Download - UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ISOLAT KAPANG ENDOFIT …

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ISOLAT KAPANG

ENDOFIT TANAMAN LUMUT HATI

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

SKRIPSI

NURILLAH DWI NOVARIENTI

NIM : 1113102000058

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

OKTOBER 2017

ii

COVER

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ISOLAT KAPANG

ENDOFIT TANAMAN LUMUT HATI

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

NURILLAH DWI NOVARIENTI

NIM : 1113102000058

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

OKTOBER 2017

vi

ABSTRAK

Nama : Nurillah Dwi Novarienti

Program Studi : Farmasi

Judul : Uji Aktivitas Antioksidan Isolat Kapang Endofit Tanaman

Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Indonesia memiliki sumber daya alam yang melimpah dan beragam berasal dari

darat dan laut. Sumber daya alam hayati tersebut dapat dieksplorasi sebagai bahan

obat, baik yang bersumber dari tanaman, hewan maupun mikroorganisme. Kapang

endofit merupakan sumber daya mikroba yang tumbuh di dalam jaringan tanaman

yang dapat menghasilkan senyawa yang memiliki khasiat sama dengan tanaman

inangnya. Tanaman lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

merupakan salah satu spesies Marchantia yang diketahui merupakan sebagai

sumber antioksidan alami yang mengandung senyawa flavonoid, tanin dan

senyawa fenolik. Antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkap atau

meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk

mengisolasi kapang endofit yang terdapat di dalam tanaman lumut hati

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees dan menguji aktivitasnya sebagai

antioksidan. Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu isolasi kapang

endofit, pemurnian, karakterisasi, fermentasi, ekstraksi dan uji aktivitas

antioksidan. Hasil dari penelitian diperoleh 6 isolat. Uji aktivitas antioksidan

menggunakan metode 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dan vitamin C

digunakan sebagai standar. Pengujian secara kualitatif menunjukkan bahwa

seluruh ekstrak metanol, n-heksan dan etil asetat positif memiliki aktivitas

antioksidan. Ekstrak kapang endofit MEB1 memiliki aktivitas antioksidan yang

baik secara kualitatif. Pengujian secara kuantitatif menunjukkan bahwa kapang

endofit MEB1 memiliki nilai Inhibition Concentration (IC50) ekstrak metanol

sebesar 720,45 ppm dan ekstrak etil asetat sebesar 48,02 ppm.

Kata Kunci: kapang endofit, tanaman lumut hati, Marchantia emarginata

Reinw., Blume & Nees, aktivitas antioksidan, DPPH

vii

ABSTRACT

Name : Nurillah Dwi Novarienti

Major : Pharmacy

Title : Antioxidant Activities Evaluation of Isolates Endophytic

Fungi of Liverworts Marchantia emarginata Reinw., Blume

& Nees

Indonesia has abundant and diverse natural resources from land and sea. These

biological natural resources can be explored as medicinal materials of a well

sourced from plants, animals or microorganisms. Endophytic fungi is a microbial

resource which grows in plant tissues that can produce compounds that have the

same efficacy as the host plant. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees is

one of the Marchantia species, which known to contain natural antioxidants, such

as flavonoids, tannins and phenolic compounds. Antioxidants are compounds that

capable of capturing or reducing the negative effects of oxidants in the body. This

study aims to isolate the endophytic fungi which contained in the liverworts of

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees and evaluate their antioxidant

activities. The method used in this study were isolation of endophytic fungi,

purification, characterization, fermentation, extraction and evaluation antioxidant

activities of isolates of endophytic fungi. The results of this study obtained 6

isolates. Antioxidant activities evaluation using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

(DPPH) method and vitamin C used as standard. The qualitative evaluation

showed that all methanol, n-hexane and ethyl acetate extracts have antioxidant

activities. Endophytic fungi MEB1 extract has good qualitative antioxidant

activities. The quantitative evaluation showed that endophytic fungi MEB1 have

value of Inhibition Concentration (IC50) methanol extract is 720,45 ppm and ethyl

acetate extract is 48,02 ppm.

Keywords: Endophytic fungi, liverworts, Marchantia emarginata Reinw., Blume

& Nees, antioxidant activity, DPPH

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin. Segala puji dan syukur Penulis panjatkan

kepada Allah SWT atas keberkahan berupa limpahan rahmat, rezeki, hidayah dan

pertolongan-Nya. Tak lupa shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada

Nabi Muhammad SAW sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian untuk

laporan Tugas Akhir ini dengan judul “Uji Aktivitas Antioksidan Isolat Kapang

Endofit Tanaman Lumut Hati Marchantia emarginata Reinw., Blume &

Nees”. Penulisan skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa dalam penyususan dan pembuatan skripsi ini

mengalami kesulitan tanpa bantuan dari berbagai pihak. Dengan segala

kerendahan hati, perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang

ditujukan kepada:

1. Pemerintah Kabupaten Musi Banyuasin yang telah memberikan beasiswa

penuh selama penulis menempuh masa perkuliahan.

2. Ibu Ismiarni Komala, Ph.D., Apt dan Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt

selaku dosen pembimbing yang telah bersedia membimbing, memberikan

ide, saran dan arahan, serta dukungan kepada penulis selama pelaksanaan

penelitian dan penyusunan skripsi.

3. Bapak Prof. Dr. H. Arief Sumantri, M.Kes., selaku dekan Fakultas

kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi dan Ibu

Nelly Suryani, Ph.D., Apt selaku Sekretaris Program Studi FKIK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak Hendri Aldrat, Ph.D., Apt dan Bapak Saiful Bahri, M.Si selaku

dosen penguji yang telah sangat membantu penulis dalam

menyempurnakan skripsi ini.

ix

6. Yang tercinta Bapak Sumartono dan Ibu Tutur, Mba Lina, Aji, Kurnia,

Adon dan Sasa, serta seluruh keluarga yang telah memberikan do’a,

bantuan, dukungan, keceriaan dan semangat yang tiada henti-hentinya

kepada penulis.

7. Bapak dan Ibu Dosen program studi farmasi yang telah membagikan ilmu

dan pengetahuan yang sangat bermanfaat.

8. Ka Walid, Mba Rani, Ka Eris, Ka Tiwi, Ka Yaenab, dan Ka Rahmadi yang

telah memberikan bantuan selama masa penelitian di laboratorium farmasi.

9. Teman-teman penelitian lumut Aisyah, Tika, Hasan khususnya endofit

lumut Puspa dan Yaya yang selalu siap mendengarkan keluh kesah,

memberikan saran dan semangat serta menjadi motivasi terbesar bagi

penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

10. Teman-teman penelitian mikrobiologi kaka Vita, Ajeng, Lisa Fizi, kaka

Tewe, Aulia, Teh Anggi, Ghifar, Abbas, Rizal dan angkatan 2013

khususnya sahabat farmasiku Medika, Visa, Auliyani, Enjah, Riris, Upi,

Lulu, dan Afri, yang telah membagikan ilmu serta membantu penulis

selama perkuliahan dan penelitian.

11. Sahabat kecilku yuksok Novi dan ddcik Eka, bblku Icha, kaka Lisa, Revi,

Amrilla, serta sahabat alumni MAN 1 Muba Suparlin, Defi, Egi, Miftah

dan Jeri, yang selalu memberikan do’a dan semangat kepada penulis.

12. Keluarga As-Shof (SJD) Musi Banyuasin khususnya angkatan 2013 Fitria,

Tiara, yuk Rani dan Sandy, yang telah menjadi teman dan keluarga

diperantauan.

13. Terakhir semua pihak yang telah membantu penulis yang tidak dapat

penulis sebutkan satu persatu.

Dalam penyusunan skripsi ini, penulis menyadari bahwa masih terdapat

banyak kekurangan dan kelemahan serta jauh dari kata sempurna. Namun penulis

yakin skripsi ini adalah salah satu kebanggaan tersendiri bagi penulis dan penulis

berharap skripsi ini dapat bermanfaat.

Jakarta, September 2017

Penulis

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL…… ..................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... v

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.......................... x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xvii

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................... 1

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ..................................................................... 3

1.3 Tujuan ............................................................................................................ 3

1.4 Manfaat .......................................................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 4

2.1 Lumut Hati ..................................................................................................... 4

2.1.1 Morfologi Lumut Hati .......................................................................... 4

2.1.2 Habitat dan Penyebaran ........................................................................ 5

2.1.3 Aktivitas Biologi Lumut Hati ............................................................... 5

2.2 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees ........................................... 6

2.2.1 Taksonomi (Goffinet & Shaw, ed., 2009) ............................................ 6

2.2.2 Morfologi ............................................................................................. 6

2.2.3 Habitat dan Penyebaran ........................................................................ 7

2.2.4 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi ............................................. 7

xii

2.3 Mikroba Endofit............................................................................................. 8

2.3.1 Definisi Mikroba Endofit ..................................................................... 8

2.3.2 Manfaat Mikroba Endofit ..................................................................... 9

2.4 Kapang Endofit ............................................................................................ 10

2.4.1 Definisi Kapang Endofit..................................................................... 10

2.4.2 Isolasi dan Kultur Kapang Endofit ..................................................... 10

2.4.3 Karakterisasi Kapang Endofit ............................................................ 11

2.4.4 Metabolit Sekunder Kapang Endofit .................................................. 12

2.5 Antioksidan .................................................................................................. 12

2.5.1 Definisi Antioksidan .......................................................................... 12

2.5.2 Golongan Antioksidan........................................................................ 13

2.5.3 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil

(DPPH) ............................................................................................... 14

2.6 Fermentasi.................................................................................................... 16

2.7 Ekstraksi ...................................................................................................... 16

2.7.1 Pengertian Ekstraksi ........................................................................... 16

2.7.2 Metode Ekstraksi ................................................................................ 17

2.8 Pelarut .......................................................................................................... 17

2.9 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................................. 18

2.10 Spektrofotometer UV-Vis ............................................................................ 20

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................ 21

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ...................................................................... 21

3.2 Alat .............................................................................................................. 21

3.3 Bahan ........................................................................................................... 21

3.3.1 Tanaman Uji ....................................................................................... 21

3.3.2 Bahan Sterilisasi Permukaan .............................................................. 22

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba............................................................. 22

3.3.4 Bahan Kimia ....................................................................................... 22

3.4 Prosedur Penelitian ...................................................................................... 22

3.4.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba .......................................... 22

3.4.2 Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit ............................ 23

3.4.3 Pemurnian Kapang Endofit ................................................................ 24

xiii

3.4.4 Karakterisasi Kapang Endofit ............................................................ 24

3.4.5 Fermentasi .......................................................................................... 25

3.4.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi ................................................................. 25

3.4.7 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi Secara Kualitatif

dengan Metode DPPH ........................................................................ 25

3.4.8 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi Secara Kuantitatif

dengan Metode DPPH ........................................................................ 26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 27

4.1 Determinasi Tanaman .................................................................................. 27

4.2 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit ....................................................... 27

4.3 Karakterisasi Kapang Endofit ...................................................................... 31

4.3.1 Isolat MEA1 ....................................................................................... 31

4.3.2 Isolat MEA2 ....................................................................................... 32

4.3.3 Isolat MEB1 ....................................................................................... 33

4.3.4 Isolat MEC1 ....................................................................................... 34

4.3.5 Isolat MEC2 ....................................................................................... 35

4.3.6 Isolat MEC3 ....................................................................................... 36

4.4 Fermentasi.................................................................................................... 37

4.5 Ekstraksi ...................................................................................................... 39

4.6 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif ................................................ 40

4.7 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif .............................................. 45

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 49

5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 49

5.2 Saran ............................................................................................................ 49

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 50

LAMPIRAN-LAMPIRAN ................................................................................. 56

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1.

Gambar 2.2.

Gambar 2.3.

Gambar 3.1.

Gambar 4.1.

Gambar 4.2.

Gambar 4.3.

Gambar 4.4.

Gambar 4.5.

Gambar 4.6.

Gambar 4.7.

Gambar 4.8.

Gambar 4.9.

Gambar 4.10.

Gambar 4.11.

Gambar 4.12.

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees…………...

Struktur senyawa marchantin A……………………...……

Struktur kimia DPPH dan reaksinya dengan antioksidan..

Sampel Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees…..

Isolat MEA1 secara makroskopik.……………………...…

Isolat MEA1 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x.

Isolat MEA2 secara makroskopik.……………...…………

Isolat MEA2 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x.

Isolat MEB1 secara makroskopik………………………….

Isolat MEB1 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x.

Isolat MEC1 secara makroskopik………………………….

Isolat MEC1 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x.

Isolat MEC2 secara makroskopik………………………….


Isolat MEC3 secara makroskopik…….................................


6

7

14

22

32

32

33

33

34

34

35

35

36

36

37

37

xv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1.

Tabel 4.2.

Tabel 4.3.

Tabel 4.4.

Tabel 4.5.

Tabel 4.6.

Tabel 4.7.

Tabel 4.8.

Tabel 4.9.

Tabel 4.10.

Penanaman sampel…………………...………………………

Hasil kontrol sterilisasi permukaan…………………………

Hasil kapang endofit yang tumbuh…………………………

Hasil isolasi dan pemurnian kapang endofit dari tanaman

lumut hati (Marchantia emarginata Reinw., Blume &

Nees)…………………………………………………………

Perolehan bobot ekstrak…………………………………......

Hasil uji KLT ekstrak……………………………………......

Perhitungan nilai Rf (Retardation factor)................................

Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan etil Asetat

secara kualitatif…………………………....................

Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan etil asetat

secara kuantitatif…………………………………......

Hasil uji aktivitas antioksidan Vitamin C secara

kuantitatif…………………………………………………….

28

29

30

31

40

41

44

46

47

48

xvi

DAFTAR SINGKATAN

AAI

BHA

BHT

DNA

DPPH

GPx

IC50

KLT

LAFC

PDA

PDB

PDY

Rf

RPM

PPM

SOD

: Antioxidant activity index (indeks aktivitas antioksidan)

: Butylated hidroxyanisol

: Butylated hidroxytoluene

: Deoxyribonucleic acid

: 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil

: Glutation peroksidase

: 50% Inhibitory Concentration (Konsentrasi Hambat 50%)

: Kromatografi Lapis Tipis

: Laminar Air Flow Cabinet

: Potato Dextrose Agar

: Potato Dextrose Broth

: Potato Dextrose Yeast

: Retardation factor

: Revolution Per Minute

: Parts Per Million (µg/mL)

: Superoksida dismutase

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.

Lampiran 2.

Lampiran 3.

Lampiran 4.

Lampiran 5.

Lampiran 6.

Lampiran 7.

Lampiran 8.

Lampiran 9.

Lampiran 10.

Lampiran 11.

Lampiran 12.

Lampiran 13.

Lampiran 14.

Lampiran 15.

Skema Tahapan Penelitian………...…………………………..

Hasil Determinasi Tanaman Lumut Hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume &Nees……………………………

Skema Tahapan Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit……...

Skema Tahapan Karakterisasi Kapang Endofit………………..

Skema Tahapan Fermentasi…………………………………...

Skema Tahapan Ekstraksi Hasil Fermentasi………...………...

Skema Tahapan Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif…

Skema Tahapan Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif..

Hasil Fermentasi…………………………………………….....

Ekstrak…………………………………………………………

Panjang Gelombang Maksimum DPPH…………………….....

Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji

Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif Ekstrak Metanol

Kapang Endofit MEB1………………………………….……..

Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji

Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif Ekstrak Etil Asetat

Kapang Endofit MEB1………………………………….……..

Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks

Aktivitas Antioksidan (AAI)…………………………….….....

Kurva Persamaan Regresi Linear Vitamin C……………….....

58

59

60

61

61

62

63

63

64

65

68

69

70

71

72

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sejak akhir abad ke-19 hingga saat ini generasi ahli kimia bahan alam

telah menerapkan kemampuan dan ilmunya terhadap puluhan ribu molekul yang

berasal dari alam serta masyarakat mempercayai bahwa bahan alam berpotensi

besar bagi kehidupan. Meskipun sekitar 200.000 senyawa alami yang berasal dari

sumber-sumber alam seperti tanaman, hewan, atau mikroorganisme yang saat ini

dikenal, masih merupakan sebagian kecil untuk memperluas sumber daya alam

yaitu hanya sekitar 5-15% dari hampir 250.000 tanaman tingkat tinggi dan kurang

dari 1% dari mikroba telah dieksplorasi sejauh ini, namun sebagian besar sumber-

sumber ini tetap belum dimanfaatkan (Brahmachari, 2012).

Salah satu sumber daya mikroba, dikenal dengan sebutan mikroba endofit

yang terdapat di dalam jaringan tanaman saat ini mulai banyak mendapat

perhatian. Hal ini merupakan salah satu alternatif dalam pengendalian non

kimiawi yang terus dikembangkan hingga sekarang. Menurut Tan & Zou (2001),

endofit dapat menghasilkan senyawa fitokimia yang karakternya mirip atau sama

dengan inangnya. Senyawa fitokimia tersebut merupakan senyawa-senyawa

metabolit sekunder seperti alkaloid, steroid, terpenoid, turunan isokumarin,

kuinon, flavonoid, fenol dan lain sebagainya. Senyawa-senyawa ini sebagian

besar mempunyai potensi yang besar sebagai senyawa bioaktif.

Keunggulan lain dari mikroba endofit dalam pencarian sumber-sumber

senyawa bioaktif baru adalah siklus hidup mikroba endofit yang singkat dan

senyawa-senyawa yang dihasilkan dapat diproduksi dalam skala besar melalui

proses fermentasi. Isolasi senyawa bioaktif dari tumbuhan banyak mengalami

kendala dikarenakan jumlahnya yang terbatas dan siklus hidup tumbuhan yang

relatif lama. Oleh karena itu, mikroba endofit memiliki prospek yang baik dalam

penemuan senyawa-senyawa baru (Prihatiningtias & Wahyuningsih, 2006).

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Mikroba endofit yang paling umum ditemukan adalah endofit dari jenis

fungi (Strobel, 2003). Fungi endofit yang tumbuh pada jaringan tumbuhan obat,

juga dapat menghasilkan senyawa yang memiliki khasiat sama dengan tanaman

inangnya, walaupun jenis senyawanya berbeda. Sementara itu, senyawa yang

dihasilkan fungi endofit seringkali memiliki aktivitas yang lebih besar

dibandingkan aktivitas senyawa dari tanaman inangnya (Prihatiningtyas, 2005

dalam Hasanah, dkk., 2015). Fungi endofit telah ditemukan dan diidentifikasi

sejauh ini dalam jaringan semua garis turunan dari tanaman darat, termasuk lumut

hati (Petrini & Petrini, 1985; Stone, dkk., 2000; Davis, dkk., 2003).

Endofit dari beberapa spesies lumut hati terbatas dalam rhizoid, sedangkan

dari spesies lumut hati lainnya dapat dideteksi tumbuh dalam talus (Davis, dkk.,

2003). Lumut hati (Marchantiophyta) memiliki minyak tubuh (oil bodies)

berwarna biru, kuning atau tidak berwarna berasal dari senyawa-senyawa

terpenoid, acetogenins, dan senyawa aromatik (bibenzil, bis-bibenzil, benzoat,

sinamat, rantai panjang alkil fenol, naftalena, phthalide dan isokumarin), termasuk

flavonoid dengan lebih dari 40 kerangka karbon baru telah diisolasi (Asakawa,

dkk., 2013). Beberapa senyawa yang telah diisolasi dari lumut hati menunjukkan

aktivitas sebagai antimikroba, antijamur, antivirus, sitotoksisitas, antifeedant

serangga, antioksidan, relaksan otot dan sebagainya (Asakawa, dkk., 2013).

Antioksidan memiliki kemampuan untuk meredam radikal bebas dan

menghambat peroksidasi lipid sehingga dapat melindungi tubuh manusia dari

serangan beberapa penyakit yang disebabkan oleh reaksi radikal (Septiana &

Simanjuntak, 2017). Oleh karena itu, antioksidan menjadi topik yang menarik saat

ini. Berdasarkan banyaknya penelitian menunjukkan bahwa lumut hati memiliki

aktivitas antioksidan kuat. Seskuiterpen tipe humulane dan marchantin A (suatu

bis-bibenzil eter siklik) telah diisolasi dan dikarakterisasi dari Marchantia

emarginata. Marchantin A diketahui memiliki aktivitas terhadap radikal bebas.

(Toyota, dkk., 2004; Huang, dkk., 2010). Berdasarkan hasil penelitian Huang,

dkk., 2010, marchantin A memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 20

µg/mL.

3


Penelitian dari tanaman lumut hati bisa dikatakan masih sangat sedikit

dilakukan di Indonesia, khususnya lumut hati Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees. Berdasarkan latar belakang bahwa fungi endofit dapat

menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang memiliki khasiat sama dengan

inangnya, maka perlu dilakukan isolasi kapang endofit dan uji aktivitas sebagai

antioksidan dari tanaman lumut hati ini.

1.2 Batasan dan Rumusan Masalah

Berdasarkan hasil penelusuran pustaka diketahui bahwa belum ada

penelitian yang berfokus pada kapang endofit tanaman lumut hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume & Nees, maka dilakukanlah penelitian untuk

mengisolasi kapang endofit yang ada di dalam jaringan tanaman lumut hati

Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees serta menguji aktivitasnya

sebagai antioksidan.

1.3 Tujuan

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi kapang endofit dari

tanaman lumut hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees serta menguji

aktivitasnya sebagai antioksidan.

1.4 Manfaat

Manfaat penelitian ini adalah diharapkan dapat memberikan informasi

ilmiah tentang bagaimanakah cara mengisolasi kapang endofit dari tanaman lumut

hati Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees. dan bagaimanakah aktivitas

antioksidan yang dimiliki oleh isolat kapang endofit tersebut sehingga dapat

dimanfaatkan secara maksimal khususnya dalam bidang farmasi.


BAB II

2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Lumut Hati

Tanaman lumut (Bryophyta) terdiri dari 18.000 spesies diseluruh dunia dan

secara taksonomi ditempatkan diantara alga dan paku-pakuan (pteridophyta)

(Asakawa, 2004). Secara kolektif, tanaman lumut mewaili beberapa garis

evolusioner yang terpisah dan dikelompokkan menjadi tiga koordinat filum:

bryophyta (mosses/lumut sejati), Marchantiophyta (liverworts/lumut hati) dan

Anthocerophyta (hornworts/lumut tanduk) (Asakawa, 2004).

Marchantiophyta (liverworts) mencakup tiga kelas yaitu Haplomitriopsida,

Marchantiopsida, dan Jungermanniopsida, dengan 15 ordo, 82 famili, 316 genus

dan 6.000 spesies. Kelompok tanaman kecil ini terdistribusi hampir di mana-mana

di dunia (Asakawa, 2004).

2.1.1 Morfologi Lumut Hati

Struktur dasar lumut hati cukup sederhana. Ada talus yang tumbuh dari sel

apikal tunggal, dengan rhizoid uniseluler, papilla berlendir (slime papillae), dan

gametangia jantan (male) dan betina (female) yang biasanya terbatas pada zona

tertentu. Germinat spora dan protonema menghasilkan gametofit tunggal (Brown,

2002).

Lumut hati memiliki 2 tipe yaitu lumut hati bertalus (thallose liverwort)

dan lumut hati berdaun (leafy liverwort). Lumut hati melekat pada substrat dengan

menggunakan rhizoid (Hasan dan Ariyanti, 2004). Lumut hati bertalus memiliki

talus yang dikotomus bercabang, memiliki pori-pori dan pada umumnya terdiri

dari beberapa sel yang tebal. Jaringan bagian atas (dorsal) bersifat longgar akibat

dari ruang udara internal. Bagian permukaan bawah (ventral) biasanya memiliki

dua jenis rhizoid, yaitu halus dan dengan tonjolan (Glime, 2017). Lumut hati

berdaun memiliki rhizoid yang terdiri atas 1 sel (uniseluler). Beberapa spesies

memiliki 2 – 3 baris daun yang melekat pada batang, terbagi atas dua baris daun

dorsal (lobe), satu baris daun ventral (under leaf) yang biasanya memiliki ukuran

lebih kecil daripada daun dorsal atau bahkan tidak ada.

5


Pada beberapa spesies, daunnya memiliki modifikasi membentuk cuping yang

disebut lobule. Lobule adalah perluasan daun yang bisa menangkap atau

menampung air yang berada di bagian ventral (Sulistyowati, dkk., 2014).

2.1.2 Habitat dan Penyebaran

Lumut hati (liverworts) telah disurvei terdapat pada habitat khusus

tertentu, seperti hutan bakau dan hutan pesisir, tempat beriklim sedang, dan

tempat hutan hujan tropis. Spesies Marchantiophyta dapat diamati di Pulau Yaku,

Jepang dan di Selandia Baru. Selandia Baru merupakan Negara yang paling

menarik untuk mengamati spesies Marchantiophyta yang sangat berbeda dengan

yang ditemui di Asia, termasuk Jepang. Banyak spesies lumut hati telah

ditemukan di daerah tropis, seperti Asia Tenggara, Borneo, Sumatra dan Papua

Nugini serta Kolombia, Ekuador dan Venezuela. Di Ekuador dan Kolumbia,

spesies Marchantiophyta tumbuh di pegunungan tinggi lebih dari 2.000 meter

(Asakawa, 2004; Asakawa, dkk., 2012).

2.1.3 Aktivitas Biologi Lumut Hati

Beberapa konstituen kimia yang ada dalam lumut hati menunjukkan

aktivitas biologis yang menarik seperti antimikroba, antijamur, sitotoksik,

antifeedant serangga, insektisida, relaksan otot, serta aktivitas inhibisi enzim dan

reduksi apoptosis (Asakawa, 2004). Spesies Marchantia telah digunakan sebagai

obat herbal di Cina kuno.

Spesies lumut hati yang memiliki aktivitas biologi beberapa diantaranya

yaitu Frullania tamarisci: aktivitas antiseptik; Marchantia polymorpha:

antipiretik, antihepatik, antidotal, diuretik, untuk menyembuhkan luka, patah

tulang, gigitan ular berbisa, luka bakar dan luka terbuka; Radula marginata:

antimikroba, antioksidan, antijamur, sitotoksik dan aktivitas biologi penting

lainnya (Ludwiczuk & Asakawa, 2008; Asakawa, 2004).

6


2.2 Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

2.2.1 Taksonomi (Goffinet & Shaw, ed., 2009)

Klasifikasi tanaman Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Marchantiophyta

Kelas : Marchantiopsida

Ordo : Marchantiales

Famili : Marchantiaceae

Genus : Marchantia

Spesies : Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

Gambar 2.1. Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

(Sumber: Dokumentasi Pribadi, Februari 2017)

2.2.2 Morfologi

M. emarginata menunjukkan variasi yang luas terhadap talus dan

archegoniophore (receptacle female). Talus bisa atau tanpa dengan pita median

pada bagian dorsal, berukuran kecil, dengan garis tepi keunguan, kemerahan, dan

kadang-kadang berhialin. Archegoniophore sering melengkung ke arah tangkai

dan kadang-kadang lurus; lobus bervariasi dari 5-3; permukaan dorsal datar dan

sedikit asimetris hingga simetris. Puncak dari lobus archegoniophore bervariasi

seperti berlekuk (emarginate), memotong (truncate) atau kadang-kadang bulat

(rounded) (Siregar, dkk., 2013).

7


2.2.3 Habitat dan Penyebaran

M. emarginata Reinw., Blume & Nees dapat ditemukan di tanah, batuan

(basah, lembab atau basah, teduh, tempat semi terbuka, aliran sungai, anak sungai)

dari ketinggian 870 hingga 1450 meter. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa

M. emarginata Reinw., Blume & Nees tersebar di berbagai negara seperti Jepang,

Korea, Cina, India, Sri Lanka, Andaman dan Pulau Nicobar, Thailand, Malaysia,

Indonesia (Sumatera, Jawa, Kepulauan Nusa Tenggara, Bali, Maluku, Irian jaya),

Borneo (Sabah, Sarawak), Filipina, Marianas, Guam, New Guinea, New Britain,

Pulau Solomon (Siregar, dkk., 2013).

2.2.4 Kandungan Kimia dan Aktivitas Biologi

Marchantia sebagai salah satu genus dari lumut hati merupakan sumber

antioksidan alami. Kandungan senyawa yang terdapat di dalam Marchantia

seperti flavonoid, tanin dan senyawa fenolik memainkan peran utama sebagai

penangkap radikal bebas, sehingga bertindak sebagai antioksidan alami (Potterat,

1997 dalam Gupta, dkk., 2015).

Huang, dkk., (2010) menyebutkan bahwa spesies M. tosana koleksi

Taiwan mengandung marchantin A dalam jumlah yang cukup tinggi. Marchantin

A telah dilaporkan memiliki berbagai aktivitas biologis, seperti antijamur,

antimikroba, antiinflamasi, antioksidan, dan relaksan otot skeletal.

Gambar 2.2. Struktur senyawa marchantin A (Sumber: Huang, dkk., 2010)

Senyawa marchantin A yang diisolasi dari lumut hati M. emarginata

subsp. Tosana memiliki aktivitas penangkap radikal bebas. Senyawa marchantin

A juga dapat menghambat induksi pertumbuhan sel secara apoptosis pada MCF-7

sel kanker payudara manusia.

8


Senyawa tersebut meningkatkan ekspresi gen P21 dan P27 ketika ekspresi gen

cyclin B1 dan D1 menurun dengan cara direduksi (Huang, dkk., 2010).

Selain itu, senyawa marchantin A dari M. emarginata menunjukkan

aktivitas sebagai antibakteri terhadap Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes

faecalis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Cryptococcus

neoformans, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Proteus mirabilis,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium dan Staphylococcus aureus

serta menunjukkan aktivitas sebagai antifungi terhadap Alternaria kikuchiana,

Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Candida albicans, Microsporum

gypseum, Penicillium chrysogenum, Piricularia oryzae, Rhizoctonia solani,

Saccharomyces cerevisiae, Sporothrix schenckii, Trichophyton mentagrophytes

and Trichophyton rubrum (Asakawa, 1995).

Dalam ekstrak n-heksan dari M. emarginata subsp. Tosana diketahui

terdapat senyawa (+)-delta-cadinene. Selain itu, ekstrak eter dari M. tosana

koleksi Jepang dianalisis dengan GC/MS untuk mengidentifikasi senyawa

isolepidozene menunjukkan hasil 49,0 dan 45,2% terdapat dalam ion

kromatogram sampel tersebut (Asakawa, dkk., 2013). Senyawa sesquiterpen tipe

humulane dan bis-bibenzil telah dilaporkan terdapat pada lumut hati M. tosana

koleksi Jepang (Huang, dkk., 2010).

2.3 Mikroba Endofit

2.3.1 Definisi Mikroba Endofit

Secara harfiah, kata endofit (endophyte) berarti “di dalam tanaman”

berasal dari kata “endon” yang berarti di dalam dan “phyton” yang berarti

tanaman (Schulz & Boyle, 2006). Mikroba endofit adalah mikroorganisme

(bakteri atau jamur) yang hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu

dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa

membahayakan inangnya.

Adanya aksi enzim yang menimbulkan kemungkinan bahwa terjadi

pertukaran genetik (genetic recombination) antara endofit dengan inangnya

secara evolusioner, sehingga mampu menghasilkan senyawa biologi atau

metabolit sekunder (Tan & Zou, 2001).

9


Mikroba endofit yang ada di dalam jaringan tumbuhan terdapat beberapa

bentuk yaitu fungi (kapang dan khamir), bakteri, dan actinomycetes (Strobel,

2003). Mikroba endofit terdapat di dalam jaringan hampir semua tanaman serta

hidup bersimbiosis saling menguntungkan dengan inangnya, dimana tanaman

menyediakan nutrisi untuk mikroba endofit sedangkan mikroba endofit

menghasilkan senyawa aktif berupa metabolit sekunder yang menjaga inang dari

serangan hama (penyakit) (Taechowisan, dkk., 2005).

2.3.2 Manfaat Mikroba Endofit

Strobel & Daisy (2003) melaporkan bahwa endofit saat ini dianggap

sebagai sumber baru dari senyawa metabolit sekunder yang menawarkan potensi

dalam bidang medis, pertanian, dan industri. Apabila endofit yang diisolasi dari

suatu tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid atau metabolit sekunder sama

dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka tidak

perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang

kemungkinan besar memerlukan puluhan tahun untuk dapat dipanen. Metabolit

sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil diisolasi

dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya (Radji, 2005).

Mikroba endofit yang menghasilkan antibiotika Cryptocandin adalah

antifungi yang dihasilkan oleh mikroba endofit Cryptosporiopsis quercina,

diisolasi dari tanaman obat Tripterigeum wilfordii. Mikroba endofit yang

menghasilkan metabolit sebagai antikanker seperti paclitaxel dan derivatnya

pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh mikroba endofit. Paclitaxel

merupakan senyawa diterpenoid yang didapatkan dalam tanaman taxus.

Sementara itu, endofit yang memproduksi antioksidan seperti pestacin dan

isopestacin (metabolit sekunder), dihasilkan oleh endofit Pestalotiopsis

microspore, endofit ini berhasil diisolasi dari tanaman Terminalia morobensis,

yang tumbuh di Papua New Guinea (Radji, 2005).

10


2.4 Kapang Endofit

2.4.1 Definisi Kapang Endofit

Kapang merupakan fungi yang bersifat heterotrofik (memerlukan senyawa

organik untuk nutrisi). Kapang memiliki tubuh atau talus yang pada dasarnya

terdiri dari dua bagian yaitu miselium dan spora. Miselium dapat bersifat vegetatif

atau reproduktif. Miselium merupakan kumpulan dari beberapa filamen yang

dinamakan hifa. Hifa memiliki lebar 5-10 µm dan terdapat sitoplasma. Morfologi

hifa terbagi menjadi 3 macam yaitu aseptat atau senosit, septat dengan sel-sel

uninukleat dan septat dengan sel-sel multinukleat (Pelczar & Chan, 2006).

Radji (2005) melaporkan bahwa kapang adalah organisme yang sering

diisolasi sebagai endofit. Kapang endofit dapat sebagai pelindung bagi tanaman

inang dari stres lingkungan dan kompetisi mikroba yang diisolasi dari bunga,

buah, batang, daun, akar dan biji (Hung, dkk., 2007). Sekitar 6500 kapang endofit

dari tanaman herba dan pohon serta alga telah diskrining dan diisolasi untuk

mengetahui aktivitas biologis serta menentukan struktur senyawa biologis aktif

(Schulz, dkk., 2002).

2.4.2 Isolasi dan Kultur Kapang Endofit

Pemilihan tanaman sampel yang akan digunakan untuk mengisolasi fungi

endofit didasarkan pada pemilihan secara rasional dalam menyeleksi tanaman.

Ada beberapa hipotesis yang menjadi dasar pemilihan tanaman sampel secara

rasional, yaitu: tanaman tersebut dari lingkungan yang unik, terutama yang

memiliki sifat biologi yang tidak biasa; tanaman tersebut memiliki riwayat

etnobotani, misalnya tanaman tersebut digunakan oleh masyarakat adat sebagai

obat; tanaman tersebut endemik pada suatu wilayah dan masa pertumbuhannya

cukup lama; dan tanaman tersebut tumbuh di wilayah dengan keanekaragaman

hayati yang tinggi (Strobel & Daisy, 2003).

Menurut Noverita, dkk., (2009), isolasi kapang endofit dari tumbuhan akan

bermanfaat untuk mencari jenis-jenis kapang endofit yang memiliki kemampuan

spesifik dan unik. Berbagai jenis tumbuhan, dapat berpotensi sebagai sumber

isolat kapang endofit. Kapang endofit dapat diisolasi dari bagian organ tumbuhan

yang masih segar dan telah disterilkan permukaan (Agusta, 2009).

11


Sterilisasi permukaan bertujuan untuk mengeliminasi mikroba yang terkandung

pada permukaan tanaman. Sterilisasi permukaan dapat dilakukan dengan

direndam dalam alkohol 70-75% dan direndam dalam NaOCl (Strobel, 2003).

Media yang digunakan untuk isolasi jamur endofit umumnya adalah media

potato dextrose agar (PDA), sedangkan media yang digunakan untuk fermentasi

yaitu potato dextrose yeast (PDY) (Noverita, dkk., 2009; Hafsari & Asterina,

2013; Ariyono, dkk., 2014). Agusta (2009) melaporkan bahwa media yang

digunakan dalam proses isolasi adalah media yang kaya nutrisi sehingga

memungkinkan mempercepat perkembangan jamur endofit. Media PDA adalah

media yang kaya nutrisi dan bersifat selektif terhadap jamur endofit. Karbohidrat

dan senyawa yang terkandung dalam kentang mampu mendukung pertumbuhan

jamur endofit. Media PDY merupakan media potato dextrose broth (PDB) yang

seringkali dicampurkan dengan yeast extract (Strobel, 2003). Pada umumnya

kapang yang telah diperoleh sebagai kultur murni dapat langsung dimanfaatkan

dengan fermentasi untuk memperoleh metabolit lalu senyawa bioaktif diekstraksi

(Strobel, 2003).

2.4.3 Karakterisasi Kapang Endofit

Gandjar, dkk. (1999) berpendapat bahwa karakterisasi kapang endofit

dapat dilakukan dengan cara melakukan pengamatan terhadap morfologi kapang

endofit secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan secara makroskopis

terhadap kapang endofit antara lain:

1. Warna dan permukaan koloni (granular; seperti tepung; menggunung; licin;

ada atau tidaknya tetesan eksudat).

2. Ada atau tidaknya garis-garis radial dari pusat koloni ke arah tepi koloni.

3. Lingkaran-lingkaran konsentris dalam cawan petri (konsentris atau tidak

konsentris).

4. Pertumbuhan koloni (cm/hari) yang dilakukan setiap hari sampai koloni jamur

mencapai diameter 9 cm dengan menggunakan penggaris.

Secara mikroskopis, kapang endofit diamati hifa (sekat, percabangan, dan

warna) serta konidia (ada atau tidaknya dan bentuk) menggunakan mikroskop

pada pengamatan terakhir (5 hingga 7 hari).

12


Parameter warna hifa pada pengamatan mikroskopis meliputi hialin, transparan,

atau gelap. Parameter bentuk konidia yang diamati yaitu bulat, lonjong, berantai,

atau tidak beraturan.

2.4.4 Metabolit Sekunder Kapang Endofit

Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme endofit diduga

sama seperti yang terkandung dalam tanaman inangnya karena adanya

kemungkinan transfer genetik antara tanaman inang dan mikroba endofit. Oleh

karena itu, zat-zat yang bermanfaat di tanaman juga dapat dihasilkan oleh mikroba

endofitnya (Petrini, dkk., 1993).

Mikroba endofit yang berpotensi memiliki metabolit yang sama dengan

tanaman inangnya salah satunya kapang endofit. Endofit diketahui menghasilkan

metabolit seperti alkaloid, terpenoid, steroid, kuinon, derivat isokumarin,

flavonoid, fenol, asam fenolik, dan peptida (Zhang, dkk., 2013).

Menurut Tejesvi, dkk., (2007), setiap mikroba dapat menghasilkan

metabolit dengan bioaktivitas yang diinginkan. Jika metabolit mikroba dianggap

sebagai calon obat, bahan tambahan yang diperlukan dapat diperoleh dengan

fermentasi skala besar. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh endofit terkait

dengan tanaman obat dapat dimanfaatkan untuk menyembuhkan penyakit.

Pengembangan obat dari endofit dengan potensi tinggi dan durasi kerja yang

wajar akan menawarkan banyak kebutuhan obat baru untuk penyakit akut dan

kronis pada manusia.

2.5 Antioksidan

2.5.1 Definisi Antioksidan

Secara biologis, antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkap atau

meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Dalam pengertian kimia, senyawa

antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donors). Antioksidan

bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat

oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat (Winarsi,

2007).

13


Radikal bebas merupakan atom molekul yang memiliki kereaktifan tinggi, hal ini

dikarenakan adanya elektron yang tidak berpasangan. Sumber radikal bebas dapat

berasal dari sisa hasil metabolisme tubuh dan dari luar tubuh seperti makanan,

sinar UV, polutan dan asap rokok (Fitriana, dkk., 2015).

2.5.2 Golongan Antioksidan

Berdasarkan sifatnya antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan

enzimatis dan antioksidan non enzimatis. Antioksidan enzimatis merupakan

sistem pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stres oksidatif dan bekerja

dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru. Contoh

antioksidan enzimatis yaitu superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation

peroksidase. Antioksidan non enzimatis berupa antioksidan larut lemak (misalnya

tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin) dan antioksidan larut air

(misalnya asam askorbat, protein pengikat logam). Senyawa-senyawa itu

berfungsi menangkap senyawa oksidan serta mencegah terjadinya reaksi berantai

(Winarsi, 2007; Sayuti & Yenrina, 2015).

Berdasarkan fungsi dan mekanisme kerjanya, antioksidan dibagi menjadi

tiga macam yaitu (Sayuti & Yenrina, 2015):

1. Antioksidan Primer

Antioksidan primer merupakan antioksidan yang bekerja untuk mencegah

pembentukan senyawa radikal baru, yaitu mengubah radikal bebas yang ada

menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum senyawa radikal

bebas bereaksi. Antioksidan primer mengikuti mekanisme pemutusan rantai reaksi

radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara cepat pada suatu lipid yang

radikal, produk yang dihasilkan lebih stabil dari produk awal. Contoh antioksidan

primer adalah superoksida dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPx),

katalase dan protein pengikat logam.

2. Antioksidan Sekunder

Antioksidan sekunder bekerja dengan cara mengkelat logam yang

bertindak sebagai pro oksidan, menangkap radikal dan mencegah terjadinya reaksi

berantai.

14


Antioksidan sekunder berperan sebagai pengikat ion-ion logam, penangkap

oksigen, pengurai hidroperoksida menjadi senyawa non radikal, penyerap radiasi

UV atau deaktivasi singlet oksigen. Contoh antioksidan sekunder adalah vitamin

E, vitamin C, β-karoten, isoflavon, bilirubin dan albumin.

3. Antioksidan Tersier

Antioksidan tersier bekerja dengan cara memperbaiki kerusakan

biomolekul yang disebabkan radikal bebas. Contoh antioksidan tersier adalah

enzim-enzim yang memperbaiki DNA yaitu metionin sulfida reduktase.

Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu

antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia)

dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).

Beberapa contoh antioksidan sintetik yang diizinkan penggunaannya

secara luas diseluruh dunia untuk digunakan dalam makanan adalah butylated

hidroxyanisol (BHA), butylated hidroxytoluene (BHT), tert-butylated

hidroxyquinon (TBHQ) dan tokoferol. Antioksidan alami mengandung senyawa-

senyawa seperti fenol, polifenol, dan yang paling umum adalah flavonoid

(flavonol, isoflavon, flavon, flavonon dan katekin), turunan asam sinamat,

tokoferol dan asam organik polifungsi. Senyawa-senyawa tersebut terdapat dalam

tanaman pada seluruh bagian dari tanaman seperti akar, daun, bunga, biji, batang

dan sebagainya.

2.5.3 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil

(DPPH)

DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang stabil dan jika akan

digunakan sebagai pereaksi cukup dilarutkan. Senyawa ini jika disimpan dalam

keadaan kering dan kondisi penyimpanan yang baik akan stabil selama bertahun-

tahun (Winarsi, 2007).

Radikal DPPH adalah radikal nitrogen organik dengan warna ungu tua.

Radikal DPPH tersedia secara komersial dan tidak harus diproduksi sebelum diuji.

Bila larutan radikal DPPH dicampur dengan senyawa antioksidan/pereduksi,

warnanya berubah dari ungu menjadi kuning dari hidrazin yang sesuai (Gambar

2.3).

15


Kemampuan reduksi antioksidan terhadap DPPH dapat dievaluasi dengan

memantau penurunan absorbansi pada 515-528 nm karena DPPH hidrazin yang

terbentuk menghasilkan larutan kuning atau dengan resonansi putaran elektron

(Pyrzynska & Pekal, 2013).

Gambar 2.3. Struktur kimia DPPH dan reaksinya dengan antioksidan

(Sumber: Pyrzynska & Pekal, 2013)

Menurut Pine, dkk., (2008), metode DPPH merupakan metode yang dapat

mengukur efektifitas antioksidan secara cepat, sederhana, dan tidak membutuhkan

biaya yang mahal. DPPH telah digunakan secara luas untuk mengukur

kemampuan suatu senyawa untuk menghambat radikal bebas atau sebagai

pendonor hidrogen, dan juga untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dalam

makanan (Pratama, dkk., 2016).

Radikal DPPH memiliki warna ungu tua karena elektron tidak

berpasangan. Pengujian dilakukan dengan cara yaitu campuran larutan uji

diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit dalam ruangan gelap. Absorbansi

diukur pada 517 nm terhadap metanol sebagai blanko. Aktifitas untuk menangkap

radikal bebas kemudian dihitung berdasarkan persamaan berikut (Huang, dkk.,

2010; Komala, dkk., 2015).

nhibisi absorbansi kontrol absorbansi sampel

absorbansi kontrol

Nilai EC50 (efficient concentration) didefinisikan sebagai konsentrasi

senyawa uji yang mampu menangkal 50% dari radikal bebas secara relatif dan

mutlak. EC50 disebut juga dengan IC50 (50% inhibititory concentration) (Huang,

dkk., 2010; Sebaugh, 2011).

16


Aktivitas antioksidan ditunjukkan dengan indeks aktivitas antioksidan

(antioxidant activity index/AAI) dan dihitung berdasarkan persamaan berikut

(Komala, dkk., 2015).

ndeks Aktivitas Antioksidan konsentrasi akhir PP g m )

C g m )

2.6 Fermentasi

Istilah "fermentasi" berasal dari kata latin fervere. Pengertian fermentasi

berbeda untuk ahli biokimia dan ahli mikrobiologi industri. Pengertian fermentasi

dalam biokimia berkaitan dengan proses penghasilan energi oleh katabolisme

senyawa organik, sedangkan dalam mikrobiologi industri cenderung jauh lebih

luas (Stanbury, dkk., 2017). Pengertian fermentasi menurut Muhiddin, dkk.,

(2001) yaitu aplikasi metabolisme mikroba untuk mengubah bahan baku menjadi

produk yang bernilai lebih tinggi, seperti asam-asam organik, protein sel tunggal,

antibiotika dan biopolimer.

Fermentasi dapat dibedakan menjadi dua berdasarkan jenis media, yaitu

fermentasi media padat dan fermentasi media cair. Fermentasi media padat adalah

proses fermentasi dengan substrat tidak larut dan tidak mengandung air bebas,

tetapi cukup mengandung air untuk keperluan mikroba. Fermentasi media cair

adalah proses fermentasi dengan substrat yang larut atau tersuspensi dalam fase

cair. Fermentasi media cair disebut fermentasi kultur terendam yang umumnya

memerlukan aerasi dan agitasi. Pembentukan produk hasil fermentasi mikroba

dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti substrat dan nutrien, suhu, pH,

aerasi dan agitasi (Kumala, 2014).

2.7 Ekstraksi

2.7.1 Pengertian Ekstraksi

Ekstrak adalah material hasil penarikan oleh pelarut air atau pelarut

organik dari bahan kering (dikeringkan). Dari hasil tersebut kemudian pelarutnya

dihilangkan dengan cara penguapan dengan alat evaporator sehingga diperoleh

ekstrak kental jika pelarutnya organik. Jika pelarutnya air, pada tahap akhir

dilakukan penghilangan total dengan cara liofilisasi menggunakan freeze dryer

(Saifudin, 2014).

17


Istilah ekstraksi secara farmasi merupakan pemisahan bagian jaringan

tanaman dan/atau hewan yang aktif secara medis dengan menggunakan pelarut

yang selektif melalui prosedur standar (Tiwari, dkk., 2011). Ada beberapa target

ekstraksi meliputi senyawa bioaktif yang tidak diketahui, senyawa yang diketahui

ada pada suatu organisme dan sekelompok senyawa dalam suatu organisme yang

berhubungan secara struktural (Seidel, 2006).

2.7.2 Metode Ekstraksi

Beberapa metode ekstraksi yang dapat digunakan yaitu maserasi,

perkolasi, ekstraksi soklet (soxhlet extraction), ekstraksi pelarut bertekanan

(pressurized solvent extraction), ultrasound assisted solvent extraction, ekstraksi

bawah reflux (extraction under reflux) dan destilasi uap. Untuk produk alami

mikroba, isolasi mikroorganisme dan metode ekstraksi digunakan untuk

mengambil metabolit (metabolites recovery) dari fermentasi. Metode yang

digunakan bertujuan meminimalkan degradasi senyawa, pembentukan artefak,

kontaminasi ekstrak dengan pengotor eksternal (Seidel, 2006).

2.8 Pelarut

Pelarut adalah zat yang sering digunakan untuk melarutkan zat lain. Sifat

pelarut yang baik untuk ekstraksi yaitu toksisitas rendah, mudah menguap pada

suhu rendah, dapat mengekstraksi komponen senyawa dengan cepat, dapat

mengawetkan dan tidak menyebabkan ekstrak terdisosiasi (Tiwari, dkk., 2011).

Pemilihan pelarut tergantung pada senyawa yang ditargetkan. Menurut

(Sarker, dkk., 2006), pembagian pelarut berdasarkan kepolaran yang digunakan

dalam ekstraksi meliputi:

a. Pelarut polar: air, etanol, metanol (MetOH), dan sebagainya.

b. Pelarut semi polar: etil asetat (EtOAc), diklorometana (DCM), dan

sebagainya.

c. Pelarut non polar: n-heksan, petroleum eter, kloroform (CHCl3), dan

sebagainya.

18


2.9 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

KLT merupakan suatu teknik pemisahan dengan menggunakan adsorben

(fase stasioner) berupa lapisan tipis seragam yang disalutkan pada permukaan

bidang datar berupa lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik.

Pengembangan kromatografi terjadi ketika fase gerak tertapis melewati adsorben

(Deinstrop, 2007). KLT akan memvisualisasikan senyawa-senyawa yang

terkandung di dalam bahan sehingga bisa diketahui sifat-sifatnya terutama

polaritas (Saifudin, 2014).

Berdasarkan Rubiyanto (2016), teknik dalam melakukan KLT meliputi:

1. Lapisan tipis adsorben dibuat pada permukaan plat kaca atau aluminium

berukuran 5 cm x 20 cm; 20 cm x 20 cm. Untuk plat aluminium, ukuran

dapat diperkecil dengan memotongnya sesuai keinginan.

2. Tebal lapisan bervariasi tergantung tujuan penggunaan, adapun tebal

lapisan yang standard untuk plat KLT yang diperdagangkan umumnya ±

250 µm.

3. Larutan campuran senyawa diteteskan pada jarak tertentu dari dasar plat (±

1,5 cm) dengan menggunakan pipet mikro atau siringe untuk analisis

kuantitatif dan dapat menggunakan pipa kapiler untuk analisis kualitatif.

4. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel diuapkan dulu dengan

membiarkan sejenak plat setelah ditotol dengan sampel sebelum

dimasukkan ke dalam bejana pengembang (development chamber) yang

berisi fasa gerak (eluen).

5. Plat kromatografi dikembangkan dengan mencelupkannya ke dalam bejana

tersebut. Fasa gerak yang dipergunakan dapat terdiri atas satu macam atau

lebih pelarut.

6. Komponen-komponen senyawa akan bergerak dengan kecepatan berbeda

sesuai interaksi adsobsinya dengan fasa diam.

7. Kromatografi diakhiri ketika fasa gerak telah mencapai jarak tertentu dari

ujing plat. Senyawa-senyawa yang berbeda satu sama lain memiliki

perbandingan jarak tempuh senyawa terhadap jarak tempuh fasa gerak

yang berbeda pula. Nilai perbandingan ini dinamakan Rf (Retardation

factor).

19


a. Fase Diam

Beberapa jenis adsorben dan penggunaannya antara lain silika gel (asam-

asam amino, alkaloid, asam-asam lemak, dan lain-lain), alumina (zat warna,

fenol-fenol, dan lain-lain), kielsghur (tanah diatomae) (gula, oligosakarida,

trigliserida, dan lain-lain) dan selulosa (asam-asam amino, alkaloid, dan lain-

lain) (Rubiyanto, 2016). Sebagai adsorben dan fase diam yang paling banyak

digunakan dalam KLT adalah silika gel. Terkadang silika gel perlu ditambahkan

senyawa fluoresensi dengan tujuan bila disinari sinar ultraviolet (UV) maka

dapat berfluoresensi atau berpendar, sehingga dikenal dengan silica gel GF254

yang berarti silika gel dengan fluoresen berpendar pada 254 nm (Sumarno,

2001).

b. Fase Gerak

Karakter yang diinginkan dalam pemilihan fase gerak yang kompetitif

untuk KLT antara lain parameter kelarutan (solubility parameter), indeks polaritas

(polarity index), dan kekuatannya sebagai solvent (solvent strength).

Parameter kelarutan menunjukkan kemampuannya untuk berkombinasi dengan

beragam pelarut lain. Indeks polaritas menunjukkan besaran empiris yang

digunakan untuk mengukur ketertarikan antar molekul dalam solut dengan

molekul solvent pada parameter kelarutan solvent yang bersangkutan dalam

keadaan murninya (Rubiyanto, 2016).

Berdasarkan Rubiyanto (2016), sifat-sifat ideal pelarut yang digunakan

dalam KLT antara lain :

1. Tersedia dalam bentuk yang sangat murni dan harga yang memadai.

2. Tidak bereaksi dengan komponen dalam sampel maupun material fasa

dalam.

3. Memiliki titik didih yang rendah untuk memudahkan pengeringan

setelah pengembangan.

4. Memiliki kelarutan yang ideal pada berbagai campuran.

5. Tidak toksis dan mudah pembuangan limbahnya.

20


2.10 Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-Vis memiliki radiasi pada panjang gelombang 200-

700 nm yang dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron-elektron pada

ikatan di dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga menempati keadaan

kuantum yang lebih tinggi dan dalam proses menyerap sejumlah energi yang

melewati larutan tersebut. Semakin longgar elektron tersebut ditahan di dalam

ikatan molekul, semakin panjang gelombang radiasi yang diserap (Watson, 2009).

Komponen spektrofotometri UV-Vis terdiri dari sumber cahaya,

monokromator dan detektor. Sumber cahaya yang biasa digunakan adalah lampu

deuterium dan lampu tungsten. Monokromator merupakan diffraction grating

yang berperan untuk menyebarkan sinar beam ke komponen panjang gelombang.

Cahaya yang melalui sampel akan mencapai detektor yang merekam intensitas

cahaya transmisi. Detektor yang sering digunakan untuk instrumen modern adalah

fotoioda (Pavia, dkk., 2001).

Pengukuran dengan Spektrofotometer UV-Vis berdasarkan besarnya

energi yang diabsorbansi atau diteruskan oleh suatu zat, sehingga larutan yang

mengandung zat yang dapat menyerap cahaya monokromatik akan mengakibatkan

terjadinya pemantulan, penyerapan atau penerusan dari cahaya tersebut (Harmita,

2006). Panjang gelombang yang digunakan untuk uji antioksidan adalah panjang

gelombang maksimum absorbansi. Variasi ukuran panjang gelombang maksimum

yang digunakan untuk pengukuran adalah 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm dan

520 nm (Molyneux, 2004).


BAB III

3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia dan

Laboratorium Analisis Obat dan Pangan Halal Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Waktu

pelaksanaan penelitian yaitu dimulai dari Februari hingga September 2017.

3.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri

(Anumbra), jarum ose, batang L, labu Erlenmeyer (Pyrex), pinset, magnetic

stirrer, bunsen dan pemantik api, alumunium foil, karet, plastic wrap, plastik

tahan panas, karet, gunting, sumbat kapas, kertas saring, sedotan steril, neraca

analitik (AND GH-202), autoklaf (ALP Co., Ltd), mikropipet (Thermoscientific),

hot plate (Cimarec), Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), Fermentation Shaker

(IKA® KS 3000 i control), Vacuum rotary evaporator (Eyela), water bath

(Eyela), kaca obyek dan cover glass, mikroskop cahaya (Shimadzu) , botol,

corong pisah, statif, vial, pipa kapiler, cawan penguap, kaca arloji, pipet tetes, plat

kromatografi lapis tipis (KLT), bejana KLT, lampu UV, Spektrofotometer Uv-

Vis, dan alat-alat lainnya yang akan digunakan di laboratorium.

3.3 Bahan

3.3.1 Tanaman Uji

Sampel tanaman uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu tanaman

lumut hati M. emarginata Reinw., Blume & Nees yang diperoleh dari kawasan

Air Terjun Cigamea, Desa Gunungsari, Kecamatan Pamijahan, Kabupaten Bogor,

Provinsi Jawa Barat, diambil pada tanggal 02 Februari 2017 dan telah

dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi

LIPI, Cibinong, Bogor, Jawa Barat.

22


Gambar 3.1. Sampel Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees

3.3.2 Bahan Sterilisasi Permukaan

Natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25% (Bayclean), etanol 70%, dan akuades

steril.

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba

a. Media yang digunakan untuk isolasi kapang endofit yaitu Potato

Dextrose Agar (PDA).

b. Media yang digunakan untuk fermentasi yaitu Potato Dextrose Yeast

(PDY).

3.3.4 Bahan Kimia

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu etil asetat teknis, n-

heksan teknis, metanol teknis, plat KLT, metanol grade for analysis, akuades,

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) (Sigma-Aldrich) dan vitamin C (Sigma-

Aldrich).

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba

a. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)

Media PDA dibuat untuk isolasi kapang endofit. Media PDA dibuat

dengan cara ditimbang 39 gram PDA, dan ditambahkan 1 liter akuades. Kemudian

dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih sambil diaduk dengan magnetic

stirrer hingga homogen. Setelah itu, media disterilisasi dengan autoklaf selama 15

menit suhu 121°C. Media yang telah steril selanjutnya dituang ke dalam cawan

petri sebanyak ± 10 mL secara aseptis dan dibiarkan memadat dalam suhu ruang

(Ramadhan, 2011).

23


b. Pembuatan Media Potato Dextrose Yeast (PDY)

Media PDY dibuat untuk fermentasi kapang endofit. Media PDY dibuat

dengan cara mencampurkan media PDB, yeast extract dan CaCO3. Media PDB

dibuat dengan cara ditimbang 200 gram kentang yang telah dicuci bersih, lalu

diiris dan direbus dalam 1 liter air. Setelah itu, ditambahkan 20 gram dektrosa ke

dalam air hasil rebusan kentang (Zeng, dkk., 2011). Media PDB yang telah dibuat

ditambahkan dengan 2g/L yeast extract dan CaCO3 (hingga pH = 6) (Kumala,

dkk., 2007). Selanjutnya, media PDY disterilisasi dengan autoklaf selama 15

menit suhu 121°C (Ramadhan, 2011).

3.4.2 Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit

Tanaman lumut hati M. emarginata yang masih segar dan sehat

dibersihkan dari tanah lalu dicuci dengan air mengalir selama 30 menit.

Selanjutnya, M. emarginata disterilisasi permukaannya dengan cara direndam

dalam etanol 70% selama 1 menit, kemudian dipindahkan ke dalam larutan

NaOCl 5,25% selama 2 menit, lalu dipindahkan lagi ke dalam etanol 70% selama

30 detik (Hulikere, dkk., 2016 dengan modifikasi). Kemudian, M. emarginata

dicuci secara menyeluruh 3 kali dengan akuades steril selama beberapa menit

untuk menghilangkan larutan sterilisasi permukaan (surface sterilant) yang

berlebihan. Selanjutnya, lumut hati diletakkan di atas kertas saring steril hingga

kering (Kusari, dkk., 2014 dengan modifikasi).

Untuk mengisolasi kapang endofit dari tanaman lumut hati ini, sampel

yang telah kering dipotong ±1x1 cm menggunakan gunting steril. Kemudian

diambil 3 potongan lalu ditanam pada media PDA yang sudah memadat. Isolasi

kapang endofit dilakukan secara triplo. Isolasi kapang endofit dilakukan dalam

keadaan aseptis, yaitu di dalam LAFC. Setelah itu, diinkubasi selama 14 hari pada

suhu 27-30°C (Ariyono, dkk., 2014; Kumala & Pratiwi, 2014).

Pada akuades bilasan terakhir digunakan sebagai kontrol dengan cara

batang L steril dicelupkan ke dalam akuades dan diratakan ke permukaan media

PDA lainnya. Apabila pada media PDA kontrol tumbuh kapang, maka kapang

yang tumbuh bukanlah kapang endofit (Ariyono, dkk., 2014).

24


3.4.3 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi PDA kemudian

dimurnikan ke media PDA lain secara aseptis, yaitu di dalam LAFC. Pemurnian

berdasarkan kenampakan morfologi secara makroskopis yang meliputi warna dan

bentuk. Pemurnian dilakukan secara berulang-ulang hingga didapatkan isolat

kapang tunggal dan murni dengan cara masing-masing mikroorganisme diambil

dengan jarum ose dan ditumbuhkan kembali pada cawan petri yang berisi media

PDA (Ariyono, dkk., 2014). Isolat yang telah murni dipindahkan ke dalam dua

jenis media kultur (stock culture ke dalam PDA lain dan working culture ke dalam

PDA miring) (Kumala & Siswanto, 2007).

3.4.4 Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi kapang endofit dilakukan secara makroskopis dan

mikroskopis. Pengamatan isolat kapang endofit dilakukan berdasarkan Gandjar

(1999).

a. Secara Makroskopis

Pengamatan secara makroskopis meliputi warna dan permukaan koloni

(granular; seperti tepung; menggunung; licin; ada atau tidaknya tetesan eksudat),

garis-garis radial dari pusat koloni ke arah tepi koloni, dan lingkaran-lingkaran

konsentris dalam cawan petri (konsentris atau tidak konsentris), serta

pertumbuhan koloni (cm/hari) yang dilakukan setiap hari sampai koloni kapang

mencapai diameter 9 cm dengan menggunakan penggaris.

b. Secara Mikroskopis

Pengamatan secara makroskopik terlebih dahulu membuat preparat

kapang. Disiapkan cawan petri yang berisi tisu, kaca objek dan cover glass

dibungkus menggunakan kertas. Selanjutnya, cawan petri disterilisasi

menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

25


Setelah proses sterilisasi selesai di atas kaca objek ditetesi media PDA dan

dibiarkan memadat. Kapang yang telah diisolasi pada media PDA diambil sedikit

miseliumnya dengan menggunakan jarum ose steril kemudian diletakkan pada

kaca objek yang telah ditetesi media PDA kemudian ditutup dengan menggunakan

cover glass. Preparat diletakkan pada cawan petri yang telah diberi alas tisu steril

lembab dan inkubasi selama 2-3 hari (Ariyono, dkk., 2014).

3.4.5 Fermentasi

Terlebih dahulu isolat kapang endofit ditumbuhkan pada media PDA

selama 7 hari dalam cawan petri. Saat usia isolat kapang endofit telah 7 hari

diambil sebanyak 5 potong menggunakan sedotan steril berdiameter 1 cm.

Kemudian, potongan kapang tersebut dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250

mL yang berisi media fermentasi PDY steril sebanyak 50 mL dan difermentasi

menggunakan fermentation shaker selama 14 hari pada suhu 28°C dengan

kecepatan 130 rpm (Kumala, dkk., 2015 dengan modifikasi).

3.4.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi

Terlebih dahulu medium fermentasi (filtrat) dan biomassa dipisahkan

dengan cara penyaringan (Guo, dkk., 2008). Selanjutnya dilakukan ekstraksi, pada

biomassa dimaserasi dengan menggunakan metanol dan filtrat dipartisi cair-cair

dengan menggunakan pelarut berdasarkan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu n-

heksan (non polar) dan etil asetat (semi polar). Perbandingan masing-masing

filtrat:pelarut (1:1). Hasil ekstraksi kemudian diuapkan menggunakan rotary

evaporator vaccum hingga didapatkan ekstrak kental atau pekat.

3.4.7 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi Secara Kualitatif

dengan Metode DPPH

Pertama-tama dibuat reagen larutan DPPH dengan cara melarutkan 8 mg

serbuk DPPH ke dalam 20 mL metanol pro analisis (DPPH 0,04%). Pengujian

dilakukan dengan cara ekstrak fermentasi dilarutkan dengan pelarut seperti yang

digunakan pada ekstraksi, kemudian ditotolkan pada plat KLT dengan

menggunakan pipa kapiler. Plat yang sudah ditotol selanjutnya dielusi dengan

eluen yang sesuai.

26


Selanjutnya disemprot dengan reagen DPPH hingga permukaan terbasahi secara

menyeluruh dan dibiarkan selama beberapa menit pada ruangan tertutup. Setelah

itu, bercak yang muncul diamati (Basma, dkk., 2011).

3.4.8 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fermentasi Secara Kuantitatif

dengan Metode DPPH

Terlebih dahulu membuat reagen DPPH 0,25 mM dengan cara melarutkan

sebanyak 4,9 mg DPPH ke dalam metanol 50 mL. Selanjutnya dilakukan

pengujian dengan cara membuat variasi konsentrasi (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25

μg ml) dari ekstrak fermentasi. Masing-masing konsentrasi di masukkan ke dalam

labu ukur, ditambahkan metanol hingga 4 mL lalu ditambahkan 1 mL reagen

DPPH 0,25 mM. Campuran yang telah dibuat tersebut kemudian dikocok dengan

kuat dan diinkubasi di dalam kondisi gelap selama 30 menit. Setelah itu,

dilakukan pengukuran terhadap absorbansi dari masing-masing campuran

menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Pada

uji ini vitamin C digunakan sebagai standar (Huang, dkk., 2010; Komala, dkk.,

2015).


BAB IV

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tanaman

Determinasi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui keaslian dan

kebenaran tanaman. Hasil determinasi yang dilakukan di Herbarium Bogoriense,

Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI, Cibinong, Bogor, Jawa Barat

menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar

tanaman lumut hati (Marchantia emarginata Reinw., Blume & Nees) dari suku

Marchantiaceae (Lampiran 2).

4.2 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit

Sampel yang digunakan sebagai sumber isolat kapang endofit berasal dari

talus tanaman lumut hati M. emarginata Reinw., Blume & Nees. Tanaman lumut

juga merupakan tempat bagi endofit dan endofit dari spesies lumut hati tumbuh di

dalam talus (Davis et al., 2003; Kumala, 2014).

Sampel yang digunakan harus memenuhi kriteria yaitu segar dan tidak

layu; sehat (tidak menunjukkan adanya gejala penyakit) karena di dalam jaringan

tanaman inang yang sakit biasanya didominasi oleh kapang patogen (Atika, 2007).

Proses isolasi merupakan tahap pertama yang dilakukan untuk memperoleh

kapang endofit dari sampel. Sebelum isolasi, sampel dicuci dengan air bersih

mengalir untuk menghilangkan pengotor dan tanah yang menempel, lalu

dilakukan sterilisasi permukaan untuk menghindari kontaminan atau adanya

kapang lain yang tumbuh namun bukan berasal dari sampel. Permukaan sampel

yang akan digunakan harus steril dan bebas dari kontaminasi sehingga kapang

yang tumbuh pada media isolasi benar merupakan kapang endofit (Strobel, 2003).

Pada penelitian ini, sterilisasi permukaan dilakukan dengan perendaman

sampel dalam alkohol 70% dan NaOCl 5,25% (Hulikere, dkk., 2016). Alkohol

70% berfungsi untuk mendenaturasi protein, membran sel, merusak struktur

lemak dan membran protein mikroba sehingga mikroba mengalami dehidrasi.

28


NaOCl merupakan zat kimia yang termasuk golongan halogen yang akan

melepaskan klor. Mekanisme kerja senyawa klor yaitu bergabung dengan protein

membran sel dan enzim sehingga dapat terjadi oksidasi dan kerusakan organel

terpenting dari sel mikroba (Pelczar, 1998; Pratiwi, 2008). Kombinasi dua pelarut

tersebut digunakan untuk mensterilkan permukaan organ tanaman secara optimal

(Zhang, dkk., 2006). Setelah proses dekontaminasi, dilakukan pembilasan dengan

menggunakan akuades steril, tujuannya yaitu untuk menghilangkan sisa alkohol

70% dan NaOCl 5,25% yang menempel pada sampel.

Cara yang dilakukan untuk meminimalkan terjadinya kontaminasi dari

lingkungan yaitu pengerjaan dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow

cabinet pada proses sterilisasi permukaan dan isolasi kapang endofit (Radji,

2011). Isolasi dilakukan dengan cara triplo untuk mencegah kontaminasi dan

dengan menggunakan metode direct seed planting yaitu sampel langsung

ditempelkan pada media isolasi (Tabel 4.1). Potongan talus pada media isolasi

kemudian diinkubasi dalam suhu ruang selama 14 hari dan pertumbuhannya

diamati setiap hari.

Tabel 4.1. Penanaman sampel

Keterangan: dalam satu petri ditanam 3 potongan talus

Media isolasi yang digunakan yaitu media PDA. Media PDA merupakan

media yang umum digunakan untuk menumbuhkan kapang endofit dan media

pemurnian kapang endofit. Media PDA kaya akan nutrisi yang mudah dicerna,

sehingga memudahkan pertumbuhan kapang (Ariyono dkk., 2014).

Tampak Sebalik Tampak Depan

29


Media PDA mengandung ekstrak kentang dan dekstrosa, sebagai sumber

karbohidrat sebagai nutrisi untuk pertumbuhan kapang. Akuades bilasan terakhir

pada proses sterilisasi permukaan digunakan sebagai kontrol dengan meneteskan

di permukaan media PDA. Adanya kontrol bertujuan untuk memastikan

keefektifan dari sterilisasi permukaan, jika tidak terjadi pertumbuhan kapang pada

media kontrol maka hal tersebut membuktikan bahwa kapang yang tumbuh di

sekitar sampel adalah benar kapang endofit (Ariyono dkk., 2014). Hasil kontrol

sterilisasi permukaan dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Tabel 4.2. Hasil kontrol sterilisasi permukaan

Keterangan: tidak ada mikroorganisme yang tumbuh

Kapang endofit yang berhasil tumbuh pada media isolasi diamati koloni

kapangnya. Pengamatan koloni kapang dilakukan dengan menggunakan kriteria

bahwa bentuk koloni yang berbeda dianggap sebagai isolat yang berbeda,

kemudian setiap koloni dengan morfologi berbeda dipisahkan menjadi isolat

tersendiri yang ditanam pada media PDA baru untuk memperoleh biakan kapang

endofit yang murni. Hasil kapang endofit yang tumbuh dapat dilihat pada Tabel

4.3.

Tampak Sebalik Tampak Depan

30


Tabel 4.3. Hasil kapang endofit yang tumbuh

Petri 1

Petri 2

Petri 3

Keterangan: Pada petri 1 tumbuh kapang di 2 talus, Pada petri 2 tumbuh kapang di 1 talus, Pada

petri 3 tumbuh kapang di tiga talus

Tampak Depan

Tampak Depan

Tampak Depan

Tampak Sebalik

Tampak Sebalik

Tampak Sebalik

31


Tabel 4.4. Hasil isolasi dan pemurnian kapang endofit dari tanaman lumut hati

(M. emarginata Reinw., Blume & Nees).

Sampel Petri Jumlah Kode Isolat

Tanaman lumut hati (M. emarginata Reinw.,

Blume & Nees)

Petri 1 2 Isolat MEA1

MEA2

Petri 2 1 Isolat MEB1

Petri 3 3 Isolat MEC1

MEC2

MEC3

Hasil isolasi dan pemurnian yang dilakukan, didapatkan 6 isolat kapang

endofit dengan perincian dapat dilihat pada Tabel 4.4. Keenam isolat tersebut

kemudian dilakukan karakterisasi secara makroskopik dan mikroskopik.

4.3 Karakterisasi Kapang Endofit

4.3.1 Isolat MEA1

Secara makroskopik isolat MEA1 yang berumur 7 hari memiliki diameter

6,7 cm. Tampak depan berwarna abu-abu kehijauan, permukaan rata dan tipis,

terdapat tetesan eksudat tidak terdapat garis-garis radial, serta memiliki lingkaran-

lingkaran konsentris. Sedangkan tampak sebalik berwarna abu-abu kehijauan,

berbintik hitam, dan tepi berwarna putih. Secara mikroskopik isolat MEA1

memiliki hifa yang bersekat (septat), hifa bercabang, dan terdapat konidia

berbentuk lonjong dan bulan sabit. Hasil karakteristik isolat MEA1 secara

makroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan secara mikroskopik dapat dilihat

pada Gambar 4.2.

32


Gambar 4.1. Isolat MEA1 secara makroskopik (a) tampak depan, (b) tampak sebalik

(Dokumentasi Pribadi, 2017)

Gambar 4.2. Isolat MEA1 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x

(a) septat, (b) konidia lonjong, (c) konidia bulan sabit

4.3.2 Isolat MEA2

Secara makroskopik isolat MEA2 yang berumur 7 hari memiliki diameter

8,2 cm. Tampak depan berwarna putih keabu-abuan, dengan bagian tengah

berwarna hijau, permukaan seperti kapas, tebal, tidak terdapat garis-garis radial,

serta memiliki lingkaran-lingkaran konsentris. Sedangkan tampak sebalik

berwarna hijau kehitaman dengan tepi berwarna putih. Secara mikroskopik isolat

MEA2 memiliki hifa yang bersekat (septat), hifa bercabang, dan terdapat konidia

berbentuk lonjong. Hasil karakteristik isolat MEA2 secara makroskopik dapat

dilihat pada Gambar 4.3 dan secara mikroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.4.

(a) (b)

a

b c

33


Gambar 4.3. Isolat MEA2 secara makroskopik (a) tampak depan, (b) tampak sebalik


Gambar 4.4. Isolat MEA2 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x

(a) septat, (b) konidia lonjong

4.3.3 Isolat MEB1

Secara makroskopik isolat MEB1 yang berumur 7 hari memiliki diameter

9 cm. Tampak depan berwarna putih keabu-abuan, permukaan menggunung, tidak

terdapat garis-garis radial, serta tidak terdapat lingkaran-lingkaran konsentris.

Sedangkan tampak sebalik berwarna coklat kehijauan dan tepi tidak rata. Secara

mikroskopik isolat MEB1 memiliki hifa yang bersekat (septat), hifa bercabang,

hifa berwarna hijau kehitaman, dan terdapat konidia berbentuk tidak beraturan.

Hasil karakteristik isolat MEB1 secara makroskopik dapat dilihat pada Gambar

4.5 dan secara mikroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.6.

(a) (b)

a

b

34


Gambar 4.5. Isolat MEB1 secara makroskopik (a) tampak depan, (b) tampak sebalik


Gambar 4.6. Isolat MEB1 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x

(a) septat, (b) konidia tidak beraturan

4.3.4 Isolat MEC1

Secara makroskopik isolat MEC1 yang berumur 7 hari memiliki diameter

6,3 cm. Tampak depan berwarna putih, krem, dan hitam kehijauan; permukaan

isolat berbintik hitam, tipis; terdapat garis-garis radial dari pusat koloni kearah

tepi koloni; serta memiliki lingkaran-lingkaran konsentris. Sedangkan tampak

sebalik berwarna kuning dan hitam kehijauan, tepi tidak rata berwarna putih.

Secara mikroskopik isolat MEC1 memiliki hifa yang bersekat (septat), hifa

bercabang, hifa berwarna hijau, dan terdapat konidia berbentuk lonjong. Hasil

karakteristik isolat MEC1 secara makroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.7 dan

secara mikroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.8.

(a) (b)

a

b

35


Gambar 4.7. Isolat MEC1 secara makroskopik (a) tampak depan, (b) tampak sebalik


Gambar 4.8. Isolat MEC1 secara mikroskopik dengan perbesaran 400x


4.3.5 Isolat MEC2


6 cm. Tampak depan berwarna abu-abu dan hitam kehijauan, permukaan rata dan

tipis, terdapat tetesan eksudat, tidak terdapat garis-garis radial, serta memiliki

lingkaran-lingkaran konsentris. Sedangkan tampak sebalik berwarna abu-abu dan

hitam kehijauan,berbintik hitam, serta tepi tidak rata berwarna putih. Secara

mikroskopik isolat MEC2 memiliki hifa yang bersekat (septat), hifa bercabang,

dan terdapat konidia berbentuk lonjong. Hasil karakteristik isolat MEC2 secara

makroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.9 dan secara mikroskopik dapat dilihat

pada Gambar 4.10.

(a) (b)

a

b

36






4.3.6 Isolat MEC3


7,5 cm. Tampak depan berwarna putih, permukaan seperti kapas, memiliki garis-

garis radial, serta tidak memiliki lingkaran-lingkaran konsentris. Sedangkan

tampak sebalik berwarna putih dengan. Secara mikroskopik isolat MEC3

memiliki hifa yang bersekat (septat), hifa bercabang, serta terdapat konidia

berbentuk bulat. Hasil karakteristik isolat MEC3 secara makroskopik dapat dilihat

pada Gambar 4.11 dan secara mikroskopik dapat dilihat pada Gambar 4.12.

(a) (b)

a

b

37





(a) septat, (b) konidia bulat

Berdasarkan hasil karakteristik kapang endofit, keenam isolat tersebut

tidak memiliki kesamaan dari segi kenampakan morfologi antara satu isolat

dengan isolat lainnya. Dengan demikian, keenam isolat tersebut dilanjutkan ke

tahap selanjutnya.

4.4 Fermentasi

Fermentasi bertujuan untuk mendapatkan metabolit sekunder dari kapang

endofit. Pada Proses fermentasi digunakan media PDY yang diproses semi

sintetik, yaitu dengan cara ekstrak kentang dibuat terlebih dahulu dan

ditambahkan dekstrosa, kemudian yeast extract serta CaCO3.

(a) (b)

a

b

38


Tujuan penambahan yeast extract ke dalam ekstrak kentang adalah agar nutrisi

yang dibutuhkan untuk pertumbuhan kapang dapat terpenuhi sehingga kapang

dapat tumbuh secara optimal, sedangkan tujuan penambahan CaCO3 yaitu untuk

mengatur pH.

PDY adalah medium yang mengandung karbon dalam jumlah yang banyak

bersumber dari ekstrak kentang dan dekstrosa, serta mengandung nitrogen

bersumber dari yeast extract (Kumala, dkk., 2015). Sel-sel mikroba sebagian

besar terdiri dari unsur-unsur karbon dan nitrogen, sehingga sumber karbon dan

nitrogen merupakan komponen terpenting dalam medium pertumbuhan (Pratiwi,

2008). Karbohidrat merupakan senyawa struktural dan penyimpanan di dalam sel

kapang serta memiliki peran penting dalam pertumbuhan juga dalam produksi

senyawa metabolit sekunder yang berguna (Abo-Elmagd, 2014). Medium

fermentasi yang mengandung sumber nitrogen dari yeast extract akan

menghasilkan senyawa metabolit sekunder sebagai antioksidan (Gazi, dkk., 2004).

Selain nutrisi, pH substrat juga sangat penting untuk pertumbuhan, karena

enzim-enzim tertentu hanya akan mengurai suatu substrat sesuai dengan

aktivitasnya pada pH tertentu (Gandjar, dkk., 2006). Kapang cenderung

menghasilkan senyawa metabolit sekunder sebagai antioksidan pada kisaran pH

asam dengan kondisi yang optimum terbentuknya senyawa aktif yaitu pada pH

awal 7 (Gazi, dkk., 2004 dalam Septiana & Simanjuntak, 2017).

Proses fermentasi dilakukan selama 14 hari pada suhu kamar dengan

metode fermentasi goyang (shaking fermentation) menggunakan incubator

shaker. Proses agitasi dan aerasi dalam fermentasi goyang menyebabkan efisiensi

suplai oksigen lebih baik dan distribusi panas tersebar rata pada semua bagian

substrat yang dibutuhkan oleh mikroorganisme (Kumala dkk., 2015). Fermentasi

kapang endofit menggunakan medium cair yang digoyang, setelah beberapa hari

akan terlihat kapas-kapas kecil berwarna putih melayang-layang dalam medium.

Medium fermentasi juga mengalami perubahan warna, sebagian media berwarna

keruh dan sebagian lagi menjadi jernih.

39


Bentuk-bentuk seperti kapas tersebut adalah spora atau konidia tunggal yang

sudah tumbuh menjadi miselium. Pemisahan miselium dari mediumnya harus

melalui suatu penyaringan (Gandjar, dkk., 2006). Gambar hasil fermentasi kapang

endofit dapat dilihat pada Lampiran 9.

4.5 Ekstraksi

Setelah mendapatkan hasil fermentasi, selanjutnya pemisahan biomassa

dengan filtrat menggunakan alat corong Buchner. Hal tersebut bertujuan untuk

memisahkan endapan dari suatu campuran larutan yang tidak larut. Prinsip kerja

dari corong Buchner adalah menyedot udara di ruang corong, dengan demikian air

dapat menetes dan menurun sedangkan zat yang tidak larut tetap di dalam

corongnya. Filtrat diekstraksi dengan metode partisi cair-cair dan biomassa

diekstraksi dengan metode maserasi. Ekstraksi dilakukan untuk memisahkan

senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari fermentasi berdasarkan

kepolarannya (Kumala & Pratiwi, 2014).

Filtrat dipartisi menggunakan pelarut n-heksan dan etil asetat berdasarkan

perbedaan kepolarannya. Pelarut n-heksan akan menarik senyawa non polar dan

etil asetat akan menarik senyawa semi polar. Ekstraksi ini dimaksudkan agar

senyawa dalam kapang endofit diharapkan dapat terlarut dengan baik sesuai

polaritasnya. Pada biomassa dilakukan proses penghalusan dengan menggunakan

lumpang dan alu. Dengan adanya penghalusan maka memungkinkan terjadinya

pemecahan sel yang dapat membantu proses maserasi. Ukuran zat yang semakin

kecil akan meningkatkan luas permukaan sehingga proses ekstraksi akan semakin

efektif (Handa, dkk., 2008). Maserasi dilakukan menggunakan pelarut metanol.

Metanol dan golongan alkohol merupakan pelarut serba guna yang baik untuk

ekstraksi pendahuluan (Harborne, 1987).

Fraksi pelarut hasil partisi dan maserasi yang telah didapatkan, kemudian

diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak

kental atau kering. Perolehan jumlah bobot ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.5

dan ekstrak hasil ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 10.

40


Tabel 4.5. Perolehan bobot ekstrak

Kode Isolat

Biomassa Medium Fermentasi (Filtrat)

Ekstrak Metanol

(mg)

Ekstrak Etil Asetat

(mg)

Ekstrak N-heksan

(mg)

MEA1 274,3 27 267,9

MEA2 82,2 23,3 67,3

MEB1 352,6 52,4 7,3

MEC1 566 126,9 52,6

MEC2 254,1 116,8 9,2

MEC3 188,1 12,8 5,9

4.6 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif

Uji aktivitas antioksidan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif

menggunakan metode DPPH. Metode DPPH merupakan metode yang dapat

mengukur efektifitas antioksidan secara cepat, sederhana dan tidak membutuhkan

biaya yang mahal (Pine, dkk., 2008). Uji aktivitas antioksidan dengan metode

DPPH berdasarkan hilangnya warna ungu akibat tereduksinya DPPH oleh

antioksidan. KLT digunakan sebagai uji secara kualitatif untuk mengetahui

aktivitas antioksidan ekstrak kapang endofit. Aktivitas antioksidan dari ekstrak

ditunjukkan dengan perubahan warna pada plat KLT dari ungu menjadi kuning

setelah disemprot larutan DPPH.

Masing-masing ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol dilarutkan sedikit

ke dalam pelarutnya hingga homogen kemudian ditotolkan pada plat KLT. Plat

KLT selanjutnya dielusi dengan eluen yang sesuai. Eluen yang digunakan untuk

ekstrak n-heksan yaitu n-heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2, untuk

ekstrak etil asetat yaitu etil asetat:n-heksan dengan perbandingan 8:2, dan untuk

ekstrak metanol yaitu metanol:etil asetat dengan perbandingan 8:2. Setelah selesai

dielusi, plat KLT disemprotkan dengan larutan DPPH 0,04%. Adanya aktivitas

antioksidan dari ekstrak ditandai dengan hasil positif dari uji yang dilakukan,

begitu sebaliknya. Hasil uji KLT dapat dilihat pada Tabel 4.6.

41


Tabel 4.6. Hasil uji KLT ekstrak

Kode

Ekstrak UV 254 nm UV 366 nm

Hasil Uji Kualitatif

dengan DPPH

Ket

MEA1

Metanol

+

Etil asetat

+

N-heksan

+

MEA2

Metanol

+

Etil asetat

+

N-heksan

+

Keterangan: hasil uji kualitatif untuk melihat aktivitas antioksidan dari masing-masing ekstrak.

Semua ekstrak fermentasi isolat MEA1 dan MEA2 memiliki hasil yang positif dengan uji DPPH.

42


Kode

UV 254 nm UV 366 nm Hasil Uji Kualitatif

dengan DPPH

Ket

MEB1

Metanol

+

Etil asetat

+

N-heksan

+

MEC1

Metanol

+

Etil asetat

+

N-heksan

+


Semua ekstrak fermentasi isolat MEB1 dan MEC1 memiliki hasil yang positif dengan uji DPPH.

43


Kode

Ekstrak UV 254 nm UV 366 nm

Hasil Uji Kualitatif

dengan DPPH

Ket

MEC2

Metanol

+

Etil asetat

+

N-heksan

+

MEC3

Metanol

+

Etil asetat

+

N-heksan

+


Semua ekstrak fermentasi isolat MEC2 dan MEC3 memiliki hasil yang positif dengan uji DPPH.

44


Tabel 4.7. Perhitungan nilai Rf (Retardation Factor)

Isolat Ekstrak Jarak Bercak

(cm)

Jarak Elusi

(cm)

Nilai Rf

MEA1

Metanol 1

3,8

4

4

0,25

0,95

Etil Asetat 1,9

3

4

4 0,47

0,75

N-heksan 1

2,3

3,1

4

4

4

0,25

0,57

0,77

MEA2

Metanol 1,7

2,4

4

4 0,42

0,6

Etil Asetat 1,5

3

3,8

4

4

4

0,37

0,75

0,95

N-heksan 2,6

3,3

4

4 0,65

0,82

MEB1

Metanol 2,3 4 0,57

Etil Asetat 1,3

2,7

3,5

4

4

4

0,32

0,67

0,87

N-heksan 1,2

2

4

4

0,3

0,5

MEC1

Metanol 1,1 4 0,27

Etil Asetat 2,3 4 0,57

N-heksan 2,1

2,6

4

4 0,52

0,65

MEC2

Metanol 2,5

3,2

4

4

0,62

0,8

Etil Asetat 1,1

2,7

3,6

4

4

4

0,27

0,67

0,9

N-heksan 1,8

3

4

4

0,45

0,75

MEC3

Metanol 2,2 4 0,55

Etil Asetat 3,8 4 0,95

N-heksan 2,5

3,2

4

4 0,62

0,8 Keterangan: hasil perhitungan nilai Rf dari masing-masing ekstrak fermentasi kapang endofit.

Dengan nilai Rf menunjukkan keberadaan senyawa antioksidan dari masing-masing ekstrak.

45


Secara umum, eluen yang digunakan belum mampu mendeteksi senyawa

antioksidan, namun pada gambaran awal aktivitas antioksidan telah ditunjukkan

pada penggunaan eluen tersebut (Sutomo, dkk., 2016). Hasil uji KLT

memperlihatkan bahwa seluruh ekstrak fermentasi isolat kapang endofit positif

memiliki aktivitas antioksidan. Hasil positif ditandai dengan adanya bercak

kuning dengan latar belakang ungu yang semakin memudar setelah disemprot

larutan DPPH. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh ekstrak fermentasi kapang

endofit memiliki aktivitas antioksidan yang ditandai dengan hasil positif pada uji

KLT.

Dua senyawa atau lebih dapat dikatakan identik apabila mempunyai nilai

Rf yang sama pada kondisi KLT yang sama (Rusnaeni, dkk.. 2016). Berdasarkan

hasil nilai Rf pada masing-masing ekstrak menunjukkan bahwa keberadaan

senyawa antioksidan berada pada rentang nilai Rf 0,2 hingga 0,9. Hasil

perhitungan nilai Rf dapat dilihat pada Tabel 4.7.

Ekstrak fermentasi isolat kapang endofit MEB1 memiliki aktivitas

antioksidan yang baik secara kualitatif dilihat dari profil KLTnya (Tabel 4.6).

Dengan demikian, dilanjutkan untuk uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif.

4.7 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif

Berdasarkan hasil uji aktivitas antioksidan secara kualitatif, ekstrak

metanol dan etil asetat dari isolat kapang endofit MEB1 memiliki aktivitas

antioksidan yang baik (Tabel 4.8) dan dengan pertimbangan jumlah bobot ekstrak

menjadi alasan pemilihan ektrak untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan secara

kuantitatif. Jumlah bobot masing-masing ekstrak yaitu ekstrak metanol 352,6 mg,

dan ektrak etil asetat 52,4 mg. Ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat yang

diujikan aktivitas antioksidannya secara kuantitatif, sedangkan ekstrak n-heksan

tidak diujikan karena jumlah bobot ekstrak n-heksan 7,3 mg dan jumlah bobot

ekstrak yang dibutuhkan untuk uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif yaitu 10

mg.

46


Tabel 4.8. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan etil asetat

secara kualitatif

Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat

Uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis. Hasil Optimasi panjang gelombang DPPH

menunjukkan larutan DPPH terletak pada panjang gelombang maksimum 515,5

nm (Lampiran 11). Dengan demikian, semua pengukuran dengan metode DPPH

dilakukan pada panjang gelombang tersebut.

Pengujian aktivitas antioksidan metode DPPH menggunakan

spektrofotometer UV-Vis melibatkan pengukuran nilai absorbansi pada panjang

gelombang maksimum 515,5 nm dengan berbagai variasi konsentrasi sampel yang

digunakan yaitu 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm, dan 6,25 ppm.

Tiap konsentrasi diukur pada spektrofotometer UV-VIS dengan vitamin C sebagai

pembanding (kontrol positif). Variasi konsentrasi vitamin C yaitu 1 ppm, 2 ppm, 3

ppm, 4 ppm, 5 ppm. Semakin besar konsentrasi sampel maka nilai absorbansi

akan semakin menurun. Aktivitas antioksidan dari sampel akan merubah warna

larutan DPPH dalam metanol yang semula berwarna ungu berubah menjadi

kuning (Molyneux 2004). Tabel absorbansi dan kurva persamaan regresi linear

dapat dilihat pada Lampiran 12 dan Lampiran 13.

47


Tabel 4.9. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan etil asetat secara

kuantitatif

Konsentrasi

(ppm)

∑ Absorbansi % Inhibisi IC50 (ppm) AAI

Ekstrak Metanol

Blanko 0,588 -

720,4

0,13

200 0,504 14,285

100 0,540 8,163

50 0,559 4,931

25 0,570 3,061

12,5 0,578 1,70

6,25 0,584 0,68

Ekstrak Etil Asetat

Blanko 0,418 -

48,02

2,04

100 0,062 85,167

50 0,168 59,808

25 0,272 34,928

12,5 0,329 21,291

6,25 0,361 13,636

Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai konsentrasi hambat 50%

(IC50). Dimana aktivitas antioksidan akan berbanding terbalik dengan nilai IC50.

Semakin tinggi aktivitas suatu sampel maka semakin rendah nilai IC50 dan

sebaliknya (Pratiwi, dkk., 2013). Hasil persamaan regresi linear menunjukkan

bahwa masing-masing ekstrak fermentasi isolat kapang endofit MEB1 memiliki

aktivitas antioksidan yang bervariasi. Ekstrak metanol (biomassa) memiliki

aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 720,45 ppm dan ekstrak etil asetat (filtrat)

memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 48,02 ppm.

Aktivitas antioksidan suatu bahan dikelompokkan ke dalam 4 kategori

yaitu antioksidan kategori sangat kuat jika nilai IC50 <50 ppm , kategori kuat jika

nilai IC50 50-100 ppm, kategori sedang jika nilai IC50 101-150 ppm dan kategori

lemah jika nilai IC50 >150 ppm (Blois, 1958). Perhitungan nilai IC50 ekstrak

dapat dilihat pada Lampiran 13.

48


Tabel 4.10. Hasil uji aktivitas antioksidan vitamin C secara kuantitatif

Konsentrasi

(ppm)

∑ Absorbansi % Inhibisi IC50 (ppm) AAI

Blanko 0,598 -

3,74

26,19 1 0,568 5,066

2 0,467 21,881

3 0,393 34,354

4 0,281 53,062

5 0,159 73,385

Nilai AAI juga digunakan untuk menyatakan aktivitas Antioksidan.

Aktivitas antioksidan berdasarkan nilai AAI suatu ekstrak atau senyawa dapat

dikelompokkan ke dalam 4 kategori , sama halnya dengan kategori nilai IC50.

Keempat kategori tersebut yaitu AAI <0,5 bermakna aktivitas antioksidan lemah,

AAI 0,5-1 bermakna aktivitas antioksidan sedang, AAI 1-2 bermakna aktivitas

antioksidan kuat, dan AAI >2 bermakna aktivitas antioksidan sangat kuat (Scherer

dan Godoy, 2009).

Indeks aktivitas antioksidan ekstrak metanol yaitu 0,13 menunjukkan

bahwa ekstrak metanol kapang endofit MEB1 memiliki aktivitas antioksidan

dengan kategori lemah. Indeks aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat yaitu 2,04

menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kapang endofit MEB1 memiliki aktivitas

antioksidan dengan kategori kuat.

Vitamin C sebagai pembanding memiliki nilai IC50 3,74 ppm dan nilai

AAI 26,19 (Tabel 4.8). Jika dibandingkan berdasarkan nilai AAI ekstrak etil

asetat termasuk kategoti sangat kuat seperti vitamin C, sedangkan ekstrak metanol

termasuk kategori lemah.


BAB V

5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Isolasi kapang endofit dari tanaman Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees pada media potato dextrose agar (PDA) diperoleh 6 isolat yaitu

MEA1, MEA2, MEB1, MEC1, MEC2, MEC3. Ekstrak fermentasi isolat kapang

endofit MEB1 memiliki aktivitas antioksidan yang baik secara kualitatif.

Berdasarkan hasil penelitian, ekstrak metanol (biomassa) kapang endofit MEB1

memiliki nilai IC50 sebesar 720,45 ppm dan nilai AAI 0,13, ekstrak etil asetat

(filtrat) kapang endofit MEB1 memiliki nilai IC50 sebesar 48,02 ppm dan nilai

AAI 2,04, sedangkan ekstrak n-heksan tidak dilakukan uji aktivitas antioksidan

secara kuantitatif. Vitamin C sebagai pembanding memiliki nilai IC50 3,74 ppm

dan nilai AAI 26,19.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan optimasi kondisi fermentasi dan ekstraksi terhadap isolat-

isolat kapang endofit.

2. Perlu dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui metabolit sekunder dari

kapang endofit.

3. Perlu dilakukan uji terhadap aktivitas lain dari ekstrak fermentasi isolat

kapang endofit.

4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk isolasi senyawa terhadap

ekstrak fermentasi isolat kapang endofit Marchantia emarginata Reinw.,

Blume & Nees sehingga dapat diketahui jenis senyawa yang aktif sebagai

antioksidan.

50


DAFTAR PUSTAKA

Abo-Elmagd, H.I. 2014. “Evaluation and Optimization of Antioxidant Potentially

of Chaetomium madrasense AUMC 9376”. J. Genet. Engineer.

Biotechnol.12:21-26.

Agusta, Andria. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: Penerbit ITB.

Ariyono,R., dkk. 2014. "Keanekaragaman Jamur Endofit Akar Kangkung Darat

(Ipomoea reptans Poir.) Pada Lahan Pertanian Organik dan

Konvensional". Jurnal Hama Dan Penyakit Tanaman, 2(1), 1–10.

Asakawa, Y. 1995. Chemical Constituent of The Bryophytes. (W. Herz, G. .

Kirby, W. . Moore, & C. Tamm, Eds.). New York: Springer-Verlag/Wien.

Https://Doi.Org/10.1007/978-3-7091-6896-7.

Asakawa, Y. 2004. "Chemosystematics of The Hepaticae". 65, 623–669.

Https://Doi.Org/10.1016/J.Phytochem.2004.01.003.

Asakawa, Y., dkk. 2012. "Phytochemistry Phytochemical and Biological Studies

of Bryophytes". Phytochemistry.

Https://Doi.Org/10.1016/J.Phytochem.2012.04.012.

Asakawa, Y., dkk. 2013. Progress In The Chemistry of Organic Natural Product.

(A. Kinghorn, H. Falk, & J. Kobayashi, Eds.). New York Dordrecht

London. Https://Doi.Org/10.1007/978-3-7091-1084-3.

Atika, Dian. 2007. Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapang Endofit

yang Diisolasi dari Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fruticosa

Lauterb Dan Garcinia latriflora Blume serta Akar dan Daun Tanaman

Garcinia cowa Roxb. Skripsi. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan

Alam. Universitas Indonesia: Depok.

Basma, A.A., dkk. 2011. "Antioxidant Activity and Phytochemical Screening of

The Methanol Extracts of Euphorbia hirta L". Asian Pacific Journal Of

Tropical Medicine, 4(5), 386–390. Https://Doi.Org/10.1016/S1995-

7645(11)60109-0.

Blois, M.S. 1958. "Antioxidant Determination by The Use of Stable Free

Radicals". Nature. 181:1199-2000.

Brahmachari, G. 2012. "Natural Product In Drug Discovery: Impacts And

Opportunities-An Assessment". Research Gate, 581–628.

Https://Doi.Org/10.1016/S1572-5995(02)80015-1.

Brown, E.A. 2002. "Bryophytes (Liverworts)", 1–7.

51


Davis, E., dkk. 2003. "Endophytic Xylaria (Xylariaceae) Among Liverworts and

Angiosperms: Phylogenetics, Distribution, and Symbiosis". American

Journal Of Botany, 90(11), 1661–1667.

Deinstrop, E.H. 2007. Applied Thin-Layer Chromatography 2nd

ed. Weinheim:

John Wiley & Sons.

Fitriana, W., dkk. 2015. "Uji Aktivitas Antioksidan Terhadap DPPH dan ABTS

dari Fraksi-Fraksi Daun Kelor (Moringa oleifera)". SNIPS, 658.

Gandjar, I., dkk. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

Gandjar, I., dkk. 2006. Mikologi: Dasar dan Terapan. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

Gazi, M.R., dkk. 2004. "Optimization of Various Cultural Conditions on Growth

and Antioxidant Activity Generation by Saccharomyces cerevisiae". IFO

2373. J. Biol. Sci. 4: 224-228.

Glime, J. 2017. Marchantiophyta. 1(March), 1–24.

Goffinet, B., dan Shaw, A. J., ed.. 2009. Bryophyte Biology 2nd

ed.. New York:

Cambridge University Press.

Guo, L., dkk. 2008. "Chemical Composition, Antifungal and Antitumor Properties

of Ether Extracts of Scapania verrucosa Heeg. and Its Endophytic Fungus

Chaetomium fusiforme". Molecules 13(9), 2114–2125.

Https://Doi.Org/10.3390/Molecules13092114.

Gupta, S., dkk. 2015. "A Review on Some Species of Marchantia With Reference

to Distribution, Characterization and Importance". World Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Science, 4(04), 1576–1588.

Handa, dkk. 2008. Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants.

Italy: UNIDO

Hafsari, A & Asterina, I. 2013. "Isolasi Dan Identifikasi Kapang Endofit Dari

Tanaman Obat Surian (Toona sinensis)". Vii(2), 175–191.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Diterjemahkan oleh K Radmawinata dan

I,Soediro. Bandung: Penerbit ITB.

Hasanah, R., dkk. 2015. "Uji Antijamur Patogen Ekstrak Metabolit Sekunder

Jamur Endofit Tumbuhan Raru (Cotylelobium melanoxylon)". Biosains,

1(2).

Huang, W., dkk. 2010. "Marchantin A, A Cyclic Bis(Bibenzyl Ether), Isolated

from The Liverwort Marchantia emarginata Subsp. Tosana Induces

Apoptosis in Human MCF-7 Breast Cancer Cells". Cancer Letters, 291(1),

108–119. Https://Doi.Org/10.1016/J.Canlet.2009.10.006

52


Hulikere, M., dkk. 2016. "Antiangiogenic, Wound Healing and Antioxidant

Activity of Cladosporium cladosporioides (Endophytic Fungus) Isolated

From Seaweed (Sargassum wightii)". Mycology, 7(4), 203–211.

Https://Doi.Org/10.1080/21501203.2016.1263688.

Hung, P., dkk. 2007. "Isolation and Characterization of Endophytic Bacteria from

Wild and Cultivated Soybean Varieties". Biology and Fertility of Soils,

44(1), 155–162. Https://Doi.Org/10.1007/S00374-007-0189-7.

Komala, I., dkk. 2015. "Antioxidant And Anti-Inflammatory Activity of The

Indonesian Ferns, Nephrolepis falcata And Pyrrosia lanceolata". 7(12),

12–15.

Kumala, S., dkk. 2007. "Cytotoxic Secondary Metabolites from Fermentation

Broth of Brucea javanica Endophytic Fungus" 1.2.11. Research Journal

Of Microbiology 2 (8): 625-31. Issn 1816-4935.

Kumala, S., dkk. 2015. "Antimicrobial Activity of Secondary Metabolites

Produced by Endophytic Fungi Isolated from Stems of Jati Tree (Tectona

grandis L.F)". International Journal Of Pharmaceutical Sciences And

Research, 6(6), 2349–2353. Https://Doi.Org/10.13040/Ijpsr.0975-

8232.6(6).2349-53.

Kumala, S & Pratiwi, A. 2014. "Efek Antimikroba dari Kapang Endofit Ranting

Tanaman Biduri". Farmasi Indonesia, 7(2), 111–120.

Kumala, S & Siswanto, E. 2007. "Isolation and Screening of Endophytic

Microbes from Morinda citrifolia and Their Ability to Produce Anti-

Microbial Substances". Microbiology Indonesia, 1(3), 3–6.

Kusari, P., dkk. 2014. "Biocontrol Potential of Endophytes Harbored in Radula

marginata (Liverwort) From The New Zealand Ecosystem". Antonie Van

Leeuwenhoek, International Journal Of General And Molecular

Microbiology, 106(4), 771–788. Https://Doi.Org/10.1007/S10482-014-

0247-8.

Ludwiczuk, A & Asakawa, Y. 2008. Distribution of Terpenoids and Aromatic

Compounds in Selected Southern(In Part Three : Liverwort Chemistry

And Physiology), (47), 37–58.

Molyneux, P. 2 4. “The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-Hydrazyl

(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity”. Songklanakarin Journal of

Science and Technology 26 (2): 211–19. Doi:10.1287/isre.6.2.144.

Muhiddin, N., dkk. 2001. "Peningkatan Kandungan Protein Kulit Umbi Ubi Kayu

Melalui Proses Fermentasi". JMS, 6(1), 1–12.

Noverita, dkk. 2009. "Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit dari

Daun dan Rimpang Zingiber ottensii Val". Farmasi Indonesia, Vol.

4(April), 171–176.

53


Pavia, D., dkk. 2001. Introduction to Spectroscopy. (J. Vondeling & S. Kiselica,

Eds.) (Third Edition). USA: Thomson Learning, Inc. Thomson.

Pelczar, Michele J. Jr & E.C.S Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Cetakan

Kesatu. Jakarta: UI Press.

Petrini, L., & Petrini, O. 1985. "Xylariaceous Fungi As Endophytes". Sydowia,

Annales Mycologici Ser. Ii, 38, 216–234. Retrieved From

Http://Scholar.Google.Com/Scholar?Hl=En&Btng=Search&Q=Intitle:Xyl

ariaceous+Fungi+As+Endophytes#0.

Petrini, O., dkk. 1993. "Ecology, Metabolite Production and Substrate Utilization

in Endophytic Fungi". Natural Toxin, 196(October 2015), 185–196.

Https://Doi.Org/10.1002/Nt.2620010306.

Pine, T.D., dkk. 2008. "Standarisasi Mutu Ekstrak Daun Gedi (Abelmoschus

manihot (L.) Medik) Dan Uji Efek Antioksidan Dengan Metode DPPH".

Pratama, M., dkk. 2016. "Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Tomat

Buah (Lycopersicon esculentum Mill, Var. Pyriforme Alef) dan Daun

Tomat Sayur (Lycopersicon esculentum Mill, Var.Commune Bailey)

dengan Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picryl Hydrazil)", 2(1), 76–82.

Prihatiningtias & Wahyuningsih. 2006. "Prospek Mikroba Endofit Sebagai

Sumber Senyawa Bioaktif". Traditional Medicine Journal.

Pyrzynska, K., & Pekal, A. 2013. "Application of Free Radical

Diphenylpicrylhydrazyl ( DPPH ) to Estimate Antioxidant Capacity of Food

Sample. (June). Https://Doi.Org/10.1039/C3ay40367j.

Radji, M. 2005. "Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal". Majalah Ilmu Kefarmasian, Ii(3), 113–126.

Ramadhan, M. 2011. Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan α-Glukosidase

dari Kapang Endofit Daun Johar ( Cassia siamea Lamk .). Skripsi. FMIPA

UI. Depok.

Rubiyanto, D. 2016. Teknik Dasar Kromatografi. Yogyakarta: Deepublish.

Saifudin, A. 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik

Pemurnian (Edisi I). Yogyakarta: Deepublish.

Sarker, S., dkk. 2006. Natural Products Isolation. Natural Product Isolation

(Second Edition). Totowa, New Jersey: Humana Press.

Https://Doi.Org/10.1007/978-1-59259-256-2_10.

Sayuti, K & Yenrina, R. 2015. Antioksidan Alami dan Sintetik (Cetakan I).

Padang: Andalah University Press.

Scherer & Godoy. 2009. "Antioxidant Activity Index (AAI) by The 2,2-Diphenyl-1-

Picrylhydrazyl Method". Food Chemistry 112:654-658.

54


Schulz, B & Boyle, C. 2006. "Microbial Root Endophyte", 9, 1–14.

Https://Doi.Org/10.1007/3-540-33526-9.

Schulz, B., dkk.. 2002. "Endophytic Fungi: A Source of Novel Biologically Active

Secondary Metabolite"s. Mycological Research, 106, 996–1004.

Sebaugh, J. 2011. "Guidelines for Accurate EC50/IC50 Estimation", (April 2010),

128–134. Https://Doi.Org/10.1002/Pst.426.

Seidel, V. Initial and Bulk Extraction in Natural Products Isolation. Natural

Product Isolation (Second Edition) (Editor: Sarker, dkk. 2006). Totowa,

New Jersey: Humana Press. Https://Doi.Org/10.1007/978-1-59259-256-

2_10.

Septiana, E & Simanjuntak, P. 2017. "Pengaruh Kondisi Kultur yang Berbeda

Terhadap Aktivitas Antioksidan Metabolit Sekunder Kapang Endofit Asal

Akar Kunyit". 22(April), 31–36.

Siregar, E dkk. 2013. "The Liverwort Genus Marchantia (Marchantiaceae) of

Mount Sibayak North Sumatra, Indonesia". Biotropia, 20(2), 73–80.

Https://Doi.Org/10.11598/Btb.2013.20.2.3.

Stanbury, P., dkk. 2017. Principle of Fermentation Technology. (F. Gerachty &

M. Convey, Eds.) (Third Edition). Butterworth-Heinemann.

Stone, J., dkk. 2000. "An Overview of Endophytic Microbes: Endophytism

Defined". Microbial Endophytes, (January 2000), 3–29.

Https://Doi.Org/10.1163/_Q3_Sim_00374

Strobel, G. 2003. "Endophytes As Sources of Bioactive Products". Microbes and

Infection. 5(6), 535–544. Https://Doi.Org/10.1016/S1286-4579(03)00073-

X.

Strobel, G., & Daisy, B. 2003. "Bioprospecting for Microbial Endophytes and

Their Natural Product". Microbiology And Molecular Biology Review,

67(4), 491–402. Https://Doi.Org/10.1128/Mmbr.67.4.491.

Sulistyowati, D., dkk. 2014. "Keanekaragaman Marchantiophyta Epifit Zona

Montana di Kawasan Gunung Ungaran, Jawa Tengah", 16(1).

Sumarno. 2001. Kromatografi Teori Dasar. Yogyakarta: Bagian Kimia UGM.

Taechowisan, T., dkk. 2005. "Secondary Metabolites From Endophytic

Streptomyces aureofaciens CMUAC130 and Their Antifungal Activity".

Microbiology, 151(5), 1691–1695. Https://Doi.Org/10.1099/Mic.0.27758-

0.

Tan & Zou. 2001. "Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites. Natural

Product Reports", 18(March), 448–459.

Https://Doi.Org/10.1039/B100918o.

55


Tejesvi, M., dkk. 2007. "New Hopes from Endophytic Fungal Secondary

Metabolites". Bol. Soc. Quím. Méx, 1(1), 19–26.

Tiwari, P., dkk. 2011. "Phytochemical Screening and Extraction - A Review".

Internationale Pharmaceutica Sciencia. 1(1), 98–106. Retrieved From

Http://Www.Ipharmsciencia.Com.

Toyota, M., dkk. 2004. "New Humulane-Type Sesquiterpenes from The

Liverworts Tylimanthus tenellus and Marchantia emarginata Subsp.

Tosana". Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 52(4), 481–484.

Https://Doi.Org/10.1248/Cpb.52.481.

Watson, D,G. 2009. Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan

Praktisi Farmasi. Diterjemahkan oleh Winny R, Syarif, Edisi kedua.

Jakarta: EGC.

Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Penerbit

Kanisius.

Zeng, P., dkk. 2011. "In Vitro Antioxidant Activities of Endophytic Fungi Isolated

from The Liverwort Scapania verrucosa". Genetics and Molecular

Research, 10(4), 3169–3179.

Https://Doi.Org/10.4238/2011.December.20.1.

Zhang, dkk. 2013. "Diversity and Cold Adaptation of Culturable Endophytic

Fungi from Bryophytes In The Fildes Region, King George Island, Maritime

Antarctica". Fems Microbiology Letters, 341(1), 52–61.

Https://Doi.Org/10.1111/1574-6968.12090.

56


LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Tahapan Penelitian

Sampling Tanaman

Lumut Hati (Marchantia emarginata

Reinw., Blume & Nees

Sterilisasi Permukaan dan Isolasi

Kapang Endofit

Pemurnian Kapang Endofit

Karakterisasi Kapang Endofit

(Makroskopik dan Mikroskopik)

Fermentasi

Ekstraksi Hasil Fermentasi

-Biomassa

-Filtrat

Secara Kualitatif

Secara Kuantitatif

Determinasi

(LIPI, Cibinong,

Bogor)

Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Ekstrak

57


Lampiran 2. Hasil Determinasi Tanaman Lumut Hati Marchantia

emarginata Reinw., Blume &Nees

58


Lampiran 3. Skema Tahapan Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit

Isolat murni

59


Lampiran 4. Skema Tahapan Karakterisasi Kapang Endofit

Lampiran 5. Skema Tahapan Fermentasi

Makroskopik dan Mikroskopik Pembuatan Preparat Kapang

60


Lampiran 6. Skema Tahapan Ekstraksi Hasil Fermentasi

Hasil Fermentasi

Disaring

Biomassa Filtrat

Metanol

-Dihaluskan

-Dimaserasi Dipartisi cair-cair

1:1 N-heksan

Fraksi Air

Fraksi N-heksan Fraksi Air

Fraksi Etil Asetat

Ekstrak N-heksan

Dipekatkan

1:1 Etil Asetat

Ekstrak Etil Asetat

Dipekatkan

Fraksi Air Fraksi Metanol

Dipekatkan

Ekstrak Metanol

61


Lampiran 7. Skema Tahapan Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif

Lampiran 8. Skema Tahapan Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif

62


Lampiran 9. Hasil Fermentasi

Fermentasi Hari Ke-14

Isolat MEA1 Isolat MEC1

pH = 5-6 pH = 4-5

Isolat MEA2

Isolat MEC2

pH = 7-8 pH = 5-6

Isolat MEB1

Isolat MEC3

pH = 7-8 pH = 4-5

63


Lampiran 10. Ekstrak

No Kode Isolat Fraksi Bobot (mg) Ekstrak

Gambar Organoleptis

1

MEA1

Metanol 274,3

Coklat tua; kental

Etil Asetat 27

Hitam kecoklatan;

kental

N-heksan 267,9

Kuning; kental

2

MEA2

Metanol 82,2

Coklat tua; kental

Etil Asetat 23,3

Hitam kecoklatan;

kental

N-heksan 67,3

Coklat muda; kering,

semi kental

64


No Kode isolat Fraksi Bobot (mg) Ekstrak

Gambar Organoleptis

3

MEB1

Metanol 352,6

Coklat tua; kental

Etil Asetat 52,4

Hitam kecoklatan;

kental

N-heksan 7,3


semi kental

4

MEC1

Metanol 566

Coklat tua; kental

Etil Asetat 126,9

Hitam kecoklatan;

kental

N-heksan 52,6


semi kental

65


No Kode isolat Fraksi Bobot (mg) Ekstrak

Gambar Organoleptis

5

MEC2

Metanol 254,1

Coklat tua; kental

Etil Asetat 116,8

Coklat tua; kering,

kristal

N-heksan 65,4


semi kental

6

MEC3

Metanol 188,1

Coklat tua; kental

Etil Asetat 34,8

Hitam kecoklatan;

kental

N-heksan 5,9

Kuning; kering, semi

kental

66


Lampiran 11. Panjang Gelombang Maksimum DPPH

Peak Start (nm) Apex (nm) End (nm) Height (Abs) Area (Abs*nm) Valley (nm) Valley (Abs)

1 570.0 515.5 400.0 0.534 57.714 400.0 0.133

Keterangan : hasil pengukuran panjang gelombang maksimum DPPH yaitu pada 515,5 nm dengan

absorbansi 0,534.

67


Lampiran 12. Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji Aktivitas

Antioksidan Secara Kuantitatif Ekstrak Metanol Kapang Endofit

MEB1

Konsentrasi (ppm) Absorbansi ∑ Absorbansi % Inhibisi

Blanko 0,587

0,592

0,586

0,588

200 0,502

0,497

0,513

0,504

14,285

100 0,536

0,547

0,538

0,540

8,163

50 0,563

0,549

0,565

0,559

4,931

25 0,570

0,568

0,572

0,570

3,061

12,5 0,576

0,582

0,577

0,578

1,70

6,25 0,584

0,583

0,585

0,584

0,68

y = 0.068x + 1.009

R² = 0.9905

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 50 100 150 200 250

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

Ekstrak Metanol

68


Lampiran 13. Tabel Absorbansi dan Kurva Persamaan Regresi Linear Uji Aktivitas

Antioksidan Secara Kuantitatif Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit

MEB1

Konsentrasi (ppm) Absorbansi ∑ Absorbansi % Inhibisi

Blanko 0,455

0,413

0,388

0,418

100 0,066

0,061

0,060

0,062

85,167

50 0,149

0,184

0,171

0,168

59,808

25 0,268

0,263

0,285

0,272

34,928

12,5 0,334

0,329

0,325

0,329

21,291

6,25 0,366

0,360

0,357

0,361

13,636

Lampiran 14. Perhitungan Konsentrasi Hambat 50% (IC50) dan Indeks Aktivitas

Antioksidan (AAI)

y = 0.7582x + 13.586

R² = 0.9659

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

Ekstrak Etil Asetat

69


Ekstrak Persamaan Regresi Linear R2

Metanol y = 0,068x + 1,009 0,9905

Etil Asetat y = 0,758x + 13,586 0,9659

Ekstrak Metanol IC50 y = 0,068x + 1,009

50 = 0,068x + 1,009

x =

x = 720,445 ppm

AAI

Konsentrasi DPPH =

= 98 ppm

AAI =

= 0,136

Ekstrak Etil Asetat IC50 y = 0,758x + 13,586

50 = 0,758x + 13,586

x =

x = 48,039 ppm

AAI

Konsentrasi DPPH =

= 98 ppm

AAI =

= 2,040

Lampiran 15. Kurva Persamaan Regresi Linear Vitamin C

70


y = 16.782x - 12.795 R² = 0.9932

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi

Vitamin C