Disusun Oleh : Praktek C Kelompok 3 (D3 FARMASI)1. Evie Rosiana Dewi17141088B2. Lina Puspita Sari17141090B3. Tamara Vebby Pradhani17141093B4. Ayu Sonia Cahyani17141098B

UNIVERSITAS SETIA BUDITAHUN AJARAN 2015I. HARI, TANGGAL PRAKTIKUMKamis, 16 April 2015, Jumat, 17 April 2015 & Sabtu, 18 April 2015

II. ACARA PRAKTIKUM Isolasi bakteri pada media kultur dan uji fisiologis bakteri (uji biokimiawi)

III. TUJUAN 1. Isolasi bakteri pada media kultur Mempelajari macam-macam metode isolasi bakteri menggunakan media kultur sehingga diperoleh koloni yang terpisah.2. Uji fisiologis bakteri Mengetahui sifat fisiologis bakteri dengan melakukan inokulasi pada media-media uji biokimiawi.

IV. PRINSIP1. Isolasi bakteri pada media kulturMetode cawan gores (streak plate method) Menggoreskan sejumlah inokulum secara aseptik pada permukaan media lempeng agar2. Uji fisiologis bakteri Menginokulasikan sejumlah inokulum pada berbagai macam media uji biokimia dan diamati perubahan media atau diuji dengan reagen tertentu.

V. DASAR TEORI1. ISOLASI BAKTERI PADA MEDIA KULTURIsolasi merupakan cara untuk memisahkan biakan campuran atau sampel dengan menggunakan media kultur sehingga diperoleh isolatt atau biakan murni (inokulum).Ada beberapa macam metode isolasi yaitu :a. Metode goresan (streak plate method)b. Metode taburan (pour plate method)c. Metode perataan (spread plate method)Sedangkan inokulasi merupakan carra memindahkan biakan murni dari satu media ke media lain yang sama atau berbeda. Inokulasi dapat dilakukan pada media agar attau media cair.Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-jenis.Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisioptimumuntuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (plezar, 2006).Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle, 2007)Mikroorganisme tidak memerlukan banyak ruangan untuk perkembangannya, sebab itu media buatan (agar) dapat dimasukkan ke dalam sebuah tabung percobaan labu atau cawan Petri. Pada permulaannya tabung atau cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas dari setiap mikroorganisme hidup) lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan, tabung atau cawan harus dilindungi terhadap kontaminasi dari luar. Sumber utama pencemaran dari luar adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang berterbangan. Bentuk cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk mencegah pencemaran udara. Pencemaran tabung atau labu dihindari dengan cara menyumbat mulutnya dengan penutup yang cocok, biasanya dengan kapas. Permukaan luar cawan biakan yang menjadi sasaran pencemaran, dan bagian dalam labu atau tabung akan tercemar bila dibuka untuk memasukkan atau mengeluarkan bahan. Bahaya ini dapat dihindari dengan cara membakar bibir atau pinggiran cawan, tabung atau labu dalam api, segera setelah penutup dibuka dan dibakar sekali lagi pada waktu akan ditutup.Ada empat cara isolasi bakteri yaitu :a. Pour plate atau shake cultureBeberapa ml suspensi bakteri dicampur dengan mediaum yang masih cair (belum membeku) dengan demikian akan diperoleh piaraan adukan. Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar.b. Streak Plate atau cultureUjung kawat imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel - sel yang digores.c. Slant cultureUjung kawat yang membawakan bakteri digesekkan pada permukaan agar-agar miring dalam tabung reaksi. Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarumoseyang bagian atasnya dilengkungkan. Cara ini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. (Rusdimin, 2003).d. Stab cultureUjung kawat yang membawakan bakteri ditusukkan pada media padat (agar-agar) dalam tabung reaksi, berbeda dengan slant culture permukaan agar-agar ini tidak miring. Media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis.Karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi bakteri. Beberapa bentuk koloni spesifik koloni bakteri pada media agar datar yaitu (SutedjodalamSari, 2009) :1. Ukurana. Titikb. Kecilc. Sedangd. Besar2. Warna koloniBakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti.3. Bentuk kolonia. Bundarb. Tidak beraturanc. Koloni bertumpuk4. Bentuk bagian tepi koloni (margin)a. Rata (entire)b. Tidak rata, bergelombang secara beraturan (lobate)c. Bergelombang (undulate)d. Bergerigi(serrate)e. Seperti filamen (filamentous)

2. UJI FISIOLOGIS BAKTERI (UJI BIOKIMIAWI)Cara identifikasi dapat dilakukan selain dengan pengamatan morfologinya, dapat pula dilakukan dengan pengujian sifat fisiologinya berdasarkan reaksi biokimiawi yang terjadi pada media uji.Mikroorganisme tidak mempunyai varietas dan ciri-ciri anatomi, tidak seperti halnya pada tumbuhan atau hewan yang mudah dipelajari dan taksonomi. Masalah yang paling mendasar didalam bakteriologi adalah penyembuhan, pembersihan, dan identifikasi dari kultur bakteri. Identifikasi bakteri didasarkan pada varietas dari karakteristik yang dimiliki oleh bakteri tersebut, tidak hanya dari morfologi tetapi juga karakteristik kultur mikroorganisme, fisiologi, dan patogenitas (Seeley & VanDemark, 1971).Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri tersebut. Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahui sifat-sifat suatu koloni bakteri. Sifat-sifat suatu koloni tersebut ialah sifat-sifat yang ada sangkut pautnya dengan bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan, dan sebagainya (Dwidjoseputro, D. 1989).Bakteri memiliki berbagai aktivitas biokimia dengan menggunakan nutrisi yang diperoleh dari lingkungan sekitarnya. Transformasi biokimia dapat timbul didalam dan diluar dari bakteri yang diatur oleh enzim. Setiap bakteri memiliki kemampuan dengan menggunakan enzim yang dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino, metabolisme ini biasanya menghasilkan produk yang dapat digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri. Pada prinsipnya pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahuidari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekulyang kompleks dan molekul-molekul sederhana. Selain itu, metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi (Ramaisyah, 2011).Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain, uji KIA, uji SIM, uji LIA, uji CITRAT dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998).

VI. ALAT DAN BAHANa. Cawan petri sterilb. Jarum ose/entc. Lampu spiritusd. Media kultur Endo Agar Mac Conkeye. Biakan campuran atau sampel Edwardsiella Shigellaf. Pipet ukur sterilg. Media uji biokimiawi KIA SIM LIA CITRAT

VII. CARA KERJA1. Isolasi bakteri pada media kultura. Dituang media agar kedalam cawan petri steril secara aseptik.b. Dibiarkan media menjadi padat pada suhu kamar.c. Pijarkan jarum inokulan dengan api spiritus lalu diamkan sebentar.d. Diambil 1 ose biakan atau sampel secara aseptik.e. Digoreskan jarum ose pada permukaan lempeng agar pada salah satu sisi.f. Dipijarkan jarum ose kembali sehingga bakteri yang tersisa pada ose mati.g. Dibiarkan sebentar agar dingin atau disentuhkan pada daerah media yang masih kosong (tepi media).h. Dilakukan goresan sampai permukaan media penuh dengan goresan. Catatan : goresan yang terakhir tidak boleh bersentuhan dengan goresan yang pertama.i. Diinkubasi cawan petri tersebut secara terbalik pada suhu 370C selama 24-48 jam.j. Diamati adanya pertumbuhan koloni yang terpisah.2. Uji fisiologis bakteri Dilakukan inokulasi biakan uji / isolat (diambil dari hasil isolasi bakteri pada media kultur) pada media : KIA: tusukan dan goresan SIM: tusukan LIA : tusukan dan goresan CITRAT: goresan Diinkubasi semua media pada suhu 370C selama 24-48 jam. Diamati hasilnya, misal perubahan warna media atau dengan penambahan reagen tertentu. Digambar hasil pengamatan dan dicatat dalam tabel pengamatan hasil.

VIII. HASIL PENGAMATAN

Isolasi bakteri pada media kultur

a. Bakteri Edwardsiella pada media Endo Agar

b. Bakteri Edwardsiella pada media Mac Conkey

c. Bakteri Shigella pada media Endo Agar

d. Bakteri Shigella pada media Mac Conkey

Uji fisiologis bakteriMedia Uji biokimiawi

Keterangan :1. Media KIA berwarna merah2. Media SIM berwarna kuning muda3. Media LIA berwarna ungu4. Media CITRAT berwarna hijau

a. Bakteri Edwardsiella pada media uji biokimiawi

b. Bakteri Shigella pada media uji biokimiawi

IX. PEMBAHASANDalam praktikum isolasi bakteri, memerlukan lingkungan dan medium yang berisi zat hara untuk pertumbuhan sel, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan yang sesuai dengan mikroorganisme. Medium biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikrobia dalam bentuk padat, semi padat, dan cair. Yang digunakan dalam praktikum adalah medium padat yaitu agar. Agar digunakan sebagai media karena tidak dapat diuraikan oleh mikroba. Media yang digunakan dalam praktikum adalah Endo Agar dan Mac Conkey dengan bakteri Edwardsiella dan Shigella menggunakan metode goresan.Metode goresan (streak plate) terdiri dari penginokulasian biakan murni dalam hal ini digunakan bakteri yang sudah dibuat dengan medium Endo Agar dan Mac Conkey dalam cawan petri. Mula-mula medium Endo Agar dan Mac Conkey dengan suhu 45-500C dituangkan pada cawan petri steril, diratakan dengan cara memutar-mutarkan cawan setelah itu biarkan hingga dingin dan memadat. Setelah medium Endo Agar dan Mac Conkey padat, diambil 1 ose bakteri dari biakan murni kemudian digoreskan pada permukaan agar selama menggores tutup cawan dibuka secukupnya. Cara menggoreskannya yaitu awalnya cawan dibagi menjadi 4 bagian kemudian digoreskan bakteri pada permukaan agar dengan dibuat zigzag menyambung dari cawan bagian ke-1 sampai ke cawan bagian ke-4 tidak terputus. Pada bagian cawan ke-4 goresan tidak boleh mengenai bagian yang pertama. Setelah diinkubasi selama 24-48 jam akan terlihat koloni bakteri berkumpul pada goresan-goresan tersebut. Karena pada saat penggoresan yang kurang baik, akhirnya bakteri menyebar ke semua bagian cawan.Bakteri Edwardsiella menghasilkan koloni bertumpuk pada media EA maupun MC. Bakteri Shigella menghasilkan koloni transparan kecil dengan tepi bergerigi pada media EA dan koloni transparan kecil pada media MC.Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).Uji fisiologi biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase, koagulase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji hidrolisis kanji, uji hidrogen sulfit dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998).Media yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu KIA, SIM, LIA dan CITRAT.a. Media KIA Fungsi: untuk menguji fermentasi karbohidrat (glukosa, laktosa) dan sulfida. Pengamatan pada bagian lereng media (slant), dasar (but), ada tidaknya gas dan terbentuknya warna hitam.1. Bagian lereng: jika berwarna merah maka ditulis K2. Bagian dasar: jika berwarna kuning maka ditulis A3. Adanya gas: jika media pecah/terangkat ke atas ditulis G+, jika media tetap maka ditulis G-4. Sulfida: jika media berwarna hitam maka ditulis S+, jika media tidak terbentuk warna hitam maka ditulis S-b. Media SIM Fungsi: untuk uji Sulfida, Indol, dan Motilitas. Uji sulfida: uji positif jika pada media terbentuk warna hitam Uji motilitas: media ditambah reagen Erlich A (5 tetes) dan Erlich B (5 tetes), jika terbentuk indol maka akan terbentuk warna merah. Uji motilitas: uji positif jika pertumbuhan pada seluruh media dan uji negatif jika ada pertumbuhan hanya dibekas inokulasi.c. Media LIA Fungsi: untuk menguji deaminasi lisin dan sulfida. Pengamatan pada bagian lereng media (slant), dasar (but) dan terbentuknya warna hitam.1. Bagian lereng: jika berwarna merah coklat maka ditulis R, jika berwarna ungu maka ditulis K, jika berwarna kuning maka ditulis A.2. Sulfida: jika media berwarna hitam maka ditulis S+, jika media tidak terbentuk warna hitam maka ditulis S-.d. Media CITRAT Fungsi: untuk mengetahui kemampuan bakteri dapat menggunakan citrat sebagai sumber carbon tunggal. Uji positif: jika media berwarna biru.MediaBentukKeadaanWarnaCara inokulasi

KIAPadatMiringMerahTusukan dan goresan

SIMSemi solidTegakKuning mudaTusukan

LIAPadat MiringUngu Tusukan dan goresan

CITRATPadat Miring Hijau Goresan

Pada praktikum yang kami lakukan bakteri Shigella di media :1. KIA menunjukkan hasil K/A S- dengan bagian dasar belum terlalu kuning karena waktu inkubasi yang kurang lama.2. SIM seharusnya menunjukkan hasil - + - tetapi pada praktikum yang kami lakukan menunjukkan hasil - - - karena bakteri ini tidakmembentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan Erlich A dan Erlich B masing-masing 5 tetes.3. LIA menunjukkan hasil K/K S-4. CITRAT seharusnya tetapi pada praktikum yang kami lakukan + karena bakteri menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon.Sedangkan bakteri Edwardsiella pada media :1. KIA seharusnya menunjukkan hasil K/AG S+ tetapi pada praktikum yang kami lakukan menunjukkan A/AG S- karena koloni yang diambil hanya bagian atas berwarna pink pada koloni yang tertumpuk.2. SIM menunjukkan hasil + + +3. LIA menunjukkan hasil K/K S+4. CITRAT menunjukkan hasil -X. KESIMPULANa. Bakteri Edwardsiella menghasilkan koloni bertumpuk pada media EA maupun MC. b. Bakteri Shigella menghasilkan koloni transparan kecil dengan tepi bergerigi pada media EA dan koloni transparan kecil pada media MC.c. Uji fisiologis pada bakteri Shigella dan Edwardsiella :MediaShigellaEdwardsiella

KIAK/A S-K/AG S+

SIM- +-+++

LIAK/K S-K/K S+

CITRAT--

XI. DAFTAR PUSTAKATim Penyusun, 2015. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi, Surakartahttp://fikapuspita.blogspot.com/2014/01/laporan-praktikum-mikrobiologi-dasar.htmlhttp://indahjayantikumalasari.blogspot.com/2014/07/uji-biokimia.html