UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE ENGENHARIA E ARQUITETURA
Curso de Engenharia Ambiental
Cristiane Tedesco
REMOÇÃO DE CROMO VI PELA MICROALGA Spirulina platensis
Passo Fundo, 2010.
1
Cristiane Tedesco
REMOÇÃO DE CROMO VI PELA MICROALGA Spirulina platensis
Orientadora: Dra. Luciane Maria Colla
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
ao Curso de Engenharia Ambiental da
Faculdade de Engenharia e Arquitetura da
Universidade de Passo Fundo, como requisito
para a obtenção do título de Engenheira
Ambiental, sob orientação da Dra Luciane
Maria Colla.
Passo Fundo
2010
2
AGRADECIMENTO
Primeiramente agradeço a Deus
pela oportunidade de estar aqui hoje
A minha família, que sempre me apoiou em toda
a minha graduação, nunca permitindo que eu
desanimasse perante as dificuldades.
Professora Dra. Luciane Maria Colla, pela
orientação, pelos ensinamentos, pela amizade,
pela dedicação com o trabalho e principalmente
pela compreensão quando não consegui
desenvolver todas as atividades.
Ao professor Dr. Marcelo Hemkemeier, pela
dedicação, amizade e pela co-orientação deste trabalho.
Aos colegas formandos que estiveram sempre
junto comigo nessa longa caminhada,
compartilhando momentos felizes e tristes, e a todos
os amigos e amigas que conquistei na
Engenharia Ambiental.
Meu sincero agradecimento...
3
RESUMO
A biossorção é uma técnica que se fundamenta na ligação dos metais com materiais
biológicos, tais como biomassas microbianas, para proporcionar a retenção, remoção ou
recuperação de metais pesados de um ambiente líquido. A microalga Spirulina tem sido
estudada pela possibilidade de serem utilizadas no tratamento de efluentes e na remoção
de metais pesados em soluções aquosas, através do acúmulo destes metais por
precipitação ou pela ligação dos componentes presentes na parede celular. Objetivou-se
avaliar a influência da concentração inicial de cromo VI em meio de cultivo padrão
(Zarrouk) sobre os parâmetros de crescimento e sobre a remoção do metal pela microalga
S. platensis. Os experimentos foram realizados através de um Planejamento Fatorial
Misto 21.4
1, sendo as variáveis de estudo a cepa da microalga S. platensis (paracas ou
Leb) e a concentração inicial de Cr VI no meio de cultivo (0, 10, 20 e 30 mg.L-1
). A
microalga foi cultivada no meio Zarrouk, a 30ºC, fotoperíodo de 12 h e agitação, durante
30 d. Amostras dos cultivos foram retiradas diariamente para avaliação do crescimento da
microalga e quinzenalmente para avaliação do potencial de remoção, num período de 30
d. A microalga Spirulina platensis foi capaz de realizar a biossorção de cromo VI nos
meios contaminados com 10 mg/L, 20 mg/L e 30mg/L de cromo VI, com remoções de
78%, 88% e 92%, respectivamente.
Palavras Chaves: Remoção de metais, microalga, bioacumulação, Spirulina platensis.
4
ABSTRACT
Biosorption is a technique that is based on the binding of metals with biological
materials, such as microbial biomass, to provide the retention, removal or recovery of
heavy metals in a liquid environment. The Spirulina has been studied for possible use in
the treatment of wastewater and remove heavy metals from aqueous solutions through the
accumulation of these metals by precipitation or by binding of the components present in
the cell wall. The objective was to evaluate the influence of initial concentration of
chromium VI in standard culture medium (Zarrouk) on growth parameters and on the
metal removal by microalgae S. platensis. The experiments were carried out through a
21:41 Joint Planning Factor, and the study variables were the strain of microalgae S.
platensis (Paracas or Leb) and initial concentration of Cr VI in the culture medium (0, 10,
20 and 30 mg.L-1). The microalgae were cultivated in the middle Zarrouk, 30 ° C,
photoperiod of 12 h, stirring, for 30 d. Samples of cultures were taken daily to assess
growth of microalgae and biweekly for assessing the potential for removal, a period of 30
d. The microalga Spirulina platensis was able to accomplish the biosorption of chromium
VI in contaminated media at 10 mg / L, 20 mg / L and 30mg / L of chromium VI, with
removals of 78%, 88% and 92% respectively.
Keywords: Metals removal, microalgae, bioaccumulation, Spirulina platensis.
5
Lista de Figuras
Figura 1: Spirulina platensis.......................................................................................... 17
Figura 2: Ciclo de vida da Spirulina platensis. ............................................................... 18
Figura 3: Assimilação de amonônio através das enzimas glutamina desidrogenase (GDS)
e glutamina Sintetase (GS). ........................................................................................... 22
Figura 4: Fluxograma das atividades do projeto do trabalho de conclusão de curso
realizadas no Laboratório de Fermentações da Faculdade de Engenharia e Arquitetura.. 32
Figura 5: Esquema simplificado dos cultivos aerados da cianobactéria Spirulina platensis.
..................................................................................................................................... 34
Figura 6: Técnica de separação de células por filtração.................................................. 36
Figura 7: Curva padrão da microalga Spirulina platensis Paracas. ................................. 37
Figura 8: Curva padrão da microalga Spirulina platensis Leb. ....................................... 38
Figura 9: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 1
(controle). ..................................................................................................................... 38
Figura 10: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 5
(controle). ..................................................................................................................... 38
Figura 11: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 2
(contaminação de 10 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39
Figura 12: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 6
(contaminação de 10 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39
Figura 13: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 3
(contaminação de 20 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39
Figura 14: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 7
(contaminação de 20 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39
Figura 15: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 4
(contaminação de 30 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39
Figura 16: Concentração Celular (gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 8
(contaminação de 30 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39
Figura 17: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 1 (concentração inicial de 0 mg/L de Cromo VI)........... 40
Figura 18: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
6
cálculo da umax do experimento 2 (concentração inicial de 10 mg/L de Cromo VI). ........ 40
Figura 19: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 3 (concentração inicial de 20 mg/L de Cromo VI). ........ 40
Figura 20: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 4 (concentração inicial de 30 mg/L de Cromo VI). ........ 40
Figura 21: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 5 (concentração inicial de 0 mg/L de Cromo VI)........... 41
Figura 22: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 6 (concentração inicial de 10 mg/L de Cromo VI). ........ 41
Figura 23: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 7 (concentração inicial de 20 mg/L de Cromo VI). ........ 41
Figura 24: Regressão exponencial da concentração de biomassa versus tempo para o
cálculo da umax do experimento 8 (concentração inicial de 30 mg/L de Cromo VI). ........ 41
Figura 25: Remoção de cromo VI (%) em função da concentração inicial de cromo nos
cultivos, da cepa e do tempo de cultivo (d). ................................................................... 44
7
Lista de Tabelas
Tabela 1: Padrões de potabilidade de água para metais pesados ..................................... 31
Tabela 2: Valores máximos admissíveis de alguns metais, para o descarte de efluentes. 31
Tabela 3: Composição química do meio Zarrouk ........................................................... 33
Tabela 4: Matriz do Planejamento Fatorial Multiníveis 21.4
1. ........................................ 35
Tabela 5: Concentração celular máxima, tempo de geração (Tg), velocidade específica
máxima de crescimento (µmax) e intervalo da fase logarítimica de crescimento para os
experimentos do planejamento experimental. ................................................................ 42
Tabela 6: Remoção de Cromo VI nos experimentos do Planejamento Experimental aos 15
d e 30 d de cultivo da microalga Spirulina ..................................................................... 43
8
Sumário
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 10
2 DESENVOLVIMENTO ...................................................................................... 12
2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 12
2.1.1 BIOPROCESSOS ....................................................................................... 12
2.1.2 PROCESSOS FOTOSSINTÉTICOS ...................................................... 12
2.1.3 Spirulina platensis ...................................................................................... 13
2.1.3.1 Histórico e Uso.............................................................................. 13
2.1.3.2 Vantagens e Desvantagens do Cultivo de Microalgas .................... 15
2.1.3.3 Características da Spirulina platensis............................................. 16
2.1.3.4 Condições de Cultivo .................................................................... 18
2.1.3.4.1 Luminosidade ........................................................................... 19
2.1.3.4.2 Fontes de Carbono .................................................................... 20
2.1.3.4.3 Fontes de Nitrogênio ................................................................. 21
2.1.3.4.4 Concentração de Oxigênio ........................................................ 23
2.1.3.4.5 Temperatura.............................................................................. 24
2.1.3.4.6 Aeração e Agitação ................................................................... 24
2.1.3.4.7 Salinidade ................................................................................. 24
2.1.4 CONTAMINAÇÃO DAS ÁGUAS POR METAIS................................. 25
2.1.5 PROBLEMAS DE SAÚDE CAUSADOS POR CONTAMINAÇÕES
COM CROMO..................................................................................................... 26
2.1.6 BIOSSORÇÃO ...................................................................................... 27
2.1.6.1 Biossorção de Cromo VI ............................................................... 28
2.1.7 LEGISLAÇÃO AMBIENTAL ............................................................... 30
2.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 32
2.2.1 CULTIVO DA MICROALGA Spirulina platensis ................................. 33
2.2.1.1 Meio de cultivo ............................................................................. 33
2.2.1.2 Condições de Cultivo e Biorreatores .............................................. 34
2.2.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL .................................................. 35
9
2.2.3 DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS ...................................................... 35
2.2.3.1 Determinação do pH ...................................................................... 35
2.2.3.2 Determinação da Concentração Celular ......................................... 35
2.2.3.3 Determinação de Metais ................................................................ 36
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 37
2.3.1 DETERMINAÇÃO DO pH .................................................................... 37
2.3.2 CRESCIMENTO DA BIOMASSA ........................................................ 37
2.3.3 REMOÇÃO DO METAL ....................................................................... 43
3 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 45
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 46
APÊNDICES ................................................................................................................ 50
10
1 INTRODUÇÃO
A necessidade de tratamento eficiente e econômico para remoção de metais
tóxicos tem resultado no desenvolvimento de tecnologias como biossorção, baseada na
utilização de materiais de origem natural ou biomassas microbianas como as algas
(BAIRD, 2002).
A biossorção é uma técnica que se fundamenta na ligação dos metais a materiais
biológicos, tais como biomassas microbianas, para proporcionar a retenção, remoção ou
recuperação de metais pesados de um ambiente líquido (MURALEEDHARAN et al.,
1991). Um aspecto importante da biossorção é que ela pode ocorrer mesmo com células
metabolicamente inativas. Isto pode ser considerado uma grande vantagem, pois facilita a
recuperação do metal e possibilita a reutilização do material biossorvente (TOBIN et al.,
1994).
Atualmente, um dos problemas mais sérios que afetam o meio ambiente é a
poluição química de natureza orgânica ou inorgânica. Alguns metais pesados são
substâncias altamente tóxicas. As formas em que os metais se encontram em solução
determinam o tratamento específico a ser escolhido (BAIRD, 2002).
A ocorrência natural de sais de metais pesados é muito rara, sendo a indústria a
principal responsável por sua emissão nos cursos d´água. Este fato representa um perigo
de primeiro grau, pois o comportamento dos metais não pode ser controlado na prática,
sabe-se que as intoxicações que eles provocam desenvolvem-se lentamente, sendo muitas
vezes identificadas somente depois de anos (BAIRD, 2002).
A produção de microrganismos fotossintéticos, como microalgas e cianobactérias,
tem sido amplamente estudada na biotecnologia, pois esses microrganismos apresentam
um sistema biológico muito eficiente para a utilização da energia solar e para a produção
de compostos orgânicos (VONSHAK, 1997).
A Spirulina tem sido estudada devido a sua composição química, rica em
proteínas e outros nutrientes (minerais e ácidos graxos poli-insaturados) e pelo seu
crescimento rápido em ambientes aquáticos ricos em sais. Além disso, a capacidade
destes microrganismos concentrarem metais tóxicos é bem conhecida (RICHMOND,
1990). Nos anos 80, começaram a surgir problemas de contaminação ambiental e de
reciclagem de resíduos, e, neste caso, as microalgas tornaram-se importantes pela
capacidade de utilização de resíduos orgânicos e inorgânicos de águas (DERNER, et al.,
11
2006).
Enquanto grandes empresas de alguns países se dedicaram à produção de
Spirulina sp. visando atender o mercado consumidor, centros de pesquisa em todo o
mundo começam a estudá-la, sob os diversos aspectos, tais como perfil bromatológico em
células cultivadas sob diferentes condições físico-químicas, diversificação das fontes de
nutrientes visando o cultivo e utilização da biomassa na biopurificação de efluentes. As
algas são bioindicadores de ambientes contaminados, já que são bioacumuladores. Além
de acumularem substâncias minerais, acumulam também metais tóxicos. As algas do
gênero Spirulina e Chororella possuem lipídeos, que estão relacionados com a qualidade
ambiental, já que em se tratando de poluição, acumulam lipóides, além de acumularem
também metais tóxicos (NUNES et al., 2003).
Objetivou-se verificar a remoção de cromo VI a partir da microalga Spirulina
platensis crescendo em meio Zarrouk padrão, bem como avaliar o efeito das
concentrações de Cromo VI sobre os parâmetros de crescimento da microalga.
12
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.1 BIOPROCESSOS
A definição de bioprocessos no contexto da biotecnologia ambiental refere-se à
aplicação de microrganismos (bactérias, fungos, algas), ou organismos mais
desenvolvidos como os protozoários e rotíferos, capazes de eliminar total ou parcialmente
substâncias tóxicas ao meio ambiente e seres vivos a este integrados, inclusive o homem
(MALAJOVICH, 2004).
O primeiro processo fermentativo industrial (bioprocesso) foi à produção de
vinhos e cerveja. Ao longo do século XX, a expansão da microbiologia industrial e o
desenvolvimento de bioprocessos baseados no metabolismo microbiano possibilitaram a
produção de diversas substâncias (antibióticos). Por motivos históricos, ainda hoje o
termo processos fermentativos se aplica em biotecnologia a qualquer processo
microbiano operando em grande escala, independentemente se este seja ou não uma
fermentação. E o termo fermentador se usa como sinônimo de biorreator, designando o
recipiente onde ocorre o processo, sendo este o elemento principal (MALAJOVICH,
2004).
De uma forma geral, um bioprocesso começa com a escolha do agente biológico
adequado, segue com a transformação da matéria prima, em condições que podem exigir
esterilização, aeração e controle do processo (pH, temperatura e etc), e finaliza com a
separação e purificação do produto final (MALAJOVICH, 2004).
2.1.2 PROCESSOS FOTOSSINTÉTICOS
O termo fotossíntese significa construção ou síntese pela luz. A fotossíntese é o
processo através do qual as plantas sintetizam compostos orgânicos a partir de matéria
13
prima inorgânica na presença de luz solar. As algas e as plantas e certas bactérias captam
essa energia diretamente da radiação solar e a utilizam para a síntese de alimentos
essenciais. Portanto, no nosso planeta a fonte primaria de toda energia metabólica é o sol
e a fotossíntese e são essencial para a manutenção de todas as formas de vida aqui
existente (HALL, 1980).
A fotossíntese pode ser definida como o processo mediante o qual a energia
luminosa é utilizada na síntese de compostos orgânicos. Assim, pode-se classificas os
organismos vivos em dois grandes grupos: autotróficos e heterotróficos. Os autotróficos
são capazes de sintetizar suas próprias substancias complexas a partir de substancias
simples como CO2 e H2O, utilizando a energia proveniente de diversas fontes. De acordo
com o tipo da fonte energética, têm-se autotróficos fotossintetizantes e os autotróficos
quimiosintetizantes os quais utilizam a luz solar e a energia resultante da reação de óxido-
redução, respectivamente (FERRAZ,1986).
Já os seres heterotróficos obtêm a energia necessária para a sua sobrevivência
mediante reações degradativas de moléculas complexas que retiram do meio ambiente e
convertendo-as em CO2 e H2O (FERRAZ,1986).
O processo fotossintético pode ser dividido em aeróbio ou anaeróbio. Portanto,
quando usa oxigênio , no caso das Spirulinas, trata-se de fotossíntese aeróbia, isso é a
cianobactéria utiliza a água como doadora de elétrons e líber oxigênio molecular
(CEZARE,1998).
2.1.3 Spirulina platensis
2.1.3.1 Histórico e Uso
As microalgas representam os únicos seres vivos por mais de 3 milhões de anos,
mas o estudo científico dos mesmos começou somente em 1980 (VONSHAK, 1997). A
Spirulina contém bilhões de anos de sabedoria evolutiva no seu DNA e é o fruto da
primeira forma de vida fotossintética da Terra (ABALDE et al., 1995).
A Spirulina foi “redescoberta” nos anos 60. Jean Léonard, botânico presente em
uma expedição franco-belga à África, descreveu um bolo azul-esverdeado, encontrado no
14
mercado de Fort Lamy, em Chad. Estudos posteriores revelaram que este bolo, chamado
localmente de dihé, continha uma alga azul-esverdeada identificada como Spirulina. Essa
alga era consumida pela tribo Kanembu, que vivia as margens dos lagos Chad e Niger.
Os integrantes desta tribo apresentavam constituição física diferenciada, pois cerca de
70% dos alimentos consumidos eram algas (DERNER et al, 2006).
Ao mesmo tempo em que Léonard descobria a Spirulina na África, o Instituto
Francês do Petróleo recebia um pedido da Companhia Sosa Texcoco, localizada próxima
à cidade do México: o estudo de uma alga que vivia nos lagos de produção de carbonato
de sódio e aparecia com a evaporação da água. Como resultado, o primeiro estudo
detalhado dos requerimentos nutricionais e da fisiologia da Spirulina foi realizado. Neste
estudo, parte da tese de pós-doutorado de Zarrouk, foi o desenvolvimento da base para o
estabelecimento da produção de Spirulina em larga escala (DERNER et al, 2006).
A Spirulina apareceu, como forma de alimento humano, em períodos diferentes
da história humana. Foi o alimento dos Astecas do México e tem sido a alimentação do
povo Kanembu, da África Central durante séculos. Foi usada em partes do Sudeste da
Ásia, há mais de mil anos atrás, em sopas (DERNER et al, 2006).
Uma análise da literatura histórica revela que 25 amostras separadas de alga de
água fresca foram recolhidas e ingeridas em 15 países diferentes, portanto está bem
testada e é confiada por várias culturas diferentes (DERNER et al, 2006).
A Spirulina é a microalga mais conhecida e usada no Brasil. Quando manipulada
e transformada em biomassa, é uma riquíssima fonte de vitaminas e sais minerais, além
de conter proteínas de ótima qualidade. Entre plantas e animais é o organismo que mais
tem vitamina B12, cuja principal função no ser humano é aumentar a absorção de
proteínas. O uso da Spirulina é uma das alternativas mais claras para a solução dos
problemas de nutrição da sociedade do futuro (COLLA, 1999).
A microalga Spirulina Platensis tem muitas aplicações biotecnológicas, uma
destas aplicações tem sido na aqüicultura, para a alimentação direta ou indireta de
algumas espécies de peixes, moluscos, crustáceos e de diversos organismos forrageiros
de interesse econômico (DERNER et al., 2006).
Muitos estudos vêm sendo realizados nos mais diversos campos, tais como, no
tratamento de águas residuais de inúmeros processos industriais, para a detoxificação
biológica e remoção de metais tóxicos; como bioindicadores, na detecção de nutrientes
(para as microalgas) e substâncias tóxicas (detergentes, efluentes industriais, herbicidas
etc.). Na agricultura, a biomassa pode ser empregada como biofertilizante do solo
15
(DERNER et al., 2006).
As microalgas podem produzir uma gama de moléculas bioativas com
propriedades antibióticas, anticâncer, antiflamatórias, antivirais, redutoras de colesterol,
enzimáticas e com outras atividades farmacológicas (DERNER et al., 2006).
Além disso, podem ser usadas na mitigação do efeito estufa, pela assimilação do
CO2, resultado do processo de queima dos combustíveis fósseis e de práticas agrícolas
impróprias (as queimadas, por exemplo). Ainda, possibilitam produção de bicombustíveis
(biodiesel, por exemplo) (DERNER et al., 2006).
A cultura da Spirulina é parte da nova era da agricultura ecológica. A componente
chave da produção de Spirulina é a luz do Sol e é dada atenção à medição da temperatura
e aos níveis de oxigênio. Porque os pesticidas e herbicidas matariam muitas formas de
vida num lago, os cientistas de algas aprenderam a equilibrar a ecologia do lago sem usar
essas substâncias prejudiciais. Esta forma de aqüicultura representa uma das soluções
necessárias à produção de alimentos enquanto se restaura o planeta.
2.1.3.2 Vantagens e Desvantagens do Cultivo de Microalgas
As Spirulinas sp. apresentam muitas vantagens em relação à produção de
proteínas a partir da agricultura ou pecuária, pois é um microrganismo aquático, não
requer solo fértil e não causa erosão nem contaminação de terras e águas (MAIER et al.,
2000).
O conceito de produção é muito semelhante ao da agricultura convencional, em
que ocorre o uso da energia solar, pelo aparelho fotossintético, na produção de biomassa
(VONSHAK, 1997).
Sob condições naturais, muitas algas crescem em comunidades mistas, incluindo
várias espécies e gêneros. Quando o objetivo é estudar ou cultivar espécies individuais,
um meio que possibilite condições seletivas é indispensável para o cultivo. Os principais
requerimentos incluem carbono, fósforo, nitrogênio, enxofre, potássio e magnésio. Íons
ferro e manganês são requeridos em pequenas quantidades. Outros como cobalto, zinco,
boro, cobre e molibdênio são essenciais (BECKER, 2004).
Em condições normais, a Spirulina pode ser uma das muitas espécies presentes
em águas naturais, mas quando a salinidade e a alcalinidade aumentam, o habitat se torna
16
inadequado para outras formas de vida e a Spirulina se converte na única espécie.
Um aspecto interessante ligado a Spirulina é o seu meio de cultura; que pode ser
composto por efluentes rurais e urbanos ricos em nitrogênio e fósforo. Desta forma, a
partir do cultivo recupera-se quase que a totalidade desses elementos, evitando a
proliferação de algas indesejáveis e produzindo biomassa para consumo humano e animal
(LIMA et al., 1999).
Diversos são os fatores que podem influenciar o crescimento da Spirulina
platensis, tais como: pH, salinidade, luminosidade, presença de contaminantes,
temperatura, acúmulo de oxigênio e presença de íons bicarbonato, fonte de nitrogênio,
tipo de biorreator, densidade da população (REINEHR,2001).
Ainda que a Spirulina tenha uma boa adaptação á água salgada, são poucas cepas
que crescem no mar, porque o baixo conteúdo em carbonatos e as elevadas concentrações
de magnésio e cálcio da água marinha inibem o seu desenvolvimento (HENRIKSON,
1994).
2.1.3.3 Características da Spirulina platensis
As Spirulinas são classificadas como seres procariotos (parede celular,
ribossomos e ácidos nucléicos), imóveis, não esporulados e estão incluídas no grupo das
bactérias. Sua natureza procariota, seus pigmentos do tipo ficobiliprotéico e produção de
oxigênio via fotossintética as diferencia das algas eucariotas e bactérias fotossintéticas
(LIMA et al., 1999).
As cianobactérias, ainda que se trate de seres procariontes, são muito mais
complexas que as bactérias, pois possuem uma molécula de DNA, membrana tilacóide e
várias inclusões ou estruturas citoplasmáticas e parede celular característica (DERNER et
al., 2006). Hoek et al., (1995) apontam que uma das principais características das
cianobactérias é possuírem pigmentos fotossintetizantes livres no citoplasma.
As Spirulinas vivem em meios líquidos ricos em sais minerais compostos
principalmente por bicarbonato e carbonato de sódio, com pH 8 a 11. As regiões
propícias para cultivo são as tropicais e subtropicais, quentes e ensolaradas. São
utilizadas como fonte de alimento na dieta humana e ração animal, possuindo elevados
teores protéicos e contendo todos os aminoácidos essenciais em proporções que
17
satisfazem as recomendações da FAO (Food and Agriculture Organization). As
Spirulinas são capazes de acumular germânio, que é importante devido à sua atividade
hemolítica e indutora de interferon. Além disso, possuem efeito hipocolesterolêmico, ou
seja, seu consumo pode abaixar os níveis de colesterol no sangue, conforme foi descrito
em literatura (LIMA et al., 1999).
ALONSO (1998), descreve a Spirulina como sendo uma alga de cor azul
esverdeada, que se apresenta na forma espiral, conforme mostra a Figura 1, daí seu nome.
Seu reconhecimento é fácil já que forma uma espuma verde sobre a superfície da água.
Geralmente é encontrada em lugares com muita luz solar e águas doces alcalinas.
Figura 1: Spirulina platensis
O gênero Spirulina pertence ao reino Monera, classe Cyanophyceae e à família
Oscillatoriaceae e compreende o grupo das cianobactérias filamentosas (microalgas
verde-azuladas). É caracterizado por cadeias de células, constituindo um filamento na
forma de espiral, denominado tricoma. Os tricomas são constituídos por células
cilíndricas, curtas e largas, revestida por uma fina membrana. Seu diâmetro pode variar
de 6 a 12 µm, e as estruturas helicoidais formadas por este filamento podem apresentar
diâmetro que variam de 30 a 70 µm. As dimensões celulares, o grau de ondulação e o
comprimento dos filamentos variam de espécie para espécie. Esta última característica
também pode variar conforme as condições ambientais de crescimento
(HENRIKSON,1994).
Ainda, a Spirulina é uma microalga filamentosa que habita meios como solos,
pântanos, lagos alcalino e águas salobras, marinhas e doces. Por meio da fotossíntese,
converte os nutrientes em matéria celular e libera oxigênio. Os nutrientes de que necessita
são água e fonte de carbono, nitrogênio, fósforo, potássio, ferro e outros oligoelementos.
Em lagos natural o aporte limitado de nutrientes pode regular os ciclos de crescimento,
sendo que a densidade celular cresce rapidamente, alcança uma concentração máxima e
18
retrocede quando os nutrientes se esgotam. A liberação de nutrientes por parte das células
mortas ou o aporte de nutrientes de fora do lago iniciam um novo ciclo (HENRIKSON,
1994).
O ciclo de vida da Spirulina inicia quando um tricoma maduro se quebra em
vários pedaços através de formação de células especializadas denominadas necrídios, que
após a lise, proporcionam a formação de discos de separação bicôncavos. A separação
dos necrídios leva à formação dos hormogônios, os quais formam um novo tricoma. As
células dos hormogônios perdem a porção final dos necrídios, apresentando uma parede
celular final muito pequena ou ausente nas porções finais. Durante esse processo, o
citoplasma aparece menos granulado e as células assumem uma coloração verde-azulada
pálida. O número de células no hormogônio aumenta pela fissão celular enquanto o
citoplasma começa a apresentar-se granulado, as células assumindo uma coloração verde-
azulada brilhante. Por este processo, os tricomas aumentam em comprimento e assumem
a forma helicoidal típica (RICHMOND, 1990). Na Figura 2 é apresentado um esquema
representativo do ciclo de vida da Spirulina.
Figura 2: Ciclo de vida da Spirulina platensis.
2.1.3.4 Condições de Cultivo
Cada microrganismo possui condições ótimas de crescimento, tais como
temperatura, pH, e níveis de oxigênio dissolvido. O meio de cultivo tem grande
influência nesse processo e deve conter os nutrientes requeridos para o crescimento
celular (PIRT, 1975).
19
O cultivo de microalgas como parte da biotecnologia moderna tem recebido a
atenção de pesquisadores em todas as partes do mundo. As condições de crescimento e os
biorretores para o cultivo têm sido exaustivamente estudados (COLLA, 2004).
As fontes de energia classificadas nos seguintes grupos:
a) Fontes de elementos principais (carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio);
b) Fontes dos elementos secundários (fósforo, enxofre, potássio e magnésio);
c) Vitaminas e hormônios;
d) Fontes de elementos “traços”, requerimento em quantidades mínimas para o
crescimento microbiano (cálcio, ferro, zinco e cobre). Usado em concentrações da
ordem de 10-4
para concentrações de 30 gramas de células seca por litro.
Alguns autores sugerem que a formação do meio de cultivo leve em conta a
composição celular, requerimento energético e a necessidade de substâncias específicas
(WANG et al., 1979).
O meio para crescimento microbiano deve conter os elementos presentes na
célula, em proporções corretas. As fontes de nitrogênio podem ser orgânicas ou
inorgânicas e não podem faltar na composição do meio, pois sua falta prejudica o
crescimento celular.
2.1.3.4.1 Luminosidade
As algas utilizadas para a produção de biomassa pertencem ma maioria das
vezes aos gêneros Chlorella, Scenedesmus ou Spirulina. Podem crescer
fotossisteticamente e autotroficamente, luz e fonte de carbono inorgânico ou
heterotroficamente, com compostos orgânicos como fonte de carbono e de energia. O
método mais racional para a obtenção de biomassa de algas deve ser autotroficamente e o
fator limitante é a iluminação (BU’LOCK e KRISTIANSEM, 1991).
Segundo VONSHASK, (1997), a disponibilidade de luz é um dos principais
problemas observados no cultivo fotoautotrófico de microalgas. A luz precisa ser
continuamente fornecida ao sistema porque não pode ser acumulada. A limitação do
crescimento em culturas densas pode ocorrer devido ao sombreamento provocado pelas
próprias células à medida que há o crescimento, impedindo que parte da cultura receba a
incidência da luz. Para o caso específico da Spirulina, o fenômeno do sombreamento
ocorre em concentrações superiores a 0.5 g.L-1
. A agitação da cultura pode ser um fator
20
decisivo na velocidade de crescimento, possibilitando uma absorsão homogênea da luz
pelas células.
A Spirulina é considerada fotoautotrófica e não cresce no escuro, mesmo que o
meio contenha fonte de carbono orgânica. Na presença de luz a alga pode utilizar
carboidratos, como por exemplo, glicose a 0,1% no meio aumentando a velocidade de
crescimento e produção de células (FERRAZ et al., 1985).
Para o crescimento da Spirulina é preferível ter uma fonte de iluminação
artificial em vez da luz solar, uma vez que a ultima possui ondas ultravioletas, os quais
são prejudiciais as células da microalga. Mil lux de iluminação artificial é suficiente para
o crescimento da maioria das microalgas (MICHEL et al., 1986).
2.1.3.4.2 Fontes de Carbono
O crescimento de algas quimiotróficamente ou fotoautróficamente ocorre pela
utilização de CO2 ou uma de suas formas hidratadas para a síntese de compostos
orgânicos. Na água, o CO2 pode apresentar-se como H2CO3, HCO3-
ou CO3-2
,
dependendo do pH (RICHMOND, 1990).
O Dióxido de Carbono é a fonte de carbono para o crescimento das algas. O ar
contém somente 0.03% de CO2, sendo necessária a adição de CO2 a cultura
(RICHMOND, 1990).
Cianobactérias são capazes de utilizar tanto o CO2 livre ou CO3-2
como fonte de
carbono inorgânico na fotossíntese. Os íons hidrogenocarbonatos podem ser
transportados (na presença de luz) através da membrana plasmática sendo acumulados na
célula para servir como carbono inorgânico na fotossíntese. O hidrogenocarbonato é
convertido a CO2 pela ação da enzima anidrase carbônica através da reação, como
mostrado na Equação 1:
HCO3- + H
+ → CO2 + H2O Equação (1)
A atividade da anidrase carbônica aumenta quando as concentrações de CO2
externo diminuem (FAY, 1983).
21
2.1.3.4.3 Fontes de Nitrogênio
Depois do carbono, o nitrogênio é quantitativamente o elemento mais importante
contribuindo com a massa seca das células. A proporção de nitrogênio pode variar de 1-
10% em peso seco.
Algumas cianobactérias são capazes de fixar nitrogênio atmosférico pela
redução do N2 a NH4+
catalisada pela enzima nitrogenase (RICHMOND, 1990). A
nitrogenase é extremamente sensitiva ao O2 livre e atua somente em condições
anaeróbicas. A sensibilidade da nitrogenase ao O2 e o fato de estar presente somente em
organismos procarióticos sugere que a habilidade para fixar nitrogênio foi desenvolvida
durante o período anoxigênico da história da terra. A passagem para o período oxigênico
e o aumento das pressões parciais de O2 tornou necessário que as formas fixadoras de N2
se adaptassem, fazendo surgir compartimentos na célula que impedissem a inativação da
nitrogenase pelo O2 atmosférico e também da atividade fotossintética, que são os
heterocistos (FAY, 1983).
A Spirulina não fixa nitrogênio atmosférico por não apresentar heterocistos,
podendo utilizar fontes de nitrogênio variadas como os íons nitrato, nitrito, amônio e
uréia. Quando o nitrogênio é fornecido em uma forma oxidada, como o nitrato (NO3-) ou
nitrito (NO2-), este é reduzido até amônia antes de ser incorporado em moléculas
orgânicas (YANG et al., 2000), O estado de oxidação do átomo de N no nitrato é de +5 e
na amônia –3, portanto serão necessários 8 elétrons na redução, como mostrado na
Equação 2.
NO3- NO2
- NH4
+ Equação (2)
São necessários 2 elétrons na primeira etapa e 6 elétrons na segunda etapa. Na
primeira etapa as enzimas necessárias são a nitrato redutase e a nitrato oxidorredutase, e
na segunda etapa as enzimas necessárias são a nitrito redutase e a nitrito oxidorredutase
(RICHMOND, 1990; VONSHAK, 1997).
22
Quando os íons nitrato e amônio são fornecidos como fonte de nitrogênio,
primeiramente é consumido o amônio e somente depois o nitrato, sendo o amônio
utilizado na síntese de aminoácidos. A incorporação do nitrogênio amoniacal pode
ocorrer por duas vias: a catalisada pela enzima glutamina desidrogenase (GHD), que
incorpora o nitrogênio amoniacal ao glutamato através da glutamina sintetase (GS), onde
o nitrogênio amoniacal é incorporado formando glutamina (RICHMOND, 1990), como
mostrado na Figura 3. Se somente nitratos e nitritos estiverem disponíveis, ambos serão
assimilados simultaneamente (KINNE, 1978).
Figura 3: Assimilação de amonônio através das enzimas glutamina desidrogenase (GDS)
e glutamina Sintetase (GS).
Quando hidróxido de amônio é usado como única fonte de nitrogênio, o pH pode
cair rapidamente, causando efeitos indesejáveis. Algumas algas são sensíveis a altas
concentrações de amônio e seu crescimento pode ser inibido por 1 mol.L-1
de amônio.
Esta inibição pode ser correlacionada com um acréscimo no pH interno devido à
penetração de moléculas de hidróxido de amônio não dissociadas. Manabe et al. 1992,
estudaram o efeito da concentração de cloreto de amônio no crescimento da Spirulina
platensis, verificando que o crescimento da microalga é inibido na presença de cloreto de
amônio, não havendo crescimento em concentrações superiores a 25 mol.L-1
. Entretanto,
em 24 e 40 horas de crescimento após a adição observou-se novamente o crescimento em
concentrações de 15 e 25 mol.L-1
de cloreto de amônio respectivamente.
23
A uréia pode ser considerada como fonte de nitrogênio para o crescimento de
microalgas, sendo hidrolisada antes de o nitrogênio ser incorporado pelas algas, o que
pode ocorrer através de duas reações enzimáticas, ou catalisada pela uréase ou pela
amidoliase, levando a formação de amônia (RICHMOND,1990). Comparada as fontes
como o nitrato de potássio ou nitrato de sódio, tem um custo relativamente baixo, além
do que cada molécula de uréia fornece dois átomos de nitrogênio, enquanto cada sal de
nitrato de potássio ou sódio, apenas um (FAINTUCH et al., 1992).
Em geral, microrganismos respondem à falta de nitrogênio pela degradação
preferencial de uma ou mais macromoléculas que contém nitrogênio, resultando na
diminuição destes compostos e acúmulo de compostos de reserva de carbono, como
polissacarídeos e ácidos graxos. O conteúdo de pigmentos fotossintéticos diminui e a taxa
de fotossíntese é reduzida. Nestas condições, a habilidade de assimilar compostos
combinados de nitrogênio aumenta (RICHMOND, 1990).
Nas cianobactérias duas fontes de estocagem de nitrogênio endógeno que podem
ser utilizadas na deficiência de nitrogênio nas células são cianofícias e ficocianina.
Grânulos de cianofícina são copolímeros de ácido aspártico e arginina. Mudanças na
atividade enzimática foram observadas na depleção de nitrogênio. A atividade de nitrato-
redutase foi observada em células crescendo em amônio após um curto período de falta
de nitrogênio, sendo que o aumento da atividade de enzimas de assimilação é
acompanhado por um decréscimo na taxa fotossintética (RICHMOND, 1990).
2.1.3.4.4 Concentração de Oxigênio
A concentração de O2 no tanque de cultura representa um bom parâmetro para o
controle da atividade fotossintética das microalgas. À medida que aumenta a atividade
fotossintética, a concentração de O2 no tanque pode aumentar rapidamente a valores
acima do ponto de saturação, inibindo o processo de fotossíntese e favorecendo o
processo de fotooxidação (Richmond, 1990), o qual ocasiona deterioração celular e perda
completa da cultura (FAINTUCH, 1989).
24
2.1.3.4.5 Temperatura
A temperatura afeta a concentração de biomassa, a natureza do metabolismo, as
necessidades nutricionais e a composição de biomassa (FAINTUCH, 1989), com efeitos
diretos sobre a fotossíntese e a respiração. Por outro lado, a fixação de CO2, e evolução
do O2, dependem também da luz.
A temperatura usual utilizada laboratorialmente para o cultivo da Spirulina varia
de 35ºC a 38ºC. Ótimos de temperatura podem variar entre diferentes espécies e desvios
desta faixa podem inibir a capacidade fotossintética. Estudos demonstraram que culturas
crescendo a temperaturas menores que a ótima são mais sensíveis a fotoinibição
(VONSHAK, 1997).
No inverno, a temperatura é o fator limitante afetando o crescimento da
microalga em tanques abertos, enquanto no verão, o fator limitante é a luminosidade.
Baixas temperaturas nos períodos escuros podem ser vantajosas visto que diminui a taxa
respiratória e, portanto, o consumo de biomassa (VONSHAK, 1997).
2.1.3.4.6 Aeração e Agitação
A injeção de ar aos cultivos em massa proporciona uma difusão efetiva dos
nutrientes, um aponte parcial de CO2, inorgânico, uma estabilização do pH, o mantimento
das algas em suspensão e o cultivo uniformemente distribuído. Cultivos em volumes de
um litro ou menos não necessitam aeração, basta que se realize uma agitação manual
diariamente.
Nos cultivos em grande escala, a aeração deve ser leve durante a fase de
indução, que corresponde ao período de até 2 dias depois da inoculação, devendo ser
incrementada com o aumento da densidade da cultura (MICHEL et al., 1986).
2.1.3.4.7 Salinidade
A exposição de culturas de Spirulina a altas concentrações de cloreto de sódio
resulta numa imediata interrupção do crescimento. Após a fase lag, um novo estado é
25
estabelecido.
Foi analisado o crescimento de Spirulina em concentrações de NaCl de 0,5 e
0,75 M, observando-se um decréscimo na concentração de biomassa, em comparação
com cultivos da microalga em meio padrão. O período de adaptação a elevadas
concentrações salinas depende também da espécie estudada, estando em muitos casos
associado com o declínio de clorofila das células. Duas espécies da microalga
apresentaram velocidades específicas máximas de crescimento de 0,063 e 0,059 h-1
, 0,044
e 0,026 h-1
, e 0,034 e 0,018 h-1
, crescendo no meio de cultivo padrão, com 0,5 e 0,75 M
de cloreto de sódio, respectivamente (VONSHAK, 1997).
Supõe-se que a exposição a altas salinidades é acompanhada de um aumento na
demanda de energia devido ao stress das células. A imediata inibição do sistema
fotossintético e respiratório após a exposição a um stress salino foi explicada por
Ehrenfeld; Cousin (1984) e Reed et al. (1985), citados por Vonshak (1997). Eles
mostraram um acréscimo da concentração celular de sódio ocasiona um aumento da
permeabilidade da membrana plasmática durante os primeiros instantes de exposição a
altas concentrações salinas. Supõe-se que a inibição da fotossíntese provém da rápida
entrada do sódio que pode resultar na separação dos ficobilissomas da membrana
tilacóide.
2.1.4 CONTAMINAÇÃO DAS ÁGUAS POR METAIS
Os metais tóxicos surgem nas águas naturais devido aos lançamentos de efluentes
industriais tais como os gerados em indústrias extrativistas de metais, indústrias de tintas
e pigmentos e, especialmente, as galvanoplastias, que se espalham em grande número nas
periferias das grandes cidades. Além destas, os metais podem ainda estar presentes em
efluentes de indústrias químicas, como as de formulação de compostos orgânicos e de
elementos e compostos inorgânicos, indústrias de couros, peles e produtos similares,
indústrias do ferro e do aço, lavanderias e indústria de petróleo.
Os metais tóxicos constituem contaminantes químicos nas águas, pois em
pequenas concentrações trazem efeitos adversos à saúde. Desta forma, podem inviabilizar
os sistemas públicos de água, uma vez que as estações de tratamento convencionais não
os removem eficientemente e os tratamentos especiais necessários são muito caros. Os
metais tóxicos constituem-se em padrões de potabilidade estabelecidos pela Portaria
26
1.469 do Ministério da Saúde. Devido aos prejuízos que, na qualidade de tóxicos, podem
causar aos ecossistemas aquáticos naturais ou de sistemas de tratamento biológico de
esgotos, são também padrões de classificação das águas naturais e de emissão de esgotos,
na legislação federal.
Para a remoção de metais tóxicos o processo mais eficiente é o que se baseia no
fenômeno de troca iônica, empregando-se resinas catiônicas em sua forma primitiva de
hidrogênio ou na forma sódica. Este processo permite uma remoção percentual bastante
significativa dos metais presentes na água, viabilizando seu uso para finalidades
industriais específicas e permitindo também o reuso de efluentes industriais.
No campo do tratamento de efluentes, o processo mais utilizado é o da
precipitação química na forma de hidróxidos metálicos. Cada íon metálico tem o seu
valor de pH ótimo de precipitação como hidróxido, de forma que, quando se têm misturas
de diversos metais, pode ser necessário que se trabalhe em mais de uma faixa de pH.
Como normalmente as vazões de efluentes são baixas, os tratamentos são desenvolvidos
de forma estática, em regime de batelada, o que facilita o uso de mais de uma faixa de
pH. Nos processos contínuos, ter-se-ia que utilizar uma série de sistemas de mistura e
decantação.
Um problema importante dos processos à base de precipitação química que deve
ser levado em consideração é a produção de quantidades relativamente grandes de lodos
contaminados com metais. Estes devem ser encaminhados a sistemas adequados de
tratamento ou disposição final, que nem sempre encontram-se disponíveis (WEBBER,
1983).
2.1.5 PROBLEMAS DE SAÚDE CAUSADOS POR CONTAMINAÇÕES COM
CROMO
O cromo é obtido do minério cromita, metal de cor cinza que reage com os ácidos
clorídrico e sulfúrico. Além dos compostos bivalentes, trivalentes e hexavalentes, o
cromo metálico e ligas também são encontrados no ambiente de trabalho. Entre as
inúmeras atividades industriais, destacam-se: galvanoplastia, soldagens, produção de
ligas ferro-cromo, curtume, produção de cromatos, dicromatos, pigmentos e vernizes
(SALGADO, 1996).
A absorção de cromo por via cutânea depende do tipo de composto, de sua
27
concentração e do tempo de contato. O cromo absorvido permanece por longo tempo
retido na junção dermo-epidérmica e no estrato superior da mesoderme. A maior parte do
cromo é eliminada através da urina, sendo excretada após as primeiras horas de
exposição. Os compostos de cromo produzem efeitos cutâneos, nasais, bronco-
pulmonares, renais, gastrointestinais e carcinogênicos. Os cutâneos são caracterizados por
irritação no dorso das mãos e dos dedos, podendo transformar-se em úlceras. As lesões
nasais iniciam-se com um quadro irritativo inflamatório, supuração e formação crostosa.
Em níveis bronco-pulmonares e gastrointestinais produzem irritação bronquial, alteração
da função respiratória e úlceras gastroduodenais (SALGADO, 1996).
2.1.6 BIOSSORÇÃO
A capacidade de certos microrganismos de concentrar metais pesados é bem
conhecida. Entretanto, somente durante as duas últimas décadas é que os microrganismos
estão sendo usados como uma alternativa para a remoção e recuperação de metais. O
termo “biossorção” é definido como um processo no qual sólidos de origem natural ou
seus derivados são usados na retenção de metais pesados de um ambiente aquoso
(MURALEEDHARAN et al., 1991).
A biossorção compreende a ligação de metais à biomassa por um processo que
não envolva energia metabólica ou transporte, embora tais processos possam ocorrer
simultaneamente quando biomassa viva for usada, pois a biossorção pode ocorrer com
biomassa viva ou morta (TOBIN et al., 1994).
Embora altamente promissor, o mecanismo da biossorção não está ainda bem
entendido. O termo “biossorção” não é específico com respeito ao mecanismo de
retenção.
A biossorção de metais não é baseada num único mecanismo. Ela consiste de
vários mecanismos que quantitativa e qualitativamente diferem de acordo com as
espécies usadas, a origem da biomassa e seu processamento. A biossorção de metais
segue mecanismos complexos, principalmente troca iônica, quelação, adsorção por forças
físicas e o aprisionamento de íons, como resultado do gradiente de concentração e difusão
através da parede celular e membranas (VOLESKY & HOLAN, 1995).
28
Embora células vivas e mortas sejam capazes de acumular metais, pode haver
diferenças nos mecanismos envolvidos em cada caso, dependendo da extensão da
dependência metabólica (GADD, 1990).
O entendimento dos mecanismos pelos quais microrganismos acumulam metais é
importante para o desenvolvimento de processos de concentração, remoção e recuperação
de metais de soluções aquosas. Por exemplo, o conhecimento das reações químicas ou
fisiológicas durante a biossorção metálica poderia possibilitar a especificação e controle
dos parâmetros do processo para aumentar a velocidade, quantidade e especificidade da
acumulação metálica.
As paredes de bactérias, algas e fungos são eficientes biossorventes metálicos, e
em muitos casos a ligação inicial pode ser seguida pela deposição inorgânica de
quantidades crescentes de metal. Ligações covalentes e iônicas podem estar envolvidas
na biossorção, com constituintes tais como proteínas e polissacarídeos. Em várias
espécies, a biossorção pode ser a maior proporção da retenção total. Isto é especialmente
verdadeiro para metais pesados como chumbo e alumínio, e radioativos como urânio e
tório. As variações na composição das paredes celulares das células microbianas, que
podem ser influenciadas pelas condições de cultura, podem resultar em variações
consideráveis na capacidade biossortiva e permitir algum grau de acumulação seletiva
(GADD, 1990).
2.1.6.1 Biossorção de Cromo VI
Na maioria dos estudos sobre biossorção de íons metálicos, os mesmos são
removidos de uma solução na forma de cátions, uma vez que a maioria dos metais existe
numa solução na forma catiônica. Entretanto, alguns metais podem existir em solução
tanto como cátion ou ânion, dependendo do estado de valência do metal. O cromo é um
exemplo deste tipo de metal, sendo que o ânion CrO4
2-
(Cr(VI)) é altamente tóxico.
A remoção de cromo(VI), tem sido avaliada por vários pesquisadores com
diferentes tipos de adsorventes, biológicos e não biológicos (SAG & KUTSAL, 1989;
PANDAY et al., 1984; SHARMA & FORSTER, 1993; NOURBAKHSH et al. 1994). Em
todos os casos o pH da solução teve uma influência muito grande na capacidade de
remoção do cromo(VI), sendo que as maiores remoções de cromo foram obtidas a pH 2,0.
29
A temperatura exerceu uma menor influência, mas o aumento da temperatura (numa faixa
de 25 a 45o
C) provocou uma redução na capacidade de retenção nos vários adsorventes
utilizados.
SHARMA & FORSTER (1993) avaliaram o comportamento da turfa do musgo
esfagno, substância que tem demonstrado capacidade de troca iônica e complexação com
metais pesados, na biossorção de cromo(VI). A dessorção do metal com solução de
NaOH 1M removeu somente 50% do metal sorvido, sugerindo que a interação metal-
musgo envolvia fortes forças de quimiossorção.
GUAN et al. (1993) estudaram a capacidade de adsorção de um consórcio de
bactérias desnitrificantes para CrO4
2-
. Para determinar quais fatores afetavam a
quantidade de metal captada pela biomassa, um conjunto de experimentos foi realizado.
Os fatores observados foram: pH, temperatura, concentração de CCl4, estado da biomassa
(viva ou morta) e concentração de Fe3+
. Os resultados também foram usados para
determinar quais dos parâmetros experimentais tinham efeito significativo sobre os
parâmetros da isoterma de Langmuir, máxima concentração do íons na fase sólida (limite
prático da capacidade de adsorção de um material), e constante de equilíbrio. Todos os
parâmetros, diretamente ou por interação, tiveram um efeito significativo sobre os dois
parâmetros da isoterma de Langmuir. Entretanto, os efeitos do pH da solução e estado da
biomassa (ativa ou inativa) foram maiores.
A biossorção de Cr(VI) ou sua redução para Cr(III), relativamente muito menos
tóxico, por microrganismos são processos úteis na remediação de sólidos e águas
contaminadas. Um grande número de bactérias, tanto aeróbias como anaeróbias,
removem Cr(VI) de soluções reduzindo-o a Cr(III). Uma fração do Cr(VI) reduzido pode
também ser retido pelas células.
As cianobactérias Anabaena variabilis e Synechococcus PCC 6301 foram
avaliadas quanto às suas capacidades em biossorver e reduzir o íon cromato (WILHELMI
& DUNCAN, 1995; GARNHAM & GREEN, 1995). Dois tipos de ensaios de biossorção
de cromato foram realizados (curto e longo). No ensaio “curto”, culturas em fase
exponencial de crescimento foram colocadas em contato com as soluções contendo
cromato por 4 horas. No ensaio “longo”, as culturas cresciam na presença do íons
cromato por um período de 18 dias.
30
Os estudos de acumulação de cromato de curta duração revelaram níveis de
biossorção rápidos e relativamente baixos, quando comparados à biossorção de cátions.
Para os autores, a composição da parede celular das cianobactérias, similar à das bactérias
Nos estudos de exposição ao íon cromato por períodos mais longos Anabaena
variabilis foi capaz de reduzir cromo(VI) a cromo(III) e acumular cromo(III). A espécie
Synechococcus PCC 6301 não foi capaz de reduzir cromato, interagindo com o íon
apenas por biossorção.
2.1.7 LEGISLAÇÃO AMBIENTAL
A legislação ambiental no Brasil começou a ser estabelecida na década de 80,
quando muitos dos representantes de grupos ambientalistas passaram a participar do
governo e outros setores públicos. Atualmente as leis brasileiras de proteção ambiental
são internacionalmente aceitas. Foram criadas as Áreas de Proteção Ambiental, o Estatuto
de Tombamento e, em 1998, foi sancionada a Lei de Crimes Ambientais, que estabelece
as penas para infrações e agressões cometidas contra o meio ambiente no Brasil.
A resolução 357/05 do CONAMA (Conselho Nacional do Meio Ambiente) define
padrões de qualidade para classificar uma água doce como potável para consumo humano
em 0,05 mg/L de cromo total (CONAMA, 2007), definindo o limite máximo tolerável
dos contaminantes na água para garantir a potabilidade da mesma. Porém, é difícil,
devido à falta de dados mais precisos em relação aos danos à saúde humana quando os
metais estão presentes em concentrações muito baixas. Os limites aceitáveis podem variar
de um órgão regulador para outro. Por exemplo, o CONSEMA (Conselho Estadualdo
Meio Ambiente) define em sua resolução 128/2006, 0,1 mg Cr+6
/L de cromo (VI) e
0,5mg Cr/L de cromo total.
O Conselho Nacional do Meio Ambiente estabeleceu a classificação das águas
doces, salobras e salinas do Território Nacional, através da Resolução Nº 20, de 18 de
junho de 1986, atualmente substituída pela Resolução CONAMA 357/2005. Conforme
está resolução os valores máximos para alguns metais, para água destinada ao
abastecimento doméstico, após o tratamento convencional, está apresentado no Tabela 1.
31
Tabela 1: Padrões de potabilidade de água para metais pesados
METAL CLASSE 1
(mg/L)
CLASSE 2 E 3
(mg/L)
Alunínio 0,100 0,100
Cádmio 0,001 0,010
Chumbo 0,030 0,050
Cobre 0,020 0,500
Cromo trivalente 0,500 0,500
Cromo hexavalente 0,1 0,1
Ferro solúvel 0,300 5,000
Manganês 0,100 0,500
Mercúrio 0,0002 0,002
Níquel 0,025 0,025
Zinco 0,180 5,00
Fonte: MOTA (1995).
Para descarte de efluentes a resolução Nº 20 do CONAMA estabelece alguns
limites de emosões para uns metais, que mostra a Tabela 2.
Tabela 2: Valores máximos admissíveis de alguns metais, para o descarte de efluentes.
METAL VMA(mg/L) METAL VMA(mg/L)
Cádmio 0,20 Ferro solúvel 15,0
Chumbo 0,50 Manganês solúvel 1,00
Cobre 1,00 Mercúrio 0,01
Cromo(VI) 0,50 Níquel 2,00
Cromo(III) 2,00 Zinco 5,00
Fonte: MOTA (1995).
32
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
O fluxograma da Figura 4 apresenta as atividades do Trabalho de Conclusão de
Curso, as quais foram realizadas no Laboratório de Fermentações da Faculdade de
Engenharia e Arquitetura.
Figura 4: Fluxograma das atividades do projeto do trabalho de conclusão de curso
realizadas no Laboratório de Fermentações da Faculdade de Engenharia e Arquitetura.
33
2.2.1 CULTIVO DA MICROALGA Spirulina platensis
Os cultivos foram realizados utilizando as cepas Spirulina platensis paracas e
Spirulina platensis Leb disponíveis no Laboratório de Fermentações da Faculdade de
Engenharia e Arquitetura da UPF.
2.2.1.1 Meio de cultivo
O meio utilizado para o cultivo e preparo dos inóculos foi o meio Zarrouk, de
composição química definida, e amplamente utilizado em experimentos com microalgas,
especialmente para a microalga Spirulina platensis. O meio Zarrouk foi preparado a partir
das Substâncias descritas na Tabela 3.
Tabela 3: Composição química do meio Zarrouk
Reagentes Quantidades
NaHCO3 16,8(g.L-1
)
K2HPO4 0,5(g.L-1
)
NaNO3 2,5(g.L-1
)
K2SO4 1,0(g.L-1
)
NaCl 1,0(g.L-1
)
MgSO4.7H2O 0,2(g.L-1
)
CaCl2 0,04(g.L-1
)
FeSO4.7H2O 0,01(g.L-1
)
EDTA 0,08(g.L-1
)
Solução A5 1 mL
Solução B6 1 mL
Solução A5 (g.L-1): H3BO3: 2,86; MnCl2.4H2O: 1,81; ZnSO4.7H2O: 0,222; CuCO4.5H2O: 0,079; MnO3:
0,015.
Solução B6 (g.L-1): NH4VO3: 22,86; KCr(SO4)2. 12H2O:192; NiSO4. 6H2O: 44,8; NaWO4. 2H2O: 17,94;
34
TiOSO4. H2SO4. 8H2O: 61,1; CO(NO3)2. 6H2O: 43,98.
Para cada uma das soluções, os sais foram pesados e solubilizados
separadamente em 100 mL de água destilada e autoclavados. O FeSO4 foi autoclavado
separadamente dos 100 mL de água.
Foram preparadas soluções estoque do metal, utilizando dicromato, através da
dissolução de 10 mg.L-1
, 20 mg.L-1
e 30 mg.L-1
de concentração de cromo VI.
2.2.1.2 Condições de Cultivo e Biorreatores
O cultivo da microalga S. platensis foi realizado em estufa termostatizada a 30 ºC,
com iluminação proveniente de lâmpadas fluorescentes de 20 W posicionadas no interior
da estufa, fornecendo um total de 1800 lux, fotoperíodo de 12 horas (12 horas de claro e
12 horas de escuro) controlado por um temporizador automático.
Os cultivos foram realizados em frascos de erlenmeyers de 2 L (biorretores)
contendo 1,8 L de meio inicial. O meio de cultivo utilizado foi o Zarrouk (Zarrouk,
1966), diluído a 50%. A aeração foi mantida com fluxo de ar constante, de 0,02 vvm
(volume de ar/volume de meio/minuto), mantida por bombas de diafragma. A Figura 5
mostra um esquema do aparato experimental.
Fonte: COLLA et al. (1999)
Figura 5: Esquema simplificado dos cultivos aerados da cianobactéria Spirulina platensis.
35
2.2.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Os experimentos foram realizados a partir de um Planejamento Fatorial
Multiníveis 21.4
1, conforme Tabela 4.
Tabela 4: Matriz do Planejamento Fatorial Multiníveis 21.4
1.
Experimentos X1 (Cepa) X2 (Cromo VI (mg/L) inicial)
1 (-1) Paracas (-2) 0
2 (-1) Paracas (-1) 10
3 (-1) Paracas (+1) 20
4 (-1) Paracas (+2) 30
5 (+1) Leb (-2) 0
6 (+1) Leb (-1) 10
7 (+1) Leb (+1) 20
8 (+1) Leb (+2) 30
2.2.3 DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS
2.2.3.1 Determinação do pH
Alíquotas foram coletadas a cada 24 horas para o monitoramento do pH, durante
os 30 dias de cultivo, através de leitura em um potenciômetro com eletrodo de vidro.
2.2.3.2 Determinação da Concentração Celular
Alíquotas foram coletadas a cada 24 horas para a determinação da concentração
celular, durante 30 d, através de leitura da Abs a 670 nm em espectrofotômetro. As
absorbâncias foram relacionadas com uma curva-padrão de biomassa, construída
utilizando suspensões da microalga Spirulina platensis paracas e Spirulina platensis Leb.
A curva padrão consiste numa relação pré-estabelecida entre a concentração celular e a
absorbância a 670 nm.
36
Para a construção da curva padrão, as suspensões de células foram diluídas a fim
de obterem-se diferentes concentrações da microalga. As concentrações de cada
suspensão foram determinadas através da filtração em bomba de vácuo de 25 mL de cada
diluição como mostra a Figura 6. A massa celular retida no filtro foi transferida para uma
placa de Petri e colocada em estufa a 60ºC por 24 horas. Todas as diluições foram
submetidas à leitura de absorbância em espectrofotômetro UV a 670 nm. A relação ABS
(absorbância) versus concentração de biomassa (g/L) foi obtida a partir de regressão
linear dos dados utilizando-se o programa Excel.
Figura 6: Técnica de separação de células por filtração.
2.2.3.3 Determinação de Metais
A determinação de metais foi realizada através da espectrofotometria a 540 nm,
através do método da colorimetria sendo realizada a avaliação dos metais nos tempos de
0, 15 d e 30 d.
A análise de colorimetria é realizada através de uma digestão ácida, com ácido
fosfórico (H3PO4) e logo após adicionado solução de Difenilcarbazida, o qual irá dar a
coloração que indicará a concentração do metal em questão. Esperar um tempo de 10
minutos para que a solução de Difenilcarbazida reagir com o metal, após fazer a leitura
no espectofotometro de absorção em um comprimento de onda de 540 nm. Estas leituras
foram relacionadas com a curva padrão do cromo VI pré estabelicida.
37
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.3.1 DETERMINAÇÃO DO pH
Em relação ao pH, todos os experimentos iniciaram com 10 e 10,5 e após o
cultivo atingiu-se pH entre 10,9 a 11,00, quais mostra o Apêndice A. Este aumento de pH
pode ser explicado pelo consumo de íons, ou pela troca iônica determinada pela parede
celular da microalga (ROMERA et al., 2007). O pH ótimo para o cultivo da microalga
Spirulina platensis deve ser superior a 9 (VONSHAK, 1997) verificando-se que o pH foi
mantido na faixa ótima para todos os cultivos. Os gráficos que apresentam o pH ao longo
do tempo de cultivo estão no Apêndice B
2.3.2 CRESCIMENTO DA BIOMASSA
A determinação da concentração da biomassa para os cultivos das microalgas
Spirulina platensis Paracas e Spirulina platensis Leb foi obtida através da correlação
entre a absorbância da amostra e a correspondente concentração celular, apresentada nas
curvas padrão das Figuras 7 e 8.
Figura 7: Curva padrão da microalga Spirulina platensis Paracas.
38
Figura 8: Curva padrão da microalga Spirulina platensis Leb.
Em relação ao crescimento ao longo do tempo observou-se que o máximo
crescimento celular ocorreu nos experimentos 1 e 5 conforme as Figuras 9 e 10, sendo
estes experimentos os controles realizados sem a contaminação com o metal,
apresentando concentrações máximas de biomassa de 1,45 gcélula seca/L.
Os experimentos 2 e 6 (Figura 11 e 12), com contaminação de cromo de 10 mg/L
apresentaram concentrações de biomassa de 1,42 gcélula seca/L e 1,40 gcélula seca/L, similar ao
crescimento observado nos experimentos controle.
Os experimento 3, 4, 7 e 8 (contaminações de cromo de 20 mg/L e 30 mg/L),
apresentaram baixo crescimento celular (Figuras 13, 14, 15 e 16), com concentrações de
biomassa máximas de 0,429 gcélula seca/L; 0,187 gcélula seca/L; 0,349 gcélula seca/L e 0,129 gcélula
seca/L.
Figura 9: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 1 (controle).
Figura 10: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 5 (controle).
39
Figura 11: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 2 (contaminação de 10 mg/L
de Cr VI).
Figura 12: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 6 (contaminação de 10 mg/L
de Cr VI).
Figura 13: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 3 (contaminação de 20 mg/L
de Cr VI).
Figura 14: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 7 (contaminação de 20 mg/L
de Cr VI).
Figura 15: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 4 (contaminação de 30 mg/L
de Cr VI).
Figura 16: Concentração Celular
(gcélulaseca/L) versus tempo (d) para o
experimento 8 (contaminação de 30 mg/L
de Cr VI).
40
O Apêndice B apresenta os resultados de concentração celular (gcélula seca/L) para
os experimentos do planejamento experimental em função do tempo de cultivo.
Para a obtenção das velocidades específicas máximas de crescimento (μmax) e dos
tempos de geração, foram cosntruidos os gráficos apresentados nas Figuras 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23 e 24. As regressões obtiveram altos coeficientes de correlação, o que indica
que os dados utilizados se aproximam do comportamento exponencial (fase Log), típico
da fase logarítimica de crescimento de microrganismos. As velocidades especifícas
máximas de crescimento são o coeficiente b das equações representadas nas figuras
(Y=a.eb.X
).
Figura 17: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 1
(concentração inicial de 0 mg/L de Cromo
VI).
Figura 18: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 2
(concentração inicial de 10 mg/L de
Cromo VI).
Figura 19: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 3
Figura 20: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 4
41
(concentração inicial de 20 mg/L de
Cromo VI).
(concentração inicial de 30 mg/L de
Cromo VI).
Figura 21: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 5
(concentração inicial de 0 mg/L de Cromo
VI).
Figura 22: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 6
(concentração inicial de 10 mg/L de
Cromo VI).
Figura 23: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 7
(concentração inicial de 20 mg/L de
Cromo VI).
Figura 24: Regressão exponencial da
concentração de biomassa versus tempo
para o cálculo da umax do experimento 8
(concentração inicial de 30 mg/L de
Cromo VI).
42
Os resultados da concentração celular máxima, tempo de geração (Tg), velocidade
específica máxima de crescimento (µmax) e intervalo da fase logarítimica de crescimento
obtidos através do planejamento experimental estão apresentados na Tabela 5.
Tabela 5: Concentração celular máxima, tempo de geração (Tg), velocidade específica
máxima de crescimento (µmax) e intervalo da fase logarítimica de crescimento para os
experimentos do planejamento experimental.
Exp. X1 (Cepa)
X2 (Cromo
VI (mg/L)
inicial)
Conc. máx (gcélula
seca/L) Tg (d)
µmax
(gcélula/gcélula.d)
ΔLog
(d)
1 (-1) Paracas (-2) 0 1,446 4,0159 0,1726 15
2 (-1) Paracas (-1) 10 1,426 3,5113 0,1974 13
3 (-1) Paracas (+1) 20 0,478 2,7321 0,2537 7
4 (-1) Paracas (+2) 30 0,409 3,1041 0,2233 9
5 (+1) Leb (-2) 0 1,064 3,9094 0,1773 15
6 (+1) Leb (-1) 10 1,405 3,9653 0,1748 15
7 (+1) Leb (+1) 20 0,569 2,4252 0,2858 8
8 (+1) Leb (+2) 30 0,523 3,2450 0,2136 9
Verifica-se na Tabela 4 que maiores umax (menor tempo de geração) foram obtidas
nos experimentos que apresentaram menores concentrações máximas de células, o que
pode ser explicado pelo fenômeno de sombreamento que é causado nas células quando as
concentrações de biomassa são superiores a 0,5 g/L. O sombreamento limita a absorção
de energia luminosa da fotossíntese, limitando as taxas de crescimento. Entretanto,
verifica-se que os experimentos que apresentaram elevadas umax permaneceram pouco
tempo na fase exponencial de crescimento (menores Δ log), devido serem os
experimentos com as maiores contaminações de cromo.
A concentração de biomassa é uma variável importante durante a captação de
metal (ROMERA et al., 2007). Mas devemos considerar que quanto maior o crescimento
da biomassa, maior é a quantidade de matéria seca a ser disposta corretamente, pois o
metal que é retirado do meio vai estar acumulado no interior da biomassa. Portanto em
experimentos de remoção de metais, o crescimento da biomassa não deve ser exagerado,
para não gerar um grande custo de tratamento e disposisão final desta biomassa. Neste
experimento o resultado foi muito bom, pois a biomassa não apresentou um crescimento
43
exagerado e o metal foi removido com uma boa eficiência.
2.3.3 REMOÇÃO DO METAL
A Tabela 6 apresenta os resultados de remoção de Cromo VI nos
experimentos do Planejamento Experimental aos 15 d e 30 d de cultivo da microalga
Spirulina. A análise de variância dos dados de remoção de cromo VI em função do tempo
de cultivo, da cepa e da concentração inicial de cromo demonstrou que a interação entre
as três variáveis foi significativa sobre a remoção de cromo (p < 0,00001). A comparação
de médias dos resultados de remoção de cromo VI está apresentada na Tabela 6, sendo
que médias seguidas de letras iguais não apresentam diferença significativa entre si (p >
0,05), enquanto médias seguidas de letras diferentes apresentam diferença significativa
entre si (p < 0,05). A Figura 25 apresenta a remoção de cromo em função das variáveis
cepa e concentração inicial de cromo e do tempo de cultivo.
Tabela 6: Remoção de Cromo VI nos experimentos do Planejamento Experimental aos 15
d e 30 d de cultivo da microalga Spirulina
Remoção (%)
Exp. (cepa) Concentração de cromo VI (mg/L) 15 d (%) 30 d (%)
1 (Paracas) 0 00,0a 00,0
a
2 (Paracas) 10 77,50c 78,92
d
3 (Paracas) 20 88,75g 88,93
g
4 (Paracas) 30 89,84h 92,06
j
5 (Leb) 0 00,0a 00,0
a
6 (Leb) 10 74,10b 77,80
c
7 (Leb) 20 86,47e 88,04
f
8 (Leb) 30 90,50i 90,82
i
A análise estatística demonstrou que os melhores resultados foram obtidos nos
experimentos 4 e 8, ou seja, os que iniciaram com contaminação de Cr VI de 30mg/L. O
melhor resultado obtido foi no experimento 4 com a cepa Paracas em um tempo de 30 d,
mas no tempo de 15 d também obteve-se remoção significativa. O experimento 8 com a
cepa Leb, não apresentando diferenças significativas entre os tempos de cultivo, mas
apresentou remoção do metal. A maior remoção de cromo VI foi obtida no experimento
44
4, com contaminação inicial de 30 mg/L de cromo, aos 30 d de cultivo. Entretanto, sob o
ponto de vista econômico, o cultivo deve ser encerrado em 15 d de cultivo.
Cepa: S. platensis Paracas
[Cr] mg/L
0
10
20
30-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Rem
oçã
o d
e cr
om
o (
%)
Cepa: S. platensis LEB
[Cr] mg/L
0
10
20
30
15 d
30 d
Figura 25: Remoção de cromo VI (%) em função da concentração inicial de cromo nos
cultivos, da cepa e do tempo de cultivo (d).
Calado et al. (2003) obtiveram remoções de Pb+2
de 85% com as algas Sargassum
spp e Arribadas, sendo estes valores semelhantes aos obtidos neste trabalho.
Viacelli (2007) utilizou concentrações iniciais de chumbo e cádmio de no máximo
0,2 mg/L obtendo remoções de 86% a 90%. Neste trabalho, a Spirulina realizou com
eficiência a remoção de cromo VI, demonstrando o potencial desta microalga para a
remoção de metais tóxicos por biossorção.
Bueno (2007) avaliou o potencial de remoção dos metais Pb(II), Cr(III) e Cu(II)
utilizando o microorganismo R. opacus como biossorvente. As concentrações iniciais
foram de 20 mg/L para os três metais, no final do cultivo foi obtido resultados de 94% de
remoção para o Pb(II), 54% de remoção para o Cr(III) e 43% de remoção para o Cu(II).
Neste trabalho a microalga Spirulina realizou a remoção de Cr VI com maior eficiência,
demonstrando sua capacidade de remoção de metais tóxicos.
45
3 CONCLUSÃO
Conclui-se que a microalga Spirulina foi capaz de realizar a biossorção de cromo
VI nos meios contaminados com 10 mg/L, 20mg/L e 30 mg/L de cromo VI, apresentando
remoções de 78% até 92%, podendo ser utilizada em estudos posteriores de remoção de
cromo VI de efluentes líquidos.
46
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Apêndice A
Análise de pH referente aos 8 experimentos cultivados durante 30 dias.
pH
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6 Exp 7 Exp. 8
1 10,47 10,52 10,52 10,59 10,77 10,65 10,68 10,54
2 10,81 10,95 10,65 10,56 10,65 10,9 10,64 10,46
3 10,65 10,34 10,3 10,49 10,65 10,52 10,56 10,4
4 10,63 10,58 10,5 10,31 10,51 10,46 10,39 10,3
5 10,48 10,34 10,43 10,3 10,42 10,43 10,48 10,36
6 10,85 10,78 10,59 10,55 10,82 10,67 10,54 10,53
7 10,62 10,62 10,66 10,57 10,77 10,81 10,73 10,69
8 10,45 10,49 10,54 10,38 10,5 10,51 10,53 10,37
9 10,52 10,49 10,57 10,45 10,55 10,56 10,62 10,39
11 10,52 10,47 10,5 10,33 10,5 10,48 10,55 10,27
12 10,53 10,36 10,44 10,35 10,71 10,63 10,66 10,5
13 10,36 10,29 10,33 10,15 10,38 10,57 10,45 10,39
14 10,28 10,46 10,49 10,41 10,69 10,81 10,78 10,58
15 10,32 10,44 10,45 10,36 10,8 10,6 10,68 10,52
16 10,3 10,36 10,36 10,05 10,54 10,39 10,3 10,19
18 10,59 10,49 10,56 10,29 10,53 10,53 10,38 10,5
19 10,88 10,76 10,67 10,71 10,91 10,08 10,9 10,63
20 10,93 10,97 10,87 10,76 10,87 10,9 10,97 10,68
21 11,07 11,12 10,94 10,73 10,97 10,96 11,01 10,74
22 11,19 11,23 11,07 10,86 11,17 11,17 10,96 10,86
23 10,84 10,82 10,77 10,57 10,81 10,73 10,66 10,46
25 10,79 10,83 10,64 10,45 10,81 10,88 10,84 10,53
26 10,86 10,84 10,69 10,52 10,83 10,76 10,74 10,67
27 10,82 10,99 10,77 10,72 10,94 10,85 10,61 10,63
28 10,99 10,97 10,67 10,51 10,96 10,94 10,82 10,74
30 10,91 10,96 10,64 10,73 10,88 10,91 10,69 10,56
52
Apêndice B
Os gráficos apresentam o pH ao longo do tempo de cultivo para os experimentos do planejamento experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 1 do Planejamento
Experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 2 do Planejamento
Experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 3 do Planejamento
Experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 4 do Planejamento
Experimental.
53
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 5 do Planejamento
Experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 6 do Planejamento
Experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 7 do Planejamento
Experimental.
pH versus tempo de cultivo (d) do
experimento 8 do Planejamento
Experimental.
54
Apêndice C
Análise da concentração celular (X) da microalga Spirulina platensis, em função do tempo de cultivo.
Concentração Celular (X)
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6 Exp 7 Exp. 8
1 0,054 0,049 0,060 0,043 0,048 0,048 0,043 0,045
2 0,093 0,106 0,077 0,076 0,051 0,081 0,089 0,083
3 0,108 0,113 0,084 0,077 0,062 0,098 0,103 0,093
4 0,159 0,158 0,128 0,118 0,089 0,143 0,151 0,127
5 0,189 0,194 0,125 0,113 0,106 0,168 0,162 0,129
6 0,288 0,301 0,242 0,187 0,178 0,261 0,272 0,191
7 0,360 0,371 0,259 0,217 0,222 0,312 0,315 0,224
8 0,424 0,429 0,473 0,243 0,262 0,370 0,349 0,251
9 0,461 0,475 0,308 0,269 0,304 0,414 0,398 0,281
11 0,506 0,538 0,328 0,302 0,347 0,453 0,432 0,295
12 0,528 0,566 0,478 0,318 0,346 0,485 0,451 0,291
13 0,651 0,682 0,328 0,356 0,458 0,603 0,528 0,296
14 0,689 0,705 0,342 0,362 0,451 0,634 0,569 0,268
15 0,764 0,777 0,167 0,289 0,498 0,689 0,565 0,018
16 0,810 0,813 0,272 0,200 0,557 0,720 0,514 0,022
18 0,833 0,872 0,358 0,265 0,614 0,768 0,504 0.039
19 0,884 0,908 0,376 0,249 0,612 0,953 0,512 0,050
20 1,061 1,007 0,477 0,312 0,719 0,946 0,536 0,057
21 1,084 1,074 0,198 0,321 0,751 0,972 0,350 0,058
22 1,109 1,126 0,240 0,342 0,783 1,028 0,193 0,034
23 1,168 1,154 0,151 0,344 0,852 1,064 0,105 0,007
25 1,220 1,248 0,051 0,357 0,877 1,139 0,083 0,005
26 1,238 1,337 0,179 0,377 0,872 1,195 0,068 0,002
27 1,367 1,294 0,034 0,409 0,998 1,322 0,014 0,004
28 1,436 1,423 0,099 0,409 1,064 1,387 0,016 0,011
30 1,446 1,426 0,249 0,399 1,041 1,405 0,019 0,004
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