TUGAS AKHIR
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIKBAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN
5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
Karya Ilmiah Akhir sebagai salah satu persyaratan untuk menyelesaikanProgram Pendidikan Dokter Spesialis I Ilmu Bedah
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret / RSUD Dr. Moewardi Surakarta
Disusun oleh :Mohammad Ali Yusni
NIM.S5604002
Pembimbing :Dr.dr.Ida Bagus Metria, SpB(K)BD
Dra. Dyah Ratna Budiani, M.SiProf.Dr.dr. Ambar Mudigdo, SpPA(K)
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS ILMU BEDAHFAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET
/RSUD Dr.MOEWARDI SURAKARTA2008
ii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Alloh SWT yang telah melimpahkan
karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah akhir yang
berjudul :
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK
BAWANG DAYAK (Eleutherine palmifolia, L.,Merr) DAN
5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN
PERTUMBUHAN GALUR SEL
KARSINOMA KOLON HT29
DAN EKSPRESI p53 MUTAN
Karya ilmiah akhir ini disusun sebagai salah satu persyaratan untuk
menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis I di bidang Ilmu Bedah di
Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum
Daerah Dr.Moewardi Surakarta.
Karya ilmiah akhir ini tidak akan terselesaikan tanpa dukungan dari berbagai
pihak lain, baik berupa dukungan moril maupun material. Penulis mengucapkan
terima kasih yang sebesar – besarnya kepada :
1. Dr.dr. Ida Bagus Metria,Sp.B(K)BD., selaku pembimbing utama yang telah
memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini.
2. Dra. Dyah Ratna Budiani,M.Si., selaku pembimbing pendamping yang telah
memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini.
3. Prof.Dr.dr. Ambar Mudigdo, Sp.PA(K)., selaku pembimbing pendamping
yang telah memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini.
4. dr.Bintang Soetjahjo, SPOT., selaku kepala Bagian/SMF Bedah Fakultas
Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah
Dr.Moewardi Surakarta.
5. dr. Soebandrijo, Sp.B,Sp.BTKV., selaku Ketua Program Studi PPDS I Ilmu
Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum
Daerah Dr.Moewardi Surakarta.
6. dr.Soeharto Wijanarko,SpU., selaku Sekretaris Program Studi PPDS I Ilmu
Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum
Daerah Dr.Moewardi Surakarta.
iii
7. Seluruh senior dan staf Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas
Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta.
8. dr.William A.P,SpB, dr. Dyah Andriana, dr.Tumpal Daniel P, dr.Ivan Hendra
S yang telah bekerja sama dalam penelitian ini.
9. Seluruh Paramedis dan non Paramedis di RSUD Dr. Moewardi Surakarta.
10. orang tua, mertua, dan seluruh keluarga besar saya yang telah memberikan
suport dan semangat dan doa sehingga saya bisa menyelesaikan pendidikan
ini.
11. Istri tercinta (dr.Dwi Agustina Ramadani) dan putri tercinta ( Alyssa Rizqia
Putri) yang dengan setia, sabar dan tabah telah menemani, membantu dan
selalu memberikan motivasi dan doa agar pendidikan ini dapat terselesaikan.
12. Seluruh rekan – rekan residen bedah dan semua fihak yang tidak dapat saya
sebutkan satu persatu yang telah membantu baik secara langsung maupun
tidak langsung.
Semoga Alloh SWT melimpahkan rahmat-Nya kepada kita semua. Harapan
kami, semoga penelitian akhir ini dapat bermanfaat bagi semua fihak. Terimakasih.
Hormat kami,
Penulis
iv
Telah diuji dan diseminarkan pada hari Sabtu, 13 Desember 2008, di bagian Bedah
RSUD Dr. Moewardi Surakarta, penelitian tugas akhir yang berjudul :
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN
5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
KPS PPDS I Bedah FK UNS/ SPS PPDS I Bedah FK UNS/
RSUD Dr.Moewardi Surakarta RSUD Dr.Moewardi Surakarta
dr. Soebandrijo,SpB.SpBTKV dr. Soeharto Widjanarko,SpU
NIP : 140 153 956 NIP : 140 222 096
KSMF Bedah
RSUD Dr.Moewardi Surakarta
dr. Bintang Soetjahjo,SpOT
NIP : 140 228 594
iv
DAFTAR ISI
JUDUL PENELITIAN ……………………………………………………………. iKATA PENGANTAR .............................................................................................. iiDAFTAR ISI ............................................................................................................. ivDAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viDAFTAR TABEL ..................................................................................................... viiDAFTAR SINGKATAN ........................................................................................... viiiABSTRAK ................................................................................................................ xBAB I : PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang Masalah ...................................................... 1I.2. Perumusan Masalah .............................................................. 3I.3. Tujuan Penelitian ............................................................... 3I.4. Manfaat Penelitian ............................................................... 4
I.4.1. Manfaat teoritik ............................................................ 4I.4.2. Manfaat praktis ............................................................ 4
BAB II : TINJAUAN PUSTAKAII.1. Kanker ............................................................................. 5II.2. Siklus Sel ............................................................................. 9II.3. Apoptosis pada Kanker ..................................................... 14II.4. Adeno Karsinoma Kolon ..................................................... 18
II.4.1. Definisi ................................................................ 18II.4.2. Anatomi ................................................................ 19II.4.3. Insidensi ................................................................ 20II.4.4. Etiologi dan faktor predisposisi .......................... 20
II.4.4.1 Perubahan genetik ............................... 21II.4.4.1.1. Perubahan genetik pada
karsinoma kolon.................. 21II.4.4.1.2. Gen APC............................... 23II.4.4.1.3. Gen DCC............................... 24II.4.4.1.4. Gen p53................................. 24II.4.4.1.5. K-Ras proto-oncogens........... 26II.4.4.1.6. Mismatch repair genes......... 26
II.4.4.2 Pengaruh lingkungan ........................... 27II.4.5. Klasifikasi ............................................................... 28
II.4.5.1 Derajat histopatologi ............................. 28II.4.5.2 Stadium klinik ....................................... 29
II.4.6. Diagnosis ............................................................... 31II.4.7. Terapi .................................................................... 32
II.4.7.1 Pembedahan .......................................... 32II.4.7.2 Terapi adjuvant .................................... 33
II.4.8 Prognosis ............................................................... 34II.5. Bawang Dayak (Eleutherine Palmifolia L.Merr) .................. 34
II.5.1 Morfologi 35II.5.2 Kandungan bahan kimia umbi bawang dayak 37
II.5.2.1. Flavonoid 38
v
II.5.2.2. Antrakinon 41II.5.2.3. Terpenoid 42II.5.2.4. Kaumarin 42
II.6. 5-Fluorouracil (5-FU) ............................................................ 43II.7. Galur Sel Adeno Karsinoma Kolon HT29 ........................... 44II.8. Kerangka Teori ........................................................................ 45
BAB III : KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESISIII.1. Kerangka Konseptual ........................................................ 46III.2. Hipotesis ......................................................................... 47
BAB IV : METODE PENELITIANIV.1 Jenis Penelitian .................................................................. 48IV.2. Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................. 48IV.3. Subyek Penelitian ............................................................... 48IV.4 Besar Sampel ............................................................... 48IV.5. Alat dan Bahan ............................................................... 49
IV.4.1. Alat ............................................................... 49IV.4.2. Bahan ............................................................... 49
IV.6. Cara Kerja ........................................................................ 50IV.6.1. Kultur sel ............................................................ 50IV.6.2. Starvasi ............................................................ 51IV.6.3. Uji sitotoksisitas ................................................ 51
IV.6.3.1. Kontrol negatif ................................. 52IV.6.3.2. Kontrol positif ................................. 52IV.6.3.3. Perlakuan dengan fraksi etanolik
bawang dayak........................................53
IV.6.4. Imunohistokimia ................................................ 53IV.6. Variabel Penelitian ........................................................... 54
IV.6.1. Variabel bebas .................................................. 54IV.6.2. Variabel tergantung ......................................... 54
IV.7. Definisi Operasional Variabel ......................................... 54IV.8. Rancangan Penelitian ........................................................ 56IV.9. Analisa Data .................................................................... 57
BAB V HASIL DAN ANALISA DATAV.1 Hasil Penelitian .............................................................. 58V.2 Analisa Data .............................................................. 62
BAB VI PEMBAHASANVI.1 Ekspresi p53 Mutan ...................................................... 65VI.2 Sifat Sitostatik Ekstrak
Etanolik Bawang Dayak ......................................................70
BAB VII KESIMPULAN DAN SARANVII.1 Kesimpulan ........................................................................ 75VII.2 Saran ........................................................................ 75
DAFTAR PUSTAKA Lampiran 1Lampiran 2
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Kelainan allele pada gen penekan tumor ......................................... 7Gambar 2 Skema karsinogenesis ……………………………………………. 9Gambar 3 Siklus sel …………………………………………………………. 10Gambar 4 Siklus sel kanker …………………………………………………. 12Gambar 5 Alur kerja p53 …………………………………………………… 13Gambar 6 Alur kerja Apoptosis …………………………………………….. 16Gambar 7 Perubahan sel akibat apoptosis dan necrosis …………………… 18Gambar 8 Anatomi sistema gastrointestinal ……………………………….. 19Gambar 9 Skema jalur LOH pada perkembangan karsinoma kolon dan
rectum …………………………………………………………… 22Gambar 10 Skema jalur RER pada perkembangan karsinoma kolon dan rectum 23Gambar 11 Domain protein p53 dan lokasi hot spot ........................................ 25Gambar 12 Gen penekan tumor p53 dan pRb ………………………………… 25Gambar 13 Hubungan antara faktor genetik dan lingkungan pada
karsinogenesis karsinoma kolon dan rectum …………………….. 27Gambar 14 Proses perkembangan karsinoma kolorectal ……………………. 29Gambar 15 Foto pohon bawang dayak ………………………………………. 35Gambar 16 Foto umbi bawang dayak .............................................................. 36Gambar 17 Foto bunga bawang dayak yang mekar .......................................... 36Gambar 18 Foto bunga bawang dayak yang kuncup ........................................ 37Gambar 19 Struktur dasar flavonoid …………………………………………. 41Gambar 20 Struktur dasar atrakinon …………………………………………. 42Gambar 21 Struktur dasar kaumarin …………………………………………. 43Gambar 22 Ekspresi p53 mutan pada uji tanpa perlakuan ............................... 59Gambar 23 Ekspresi p53 mutan pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak
bawang dayak 3,125µl/ml ……………………………………….. 60Gambar 24 Ekspresi p53 mutan pada uji dengan 5-fluorouracil 150 µl/ml ….. 60Gambar 25 Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada kelompok ekstrak
bawang dayak …………………………………………………… 61Gambar 26 Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada kelompok 5-FU ………. 62Gambar 27 Profil uji regresi bawang dayak ………………………………….. 63Gambar 28 Profil uji regresi 5_FU …………………………………………… 64
vii
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Perbedaan apoptosis dan necrose …………………………………… 18Tabel 2 Dukes clasification and 5 year survival …………………………….. 20Tabel 3 Stadium klinis dari karsinoma kolon .................................................. 31Tabel 4 Prosentase tampilan p53 mutan pada masing – masing sampel ......... 61
viii
DAFTAR SINGKATAN
DNA : Deoxiribo Nukleid Acid
Rb : Retinoblastoma
DCC : Deleted in cell Colorectal Carcinoma
APC : Adenomatous Polyposis Colli
WT-1 :Wilm’s Tumor-1
NF-1 : Neurofibromatosis type-1
RNA : Ribo Nukleid Acid
CDK : Cyclin Dependent Kinase
CDKI : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor
DR : Death Reseptor
IGF-BP3 : Insulin like Growth Factor-Binding Protein 3
c-LAP2 : Celluler Inhibitor of Apoptosis Protein 2
NAIP1 : Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein
Fas-L : Fas Ligan
Mdm2 : Murine doble minute-2
PARP : Poly (Adenosine 5’diphosphate-Ribose) Polymerase
TNFR : Tumor Necrosis Factor Receptor
MAP : Mitogen Activating Protein
JNK : c-Jun N Terminal Kinase
PTP : Permeability Transition Pore
ATP : Adenosine Tri Phospat
FAP : Familial Adenomatous Polyposis
HNPCC : Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer
LOH : Loss of Heterozygocity
RER : Replication Error
TAD : Transcription-Activation Domain
PRD : Proline Rich Domain
DBD : DNA-Binding Core Domain
OD : Oligomerisation Domain
CEA : Carcino Embrionic Antigen
ix
MAP : Mitogen Activating Protein
dUMP : Deoxi Uridilate Mono Phosphate
dUTP : Deoxi Uridilate Tri Phosphate
dTMP : Deoxi Thymidine Mono Phosphate
dTTP : Deoxi Thymidine Tri Phosphate
F-dUMP : 5-Fluoro-2-deoxiuridin 5-Monophosphate
FBS : Fetal Bovine Serum
USG : Ultra Sono Gram
CT Scan : Computed Tomo Scan
x
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN
5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
Mohammad Ali Yusni
ABSTRAK
Latar belakang masalah : Angka kejadian kanker colon semakin meningkat dan dengan perkembangan ilmu pengetahuan dibidang biologi molekuler mempengauhi penatalaksanaan kanker kolon termasuk melihat perilaku sel neoplastik ,salah satunya adalah ekspresi p53mutan.Banyak tanaman obat di Indonesia yang terbukti bersifat sebagai anti kanker termasuk juga bawang dayak tetapi penggunaannya sebagian besar berdasarkan empiris dan belum diteliti secara eksperimental termasuk juga terhadap kanker kolon HT29, karena itu dilakukan penelitian invitroterhadap kanker kolon HT29 dengan melihat ekspresi p53 mutan .Metode : Sel kanker kolon HT29 dilakukan kultur kemudian distarvasi setelah itu dicari LC50 (Lethal Concentration )dari fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU. Setelah ditentukan LC50 dan 3 konsentrasi dibawahnya dilakukan pemeriksaan imunohistokimia dengan melakukan pengulangan sebanyak 6 kali kemudian ekspresi p53 mutan ditampilkan dalam bentuk prosentase sel.Hasil : Untuk 5-FU sebagai kontrol (+) pada konsentrasi 150 μg/ml didapatkan ekpresi p53 mutan sebesar 0%, konsentrasi 75 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 4%, konsentrasi 37,5 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 3,11%, konsentrasi 18,75 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 4,42% sedangkan untuk fraksi etanolik bawang dayak pada konsentrasi 3,125 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 5,49%, konsentrasi 1,516 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 6,55%, konsentrasi 0,78 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 8,89%, konsentrasi 0,39 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 32,41%Kesimpulan : fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU mempunyai potensi penekanan terhadap ekspresi p53 mutan dan tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU terhadap penekanan ekspresi p53 mutan.
Kata kunci : Fraksi etanolik bawang dayak (Eleutherine Palmifolia L.Merr), 5-FU, ekspresi p53 mutan
BAB I
PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang Masalah
Kanker kolon adalah penyebab kematian kedua terutama pada negara
berkembang. Pada tahun 2005 di Amerika didapatkan sebanyak 104.950 pasien
dengan kanker kolon dengan angka kematian mencapai 47.700 pasien dan ini
merupakan 11% dari seluruh kematian yang disebabkan kanker. Dalam setahun
didapatkan sekitar 940.000 kasus baru dari kanker kolon dengan angka kematian
mencapai 500.000 pasien di seluruh dunia (World Health Organisation,2003). Di
Indonesia, angka kejadian yang pasti dari kanker kolon belum ada, tetapi mempunyai
kecenderungan meningkat. Dari evaluasi data Departemen Kesehatan Republik
Indonesia pada tahun 1986 didapatkan angka kejadian 1,8 setiap 100.000 penduduk. 1
Berdasarkan data histopatologik kanker di Indonesia tahun 1996 dan 1999, kanker
kolon menempati urutan ke-9 yaitu sebanyak 3,11% dan 3,33 %.2,3. Insiden dari
kanker kolon sejak tahun 1950 semakin meningkat kemungkinan kebanyakan
disebabkan oleh pola konsumsi masyarakat yang sering mengkonsumsi makanan
daging dan banyak mengandung lemak dengan sedikit makanan yang mengandung
serat.28,33.
Masalah yang kita hadapi adalah pengelolaan kanker kolon yang sampai saat
ini masih berdasarkan pada stadium klinik dan tingkat diferensiasi sel secara
histopatologis, yang mungkin belum mencerminkan perilaku biologis sel pada
adenokarsinoma kolon.
Kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang kedokteran khususnya
bidang biologi molekuler yang sangat pesat, mempengaruhi tatacara penanganan
2
kanker kolon, mulai dari deteksi dini , diagnostik, terapi, prediksi tingkat keganasan,
prognosis dan penanganan tindak lanjut. Pemeriksaan imunohistokimia dapat
memberi informasi mengenai kandungan berbagai unsur protein didalam sel normal
maupun neoplastik . Banyak perkembangan baru dijumpai dalam bidang
biomolekuler, bidang diagnosis, prognosis dan terapi pada kanker kolon.4
Selain prosedur baku secara medis, banyak cara yang dilakukan penderita
untuk mencari kesembuhan dari penyakit kanker, salah satunya dengan menggunakan
tanaman obat. 5 Banyak jenis tanaman obat yang sudah lama dikenal sebagai obat anti
kanker, beberapa sudah diisolasi kandungannya menjadi obat kemoterapi. Obat-obat
kemoterapi berkembang dari empirik klinik, ditunjukkan dengan kenyataan bahwa
banyak bahan-bahan sitostatika telah mendapat tempat yang tetap di klinik. Hal
serupa juga terjadi dalam penggunaan tanaman obat untuk pengobatan kanker,
diantaranya kanker colon, meskipun efek dari tanaman obat tersebut dalam
menghambat proliferasi sel kanker belum teruji secara ilmiah.5
Tanaman obat Indonesia telah secara sporadis diteliti di berbagai Universitas
dan lembaga penelitian di Indonesia. Tujuan beberapa penelitian ini umumnya untuk
membuktikan apakah penggunaan suatu tanaman obat terhadap penyakit kanker bisa
dibuktikan secara ilmiah.6 Penelitian-penelitian yang pernah ada sebelumnya lebih
bersifat pembuktian atas rasionalitas atau irrasionalitas penggunaan tanaman tersebut
sebagai obat dan bukan suatu pencarian obat baru. Tanaman-tanaman obat tersebut
memang sudah biasa digunakan sebagai obat dan dirasakan efektivitasnya secara
empiris, sehingga penelitian yang dilakukan adalah upaya untuk memahaminya.6.7
Berdasarkan uraian diatas maka dianggap perlu dilakukan penelitian untuk
membuktikan adanya kemampuan ekstrak bawang dayak dalam menghambat
proliferasi sel kanker kolon sekaligus menekan ekspresi protein p53 mutan secara in
3
vitro dengan menggunakan galur sel kanker kolon HT29. Sehingga ekstrak tersebut
nantinya dapat digunakan sebagai terapi komplementer atau sebagai terapi substitusi
pada pengobatan medis konvensional.21
I.2. PERUMUSAN MASALAH
1. Apakah fraksi etanolik bawang dayak mempengaruhi tingkat ekspresi p53
mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?
2. Apakah 5-fluorouracil mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada
biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?
3. Apakah terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan
secara in vitro antara fraksi etanolik bawang dayak dengan 5-fluorouracil
pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?
I.3.TUJUAN PENELITIAN
1. membuktikan potensi fraksi etanolik bawang dayak dalam mempengaruhi
tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29
secara in vitro
2. Membuktikan potensi 5-fluorouracil dalam mempengaruhi tingkat ekspresi
p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro
3. Membuktikan tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53
mutan secara in vitro antara fraksi etanolik bawang dayak dengan 5-
fluorouracil pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro.
4
I.4. MANFAAT PENELITIAN
I.4.1. Manfaat Teoritik
1. Diharapkan dapat memberi informasi ilmiah mengenai kemampuan fraksi
etanolik bawang dayak dalam menghambat proliferasi sel kanker kolon dan
penekanan ekspresi P53 mutan secara in vitro.
2. sebagai sarana untuk meningkatkan pengetahuan dan kemampuan peneliti
dalam bidang biologi molekuler.
3. Memberi kontribusi ilmiah terhadap penelitian – penelitian kanker kolon
selanjutnya.
I.4.2. Manfaat Praktis.
Sebagai dasar ilmiah untuk mengkaji efek klinis lebih lanjut dari senyawa
bioaktif anti kanker dan kemopreventif yang terdapat pada bawang dayak dan
diharapkan dapat dikembangkan sebagai obat anti kanker yang baru ataupun
sebagai terapi komplementer dari terapi yang ada.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Kanker
Kanker adalah suatu penyakit dengan ciri gangguan atau kegagalan
mekanisme pengaturan multiplikasi pada organisme multiseluler sehingga terjadi
perubahan yang tidak terkontrol. Perubahan sel (transformasi) ini disebabkan
oleh perubahan gen di dalam sel. Sel-sel yang telah mengalami transformasi terus
menerus berproliferasi dan menekan pertumbuhan sel normal. Pertumbuhan
kanker yang tidak terkendali tersebut diikuti dengan invasi ke jaringan
sekitar dan metastase ke bagian tubuh lain6,7,8,17.
Karsinogenesis merupakan proses pembentukan sel kanker yang
patogenesisnya secara molekuler merupakan penyakit genetik. Proses ini terjadi
akibat pengaruh berbagai faktor (multifaktorial) yang menyerang tubuh secara
bertahap (multistage). Bahan – bahan yang dapat menyebabkan sel kanker disebut
karsinogen. Berdasarkan asalnya, maka karsinogen dapat berasal dari faktor
eksogen seperti karsinogen kimiawi, virus dan fisik, dan karsinogen yang berasal
dari faktor endogen seperti hormon sex. Adapula yang memasukkan kokarsinogen
seperti diet, umur, keturunan, rangsang menahun dan trauma sebagai perangsang
terbentuknya sel kanker.35
Perubahan sel normal menjadi sel kanker melalui 3 tahap yaitu tahap
inisiasi, promosi dan progresi. Pada tahap inisiasi, terdapat faktor inisiator
yang memulai pertumbuhan sel yang abnormal seperti radiasi, bahan kimia
mutagenic, virus, mutasi spontan. Pada tahap promosi dipicu oleh promotor
seperti tumor promotor, gowth faktor, virus sehingga terbentuk sel – sel yang
6
polimorfis dan anaplastik. Pada tahap progresi ditandai dengan adanya invasi
sel ganas ke membrana basalis atau kapsul.11 Perubahan keganasan melibatkan
beberapa gen yaitu onkogen, gen penekan tumor, gen yang berperan dalam
perbaikan DNA (DNA repair gen), dan gen pengatur apoptosis. 4, 11, 12
Onkogen adalah gen yang berkaitan dengan terjadinya transformasi
neoplastik. Onkogen ini berasal dari protoonkogen yang mengalami mutasi.
Protoonkogen adalah gen yang mengatur proliferasi normal. Perubahan yang
dialami protoonkogen seluler pada aktivasi menjadi onkogen selalu bersifat
mengaktivasi, artinya mereka menstimuli suatu fungsi sel yang mengakibatkan
pertumbuhan dan diferensiasi sel. Walau ada sel yang mengalami pembelahan diri
secara tak terkendali, masih belum mengarah ke bentuk kanker, karena sel-sel
sekitar akan bereaksi dengan mengeluarkan growth inhibitor (zat pengahambat
pertumbuhan). Zat pengahambat pertumbuhan ini akan mengikat ke reseptor sel
yang malfungsi, mengirimkan signal ke inti sel, mengaktifkan gen penekan
tumor. Proses timbulnya keganasan pada tingkat molekuler dapat diamati dari
produksi protein yang berlebihan yang dihasilkan oleh onkogen. Aktivasi onkogen
merangsang produksi reseptor faktor pertumbuhan yang tidak sempurna, yang
memberi isyarat pertumbuhan terus-menerus meskipun tidak ada rangsang dari
luar. Proses proliferasi yang tidak terkendali tanpa diiringi maturasi sel dapat
mengakibatkan gangguan diferensiasi sel. Pada tahap selanjutnya, gangguan
diferensiasi sel akan mencerminkan progesifitas sel menjadi ganas.5,8,19,20
Gen penekan tumor berfungsi sebagi penghambat pertumbuhan sel, apabila
diaktifkan maka akan menghentikan siklus pembelahan sel, sehingga dapat
mencegah pembelahan sel selanjutnya. Tetapi apabila gen penekan tumor
malfungsi disebabkan mutasi, maka sel abnormal yang terus membelah diri tidak
7
menanggapi pesan growth inhibitor yang dikeluarkan oleh sel sekitarnya untuk
menghentikan pembelahan sehingga terjadi proses malignansi. 19,20 Kelainan pada
gen penekan tumor bersifat resesif, artinya baru menimbulkan tumor kalau
kedua allele menunjukkan kelainan atau bahkan kehilangan kedua allele.19
Gambar 1. Kelainan allele pada gen penekan tumor. 54
Contoh gen penekan tumor adalah gen Rb, p53, DCC (Deleted in Cell
Colorectal Carsinoma), APC (Adenomatous Polyposis Colli), WT-1 (Wilm’s
Tumor-1), NF-1 (Neurofibromatosis type-1) dan NF-2 (Neurofibromatosis type-2).
20
Identifikasi mutasi gen penekan tumor telah membuka era baru pada
kemajuan ilmu genetika. Bila hasil tes molekuler menunjukkan bahwa
individu memiliki mutasi pada gen penekan tumor maka dapat segera
dilakukan tindakan untuk mengurangi kesempatan individu tersebut terserang
karsinoma.
TUMOR SUPPRESOR GENE“two-hit”theory
8
Apoptosis ialah kematian sel terprogram yang terjadi baik pada beberapa
proses fisiologik maupun proses neoplasma. Penumpukan sel pada neoplasma
tidak hanya terjadi sebagai akibat aktifasi gen perangsang pertumbuhan atau
tidak aktifnya gen penekan tumor, tetapi juga oleh karena mutasi gen pengatur
apoptosis. Pertumbuhan sel diatur oleh gen perangsang dan gen penghambat
pertumbuhan, maka kehidupan sel ditentukan oleh gen perangsang dan
penghambat apoptosis. 8,19,22
Tahap inisiasi diawali dengan kegagalan mekanisme DNA repair sehingga
paparan inisiator seperti hormon, radiasi, mutasi spontan dan bahan kimia
mutagenik pada sel yang terinisiasi menyebabkan terjadinya perubahan urutan
nukleotida DNA proto-onkogen sehingga ekspresi gen berubah meskipun
jaringan masih terlihat normal. Tahap inisiasi merupakan proses yang
berlangsung cepat dan bersifat reversibel. 19,20,22
Tahap inisiasi akan berlanjut menjadi tahap promosi apabila se1 yang
terinisiasi tadi terpapar oleh promotor seperti faktor pertumbuhan dan infeksi
virus sehingga sel akan berkembang menjadi sel preneoplasi. Pada sel
preneoplasi akan terjadi transformasi urutan DNA sel sehingga ekspresi protein
yang dikode gen tersebut ikut berubah. Tahap promosi ini tidak terjadi dalam
waktu singkat, selain itu juga harus ada serangan promotor yang terus-menerus.
Sebenarnya proses tersebut dapat dihambat oleh anti onkogen, gen penekan tumor
dan faktor diferensiasi, akan tetapi bila faktor- faktor anti karsinogenik tadi
gagal melaksanakan fungsinya maka sel preneoplasi akan menjadi sel tumor in
situ. 19,20,36
Sel tumor in situ jika kembali mendapat paparan inisiator akan berkembang
menjadi sel tumor infiltratif yang merupakan tahap akhir karsinogenesis yaitu
9
tahap progresi. Proses perkembangan menjadi sel tumor infiltratif dihambat oleh
mekanisme apoptosis, faktor diferensiasi, penghambat angiogenesis dan sistem
imun tubuh. 19,36
Pro-carcinogenetic factor Normal Cell Anti-carcinogenetic factor Normal Phenotype
Initiated Cell
Preneoplasia
Malignant Phenotype :Drug resistant, Angiogenesis
and Immunotolerant
Invasive tumor
Promotion
Progression
Initiation DNA Repair
Growth inhibitors.Diff. factors
Diff. FactorsImmunosurveillanceLack of Angiogenesis.Apoptosis.
Radiation
Mutagenic chemicals.
Viruses.
Spontaneous Mutation
Tumor PromotersGrowth FactorViruses.
Radiation
Mutagenic chemicals.
Viruses.
Spontaneous Mutation
Gambar 2. Skema Karsinogenesis 36
II.2. Siklus Sel
Siklus sel secara normal terbagi dalam empat fase, yaitu: G1, S, G2, M
dan diselingi dengan fase istirahat yaitu Go20.
Fase awal dimulai dengan G1 , pada fase ini sel mulai mempersiapkan
untuk melakukan sintesa DNA dan juga melakukan biosintesa RNA dan
protein10,11. Kemudian dilajutkan dengan fase S, dimana pada fase ini terjadi
replikasi DNA. Pada akhir fase ini sel telah berisi DNA ganda dan kromosom
telah mengalami replikasi 20. Setelah fase S berakhir sel masuk dalam fase pra
mitosis (G2) dengan ciri: sel berbentuk tetraploid, mengandung DNA dua kali
lebih banyak dari pada sel fase lain dan masih berlangsungnya sintesis RNA
dan protein. Sewaktu mitosis berlangsung (fase M) sistesis protein dan RNA
berkurang secara tiba-tiba, dan terjadi pembelahan menjadi 2 sel. Setelah itu sel
10
memasuki fase istirahat (Go). Sel dalam fase Go yang masih potensial untuk
berproliferasi disebut sel klonogenik atau sel induk (stem cell)10. Jadi yang
menambah jumlah sel kanker ialah sel yang dalam siklus proliferasi dan
dalam fase Go.20
Gambar 3. Siklus sel.57
Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh
beberapa checkpoint. Kontrol checkpoint berfungsi untuk memastikan bahwa
kromosom utuh dan tahap-tahap kritis siklus sel telah sempurna sebelum
memasuki tahap selanjutnya6. Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan
aktivasi dan degradasi cyclin, aktivasi cyclin dependent kinases (CDKs),
cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKIs). Interaksi diantara ketiga kelas
protein tersebut berperan mengontrol berbagai tahap siklus sel, mencegah
sel ke tahap selanjutnya jika terjadi kerusakan DNA melalui mekanisme
checkpoint dan deregulasi proses ini berperan dalam kejadian kanker. 19,20
Pada kanker terjadi perubahan pada pengaturan siklus sel. Selama
11
perkembangan sel kanker, baik secara genetik maupun epigenetik,
biasanya mempengaruhi ekspresi protein-protein pengatur siklus sel. Hal
ini dapat menyebabkan overekspresi cyclin dan kehilangan ekspresi CDK
inhibitor dan mengakibatkan deregulasi aktivitas CDK. Pada sel kanker juga
terjadi ketidakmampuan kontrol checkpoint, mengakibatkan respon yang
menyimpang terhadap adanya kerusakan seluler. Contohnya, kerusakan DNA
pada fase G1 normalnya menyebabkan berhentinya siklus sel atau terjadi
apoptosis tergantung pada tingkat kerusakannya, sehingga sel tidak bisa
memasuki fase S karena dihentikan pada G16. Ketidakmampuan kontrol
checkpoint menyebabkan inisiasi fase S atau mitosis tetap berlangsung
meskipun ada kerusakan seluler dan ketidakstabilan genetik yang selanjutnya
menimbulkan clone maligna.12,15
Aktivitas dari kompleks cyclin-CDK yang mengontrol checkpoint
tersebut diatur dengan cara fosforilasi dan defosforilasi. Satu substrat protein
utama dari CDK adalah Rb. Rb saat kondisi hipofosforilasi berikatan dan
menginaktifkan faktor transkripsi E2F. Fosforilasi melepaskan E2F dari
kompleks Rb dan E2F. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E, cyclin A dan
protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Cyclin E membentuk
kompleks dengan CDK2 dan meningkatkan fosforilasi Rb. E2F yang dihasilkan
akan menginduksi transkripsi gen seperti DNA polymerase dan thymidin
kinase.7,12,13,15,
12
Gambar 4. Siklus sel kanker. 37
Protein lain yang berperan dalam kontrol checkpoint ini antara lain p53,
CDKI, p21. Pada sel yang normal, ekspresi p53 wild type rendah. Ketika
terjadi kerusakan DNA maka p53 wild type akan teraktivasi dan mengaktifkan
p21 yaitu suatu Cdk Inhibitor7,15. P21 ini akan mengikat dan menginaktifkan
kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi Rb terhambat dan
pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada
tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk
memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya6,7,12,15.
Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan
memasuki jalur apoptosis.
Jalur aktivasi dari p53 dapat terbagi menjadi 5 bagian :
1. Signal stressor yang memacu dan merangsang p53
2. Upstream aktivasi mediator akibat rangsangan p53 protein
3. Core Regulation dari p53.
4. Dowstream efek terhadap sel sebagai respon rangsangan p53 protein
5. Output seluler sebagai respon dari rangsangan p53
13
gambar 5: Alur kerja p53.55
Adanya akumulasi dari protein p53 wild type yang terjadi akibat adanya
kerusakan DNA memegang peranan penting di dalam DNA repair. Protein p53
akan merangsang keluarnya p21 yang dapat mengakibatkan terjadinya cell cycle
arrest. Cell cycle arrest ini dapat memberikan waktu bagi sel untuk melakukan
DNA repair yang mengalami kerusakan sehingga apabila berhasil sel dapat
berproliferasi secara normal. Apabila terjadinya kerusakan sel hebat dan tidak
bisa dilakukan repair, maka jalur apoptosis akan diaktifkan untuk mengeliminasi
sel yang mengalami kerusakan. Apabila normal DNA repair tidak terjadi karena
terjadi mutasi dari p53 , maka sel dapat berproliferasi secara abnormal dan dapat
terjadi keganasan. p53 dapat merangsang apoptosis dengan merangsang expresi
dari gen pro apoptosis seperti Bax, Fas/Apo-1, Death Reseptor 5 (DR5) atau
insulin Like Growth Fator-Binding Protein 3 (IGF-BP3), atau dengan
merangsang expresi gen anti apoptosis seperti Bcl-2, celluler inhibitor of
14
Apoptosis Protein 2 (c-IAP2) dan Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1
(NAIP1). Jika Apoptosis tidak terjadi karena terjadi mutasi dari p53 atau
deregulasi dari interaksi Fas-FasL maka sel dapat berkembang kearah
keganasan. Aktivitas protein p53 wild type sebagai tumor supresor dapat
diturunkan atau dihambat oleh protein Mdm2 yang mengakibatkan terjadinya
degradasi dari p53 wild type menjadi lebih cepat. Gen Mdm2 itu sendiri juga
diaktifkan oleh p53 sehingga dapat dikatakan dapat memberikan umpan balik
negatif (negative autoregulatory loop).34,37
Tidak berfungsinya kontrol checkpoint yang mengakibatkan gagalnya
respon penghentian siklus sel pada sel kanker dapat menjadi target potensial
terapi antikanker6,43. Sel dengan kontrol checkpoint yang rusak lebih sensitif
terhadap perubahan genotoksik atau kerusakan mikrotubular. Pengembangan
obat antikanker yang didasarkan pada regulasi siklus sel selanjutnya diarahkan
pada penghambatan terjadinya proses pembelahan sel, sehingga senyawa atau
protein yang diberikan pada penderita dapat mencegah sintesis DNA dan
mitosis sehingga menghentikan proliferasi sel kanker.6,7,44,45
II.3. Apoptosis Pada Kanker
Pada organisme multiseluler, homeostasis jaringan dipengaruhi oleh
proliferasi, diferensiasi dan kematian sel. Sebagaimana proliferasi dan
diferensiasi, apoptosis penting dalam mengontrol pertumbuhan. Adanya
gangguan dalam program tersebut akan mengakibatkan pertumbuhan sel
abnormal.8,20
Apoptosis adalah tipe kematian sel yang terprogram melalui serangkaian
perubahan struktural sebagai hasil dari rangsang fisiologis atau
15
patologis8,26. Ciri morfologi apoptosis adalah pengkerutan sel, penonjolan
membran (membrane blebbing), kondensasi kromatin, dan fragmentasi inti
sel.26 Gambaran tersebut adalah hasil dari aktivasi caspase, yaitu keluarga
protease yang substratnya meliputi prekursor enzim yang dapat menyebabkan
destruksi proteolitik sitoskeleton dan metabolit protein yaitu poly (adenosine-
5’diphosphate-ribose) polymerase (PARP), DNA-dependent protein kinase,
lamin, protein kinase, dan aktin.20,50
Apoptosis terjadi melalui dua jalur utama yaitu, jalur ekstrinsik atau death
receptor (DR) dan jalur intrinsik atau jalur mitokondria.50,51
Death receptor pathway dimulai dengan pengaktifan tumor necrosis
factor receptor (TNFR), yang meliputi Fas, death receptor (DR) 4, TNFRI
dan TNFRII. Fas menginduksi apoptosis melalui dua jalur. Jalur pertama
dengan mengikat ligan. Ikatan ligan mengaktifkan reseptor TNFRI dan Fas
untuk menarik dan mengikat Protein death effector Fadd/Mort-1. Ikatan
Fadd/Mort-1 menarik procaspase 8. Procaspase 8 diubah menjadi bentuk
aktifnya yaitu caspase 8 dan dilepaskan kembali ke dalam sitosol50,52.
Caspase 8 akan memecah dan mengaktifkan caspase 3. Jalur kedua lewat
jalur alternatif sinyal transduksi. Reseptor Fas berikatan dengan protein
adapter yang akan mengaktifkan mitogen activating protein kinase (MAP3) dan
memicu kaskade fosforilasi yang meningkat pada aktivasi c-Jun N terminal
kinase (JNK). JNK yang teraktivasi memfosforilasi substrat seperti c-Jun dan
p53 dan menginduksi apoptosis lewat berbagai mekanisme, meliputi
modifikasi dan pengaturan protein pada famili Bcl-2.50
Pada jalur mitokondria, salah satu kejadian yang menyebabkan
apoptosis adalah pelepasan sitokrom c dari mitokondria melalui porus yang
16
dibentuk oleh mitochondrial permeability transition pore (PTP) dan protein
pro apoptosis Bax13,14. Jika PTP berasosiasi dengan Bax maka keduanya
dapat membentuk suatu kanal spesifik untuk sitokrom c dan faktor-faktor
yang menginduksi apoptosis. Asosiasi antara Bax dengan PTP dan
aktivitas pembentukan porus dicegah oleh protein anti apoptosis BcI-2.
Sitokrom c yang dilepaskan oleh mitokondria ke sitosol akan berinteraksi
dengan Apaf-1 untuk membentuk apoptosom yang akan merekrut dan
mengaktivasi procaspase-9. Caspase-9 yang aktif akan melakukan
pemecahan terhadap caspase efektor yaitu caspase-3, -6, dan -7. Caspase
efektor ini kemudian melakukan pemecahan terhadap banyak substrat di
dalam sel yang penting, dan menimbulkan perubahan morfologis yang khas
pada apoptosis.50,51.
Gambar 6. Alur kerja Apoptosis50,56
17
Apoptosis dan gen yang mengontrolnya mempunyai efek yang besar pada
fenotip keganasan. Gangguan pada program apoptosis akan menyebabkan
mortalitas sel. Mutasi onkogenik yang mengganggu apoptosis
mempengaruhi inisiasi tumor, progresifitas tumor dan metastase.50,51,52.
Hampir semua obat anti kanker yang digunakan sekarang,
dikembangkan dengan penyaringan yang dirancang untuk mengidentifikasi
bahan yang secara selektif membunuh tumor. 50 Hubungan antara apoptosis
dengan terjadinya kanker memberikan ide penelitian tentang target dan
mekanisme farmakologi obat-obat anti kanker. 50 Suatu obat anti kanker
yang poten untuk menginduksi dan mengaktifkan apoptosis dapat
menghindari banyaknya efek samping yang tidak diharapkan karena
pelepasan material-material sampah akibat nekrosis sel, dan mengurangi
kerusakan sel-sel normal yang disebabkan oleh kemoterapi. Proses apoptosis
juga dapat digunakan untuk mengevaluasi toksisitas obat. Gangguan dan
mutasi gen pada program apoptosis dapat mengurangi sensitivitas terapi dan
menyebabkan resistensi obat.50
Disamping apoptosis dikenal cara kematian yang lain yaitu nekrosis
yang dapat terjadi oleh karena kegagalan sintesa ATP oleh mitokondria.
Nekrosis merupakan kematian sel yang tejadi secara patologis, dengan
penyebab utama gangguan produksi ATP. Pada setiap kerusakan jaringan
misalnya akibat radikal bebas, bahan toksik, atau bahan infeksius, kedua
proses ini berjalan bersama dengan proporsi yang berbeda dan saling
berkaitan.50
18
Gambar 7. Perubahan sel akibat apoptosis dan nekrosis50
Apoptosis Nekrosis
Peran sel Aktif Pasif
Distribusi Tersebar Terkonsentrasi pada satu
daerah atau menyebar dari satu
titik ( contiguous)
Morfologi Volume sel menyusut Volume sel mengembang
Membran
sel
Dipertahankan Rusak
Induksi Perlahan ( jam) Cepat ( detik – menit)
Pembersihan
sel mati
Cepat Lambat
Inflamasi Tidak ada Ada
Tabel 1. Perbedaan Apoptosis dan Nekrose
II.4. Adenokarsinoma Kolon
II.4.1. Definisi
Adenokarsinoma kolon berasal dari sel epitel yang mengalami displasia,
yang berkembang menjadi adenoma, dan terus berkembang dan terjadi invasi ke
19
mukosa muskularis menuju proses keganasan. Tahapan-tahapan ini dianggap
sebagai dasar terjadinya adenokarsinoma kolon.1,6,7
II.4.2.Anatomi
Panjang kolon sekitar 150 cm yang terbagi menjadi beberapa bagian
meliputi coecum, kolon ascenden, kolon tranversum, kolon descenden dan kolon
sigmoid. Ileocoecal junction, coecum, kolon tranversum dan kolon sigmoid terletak
intraperitoneal dan kolon ascenden dan kolon descenden terletak retroperitoneal.
Vaskularisasi dari ilocoecal junction sampai dengan fleksura lienalis berasal dari
arteri mesenterika superior, sedangkan mulai dari fleksura lienalis sampai kolon
sigmoid berasaldari arteri mesenterika inferior.28,31
Gambar 8. Anatomi sistema Gastrointestinal 31
20
II.4.3. Insidensi
Resiko terjadinya karsinoma kolon mulai meningkat setelah usia 40 tahun,
dan meningkat tajam pada umur 50 sampai 55 tahun. 1 Karsinoma kolon memiliki
insidensi dan angka kematian yang cukup tinggi di negara-negara berkembang. Di
Amerika Serikat, angka kejadian pertahun lebih dari 150.000 dan rata-rata kejadian
kasus baru sekitar 110.000 untuk karsinoma kolon dan 45.000 kasus pada karsinoma
rektum, dan merupakan penyebab kematian kedua dari semua kematian akibat
kanker. Dengan diagnosa dini dan terapi yang adekuat angka ketahanan hidup
mencapai 5 tahun dapat ditingkatkan.29,30
Stage Description 5-Year Survival
A Limited to the bowel wall 83%
B Extension to pericolic fat; no nodes 70%
C Regional lymph node metastases 30%
D Distant metastases (liver, lung, bone) 10%
Table 2. Dukes Classification and 5-Year Survival
II.4.4 Etiologi dan faktor predisposisi
Penyebab karsinoma kolon belum diketahui dengan pasti. Secara umum
dinyatakan bahwa untuk perkembangan karsinoma kolon merupakan interaksi
antara faktor lingkungan dan faktor genetik. Faktor lingkungan multipel beraksi
terhadap predisposisi genetik atau defek yang didapat dan berkembang menjadi
karsinoma kolon.1,10 Tumor ini muncul pada lesi di tunika mukosa yang dalam
perkembangannya mengadakan invasi ke tunika muskularis, struktur vaskuler,
kelenjar limfe regional struktur sekitar dan akhirnya dapat metastase secara
sistemik.29,30
21
II.4.4.1. Perubahan Genetik
Dengan bertambahnya penelitian di bidang biologi molekuler, pengaruh
faktor genetik terbukti mempunyai hubungan yang erat dengan perkembangan
karsinoma kolon.
II.4.4.1.1. Perubahan Genetik pada Karsinoma Kolon
Terdapat 3 kelompok karsinoma kolon berdasarkan perkembangannya,
yaitu :
1. Kelompok yang diturunkan (inherited) yang mencakup kurang dari 10 % dari
karsinoma kolon dan rektum, terdapat pada mereka yang dilahirkan sudah
dengan mutasi germline (germline mutation) pada salah satu allele dan terjadi
mutasi somatik pada allele yang lain. Contohnya adalah FAP (Famillial
Adenomatous polyposis) dan HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal
Cancer). HNPCC terdapat pada sekitar 5% dari karsinoma kolon dan rektum. 1
2. Kelompok sporadik, yang mencakup sekitar 70%, pada kelompok ini
membutuhkan dua mutasi somatik, satu pada masing-masing allele-nya.
3. Kelompok familial, yang mencakup 20% dari karsinoma kolon dan rektum,
lebih dari 35% terjadi pada umur muda. 1
Terdapat 2 model perjalanan perkembangan karsinoma kolon dan rektum
(karsinogenesis) yaitu LOH (Loss of heterozygocity) dan RER (Replication Error).
Model LOH mencakup mutasi gen penekan tumor meliputi gen APC, DCC, dan
p53 serta aktifasi onkogen yaitu K-ras. Model ini contohnya adalah perkembangan
polip adenoma menjadi karsinoma.
22
Gambar 9. Skema Jalur LOH pada perkembangan karsinoma kolon dan rektum 53
Sementara model RER karena adanya mutasi gen hMSH2, hMLH1,
hPMS1, hPMS2. Model RER terdapat pada perkembangan HNPCC. Pada bentuk
sporadik, 80% berkembang lewat model LOH dan 20% berkembang lewat model
RER. 1,53
Gen yang terlibat dalam perkembangan karsinoma kolon adalah APC pada
kromosom 5q, myc pada kromosom 8, K-ras pada kromosom 12, p53 dan HER-
2/neu (c-erbB2) pada kromosom 17, pRb pada kromosom 13 dan DCC pada
kromosom 18q. K-ras, c-erbB2 dan myc berperan sebagai onkogen. APC, DCC,
pRb dan p53 sebagai gen penekan tumor.47,48
23
“RER” PATHWAY TO COLORECTAL CARCINOMA
Mutation or loss of mismatch repair genes
(inherited in HNPCC)
Accumulation of somatic mutations within microsatellites
Altered function of microsatellites
Altered function of genes that contain or are regulated
By microsatellites (type II TGR-ß receptor gene)
Sequential accumulation of genetic changes
In carcinoma-related genes
Adenoma-carcinoma sequence
(ussualy does not involve APC, MCC, K-ras, DCC, p53)
Gambar 10. Skema Jalur RER pada perkembangan kanker kolon dan rektum 53
II.4.4.1.2. Gen APC
Gen APC (Adenomatous Polyposis Colli) berlokasi pada lengan panjang
kromosom 5q. Gen ini mengalami mutasi pada kasus FAP (Famillial
Adenomatous polyposis) dan Gardner’s syndrome dan banyak ditemukan pada
Turcot’s Syndrome. Gen APC mengkode satu peptida yang terdiri dari 2843 asam
amino dengan berat molekul sekitar 300 kDa.53
Mutasi pada gen APC ditemukan secara mayoritas pada kasus
adenokarsinoma kolon, hampir 63 % adenoma, 60 % adenokarsinoma, dan tidak
dijumpai pada jaringan kolon yang tidak mengalami malignansi. Hal ini
mengindikasikan adanya mutasi somatic. Karena APC merupakan gen penekan
tumor, inaktivasi allele ke dua akan mengakibatkan sel kehilangan kemampuan
24
aktifitas tumor-penekan. Mutasi gen APC merupakan awal dari karsinogenesis
sporadic adenokarsinoma kolon. Beberapa mutasi gen APC menghasilkan
hilangnya fungsi protein produknya. Hilangnya kemampuan binding dengan
protein EB1 diduga berkaitan dengan hilangnya fungsi gen penekan tumor. 53
II.4.4.1.3. Gen DCC
Gen DCC (Delleted in Colorectal Carcinoma) yang berlokasi pada lengan
panjang kromosom 18 (18q). Gen ini menghasilkan produk protein yang terlibat
dalam adesi antar sel dan interaksi antara sel-matrik, yang sangat berguna pada
pencegahan pertumbuhan tumor, invasi, dan metastase. Pada adenokarsinoma
kolon dan rektum sporadik, DCC memegang peranan yang penting sebagai satu
critical role yang menentukan kemampuan metastase tumor. 53
II.4.4.1.4. Gen p53
Gen p53 merupakan phosphoprotein yang berukuran 53 kDa dan berlokasi
pada lengan pendek kromosom 17 (17p13.1). dan mengandung 393 asam amino.
Protein ini terdiri atas 5 domain, yaitu :
1. TAD : N-terminal transkription-activation domain . mengaktivasi faktor
transkripsi, asam amino 1-42.
2. PRD : Proline Rich Domain, residu asam amino 80-94.
3. DBD : Central DNA-Binding Core Domain, mengandung 1 atom Zn dan
beberapa asam amino arginine, residu asam amino 100-300.
4. OD : Homo-Oligomerisation Domain, asam amino 307-355. Tetramerasi
penting untuk aktivasi p53 in vivo.
5. C-terminal : Terlibat dalam regulasi pengikatan DNA pada central domain :
25
residu asam amino 356-393.
Gambar 11. Domain protein p53 dan lokasi Hot Spot(Seemann et al. Clinical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2004, 41: 551-583)
protein p53 merupakan faktor determinan yang sangat penting dalam
malignansi selama karsinogenesis adenokarsinoma kolon. Gen yang diaktifkan
p53 kebanyakan merupakan gen penekan faktor pertumbuhan tumor. Dengan
demikian inaktivasi fungsi p53 berakibat pada unregulated cell growth. 47,48,53
Gambar 12. Gen penekan tumor p53 dan pRb.53
P53 adalah tumor supresor gen yang berfungsi sebagai penentu dari gen
dengan bermain pada jalur utama untuk mengetahui kerusakan DNA dan
menentukan apakah sel tersebut harus melakukan DNA repair terhadap kerusakan
DNA yang ada atau merangsang sel untuk menjalani proses Apoptosis. p53 mutan
kehilangan fungsi dari P53 wild type sehingga terjadi proliferasi sel yang
berlebihan akibat adanya kerusakan DNA sehingga sel dapat mengalami
tranformasi menjadi maligna.40
26
Lebih dari 50% tumor primer pada manusia kehilangan p53 wild type sebagai
tumor supresor gen bahkan menunjukkan peningkatan yang cepat dari level p53
mutan. Penelitian kanker selama ini bertujuan untuk mengembalikan fungsi dari
p53 wild type dan menekan ekspresi dari p53 mutan. Untuk mencapai tujuan
penelitian tersebut dalam jangka panjang dibutuhkan penjelasan tentang
mekanisme molekuler yang mengontrol aktivitas dari p53 wild type pada sel
normal dan apabila p53 wild type hilang pada perkembangan sel tumor.40
II.4.4.1.5. K-Ras Proto-oncogen
Lokasi K-ras sebagai onkogen terletak pada lengan pendek kromosom 12
(12p12.2). protein K-ras berinteraksi dengan molekul efektor, menghadirkan suatu
respon pertumbuhan. Mutasi pada K-ras mengakibatkan kacaunya signal
transduksi. Mutasi pada K-ras ditemukan sekitar 47 % kasus adenokarsinoma dan
50 % pada large adenoma. 53
II.4.4.1.6. Mismatch Repair genes
Mismatch Repair genes diperlukan sel untuk mengadakan reparasi
kesalahan DNA yang terjadi selama replikasi atau karena adanya kehilangan basa
N secara spontan. Ada 4 DNA mismatch repair genes yang ditemukan pada
manusia, yaitu :
1. hMSH2 (kromosom 2p)
2. hMLH1 (kromosom 3p21)
3. hPMS1 (kromosom 2q31-33)
4. hPMS2 (kromosom 7p22)
Mutasi pada keempat gen tersebut terlibat dalam kasus HNPCC (Hereditary
27
Non-Polyposis Colorectal Cancer) dan Lynch syndome, dalam variasi prosentase
kasus. 53
II.4.4.2. Pengaruh Lingkungan
Kejadian malignansi pada karsinoma kolon juga ditentukan oleh faktor
lingkungan, yang mempengaruhi faktor molekuler dalam sel. Faktor lingkungan
yang majemuk memungkinkan terjadinya predisposisi genetik dan menyebabkan
defek. Faktor genetik yang terlahir dengan berbagai lesi genetik akan menginisiasi
karsinogenesis atau hal ini dapat juga berawal dari faktor lingkungan, atau
kombinasi keduanya. Semuanya berakibat adanya genetik alterations dan
karsinogenesis.1,33
Gambar 13. Hubungan antara faktor genetik dan lingkungan pada karsinogenesis karsinoma kolon dan rektum. 33
28
II.4.5 Klasifikasi
II.4.5.1 Derajat Histopatologi.
Adenokarsinoma kolon sangat berbeda secara gambaran histologinya,
beberapa tumbuh relatif berdiferensiasi baik, lainnya menjadi lebih buruk. Secara
umum pertumbuhan papiliferous cenderung berdiferensiasi lebih baik daripada
lesi dengan ulserasi dan infiltrasi lebih dalam. 1
Broders, Grinnell dan Duke’s memperkenalkan suatu modifikasi sistem
penderajatan secara histologis, dimana terlihat bahwa ada hubungan erat antara
ekstensi penyebaran lesi dengan prognosis akhir setelah terapi pembedahan. 1
Duke’s pada tahun 1946 memodifikasi sistem penderajatan histologi
adenokarsinoma kolon menjadi beberapa kategori, yaitu :
1. Derajat keganasan rendah (diferensiasi baik) : gambaran tumor yang
menyerupai adenoma dengan tanda-tanda adanya proliferasi aktif epitel, tapi
dapat dikenali sebagai malignansi karena adanya infiltrasi ke lapisan
muskularis mukosa.
2. Derajat keganasan sedang (diferensiasi sedang) : Gambaran tumor dengan sel-
sel karsinoma yang banyak berkelompok tetapi tetap terbatas dalam bentuk
yang cukup rata pada satu atau 2 lapisan lebih dalam di sekitar ruang glandula.
Umum terlihat adanya nukleus yang berwarna dan bentuk mitosis yang tidak
teratur.
3. Derajat keganasan Tinggi (diferensiasi buruk) : gambaran sel tumor makin
anaplastik dan tidak membentuk sistem glandular sama sekali, tetapi meliputi
setiap jaringan atau dalam kelompok yang tidak teratur. 1:
29
gambar 14. proses perkembangan karsinoma colorectal.54
II.4.5.2. Stadium Klinik
Klasifikasi keganasan pada kolon berdasarkan ekstensi penyebaran
langsung dan adanya metastase ke sistem limfatik , pertama kali diajukan oleh
Duke’s pada tahun 1930, Dibagi menjadi 4 kategori yaitu :
Stadium A : hanya terbatas pada lapisan mukosa
Stadium B : sudah masuk dalam lapisan muskularis propia (B1),
masuk dalam lapisan subserosa (B2), masuk sampai struktur
yang berdekatan (B3).
Stadium C : bila sudah ada keterlibatan kelenjar, dibagi menjadi
stadium C 1 bila penyebarannya sudah melibatkan limfonodi
parakolika dan limfonodi epikolika , C 2 bila penyebarannya
sudah melampaui limfonodi parakolika dan limfonodi epikolika.
Stadium D : bila sudah ada metastase baik secara limfatik
maupun secara hematogen. 1,4,6,9
30
Pada tahun 1987 American Joint Committee on Cancer dan International
Union Againts Cancer memperkenalkan sistem klasifikasi TNM, dimana ekstensi
tumor (T) dibagi atas T1 s/d T4, adanya keterlibatan kelenjar (N) dibagai atas : N1
bila < 4 kelenjar, N2 bila > 4 kelenjar, dan N3 bila terdapat keterlibatan kelenjar
sepanjang pembuluh darah, dan adanya metastase jauh (M1). 1,9
pT – Tumor Primer
pTx : Tumor primer tidak dapat dinilai
pT0 : Tumor primer tidak ditemukan
pTis : Karsinoma insitu, intraepithelial atau ditemukan sebatas lapisan
mukosa saja
pT1 : Tumor menginvasi submukosa
pT2 : Tumor mengivasi lapisan muskularis propia
pT3 : Tumor menembus muskularis propia hingga lapisan serosa atau
jaringan perikolika/perirectal belum mencapai peritoneum
pT4 : Tumor menginvasi organ atau struktur disekitarnya atau
menginvasi sampai peritoneum visceral
pN – Kelenjar getah bening Regional
pNx : Kelenjar getah bening regional tidak dapat dinilai
pN0 : Tidak ditemukan metastasis pada kelenjar getah bening regional
pN1 : Ditemukan anak sebar pada -3 kelenjar getah bening regional
pN2 : Ditemukan anak sebar pada 4 atau lebih kelenjar getah bening regional
pM – Metastasis jauh
pMx : Metastasis jauh tidak dapat dinilai
pM0 : Tidak ditemukan metastasis jauh
pM1 : Ditemukan metastasis jauh
31
Stadium T N M
Stadium 0 : Tis N0 M0
Stadium IA : T1 N0 M0
IB : T2 N0 M0
Stadium IIA : T3 N0 M0
IIB : T4 N0 M0
Stadium IIIA : Semua T N1 M0
IIIB : Semua T N2 M0
Stadium IV : Semua T Semua N M1
Tabel 3. Stadium klinis dari karsinoma kolon
II.4.6. Diagnosis
Deteksi dini dan diagnosis pada pengelolaan tumor kolon dengan
kecurigaan keganasan memiliki peranan yang penting di dalam memperoleh hasil
yang optimal yaitu meningkatnya harapan hidup, dan menurunnya tingkat
morbiditas dan mortalitas pada penderita karsinoma kolon. 1,4,6
Mendiagnosis adanya tumor kolon dengan kecurigaan keganasan dapat
dilakukan dengan cara :
1. Pemeriksaan klinis, yang terdiri dari anamnesis dan pemeriksaan fisik termasuk
colok dubur.
2. Pemeriksaan laboratorium, yaitu test darah samar, test faal hati, dan Carcino-
embrionic antigen (CEA). Kadar CEA pada keadaan normal adalah 0 – 2,5
ng/mL. Terdapat beberapa keadaan yang dapat meningkatkan kadar CEA,
dengan kadar < 10 ng/mL dan bersifat reversible, antara lain pada penderita
obstruksi bilier, disfungsi hepatoseluler, bronkitis, divertikulitis, adenomatous
polyps, gastric ulcer, perokok, BPH, renal disease. Peningkatan kadar CEA
dapat dijumpai pada keganasan lain selain keganasan kolon. 10 Kadar CEA
32
pada karsinoma kolon berhubungan dengan volume tumor dan respon terapi
anti tumor, dan berhubungan dengan sisa tumor setelah reseksi. Sensitifitas
dan spesifitas CEA untuk mendeteksi kekambuhan antara 70 – 80 %. 1
3. Pemeriksaan penunjang, terdapat pemeriksaan penunjang yang terbukti efektif
dalam diagnosis tumor kolon dengan kecurigaan keganasan, yaitu barium
enema, kolonoskopi dan biopsi, Transrectal USG digunakan untuk
menentukan stadium dari karsinoma rektum, USG Abdomen digunakan untuk
mendeteksi adanya metastase ke organ intra abdomen, foto thorak untuk
mendeteksi adanya metastase ke paru, dan CT-Scan abdomen. Tingkat akurasi
dari pemeriksaan ini tergantung pada persiapan kolon yang baik. 1,14
4. Pemeriksaan Patologi Anatomi sebagai gold standar untuk menentukan
diagnosis patologi yang pasti.
II.4.7. Terapi
II.4.7.1. Pembedahan
Pembedahan masih merupakan standard terapi tumor kolon dengan
kecurigaan keganasan. Pembedahan dilakukan sebagai terapi kuratif, simptomatik,
diagnostik dan staging penyakit. Pengertian untuk aplikasi yang benar dari
pembedahan tumor pada kolon sangat penting baik untuk ahli bedah maupun
dokter yang terlibat dengan terapi penyakit ini. Sehingga pembedahan dapat
membawa kesembuhan, dan atau perbaikan kualitas hidup dan memperpanjang
survival penderita karsinoma kolon. 1,6,7
Terapi pembedahan yang dilakukan adalah reseksi kolon menurut lokasi
tumor dan mengikuti aliran darah bersangkutan. Drainase limfe mengikuti aliran
vaskuler, sampai pada asalnya pada arteri mesenterika superior atau arteri
33
mesenterika inferior. Teknik reseksi tidak banyak mengalami perubahan sejak
beberapa dekade ini. Bila tumor terletak pada kolon ascendens dapat dilakukan
hemicolectomy dextra, ditambah reseksi ileum terminal sepanjang kurang lebih 10
cm. Tumor yang terletak pada fleksura hepatika atau kolon transversum proksimal
dilakukan extended hemicolectomy dextra dan omentectomy, bila terletak pada
kolon transversum distal dan fleksura lienalis dilakukan extended hemicolectomy
sinistra disertai omentectomy atau hemicolectomy sinistra. Tumor yang terletak
pada kolon desendens dilakukan hemicolectomy sinistra, dan tumor yang terletak
pada kolon sigmoid dilakukan hemicolectomy sinistra atau reseksi sigmoid.
Tumor yang terletak pada rektum dilakukan operasi low anterior resection dan
abdomino-perineal resection. 1,6
II.4.7.2. Terapi adjuvan
Pasien dengan karsinoma kolon beresiko tinggi untuk terjadi kekambuhan
baik lokal maupun sistemik. Terapi adjuvan bertujuan untuk menanggulangi
kedua masalah tersebut. Terapi adjuvan dengan kemoterapi dan radioterapi baik
dilakukan sebelum maupun sesudah pembedahan, dari beberapa penelitian
terbukti efektif dan dapat dianggap sebagai terapi standar dan menghasilkan angka
kekambuhan yang lebih rendah. 1,3
Obat kemoterapi yang biasa digunakan pada karsinoma kolon dan rektum
adalah 5-fluorouracil (5-FU), Leukovarin, Irinotecan, Oxiliplatin, Capecitabine,
dan perkembangan terbaru pada terapi antibodi monoklonal karsinoma kolon
dengan menggunakan bevacizumab dan cetuximab telah digunakan pada terapi
karsinoma kolon. 1,3
34
II.4.8.Prognosis
Prognosis pada karsinoma kolon tergantung pada stadium tumornya, ada
tidaknya metastase jauh, yaitu klasifikasi penyebaran tumor dan tingkat keganasan
sel tumor, keadaan umum penderita, umur penderita, adanya komplikasi perforasi
dan obstruksi, serta pengelolaan pra dan pasca bedah yang teliti dengan
pembedahan dan pengangkatan tumor primer dan metastase seradikal mungkin.
1,6,7
II.5.Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr )
Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr ) merupakan tanaman
perdu. Tumbuhan ini dapat ditanam dengan mudah, dalam waktu 6 bulan
umbinya sudah dapat dimanfaatkan. Bawang ini mengandung senyawa alkaloid,
glikosida, flavonoid, fenolik dan steroid ( Herbone 1987)
Penyebaran tumbuhan bawang dayak banyak ditemukan mulai dari
semenanjung Malaysia hingga Filipina, Sumatera (Bawang kapal), Kalimantan
(Bawang Hantu , bawang makkah), Jawa (Brambang sabrang, bawang siyem,
luluan sapi, teki sabrang, bebawangan beureum), Sulawesi, Nusa Tenggara.
Secara ekologis tumbuhan bawang dayak tumbuh di daerah pegunungan pada
ketinggian 600-2000 meter di atas permukaan laut.
Sekilas taksonomi, dari tumbuhan bawang dayak (Eleutherine
palmifolia (L), Merr) dapat dijelaskan sebagai berikut :
35
Taxonomy
Division Magnoliophyta Magnoliophytina
Class Liliatae Liliiflorae
Order Liliales
Family Iridaceae Juss.
Genus Eleutherine Herb.
Species Eleutherine palmifolia (L.) Merr
II.5.1. Morfologi
Tumbuhan bawang dayak merupakan semak, berumpun, tumbuhan
semusim, tinggi sekitar 50 cm.
Batang : Tumbuh tegak atau merunduk, basah dan berumbi. Tumbuhan
ini menyukai tempat terbuka dan tanah kaya akan humus dan
cukup lembab. Untuk menanamnya dengan menggunakan
umbi.
gambar 15 : foto pohon bawang dayak
36
Daun : Tunggal lonjong berujung runcing dengan pangkal yang tumpul,
pertulangan menyirip, warna hijau (daun seperti tanaman
anggrek tanah).
Umbi : Umbi pada tumbuhan bawang dayak umumnya berbentuk
lonjong, bulat telur, merah seperti bawang merah, tidak berbau
sama sekali. Umbi dapat dikonsumsi setelah usia 6 bulan,
dengan tinggi 20 - 40 cm, lebar 1,5 - 3 cm.
Gambar 16. foto umbi bawang dayak
Bunga : tunggal,warna putih, berkelopak 6 dan mekar pada waktu sore
hari dalam beberapa jam.
37
Gambar 17 : Foto bunga bawang dayak yang mekar
Gambar 18 : Foto bunga bawang dayak yang kuncup
Tanaman ini ditemukan pada daerah tropis dan tumbuh dengan baik pada
ketinggian sekitar 600 – 1500 m dari permukaan laut. Biasanya
ditemukan di pinggir jalan yang berumput, di kebun teh, kina dan kebun
karet.
II.5.2. Kandungan bahan kimia umbi bawang dayak
Hingga saat ini belum banyak dipublikasikan mengenai kajian
kimia dan farmakologi dari tumbuhan bawang dayak. Banyak aspek
yang dapat diteliti untuk aplikasinya di bidang pengobatan, misalnya
aspek kandungan senyawa kimianya, aspek toksisitasnya dan aspek
38
aktifitas farmakologisnya. Penelitian masih terus dilakukan untuk
mengungkap lebih lanjut dari khasiat bawang dayak ini.
Aulia (2003) menegaskan hasil skrening umbi bawang dayak
dengan menggunakan pelarut petroleum eter dan ethanol, menunjukkan
bahwa umbi tanaman ini mengandung senyawa terpenoid, flavanoid,
antrakinon dan kaumarin. Lebih lanjut Aulia menegaskan bahwa ekstrak
petroleum eter bawang ini memiliki aktifitas antibakteri terhadap E. coli,
sedangkan terhadap S. dysenteriacea tidak berpotensi sebagai
antibacterial. Sedangkan ekstrak etanol memiliki aktifitas antibakteri
terhadap E coli maupun S. dysenteriacea. Nilai KBM ekstrak ethanol
masing-masing adalah 20 mg/ml untuk E. coli dan 12 mg/ml untuk S.
dysenteriacea.
II.5.2.1.Flavonoid
Merupakan golongan senyawa bahan alam yang terbesar dan
berasal dari senyawa fenolik yang banyak merupakan pigmen tumbuhan.
Saat ini lebih dari 6000 senyawa yang berbeda masuk ke dalam golongan
flavanoid (Feye, 1996).
Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air dan
dapat diextraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air
setelah extrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavanoid
merupakan bagian penting dari diet manusia karena banyak manfaatnya
bagi kesehatan. Fungsi kebanyakan flavanoid dalam tubuh manusia
adalah sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegahan
kanker. Selain itu flavanoid juga berfungsi untuk melindungi struktur sel
39
dan memiliki hubungan sinergis dengan vitamin C (meningkatkan
efektifitas vitamin C)., anti inflamasi, mencegah keropos tulang dan
sebagai antibiotic. Flavonoid dapat berperan secara langsung sebagai
antibiotik dengan mengganggu secara langsung fungsi mikroorganisme
seperti bakteri atau virus. Fungsi flavonoid sebagai antivirus telah banyak
dipublikasikan, termasuk untuk virus HIV (AIDS) dan virus herpes.
Selain itu, flavonoid juga dilaporkan berperan dalam pencegahan dan
pengobatan beberapa penyakit lain seperti asma, katarak, diabetes, encok
atau rematik, migren, wasir dan periodontitis sehingga dapat dijelaskan
bahwa mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam
pengobatan tradisional.
Penelititan-penelitain mutahir telah mengungkap fungsi lain dari
flavonoid, tidak saja untuk pencegahan tetapi juga untuk pengobatan
kanker.
Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenol terbesar yang
ditemukan di alam. Senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan
biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-
tumbuhan.
Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari
15 atom karbon, dimana 2 cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai
propana (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6. Susunan
ini dapat menghasilkan 3 jenis struktur senyawa flavonoida yaitu :
a. Flavonoida atau 1,3-diarilpropana.
b. Isoflavonoida atau 1,2-diarilpropana
c. Neoflavonoida atau 1,1-diarilpropana
40
Istilah flavonoida diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang
berasal dari kata flavon, yaitu nama dari salah satu jenis flavonoida yang
terbesar jumlahnya dari tumbuhan. Senyawa – senyawa flavon ini
mempunyi kerangka 2 fenilkroman dimana posisi orto dari cincin A dan
atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1,3-diarilpropana
dihubungkan oleh jembatn oksigen sehingga membentuk cincin
heterosiklik yang baru (cincin C).
Senyawa – senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis
tergantung dari tingkat oksidasi dari rantai propane dar system 1,3-
diarilpropana. Flavon, flavonol dan antasianidin adalah jenis yang
terbanyak di alam sehinga sering disebut flavonoid utama. Banyaknya
senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi,
alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut.
Senyawa – senyawa isoflavonoida dan neoflavonoida hanya
ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku leguminosol.
Masing – masing jenis senyawa flavonoid mempunyai struktur
dasar tertentu. Flavonoida mempunyai beberapa ciri struktur yaitu :
Cincin A dari struktur flavonoid mempunyai pola oksigenasi yang
berselang – seling yaitu pada posisi 2, 4 dan 6. Cincin B pada flavonoida
mempunyai satu gugus fungsi oksigen pada posisi para atau 2 pada posisi
para dan meta atau tiga pada posisi 1 di para dan 2 di meta.
Biosintesa
Pertama kali disarankan oleh Birch, yaitu : Pada tahap-tahap
pertama biosintesa flavonoid suatu unit C6-C3 berkombinasi dengan 3
unit C2 menghasilkan unit C6-C3 (C2+C2+C2). Kerangka C15 yang
41
dihasilkan dari kombinasi ini telah mengandung gugus – gugus fungsi
oksigen pada posisi- posisi yang diperlukan.
Cincin A dari struktur flavonoida berasal dari jalur poliketida
yaitu kondensasi dari 3 unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan
tiga atom karbon dari rantai propane berasal dari jalur fenilropanoida
(Jalur shikimat). Sehingga kerangka dasar karbon dari flavonoida
dihasilkan dari kombinasi antara 2 jenis biosintesa utama untuk cincin
aromatic yaitu jalur shikimat dan jalur asetat-malonat.
Banyak mekanisme kerja dari flavanoid yang sudah terungkap
misalnya inaktifasi karsinogen, anti proliferasi, penghambatan siklus sel,
induksi apoptosis dan differensiasi, inhibisi angiogenesis serta
pembalikan resistensi multi-obat atau kombinasi dari mekanisme-
mekanisme tersebut.
Gambar 19. Struktur dasar flavonoid
II.5.2.2.Antrakinon
Golongan kuinon alam terbesar terdiri dari antrakinon.
Beberapa antrakinon merupakan zat warna dan sebagai pencahar.
Turunan antrakinon umumnya berupa senyawa berwarna kuning
kemerahan. Antrakinon mudah larut dalam air panas dan alcohol cair
(trease dan evans (1989)). Antrakinon terhidroksilasi jarang terdapat
dalam tumbuhan secara bebas tetapi sebagai glikosida. Antrakinon
42
berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, senyawa ini biasanya
berwarna merah, dapat juga berwarna kuning sampai coklat.
Gambar 20. Struktur dasar atrakinon
II.5.2.3.Terpenoid
Berasal dari senyawa isoprena (CH2-C(CH3)-CH-CH2).
Banyak terpenoid terdapat secara alami pada tumbuhan tidak dalam
keadaan bebas sebagai ester atau glikosida (Robinson, 1995). Terpenoid
terdiri dari berbagai macam senyawa antara lain minyak atsiri yang
mudah menguap, diterpenin yang sukar menguap, triterpenoid,sterol dan
pigmen karotenoid yang tidak menguap.
Secara kimia larut dalam lemak dan terdapat dalam sitoplasma
sel tumbuhan. Kadang minyak atsiri terdapat dalam kelenjar khusus pada
permukaan daun. Sedangkan karotenoid terutama berhubungan dengan
kloroplast di dalam daun dan dengan kromoplast di dalam daun bunga
(petai). Biasanya terpenoid diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan
menggunakan eter minyak bumi, eter atau kloroform (Harbone, 1987).
II.5.2.4.Kaumarin
Kaumarin adalah senyawa fenol yang pada umumnya berasal dari
tumbuhan tinggi dan jarang sekali ditemukan pada mikroorganisme. Dari
segi biogenetik, kerangka benzopiran-z-on dari kaumarin berasal dari
asam – asam sincimat, melakiorto-hidroksilasi. Asam orto-kumarat yang
dihasilkan setelah menjalani isomerisasi cis-trans, menjalani kondensasi.
43
Hampir semua kaumarin alam mempunyai oksigen pada C-7.
Posisi lain dapat pula terokigenasi dan sering pula terdapat rantai
samping alkil. Kaumarin sering dijumpai sebagai glikosida (Robinson,
1995).
Penelitian mengenai biosintesa kaumarin pada beberapa jenis
tumbuhan ternyata mendukung biosintesa ini. Walaupun demikian,
mekanisme dari sebagian besar tahap – tahap reaksi tersebut masih belum
jelas. Misalnya reaksi isomerisasi cis-trans dari asam ortohidroksi
kumarat mungkin berlangsung dengan katalis enzim atau melalui proses
fotokimia atau melalui proses reduksi-dehidrogenasi yang beruntun.
Gambar 21. struktur dasar kaumarin
II.6. 5-Fluorouracil (5-FU)
5-FU merupakan salah satu obat kemoterapi tertua yang telah digunakan
beberapa dekade. Obat ini dapat digunakan untuk beberapa jenis kanker seperti
kolon, payudara, lambung, pankreas dan kulit. 5-FU berupa cairan jernih dan tidak
berwarna, dan diberikan secara intravena, dapat juga berupa krim yang digunakan
pada kanker kulit.
5-FU dapat diberikan melalui infus intravena, dalam 4-5 hari, atau diberikan
menurut jadwal tertentu, misalnya sekali seminggu, atau sekali tiap 3-4 minggu.
Keberadaan 5-FU di dalam darah dan jaringan tubuh sangat singkat, dalam
hitungan menit. 5-FU terikat dalam enzyme dalam sel kanker yang disebut
44
Thymidilate Synthetase dan karenanya dapat berefek sebagai anti kanker di dalam
sel. Leucovorin dapat mengubah ikatan di dalam enzyme tersebut dan memperlama
keberadaan 5-FU dalam sel kanker yang menyebabkan efek anti kanker yang lebih
besar.
Beberapa penderita dengan defisiensi enzym untuk metabolisme 5-FU dapat
mengalami efek samping setelah pemberian 5-FU, walaupun dengan dosis yang
kecil. Efek samping yang sering terjadi, antara lain : mulut kering, sulit menelan,
diare, nyeri lambung, penurunan jumlah sel darah putih, penurunan jumlah
trombosit, anemia, peningkatan sensitifitas kulit, peningkatan jumlah air mata. 54,55
II.7. Galur Sel Adenokarsinoma kolon HT29
Galur sel adenokarsinoma kolon HT29 diisolasi dari tumor primer wanita
Kaukasus berusia 44 tahun dengan golongan darah A, Rh(+), HLA
A1,A3,B12,B17,Cw5.
. Galur sel tersebut dapat menyebabkan terjadinya adenokarsinoma kolon
berdiferensiasi baik dari tumor primer grade I pada tikus dan hamster dan
differensiasi jelek pada manusia akibat efek tumorigeniknya. Ekspresi reseptor
human adrenergic alpha2A urokinase receptor (u-PAR);vitamin D(moderate
expression. Ekspresi oncogene pada galur sel ini menunjukkan p53 mutan (+), ras
(+), myc (+), Fos (+), Myb (+),sis (+), abl (-), ros (-),src (-). Penderita bisa
terinfeksi HIV dan LAV tetapi tidak pada sel tumor. Kultur dilakukan dengan
pemisahan hingga 70-80%, aproksimasi 1:3 sampai 1:10 (1-3 x 104 sel/cm2).
Pengikatan dengan menggunakan cairan NaCl 0,25% tanpa EDTA dan CO2 5%
pada suhu 37 0C.
Penyimpanan dilakukan pada es kering dengan suhu -196 0C.21
45
II.8. Kerangka Teori
progresi
Neoplasia HT29 : hiperfosforlasi pRB↑, p53 mutan ↑, p21 ↓
RadiasiVirusMutagenik kimiaMutasi spontan
Daya tahan tubuhDifferentiation
FactorsLack of angiogenesis
MG2
SCyclin A/E+CDK2
CyclinA/B+CDK1
Bawang Dayak :
Flavonoids
G1Cyclin Ds+CDK4/6
5FU
F-dUMP + Thimidilat sintetase
F-dUMP -Thimidilat sintetase kompleks
Timidilat (dTTP)
Siklus Sel
Fase S akhir & G1 :
Sel normal epitel kolon
Sel terinisiasi
promosi
Reparasi DNA
Ekspresi : Inhibitory Growth Factors &Differentiation Factors
inisiasi
Tumor promotors,Growth Factors, Virus
RadiasiVirusMutagenik kimiaMutasi spontan
Sel preneoplasia Pada Fase S Siklus Sel :
dTMP & dTTP↓↓; dUMP&
dUTP ↑↑
Sintesis DNA terhenti
Apoptosis
Siklus Sel Terhenti :P53 mutan ↓, p53 WT ↑, p21↑, HDAC-pRB-
E2F↑↑, hiperfosforilasi
pRB↓↓
BAB III
KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS
III.1. Kerangka Konseptual
Berdasarkan penjabaran pada bab – bab terdahulu maka dalam naskah
tulisan ini diajukan kerangka konseptual yang mendasari rencana penelitian ini
sebagaimana dijelaskan pada diagram berikut :
Galur sel kanker kolon HT29 dibiakkan pada media RPMI 1640 pada
konsentrasi CO2 5%. Selanjutnya dibagi dalam 3 kelompok , yaitu kelompok
perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak (Eleutherine Palmifolia (L) Merr),
∑ p53 mutan ↑ ∑ p53 mutan↓∑ p53 mutan↓
Kultur sel HT29(p53 Mutan)
Ekstrak etanolikBawang Dayak
5 – Fluorouracil(kontrol (+))
Kontrol (-)
Pertumbuhan sel Pertumbuhan sel ↓ Pertumbuhan sel ↓
ANALISA STATISTIK
47
kontrol positif kelompok perlakuan dengan 5-FU dan kontrol negatif kelompok tanpa
perlakuan apapun.
Pada uji sitotoksisitas diharapkan fraksi etanolik bawang dayak memiliki potensi
untuk menghambat pertumbuhan sel kanker kolon HT29 melalui penekanan ekspresi
p53 mutan.
Pada kontrol positif digunakan bahan uji 5-FU, diharapkan pada kontrol
positif ini juga didapatkan penghambatan pertumbuhan sel kanker kolon HT29
melalui penekanan ekspresi p53 mutan .
Pada kontrol negatif diharapkan tidak terjadi penghambatan pertumbuhan sel
kanker kolon HT29 dengan ekspresi p53 yang meningkat.
Pada perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak, 5-FU dan tanpa
perlakuan harus dikendalikan faktor-faktor luar, seperti suhu inkubator dalam media
kultur harus dipertahankan 37oC dengan konsentrasi CO2 5%, nutrisi yang cukup
dengan menggunakan FBS dan sterilitas media yang optimal.
III.2. Hipotesis
1. Fraksi etanolik bawang dayak mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada
biakan kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.
2. Fraksi 5-fluorouracil mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan
kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.
3. Tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara in
vitro antara fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil pada biakan
kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.
48
BAB IV
METODE PENELITIAN
IV.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini berupa penelitian analitik eksperimental
IV.2. Lokasi dan Waktu Penelitian
IV.2.1.Laboratorium Penelitian Dan Pengujian. Terpadu (LPPT) Universitas
Gajah Mada Jogjakarta.
IV.2.2.Laboratorium Patologi Anatomi dan Laboratorium Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Dilaksanakan pada bulan
April 2008 sampai Juni 2008.
IV.3. Subjek Penelitian
Sel kanker kolon HT29 (Sumbangan dari Dra.Dyah Ratna Budiani, M.Si)
IV.4. Besar Sampel
Penelitian ini menggunakan 24 well kultur sel HT29 pada medium RPMI
1640, masing – masing well berisi 2x105 sel/200 μl. 6 well pengulangan pada
perlakuan dengan 5-FU atau fraksi etanolik bawang dayak, pada konsentrasi
LC50 dan 3 serial di bawahnya. Dalam menentukan jumlah sampel tersebut
digunakan patokan rule of thumb, sebagaimana dituliskan oleh Murti, (2006),
yang menyatakan apabila sampel dibagi dalam sejumlah kelompok studi
berdasar tingkat perlakuan maka jangan sampai kurang dari 5 subyek
49
1V.5. Alat dan Bahan
1V.5.1. Alat
- Laminar Air Flow Hood / Tissue Culture Cabinet
- Incubator CO2
- Sentrifuse
- Mikroskop Inverted
- Improved Neubauer Hemocytometer Chamber
- Microwave oven
- Shaker inkubator
- Counter
- Mikro pipet
- Mikro tube
- Yellow tips, Blue tips, white tips
- Mikrowell plate polistiren 24 dan 96 well
- Mikroskop cahaya biasa
- Mikroskop kamera
IV.5.2. Bahan
- Galur sel kanker kolon (sel kanker kolon HT29)
- Ekstrak Bawang Dayak
- 5 - Fluorourasil
- RPMI 1640
50
- Penicillin Streptomicin 2%
- Fetal Bovine Serum
- Fungizone : Amphotericin B 0,5%
- Monoclonal antibodi mouse anti-human p53 mutan
- Sistem deteksi berbasis avidin-biotin complek
- Subtrat enzim peroksidase DAB
- Pewarna tanding hematoksilin MEYER
- Cover slip plastik (untuk kultur sel), diameter 13 mm
- Cover slib kotak 20x20 mm
- Gelas obyek
- Minyak emersi
- PBS phosphat buffer saline pH 7,0
- Sitrat buffer pH 6,4
- Methanol H2O2 0,3%
IV.6. Cara Kerja
IV.6.1. Kultur Sel
Kultur sel HT29 dilakukan setelah thawing dari tangki nitrogen cair,
sel selanjutnya dikultur pada media RPMI 1640, FBS 10%, Penstrep 2%,
Fungizone 0,5% setelah konfluent sel dipanen dengan tripsin 0,25%.
IV.6.2. Starvasi
51
Tujuan langkah ini adalah mencapai keseragaman umur sel HT29
dalam kultur. Dalam menggunakan RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%,
Fungizone 0,5%, selama 7 hari setiap 3 hari sekali media diganti dengan
yang baru dalam inkubator CO 5%. Setelah hari ke-7, sel dilepas dari flask
dengan tripsin 0,25%, ditambah RPMI 1640, disentrifuse selama 5 menit
dan kemudian supernatan dibuang, jumlah sel dihitung dengan bilik hitung
Improved Neubeuer haemocytometer.
Disiapkan mikrokultur 96 sumuran yang terdiri baris A sampai dengan
H dan kolom 1 sampai 12. Masing – masing sumuran diisi dengan sel
karsinoma kolon HT29 yang telah dilakukan starvasi dengan kepadatan sel
sama, yaitu 2x105 sel/200 µl.
IV.6.3. Uji Sitotoksisitas
Bahan uji fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil
sebagai kontrol positif yang telah disiapkan dengan masing-masing tujuh
konsentrasi, ditambahkan dengan menggunakan mikro pipet ke dalam
sumuran. Setiap konsentrasi dibuat tiga kali ulangan.
A A A A A A
52
B B B B B B
C C C C C C
D D D D D D
E E E E E E
F F F F F F
G G G G G G
Keterangan:
Bawang dayak: 25µl/ml 5-FU: 300µg/ml
Bawang dayak: 12,5µl/ml 5-FU: 150µg/ml
Bawang dayak: 6,25µl/ml 5-FU: 75µg/ml
Bawang dayak: 3,125µl/ml 5-FU: 37,5 µg/ml
Bawang dayak: 1,51625 µl/ml 5-FU: 18,75µg/ml
Bawang dayak: 0,78125 µl/ml 5-FU: 9,75µg/ml
Bawang dayak: 0,390625 µl/ml 5-FU: 4,6875µg/ml
IV.6.3.1. Kontrol Negatif
Sel HT29 yang dibiakan dengan media tanpa perlakuan apapun +
RPMI 1640, FBS 10%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%.
IV.6.3.2. Kontrol Positif
LC50 untuk 5 - Fluorourasil ditentukan dengan variasi konsentrasi :
300ug/ml, 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml, 18,75ug/ml, 9,75ug/ml, 4,6875
ug/ml. Pada media RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%.
Dilakukan penghitungan jumlah sel yang hidup dengan menggunakan
Improved Neubeuer dan mikroskop inverted.
A
B
C
E
A
G
D
F
B
C
D
E
F
G
53
IV.6.3.3. Perlakuan dengan Fraksi etanolik Bawang Dayak
LC50 untuk Bawang Dayak ditentukan dengan variasi konsentrasi :
25ul/ml, 12,5ul/ml, 6,25ul/ml, 3,125ul/ml, 1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml,
0,390625 ul/ml. Pada media RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%,
Fungizone 0,5%. Dilakukan penghitungan jumlah sel yang hidup dengan
menggunakan Improved Neubeuer dan mikroskop inverted
IV.6.4. Imunositokimia
Biakan sel HT29 pada media murni dan setelah diberi perlakuan
dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak serta 5 - fluorourasil pada
konsentrasi LC50 dan 3 serial dibawahnya dikulturkan pada media RPMI
1640 1% Amphotericin, 2% penstrep, 10% FBS dengan 24 well yang
dilengkapi dengan cover slips plastic dengan diameter 1,3 cm. Setelah 3
hari diperlakukan dengan konsentrasi bawang dayak 3,125ul/ml,
1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml, 0,390625 ul/ml dan 5-FU 150ug/ml, 75ug/ml,
37,5ug/ml, 18,75ug/ml pada 5% CO2 dan suhu 37oC (dalam inkubator).
Setelah itu media diambil dan diganti dengan PBS formalin 10% selama 30
menit. Kemudian PBS diambil dan dicuci dengan Aquadest kemudian
ditambah metanol dan 0,3% H2O2 selama 30 menit. Dilakukan blocking
dengan normal serum selama 20 menit, diinkubasi dengan antibodi primer
mouse anti p53 mutan (dengan pengenceran 1:100) selama 18 jam pada
40C. Dicuci dengan washing buffer (PBS) 2 kali selanjutnya diinkubasi 20
menit dengan polyvalent universal HRP conjugate. Dicuci dengan PBS 2
54
kali selanjutnya diinkubasi dengan DAB (Deamino Benzidin) sebagai
subtrat enzim. Pewarnaan tanding (counterstain) menggunakan
Hematoxilin Mayer. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop Olympus
DP40.
Penilaian makna tampilan p53 mutan dinyatakan sebagai prosentase
sel yang dihitung berdasarkan tampilan positif sel dengan inti sel kuning
keemasan sampai dengan coklat tua pada pembesaran 400X, dengan
pengamatan sebanyak 9 lapang pandang. Nilai prosentase yang ditampilkan
adalah nilai rerata prosentase ekspresi protein p53 mutan dari 9 lapang
pandang tersebut.
IV.7. Variabel Penelitian
IV.7.1. Variabel Bebas
a. Konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
b. Konsentrasi 5-Fluorouracil
IV.7.2. Variabel Tergantung
ekspresi P53 mutan
IV.8. Definisi Operasional Variabel
IV.8.1. Fraksi etanolik ekstrak bawang dayak adalah ekstraksi etanolik bawang
dayak sehingga berbentuk larutan. Dalam penelitian digunakan fraksi
etanolik bawang dayak murni (Eleutherine Palmifolia (L) Merr).
55
IV.8.2. Konsentrasi dosis adalah banyaknya fraksi etanolik bawang dayak dan 5-
Fluorourasil dalam larutan yang akan dimasukkan kedalam mikrokultur
dengan konsentrasi bertingkat permililiter media kultur.
IV.8.3. LC50 (Lethal Concentration) aktivitas sitotoksik secara in vitro adalah
konsentrasi ekstrak yang menyebabkan kematian 50% sel kanker kolon
HT29 pada kultur yang menerima perlakuan fraksi etanolik bawang dayak
atau 5-FU
IV.8.4. Ekspresi P53 mutan adalah ekspresi protein yang terdapat pada inti sel
kanker kolon HT29 sebagai hasil pengecatan imunostaining dengan
metode avidin-biotin-complex menggunakan MoAb primer anti-p53
mutan. Sistem enzimatis yang digunakan adalah peroksidase substrat
enzim DAB. Nilai tampilan p53 mutan dinyatakan sebagai prosentase sel.
IV.8.5. Proliferasi sel dihitung setelah 24 jam inkubasi pada suhu 37oC dan
dilakukan penghitungan jumlah sel secara direct counting menggunakan
mikroskop inverted dan bilik hitung Improved Neubeuer haemocytometer.
56
IV.8. Rancangan Penelitian
Colon Cancer Cell Line HT29
Kultur
Kontrol Positif(Media + 5 -Fluorourasil)
Media + Ekstrak Bawang Dayak
IMUNOHISTOKIMIA
Serial Konsentrasi
LC50
3 serial dari LC50 ke bawah
PROSENTASE SEL YANG MENGEKSPRESIKAN P53 MUTAN (+)
UJI STATISTIK
Kontrol Negatif
Serial Konsentrasi
LC50
3 serial dari LC50 ke bawah
57
IV.9. Analisa Data
Dari data yang diperoleh dalam penelitian, dilakukan uji normalitas data
dengan menggunakan uji kolmogorov-smirnov. Untuk mengetahui pengaruh
terhadap tingkat ekspresi p53 mutan yang dimiliki oleh fraksi etanolik ekstrak
bawang dayak dan 5-fluorouracil dilaksanakan dengan menggunakan analisis
korelasi regresi pada masing – masing perlakuan (perlakuan kontrol positif
dengan 5-FU dan perlakuan menggunakan fraksi etanolik bawang dayak.) dan
untuk mengetahui perbedaan pengaruh terhadap tingkat ekspresi p53 mutan
antara kontrol positif dan fraksi etanolik bawang dayak dilakukan uji beda T-
Test .13,14,16
BAB V
HASIL DAN ANALISA DATA
V.1. Hasil Penelitian
Dalam penelitian ini digunakan galur sel karsinoma kolon HT29 untuk menguji
aktivitas sitostatik dari fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dalam
penghambatan pertumbuhan sel dan tingkat ekspresi p53 mutan. Galur sel
karsinoma kolon HT29 ditumbuhkan pada media kultur, yaitu RPMI 1640 yang telah
ditambah dengan FBS 10%, Penstrep 2% dan Fungizone 0,5%, selanjutnya diberi
perlakuan dengan bahan uji fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-
fluorouracil sebagai kontrol positif dan tanpa perlakuan sebagai kontrol
negatif.
Penilaian aktivitas sitostatik fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
dilakukan dengan memberikan ekstrak bahan uji tersebut pada kultur galur sel
karsinoma kolon yang kemudian diinkubasikan selama 24 jam. Setelah
diinkubasikan selama 24 jam sel yang hidup dihitung secara visual
menggunakan bilik hitung hemositometer. Penghitungan tersebut menunjukkan
bahwa LC50 dari fraksi etanolik ekstrak bawang dayak adalah 3,125 µl/ml dan
LC50 5-FU adalah 150 µg/ml. Pada konsentrasi tertinggi 100µl/ml fraksi
etanolik ekstrak bawang dayak menghambat proliferasi sel kanker sebesar
100%, sedangkan 5-FU pada konsentrasi tertinggi 300µg/ml mampu
menghambat sebesar 100%.
Kultur dengan perlakuan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak atau
5-FU masing-masing ditentukan konsentrasi LC50, selanjutnya pada konsentrasi
LC50 dan 3 serial konsentrasi di bawahnya dikulturkan dengan 24 well plate
59
yang dilengkapi cover slips. Konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
yang digunakan adalah 3,125ul/ml, 1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml dan 0,390625
ul/ml sedangkan konsentrasi 5-FU adalah 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml,
18,75ug/ml. Hasil kultur sel karsinoma kolon HT-29 yang diperlakukan dengan
serial konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak atau 5-FU kemudian
dilakukan pemeriksaan imunositokimia dengan menggunakan monoklonal
antibodi primer mouse anti p53 mutan. Ekspresi positif kuat dari p53 mutan
ditunjukkan dengan adanya granula kecoklatan pada sitoplasma, sedangkan sel
yang negatif tidak menampakkan adanya granula tersebut. Pengamatannya
menggunakan Mikroskop OLYMPUS DP40. hasilnya ditampilkan dalam bentuk
prosentase sel.
Intensitas warna dari setiap preparat diamati masing-masing sembilan
lapang pandang dengan pembesaran 400 kali. Setelah didapatkan hasilnya
dihitung nilai rerata untuk masing-masing preparat. Dari prosentase sel tersebut
kemudian dapat ditentukan tingkat ekspresi p53 mutan. Untuk uji tanpa
perlakuan didapatkan proliferasi sel dengan ekspresi p53 mutan (+).
Gambar 22.ekspresi p53 mutan pada uji tanpa perlakuan
60
Untuk uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan
konsentrasi LC50 yaitu 3,125µl/ml dan juga perlakuan dengan 5-fluorouracil
didapatkan proses apoptosis dengan ekspresi p53 mutan yang minimal.
Gambar 23. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak3,125 μg/ml
Gambar 24. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan 5-fluorouracil 150μg/ml
Berdasarkan hasil pengamatan masing – masing preparat baik yang
diberi perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun dengan
61
5-FU, dapat ditentukan tingkat ekspresi p53 mutan berdasarkan prosentase sel,
untuk masing-masing sampel. Hasilnya sebagai berikut:
No SAMPEL PROSENTASE
1 5-FU 150 0
2 5-FU 75 4
3 5-FU 37,5 3,11
4 5-FU 18,75 4,42
5 Bawang dayak 3,125 5,49
6 Bawang dayak 1,51625 6,55
7 Bawang dayak 0,78125 8,89
8 Bawang dayak 0,390625 32,41
Tabel 4. Prosentase tampilan p53 mutan pada sel karsinoma kolon HT29 pada masing-masing sampel.
0
5
10
15
20
25
30
35
3.125 1.516 0.781 0.39
ekspresi p53 mutan
Gambar 25. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada ekstrak bawang dayak
62
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
150 75 37.5 18.75
ekspresi p53mutan
Gambar 26. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada 5-FU.
V.2. Analisa Data
Analisa data dilakukan dengan menggunakan SPSS 15. Untuk
mengetahui data yang diperoleh mempunyai distribusi normal atau tidak
dilakukan uji statistik kolmogorov-smirnov untuk masing – masing
bahan uji. Dan didapatkan untuk bahan uji dengan menggunakan
ekstrak bawang dayak didapatkan berditribusi normal dan untuk bahan
uji dengan menggunakan 5FU juga berdistribusi normal. Selanjutnya
untuk menguji pengaruh peningkatan konsentrasi pada fraksi etanolik
extrak bawang dayak maupun 5-FU terhadap ekspresi p53 mutan
dilakukan uji statistik menggunakan analisis korelasi regresi. Dari uji
tersebut untuk fraksi etanolik extrak bawang dayak didapatkan
persamaan Y = 48,335 - log70,414X, R : 0,843, F hitung : 105,457, F
tabel distribusi : 2,87(5%). Dari uji tersebut didapatkan F hitung > F
tabel, yang menunjukkan ada korelasi antara konsentrasi ekstrak
bawang dayak dengan tingkat ekspresi p53 mutan. Yaitu dengan
63
meningkatnya konsentrasi ekstrak etanolik bawang dayak yang diberikan
pada sel carsinoma kolon HT29 ekspresi p53 juga semakin menurun.
konsentrasiBD5.004.003.002.001.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
ekspresip53mutan
LogarithmicObserved
Gambar 27. Profil uji regresi extrak bawang dayak
Persamaan untuk 5-FU didapatkan Y= 48,784 – log65,088X, R =
0,799, F hitung : 76,056, F tabel distribusi : 2,87(5%). Dari uji tersebut
didapatkan F hitung > F tabel, yang menunjukkan ada korelasi antara
konsentrasi 5-FU dengan tingkat ekspresi p53mutan. Yaitu dengan
meningkatnya konsentrasi 5-fluoro uracil yang diberikan pada sel carsinoma
kolon HT29 ekspresi p53 juga semakin menurun.
64
konsentrasi5FU5.004.003.002.001.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
ekspresip53mutan
LogarithmicObserved
Gambar 28. Profil uji regresi konsentrasi 5-FU terhadap ekspresi p53 mutan.
Kedua persamaan di atas menunjukkan peningkatan konsentrasi baik 5-FU
maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak berpengaruh nyata pada penekanan
ekspresi p53 mutan.
Selanjutnya data dilakukan uji T-test untuk mengetahui perbedaan pengaruh
terhadap tingkat ekspresi p53 mutan antara fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-
FU, tidak ditemukan perbedaan yang bermakna antar kelompok bahan uji (α = 0,00)
yang artinya tidak ada perbedaan yang signifikan antara potensi penekanan ekspresi
p53 mutan antara kontrol positif dan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
Perhitungan statistik secara lengkap ditampilkan pada lampiran. Baik fraksi etanolik
ekstrak bawang dayak maupun 5-FU dengan uji T-test tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan dalam penekanan nilai ekspresi p53 mutan, sehingga pemakaian
ekstrak bawang dayak dapat diterima sebagai kandidat herba anti tumor.
BAB VI
PEMBAHASAN
VI.1. Ekspresi p53 mutan
Untuk menguji apakah fraksi etanolik ekstrak bawang dayak bersifat
sitostatik dan menghambat proliferasi sel karsinoma kolon HT29 melalui penekanan
ekspresi p53 mutan terhiperfosforilasi dilakukan pemeriksaan dengan
imunostaining. Hasil penelitian menunjukkan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
mampu menekan ekspresi p53 mutan dengan nilai yang sebanding dengan 5-
fluorouracil sebagai kontrol positif. Uji statistik menggunakan uji beda T-test
terhadap prosentase ekstrak bawang dayak dengan 5-FU dan tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan dalam penekanan ekspresi p53 mutan pada fraksi
etanolik ekstrak bawang dayak dibandingkan dengan kontrol positif, sehingga
pemakaian ekstrak bawang dayak dapat diterima sebagai kandidat herba anti tumor
berdasarkan penelitian invitro.
Secara statistik yang dilakukan dengan uji korelasi regresi didapatkan ada
hubungan yang bermakna antara konsentrasi dengan tingkat ekspresi p53 mutan
dimana jika terdapat peningkatan konsentrasi baik pada fraksi etanolik bawang
dayak maupun 5 fluorouracil akan terjadi penurunan tingkat ekspresi dari p53
mutan secara signifikan, sedangkan berdasarkan uji T-test tidak didapatkan
perbedaan yang bermakna dari penekanan tingkat ekspresi p53 mutan pada bahan
uji dan kontrol, (α = 0,171). Hasil uji statistik diatas membuktikan bahwa tidak ada
66
perbedaan pengaruh yang bermakna pada tingkat ekspresi p53 mutan dari kelompok
perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil. Hal ini
menunjukkan bahwa fraksi etanolik ekstrak bawang dayak secara invitro dapat
menghambat pertumbuhan sel karsinoma kolon HT29, seperti juga pada 5-
fuorouracil. Proses penghambatan pertumbuhan dapat terjadi antara lain karena
penekanan ekspresi p53 mutan dan memacu apoptosis. Apoptosis yang terjadi dapat
dipacu oleh penekanan p53 mutan atau peningkatan tumor supressor gen yang lain
atau dapat juga melalui jalur lain selain dari kedua hal tersebut.
Proses penghambatan pertumbuhan sel kanker bisa melalui berbagai jalur,
salah satunya adalah apoptosis yang bisa diinduksi oleh gen p53 wild type. Adanya
akumulasi dari protein p53 wild type yang terjadi akibat adanya kerusakan DNA
memegang peranan penting di dalam DNA repair. Protein p53 wild type akan
merangsang keluarnya p21 yang dapat mengakibatkan terjadinya cell cycle arrest
.Cell cycle arrest ini dapat memberikan waktu bagi sel untuk melakukan DNA
repair yang mengalami kerusakan sehingga apabila berhasil sel dapat berproliferasi
secara normal. Apabila terjadinya kerusakan sel hebat dan tidak bisa dilakukan
repair, maka jalur apoptosis akan diaktifkan untuk mengeliminasi sel yang
mengalami kerusakan. Apabila normal DNA repair tidak terjadi karena terjadi
mutasi dari p53, maka sel dapat berproliferasi secara abnormal dan dapat terjadi
keganasan. p53 dapat merangsang apoptosis dengan merangsang expresi dari gen
pro apoptosis seperti Bax, Fas/Apo-1, Death Reseptor 5 (DR5) atau insulin Like
Growth Fator-Binding Protein 3 (IGF-BP3), atau dengan merangsang expresi gen
67
anti apoptosis seperti Bcl-2, celluler inhibitor of Apoptosis Protein 2 (c-IAP2) dan
Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1 (NAIP1). Jika Apoptosis tidak terjadi
karena terjadi mutasi dari p53 atau deregulasi dari interaksi Fas-FasL maka sel
dapat berkembang kearah keganasan. Aktivitas protein p53 sebagai tumor supresor
dapat diturunkan atau dihambat oleh protein Mdm2 yang mengakibatkan terjadinya
degradasi dari p53 menjadi lebih cepat. Gen Mdm2 itu sendiri juga diaktifkan oleh
p53 sehingga dapat dikatakan dapat memberikan umpan balik negatif (negative
autoregulatory loop).34,37
Tidak berfungsinya kontrol checkpoint yang mengakibatkan gagalnya respon
penghentian siklus sel pada sel kanker dapat menjadi target potensial terapi
antikanker6,43. Sel dengan kontrol checkpoint yang rusak lebih sensitif terhadap
perubahan genotoksik atau kerusakan mikrotubular.
Berdasarkan teori mekanisme efek toksik intra sel, zat kimia atau
metabolitnya yang telah masuk pada sel sasarannya dapat menyebabkan gangguan
sel melalui pendesakan, pengikatan, subtitusi atau peroksidasi. Gangguan yang
ditimbulkan akan direspon oleh sel untuk mengurangi dampaknya dan sel akan
beradaptasi atau melakukan perbaikan. Namun apabila sel tidak mampu
mengeliminir gangguan yang ada akan terjadi efek toksik dalam hal ini adalah
proses repair gen.60
Proses apoptosis dibedakan menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik atau death
receptor (DR) dan intrinsik atau jalur mitokondria. DR pathway dimulai dengan
pengaktifan tumour necrosis factor receptor (TNFR), yang meliputi Fas, DR 4,
68
TNFR I dan TNFR II. Fas menginduksi apoptosis melalui dua jalur. Jalur pertama
dengan mengikat ligan. Ikatan ligan mengaktifkan reseptor TNFRI dan Fas untuk
menarik dan mengikat Protein death effector Fadd/Mort-1. Ikatan Fadd/Mort-1
menarik procaspase 8. Procaspase 8 diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu caspase
8 dan dilepaskan kembali ke dalam sitosol. Caspase 8 akan memecah dan
mengaktifkan caspase 3. Jalur kedua lewat jalur alternatif sinyal transduksi.
Reseptor Fas berikatan dengan protein adapter yang akan mengaktifkan mitogen
activating protein (MAP) kinase dan memicu kaskade fosforilasi yang meningkat
pada aktivasi c-Jun N terminal kinase (JNK). JNK yang teraktivasi
memfosforilasi substrat seperti c-Jun dan p53 dan menginduksi apoptosis lewat
berbagai mekanisme, meliputi modifikasi dan pengaturan protein pada famili Bcl-
2 Disamping hal tersebut di atas aktifasi apoptosis bisa terjadi melalui jalur
intrinsik. Pada jalur ini inisiasi apoptosis ditimbulkan oleh produk biokimia yang
berasal dari intraseluler stress, seperti oksidatif stress, perubahan redoks, ikatan
kovalen, peroksidase lipid. Bahan-bahan tersebut memberikan sinyal kepada
mitokondria sehingga menyebabkan perubahan pada mitokondria yang dimulai
dengan terbukanya membran bagian luar diikuti pembengkakan matriks dan
hilangnya potensial membrane yang menyebabkan keluarnya protein-protein
mitokondria termasuk cytochrome-c. Apoptosis akan menghasilkan apoptotic
bodies yang terdiri dari fragmen sisa-sisa sel yang akan difagositosis oleh sistem
retikuloendotelial di sekitarnya.
69
Proses apoptosis tersebut dikendalikan oleh dua perangkat gen yang berfungsi
antagonistik yaitu memacu dan menghambat. Termasuk gen yang memacu proses
apoptosis adalah p53, pRB dan E2F, yang mana protein gen ini lebih berperan
dalam siklus sel. Ketika terjadi kerusakan DNA maka p53 akan teraktivasi dan
mengaktifkan p21 yaitu suatu CDK Inhibitor. p21 ini akan mengikat dan
menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi Rb terhambat
dan pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada
tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk
memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya. Jika
kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan memasuki jalur
apoptosis. Komplek E2F dengan pRB merupakan komplek stabil untuk
mengaktivasi berbagai promotor untuk sintesis DNA. Pada kondisi tanpa adanya
sinyal pertumbuhan pRB dalam keadaan hipofosforilasi. Pada keadaan
hipofosforilasi pRB berikatan dengan E2F dan HDAC (histone deacetylase) dan
menginaktifkan faktor transkripsi E2F. Ikatan antara pRB dengan HDAC dan E2F
diatur oleh fosforilasi serine/threonine. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E,
cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Fosforilasi tahap
pertama oleh cyclin D/CDK 4, dalam stimulus growth factor, melepaskan HDAC
dari kompleks HDAC-pRB-E2F. Fosforilasi tahap berikutnya oleh cyclin E/CDK 2
melepaskan E2F dari pRB. E2F yang dihasilkan akan menginduksi transkripsi gen
seperti DNA polymerase dan thymidin kinase yang diperlukan untuk masuk dalam
fase S.
70
Dari uraian diatas dapat diketahui dengan jelas bahwa proses apoptosis dapat
dipacu oleh berbagai faktor, baik dari jalur ekstrinsik maupun jalur intrinsik dan
siklus sel juga diatur dan dipengaruhi oleh berbagai macam enzin maupun protein
yang berperan sebagai tumor supressor gen. Sehingga dengan demikian penekanan
ekspresi p53 mutan sel karsinoma kolon HT29 pada uji dengan fraksi etanolik
ekstrak bawang dayak, yang menunjukkan adanya penghambatan proliferasi sel
dapat terjadi karena adanya apoptosis melalui jalur ekstrinsik atau instrinsik dan
faktor mana saja yang mempengaruhinya. Proses apoptosis yang terjadi belum
dapat ditentukan. Hal ini tentunya perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk mencari
dan membuktikan faktor-faktor mana yang berpengaruh dalam menekan proliferasi
sel karsinoma kolon HT29 tersebut. Pengembangan obat antikanker yang
didasarkan pada regulasi siklus sel selanjutnya diarahkan pada penghambatan
terjadinya proses pembelahan sel, dan pemacu apoptosis sehingga senyawa atau
protein yang diberikan pada penderita dapat mencegah sintesis DNA dan mitosis
sehingga menghentikan proliferasi sel kanker.
VI.2. Sifat sitostatik ekstrak etanolik bawang dayak
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
mempunyai aktivitas sitostatik yang sebanding terhadap sel karsinoma kolon HT29
secara invitro bila dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan 5-fluorouracil.
Hal ini terlihat pada LC50 fraksi etanolik ekstrak bawang dayak yaitu 3,125 µg/ml
dan LC50 5-FU yaitu 150 µg/ml. Efek sitostatik tersebut disebabkan oleh karena
71
apoptosis yang dipacu oleh berbagai faktor pro apoptotic. Dengan demikian ekstrak
bawang dayak merupakan bahan yang mengandung senyawa aktif yang potensial
untuk dikembangkan sebagai antikanker, khususnya untuk karsinoma kolon
berdasarkan penelitian invitro.
Penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian 5-FU maupun fraksi etanolik
ekstrak bawang dayak dengan konsentrasi yang berbeda memberikan pengaruh yang
nyata dalam penekanan proliferasi sel karsinoma kolon HT29 maupun ekspresi p53
mutan. Uji yang dilakukan menunjukkan ada korelasi antara konsentrasi 5-FU
maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan tingkat ekspresi p53 mutan.
Pada penelitian ini evaluasi terhadap proliferasi sel karsinoma kolon HT29
dilakukan dengan menggunakan metode kromogenik menggunakan pewarnaan
tryphan blue untuk mempermudah membedakan antara sel hidup dan sel yang mati.
Sel karsinoma hidup akan memberikan warna putih mengkilat, sedangkan sel yang
mati akan memberikan warna kebiruan. Warna kebiruan ini berasal dari pewarna
yang penetrasi ke dalam sitoplasma karena membran sel telah mengalami
disintegrasi akibat memberian bahan uji.
5-FU digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini karena 5-FU
merupakan agen kemoterapi yang poten untuk karsinoma kolon dan saat ini sudah
secara luas digunakan baik sebagai agen tunggal maupun kombinasi dengan agen
kemoterapi yang lain. Hasil penelitian menunjukan bahwa terdapat penekanan
ekspresi p53 mutan yang bermakna pada perlakuan menggunakan fraksi etanolik
ekstrak bawang dayak maupun 5-FU, yang berarti bahwa terdapat efek sitostasik dan
72
sitopatik 5-FU dan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak terhadap sel karsinoma
kolon HT29 dimana dengan tertekannya ekspresi dari p53 mutan akan dapat memacu
proses apoptosis. Kematian sel HT29 dipacu oleh apoptosis yang disebabkan karena
peningkatan berbagai protein pro apoptotic maupun enzim-enzim yang memacu
apoptosis, yang ekspresinya kemungkinan diinduksi oleh 5-FU atau fraksi etanolik
ekstrak bawang dayak.
Ekspresi p53 mutan yang semakin menurun pada konsentrasi 5FU 18,75
µg/ml sampai dengan 75 µg/ml dan mencapai statsioner pada konsentrasi 150 µg/ml,
menunjukan bahwa terjadi penghambatan sintesa DNA oleh karena terbentuknya
kompleks senyawa F-dUMP-Thymidilate Sintetase, sehingga terjadi penurunan
konsentrasi dTMP dan dTTP disertai peningkatan dUMP dan dUTP (Pecorino, 2005).
Penghambatan sintesa DNA akan menyebabkan terhentinya siklus sel. Siklus sel yang
terhenti akan memberi kesempatan bagi sel untuk melakukan reparasi DNA dan
apoptosis.
Peran fraksi etanolik ekstrak bawang dayak terhadap ekspresi p53 mutan
mengikuti fungsi logaritmik dengan persamaan Y = 48,335 – log70,414 dengan peran
kandungan senyawa terpenoid, flavanoid, antrakinon dan kaumarin yang terkandung
dalam ekstrak bawang dayak fraksi etanolik yang kemungkinan berperan dalam
penghambatan aktivasi kompleks cyclin-CDK yang hadir pada fase G1 dan S dalam
siklus sel. Sanderowics (2005), menyatakan bahwa dalam percobaan invitro diketahui
bahwa senyawa flavonoid yang berupa flavopiridol mampu mempengaruhi siklus sel
dengan cara menekan aktivitas cyclin-CDK yang aktif pada fase G1 dan G2.
73
Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh
beberapa checkpoint. Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan aktivasi dan
degradasi cyclin, aktivasi cyclin dependent kinase (CDK), cyclin-dependent kinase
inhibitor (CDKI). Interaksi diantara ketiga kelas protein tersebut berperan
mengontrol berbagai tahap siklus sel, mencegah sel ke tahap selanjutnya jika
terjadi kerusakan DNA. Aktivitas dari kompleks cyclin-CDK yang mengontrol
checkpoint tersebut diatur dengan cara fosforilasi dan defosforilasi. Pada kondisi tanpa
adanya sinyal pertumbuhan pRB dalam keadaan hipofosforilasi. Pada keadaan
hipofosforilasi pRB berikatan dengan E2F dan HDAC (histone deacetylase) dan
menginaktifkan faktor transkripsi E2F. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E,
cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Protein lain yang
berperan dalam kontrol checkpoint ini antara lain p53, CDKI p21. Ketika terjadi
kerusakan DNA maka p53 akan teraktivasi, demikian pula pada keadaan cell stress
atau sel hipoksia. p53 yang teraktivasi akan mengaktifkan p21 yaitu suatu CDK
Inhibitor. p21 ini akan mengikat dan menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan
menyebabkan fosforilasi pRB terhambat dan pelepasan faktor transkripsi E2F
terhenti sehingga siklus sel terhenti pada tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti,
DNA mempunyai kesempatan untuk memperbaiki diri sebelum memasuki tahap
pembelahan selanjutnya. Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi
maka sel akan memasuki jalur apoptosis.
Peningkatan konsentrasi yang diberikan pada penelitian ini akan diikuti
oleh respon penekanan terhadap ekspresi p53 mutan dan apabila digambarkan akan
74
membentuk kurva sigmoid seperti yang telah dicantumkan dalam hasil penelitian.
Kurva sigmoid ini dapat dibuat linear untuk dapat memungkinkan menganalisa
hubungan dosis versus respon yang lebih luas. Dalam kurva ini juga dapat dinilai
perubahan efek ekspresi p53 mutan jika terdapat peningkatan konsentrasi. Apabila
kurva mempunyai slope yang besar (relatif tegak) zat tersebut memiliki efek yang
besar karena dengan perubahan konsentrasi sedikit saja akan terjadi efek yang
relatif besar sebagai respon dari peningkatan konsentrasi. Sebaliknya pada kurva
yang slopenya relatif kecil peningkatan konsentrasi yang besar akan diikuti respon
yang relatif kecil. Hal ini berlaku juga untuk obat sehingga bisa dikatakan relatif
aman.
Berbagai penyebab yang kemudian mengaktivasi p53 akan memberi pengaruh
pada tahap selanjutnya. p21 yang terekspresi akibat aktivasi p53 akan mengikat
kompleks cyclin-CDK yang menyebabkan siklus sel terhenti. p21 juga akan mengikat
PCNA, yang bersama dengan XPC yang terekspresi akibat aktivasi p53 akan
mereparasi DNA. p53 yang teraktivasi akan mengekspresikan beberapa protein pro
apoptotic, seperti Bax dan sekaligus menghambat ekspresi protein inhibitor apoptotic
Bcl yang akan menyebabkan terjadinya apoptosis. Ekspresi thrombospondin, yang juga
akibat aktivasi p53, akan menghambat angiogenesis.
BAB VII
KESIMPULAN DAN SARAN
VII.1. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut :
1. Fraksi etanolik ekstrak bawang dayak mempunyai efek sitotoksik terhadap sel
karsinoma kolon HT29 secara in vitro yang ditunjukkan dengan nilai LC50
adalah sebesar 3,125 µl/ml.
2. Didapatkan adanya penekanan ekspresi dari p53 mutan yang signifikan pada
perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun dengan 5-FU
dengan konsentrasi yang berbeda mengikuti kurva logaritme sesuai dengan
perhitungan statistik, hal ini menunjukkan bahwa pemberian 5-FU maupun
fraksi etanolik ekstrak bawang dayak memberikan pengaruh yang nyata dalam
penekanan pertumbuhan sel kanker kolon HT29 maupun ekspresi p53 mutan.
3. Potensi penghambatan terhadap ekspresi p53 mutan dari sel kanker kolon
HT29 dari fraksi etanolik bawang dayak tidak menunjukkan adanya perbedaan
yang signifikan dengan 5-fluorouracil.
VII.2. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian terhadap ekspresi p53 mutan pada galur sel
karsinoma kolon yang lain atau penelitian secara invivo dengan konsentrasi
pada LC50 dan atau di bawahnya.
76
2. Perlu dilakukan penelitian dalam bidang biologi molekuler lebih lanjut
mengenai pengaruh ekstrak bawang dayak terhadap pertumbuhan sel
karsinoma kolon HT29, khususnya terhadap produk downstream dari protein
p53 seperti p21, puma ,noxa, bax dan lain – lain..
3. Perlu dilakukan penelitian lain mengenai genomik p53 dengan aras
DNA/mRNA
77
DAFTAR PUTAKA
1. Kelompok Kerja Adenokarsinoma Kolorektal,. 2006., Panduan Pengelolaan Adenokarsinoma Kolorektal,. pp. 1-56.
2. Tjarta, A,. 2001. Neoplasia : In Patologi Umum,. Sagung Seto,. Jakarta,. pp. 198 -199
3. Ashariati, A,. 2004., Adjuvant Chemotherapy of Colorectal Cancer,. In: Recent Advances and Challenges In General Surgeons in Indonesia,. Surabaya,.
4. Helena, R, C,. Kirby, I, B,. 1997,. Tumors of the Colon, In: Maingot’s Abdominal Operations,. Volume II, Tenth edition , Appleton & Lange, USA, pp.1281-1301
5. Tannock, I.E. Hil, R.P. 1998, . The Basic Science of Oncology, 3rd Edition, Mc Graw Hill, Singapore.
6. Alfred, M, C,. Bruce,D, M,. 1997., Cancer of The Colon,. In : Cancer, Principles & Practice of Oncology., 5th Ed,. Editors : Devita. V, T., Lippincott-Raben., USA., pp. 1144- 1185
7. Kodner, I,J,. Robert, D, F,. 1999.. Colon, Rectum, and Anus., In : Principles of Surgery,. 7th Ed., Vol. 2., Editors : Seymour I. Schwartz., McGraw-Hill Health Professions Division., NBew York., USA., pp. 1265 – 1380.
8. Allen, J,I,. 1995,. Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,. Perspect Colon Rectal Surgery., 8: 181 m- 202.
9. Carolyn, C,. Compton,. 2005., The Staging of Colorectal Cancer: 2004 and Beyond,. Ca Cancer Journal for Clinicians,., Vol. 54. No. 6. pp. 295 – 308.
10. Soetamto, W, P,. 2004., Pembedahan Karsinoma Kolon dan Rektum,. In : Recent Advance and Challenges in General Surgeon in Indonesia,. pp. 12-19.
11. Sjamsuhidayat, R,. Wim, D, J,. 1997., Buku Ajar Ilmu Bedah,. EGC,. Jakarta,. pp. 876-99
12. Janne, P, A,. 2000., Chemoprevention of colorectal cancer,. The New England Journal of Medicine. Vol. 342. no. 26: pp. 1960 – 1966.
13. Murti, B., 1996,, Penerapan Metode Statistik Nonparametrik untuk Ilmu-ilmu Kesehatan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, hal:37
14. Sudigdo, S,A,. Ismael, S,. 2002., Dasar-dasar Metodologi Penelitian Klinis., ed. 2.,Sagung Seto., Jakarta,
78
15. Budiani, D,R,. Retnaningsih, D,. et al ,. 2005.. Expression of LMP1 in Javanese Colon Carcinoma Patient’s with Duke’s classification System : indicated The Association of Epstein-Barr Virus infection In colon malignancies., Department of Patology anatomy, school of medicine, Sebelas Maret University, Surakarta,.
16. Arief T.Q.M., 2004, Pengantar Metodologi Penelitian untuk Ilmu Kesehatan, Cetakan Kedua, Penerbit CSGF, Klaten
17. Compton C.C., 2005, The Staging of Colorectal Cancer : 2004 and Beyond, Ca Cancer Journal for Clinicians, Vol. 54. No. 6, pp. 295 – 308
18. Katzung B.G., 2001, Basic & Clinical Pharmacology, 8th Ed, Mc Graw-Hill Companies, Philadelphia
19. Pusztai L., et al., 1996, Cell Proliferation in Cancer ; Regulatory Mechanisms of Neoplastic Cell growth, Oxford University Press, New York
20. Shengli C., 2001, Cell Cycle and Tumor Suppressor Genes, Charles Cai Tech, edit Tom Beron, pp. 1 – 36
21. Sigma A, 2007, HT29 Cell Line Human Colon Adenocarcinoma, http://sigmaaldrich.com
22. Teich N.M., 1997, Oncogenes and Cancer, In : Cellular and Molecular Biology of Cancer 3rd Ed, Editors : Franks L.M., Teich N.M., Oxford University Press, New York, pp. 169 – 201
23. Tim Skripsi FK UNS., 2007, Buku Panduan Skripsi, Fakultas kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta
24. Wolf J.C, Ginn P.E, HomerB, Fox L.E, Kurzman I.D., 1997 Immunohistochemical Deecion of p53 Tumor Suppressor Gene Protein in Canine Epithelial Colorectal Tumors.Vet Pathol;34:394-404
25. leonart ME, Vidal F,Gallardo D, Fuertez MD, Rojo F, Cuatrecasas M et all , 2006,New p53 Related Genes in Human Tunord:Significant down reguatin in Colon and Lung Carcinoma .Onkology reports;16:603-608
26. Petak I, Tilman DM, Hougthon JA. 2000, P53 Dependence of Fas Induction and Acute Apoptosis in Response to 5-Fluorouracil-Leucovrin in Human Colon Carcinoma Cell Lines. Clinical Cancer Research;6:4432-4441
27. Yang B, Stambrook P.J, Markowitz S.D, 1996. Wild Type p53 Demonstrates Functional Dominance in a Human Colon Carcinoma Cell Line in which it induces Reversible Growth Arrest. Clnical Cancer Research;2:1639-1647
79
28. Deiry W.S.Colon Cancer,Adenocarcinoma.http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007
29. Shalkow J. Colorectal Tumor. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007
30. Cirinaone E. Rectal Cancer. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007
31. Hassan I.Colon,Adenocarcinoma. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007
32. Tullo A, D’erchia A.M, Honda K, Mitry R.R, Kelly M.D, Hbib N.A, 1999.Characterization of p53 mutations in colorectal liver metastases and correlation with clinical parameters.Clinical Cancer Research;5:3523-3528
33. Slatery M.L, Curtin K, Edwards S, Schaffer D, Anderson K, Samowitz W., 2002Diet,activity and lifestyle associations with p53 mutations in colon tumor.CancerEpydemiology,Biomarker&Prevention .;11:541-548
34. Chen F, Chang D, Goh M, Klibanov S, Ljungman M. 2000. Role of p53 in Cell Cycle Regulation and Apoptosis following Exposure to Proteasome Inhibitor.;11:239-246
35. Tjarta A, 1973, Neoplasma in PATOLOGI. Bagian Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,pp:77-82
36. Pusztai, L,. et al., 1996., Cell Proliferation in Cancer ; Regulatory Mechanisms of Neoplastic Cell growth., Oxford University Press.,
37. Anonim,2002.The Central Role of p53 Cell-Cycle Arrest, DNA Repair and Apoptosis Following UV Irradiation.http://www.expertreviews.org/
38. Basu A.,Haldar S.,1998. The Relationship between Bcl2,Bax and p53:Qonsequences for cell cycle progression and cell death.Molecular Human Reproduction;4:1099-1109.
39. Mohanna M.A.,Khodairy F.M.,Krezolek Z.,Bertilsson P.,Houssein K.A.,Aboussekhra A,2001.p53 is dispensable for UV-induced cell cycle arrest at late G1 in mammalian cells. Carcinogenesis;22:573-578.
40. Rotter V, 2002.Expression of the wild type p53 tumor supressor gene in normal cells and its deregulation in cancer cells. Departement of Molecular Cell Biology :p:176-177.
80
41. Offer H.,Zurer I.,Bontalvi G.,Reha’k M.,Falcovitz A.,Milyavsky M.,et all,2001. P53 modulates base excission repair activity in a cell cycle-spesific Manner after Genotoxic Stress. Cancer Research;61:88-96.
42. Sato T.,Koseki T.,Yamato K.,Saiki K.,Konishi K.,Yoshikawa M., et all.2002.p53-Independent Expression of P21CIPI/WAFI in Plasmacytic Cells During G2 Cells Cycle Arrest Induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans Cyto Lethal Distending Toxin.Infection and Immunity;70:528-534.
43. Abrhamson J.A.,Lee J.M.,Bernstein A., 1995. Regulation of p53-Mediated Apoptosis and Cell Cycle Arrest by Steel Factor. Molecular and Celluler Biology;15:6953-6960.
44. Pellegata N.,Antoniono R.J.,Redpath J.L.,Stanbridge E.J.,1996. DNA Damage andp53-mediated Cellcycle Arrest:A Reevaluation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA;93:15209-15214.
45. Sablino A.A., Ilyinskaya G.V.,Rubtsova S.N.,Aqapova L.S.,Chumakov P.M.,Kopnin B.P.,1998. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in Response to Micronuclei Formation.Journal of Cell Science;111:977-984.
46. Moll.U.,Ostermeyer A.G.,Haladay R.,Winkfield B.,Frazier M.,Zambetti G., 1996. Cytoplasmic Sequestration of Wild Type p53 Protein Impairs the G1 Checkpoint After DNA Damage. Molecular and Celluler Biology;16:1126-1137.
47. Pines J. 1997.Tumor Suppressors and Cell Cycle Control.Oncogenes and Tumor Suppressors.Oxford University Press;p:189-214.
48. Gangopadhyay S.B.,Abraham J., Lin Y.P.,Benchimol S.,1997. The Tumour Suppressor gene p53. Oncogenes and Tumor Suppressors.Oxford University Press;p:261-280.
49. Yuwono T., 2005, Biologi Molekular, Penerbit Erlangga, Jakarta
50. Ghobrial I.M.,Witzig T.E.,Adjei A.A.,2005. Targeting Apoptosis Pathways in Cancer Therapy.CA Cancer J Clin;55:178-194
51. Schuler M.,Green D.R.,2001.Mechanisms of p53-dependent Apoptosis.Biochemical Society Transactions;29:684-688
52. Murphy M.E., 2000. Ellucidation of the p53- Dependent Apoptosis Pathway.Medical Science division:p:244-247
53. Allen, J,I,. 1995,. Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,. Perspect Colon Rectal Surgery., 8: 181 – 202
81
54. Bruce blumberg,.2000. Oncogenes and Cancer.BioSci 145 A lecture 18.Page 1 – 15
55.Levine A.J., Hu W., Feng Z. 2006. The p53 Pathway: What Questions Remain to be Explored?.Cell Death and Differentiation.,13:1027-1036
56. Aguda B.D., 2006. Oncogene and Tumor Suppressor gene networks in cell cycle check points,Apoptosis & cell Survival.
57. Wongpalee S.,2006. RNA interfere (RNAi) Screening of non coding RNAs (ncRNA) Essential for Cancer Cell Proliferation.
58. Winarto W.P.,2007. Tanaman obat indonesia untuk pengobatan herbal, 1:55-57.
59. Lenny S.,2006. Senyawa Flavonoida, Fenil-propanoida, dan Alkaloida. Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,Universitas Sumatera Utara, Medan.
60. Priyanto, 2007. Toksisitas Obat, Zat Kimia dan Terapi Antidotum,I:1-31
LAMPIRAN 1
Gambar 29.Foto sel karsinoma kolon HT29 tanpa perlakuan (kontrol negatif)
Gambar 30.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 18,755µl/ml
Gambar 31.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 37,5µl/ml
Gambar 32.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 75µl/ml
Gambar 33.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 150µl/ml
Gambar 34.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan Bawang Dayak dengan konsentrasi 0,390625µl/ml
Gambar 35.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5awang Dayak dengan konsentrasi 0,78125µl/ml
Gambar 36.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan bawang dayak dengan konsentrasi 1,51625µl/ml
Gambar 37.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan bawang dayak dengan konsentrasi 3,125µl/ml
Uji Kolmogorov Smirnov
Bawang dayak
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
4
13.3350
12.79575
.386
.386
-.270
.772
.591
N
Mean
Std. Deviation
Normal Parametersa,b
Absolute
Positive
Negative
Most ExtremeDifferences
Kolmogorov-Smirnov Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
PROSENTASEP53
Test distribution is Normal.a.
Calculated from data.b.
5-fluorouracil
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
4
2.8825
1.99777
.295
.221
-.295
.591
.876
N
Mean
Std. Deviation
Normal Parametersa,b
Absolute
Positive
Negative
Most ExtremeDifferences
Kolmogorov-Smirnov Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
PROSENTASEFU
Test distribution is Normal.a.
Calculated from data.b.
Regression
Descriptive Statistics
30.5100 39.97126 5
1.1626 1.23178 5
ekspresip53mutan
konsentrasiBD
Mean Std. Deviation N
Variables Entered/Removedb
konsentrasiBD
a . Enter
Model1
VariablesEntered
VariablesRemoved Method
All requested variables entered.a.
Dependent Variable: ekspresip53mutanb.
Model Summaryb
.663a .440 .254 34.53323Model1
R R SquareAdjustedR Square
Std. Error ofthe Estimate
Predictors: (Constant), konsentrasiBDa.
Dependent Variable: ekspresip53mutanb.
ANOVAb
2813.174 1 2813.174 2.359 .222a
3577.632 3 1192.544
6390.806 4
Regression
Residual
Total
Model1
Sum ofSquares df Mean Square F Sig.
Predictors: (Constant), konsentrasiBDa.
Dependent Variable: ekspresip53mutanb.
Coefficientsa
55.541 22.452 2.474 .090 -15.913 126.994
-21.530 14.018 -.663 -1.536 .222 -66.140 23.081
(Constant)
konsentrasiBD
Model1
B Std. Error
UnstandardizedCoefficients
Beta
StandardizedCoefficients
t Sig. Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval for B
Dependent Variable: ekspresip53mutana.
konsentrasiBD4.003.002.001.000.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
ekspresip53mutan
LogisticObserved
Regression
Descriptive Statistics
22.1480 43.11370 5
56.2500 59.29271 5
ekspresip53mutan
konsentasi5FU
Mean Std. Deviation N
Variables Entered/Removedb
konsentasi5FU
a . Enter
Model1
VariablesEntered
VariablesRemoved Method
All requested variables entered.a.
Dependent Variable: ekspresip53mutanb.
Model Summaryb
.560a .314 .085 41.23382Model1
R R SquareAdjustedR Square
Std. Error ofthe Estimate
Predictors: (Constant), konsentasi5FUa.
Dependent Variable: ekspresip53mutanb.
ANOVAb
2334.478 1 2334.478 1.373 .326a
5100.685 3 1700.228
7435.163 4
Regression
Residual
Total
Model1
Sum ofSquares df Mean Square F Sig.
Predictors: (Constant), konsentasi5FUa.
Dependent Variable: ekspresip53mutanb.
Coefficientsa
73.318 29.246 2.507 .087 -19.755 166.390
-.771 .658 -.560 -1.172 .326 -2.864 1.322
(Constant)
p53mutan
Model1
B Std. Error
UnstandardizedCoefficients
Beta
StandardizedCoefficients
t Sig. Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval for B
Dependent Variable: konsentrasi5FUa.
konsentrasi5FU5.004.003.002.001.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
ekspresip53mutan
LogarithmicObserved
T-Test
Paired Samples Statistics
30.5100 5 39.97126 17.87569
22.1480 5 43.11370 19.28103
ekspresip53BD
ekspresip535FU
Pair1
Mean N Std. DeviationStd. Error
Mean
Paired Samples Correlations
5 .966 .007ekspresip53BD &ekspresip535FU
Pair1
N Correlation Sig.
Paired Samples Test
8.36200 11.22359 5.01934 -5.57393 22.29793 1.666 4ekspresip53BD -ekspresip535FU
Pair1
Mean Std. DeviationStd. Error
Mean Lower Upper
95% ConfidenceInterval of the
Difference
Paired Differences
t df
Top Related