ‘smear’.  Teknik yang dianamakan Southern

blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear

DNA. 

Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. 

Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat

DNA akan terikat.  Setelah DNA tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan

probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. 

‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan

kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat.  Dalam kondisi ini DNA probe akan

berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat.

Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh

DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos

ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos

sama dengan lokasi hybrid (Gambar 1).

18

Gambar 1.  Hasil probing DNA

4. Kloning DNA

Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel

disebut kloning DNA.  Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk

memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. 

Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang

memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang

terpotong dengan DNA lain.  Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang

dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan

diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.

19

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik

maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam

molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid

pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai

bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar

ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan

tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila

dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan

dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna

DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA

plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap

oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan

etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada

kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi

kerapatan.

a. Kloning DNA dalam plasmid vektor

DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor

untuk diperbanyak.  Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA

adalah bakteri E. coli. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:

1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA

bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.

2. Mengandung marker selektif yang menyebabkan sel yang membawa vektor

(termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi.

3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi.  Hal ini

menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector 

sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.

20

Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA

sirkular disebut plasmid.  Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri.  Pada

banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.

Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang

mudah.  Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector

disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI.  Potongan DNA yang akan diklon

kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 1).

Gambar 1.  Kloning DNA dalam plasmid vektor

b. Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi

Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari

lingkungan.  Beberapa bakteri, tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami

dan dikatakan memiliki kompetensi genetik.  E. coli dapat bersifat kompeten mengambil

DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium.   Antibiotika kemudian ditambahkan dalam

medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini

disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium,

sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).

21

c. Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning

Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing

berisi insert yang berbeda.  Untuk membuat perpustakaan DNA, DNA target dipotong

dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. 

Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase.  DNA

yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong

dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase.  Hal ini menghasilkan koleksi

vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 2).

Gambar 2.  Pembentukan DNA library

Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari

berbagai sumber.  Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA

genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.‘cDNA library’ dikembangkan

untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library.  cDNA library dibuat dengan

menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA.  Proses ini disebut reverse

transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9).  Saat diberi

perlakuan dengan reverse transcriptase, mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas

ganda  yang disebut cDNA (copy DNA).

22

Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada

DNA genomic.  cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan

fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vektor.

Gambar 2. Pembentukan Cdna

d. Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library

Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan

menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan

DNA gen yang diinginkan.  Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel

digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization.

cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat

dalam vektot umum.  Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai

inang, sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar.  Tiap sel akan tumbuh

menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari

library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing.

23

Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada

membrane.  Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter.  Filter yang mengandung sel

diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada

filter pada lokasi yang sama dengan sel.  Filter selajutnya diinkubasi dengan probe.

e. PCR (polymerase chain reaction)

PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan

menggunakan enzim Taq polimerase.  PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian

DNA yang pendek (sampai 10 kb). Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983,

teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat

bervariasi. Protokol dasar PCR adalah:

1. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas yang

berfungsi sebagai cetakan.

2. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada

temperature rendah.  Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan

cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target.

3. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim  DNA polymerase dapat melakukan

sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru.

4. Utas ganda DNA yang baru disintesis, didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus

berulang.

24

Gambar 10 menunjukkan proses PCR.  Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis

dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-

transiluminator.

Gambar 1. Proses PCR

25

BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pembahasan, dapat disimpulkan bahwa:

Teknik dari Teknologi DNA Rekombinan terdiri dari:

- Teknik untuk mengisolasi DNA

- Teknik untuk memotong DNA

- Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA

- Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup

B. Saran

Dengan mempelajari Biologi Molekuler diharapkan kita bisa menerapkan berbagai teknologi

untuk hal-hal yang lebih berguna.

26

DAFTAR PUSTAKA

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.  1989.  Molecular cloning. A laboratory manual. 

Cold Spring Harbor Lab Press, USA.

Watson, J.D., T.A. Baker, S.P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. 2008.  Molecular

Biology of The Gene.  Pearson Education, Inc, San Francisco

27