PRODUKSI KOLAGENASE DARI ISOLAT Bacillus
licheniformis F-11.1 DAN F-11.4
CINDY THERESIA OCTIVIANTI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
CINDY THERESIA OCTIVIANTI. Produksi Kolagenase dari Isolat Bacillus licheniformis F-11.1
dan F-11.4. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO. Hidrolisis enzimatik dengan kolagenase berperan meningkatkan nutrisi dan fungsional protein
pangan. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1
dan F-11.4. Isolat B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 ditumbuhkan pada tiga macam media
produksi, yaitu media Luria Bertani (LB) yang mengandung 5% kolagen (LBC), media LB 50%
dengan 5% kolagen (LBHC), dan 5% kolagen (CLG). Aktivitas kolagenase, kadar protein, dan
turbiditas sel B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 diukur setiap selang waktu 5 jam selama 50 jam
waktu inkubasi. Hasil menunjukkan bahwa produksi kolagenase tertinggi isolat B. licheniformis F-
11.1 dicapai pada media LBC dan LBHC dengan aktivitas spesifik masing-masing sebesar 2,057
U/mg dan 2,037 U/mg. Produksi kolagenase tertinggi isolat B. licheniformis F-11.4 dicapai pada
media LBC dengan aktivitas spesifik sebesar 4,695 U/mg. Isolat F-11.4 pada media LBHC
memiliki aktivitas spesifik tertinggi sebesar 2,811 U/mg. Media CLG memberikan aktivitas
spesifik tertinggi untuk B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 masing-masing sebesar 0,807 U/mg dan
0,306 U/mg. Dari ketiga media percobaan disimpulkan bahwa media LBC dan LBHC merupakan
media terbaik untuk produksi kolagenase B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4.
Kata kunci: produksi, kolagenase, Bacillus licheniformis
ABSTRACT CINDY THERESIA OCTIVIANTI. Collagenase Production of Bacillus licheniformis isolate F-
11.1 and F-11.4. Supervised by SRI BUDIARTI and MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO. Hydrolysis by collagenase enzyme could increase nutrition and function of food proteins. This
research was conducted to produce collagenase enzyme from Bacillus licheniformis F-11.1 and F-
11.4. B. licheniformis isolate F-11.1 and F-11.4 were cultured in three types of production media,
which is Luria Bertani (LB) media consisted of 5% collagen (LBC), 50% LB media consisted of
5% collagen (LBHC), and 5% collagen (CLG). The activity of collagenase, protein content, and
cell turbidity of B. licheniformis F-11.1 and F-11.4 were measured every 5 hours during 50 hours
incubation. The result showed that optimum collagenase production of B. licheniformis isolate F-
11.1 was reached in LBC and LBHC media with activity of 2,057 U/mg and 2,037 U/mg,
respectively. Optimum collagenase production of B. licheniformis isolate F-11.4 was reached in
LBC media with activity of 4,695 U/mg. Isolate F-11.4 in LBHC media possesed the optimum
collagenase activity of 2,811 U/mg. CLG media gave optimum collagenase activity of B.
licheniformis F-11.1 and F-11.4 at 0,807 U/mg and 0,306 U/mg respectively. These research
concluded that LBC and LBHC media was the best choice for collagenase production of B.
licheniformis F-11.1 and F-11.4.
Keywords: production, collagenase, Bacillus licheniformis
PRODUKSI KOLAGENASE DARI ISOLAT Bacillus
licheniformis F-11.1 DAN F-11.4
CINDY THERESIA OCTIVIANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Produksi Kolagenase dari Isolat Bacillus licheniformis F-11.1 dan
F-11.4
Nama : Cindy Theresia Octivianti
NIM : G34080121
Disetujui,
Pembimbing I, Pembimbing II,
Dr. dr. Sri Budiarti Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono
NIP. 195813081993032001 NIP. 195305071977012001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP. 196410021989031002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas karunia-Nya sehingga
laporan skripsi yang berjudul “Produksi Kolagenase dari Isolat Bacillus licheniformis F-11.1 dan
F-11.4” dapat diselesaikan tepat pada waktunya. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember
2011 hingga Mei 2012, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat
Pengembangan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Laboratorium Mikrobiologi dan
Laboratorium Mikologi, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. dr. Sri Budiarti dan Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy
Thenawidjaja Suhartono selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, saran, dan
motivasi selama pelaksanaan penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono yang telah memberikan dana penelitian. Ucapan
terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Yohana Caecilia Sulistyaningsih, M.Si selaku
dosen penguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan saran saat
ujian dan penulisan karya ilmiah.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada kepala Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi (PPSHB)-IPB beserta seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia atas
sarana, prasarana, dan bantuan selama penulis melakukan penelitian. Terima kasih penulis
ucapkan pula kepada staf pengajar Bagian Mikrobiologi dan seluruh staf pengajar di Departemen
Biologi IPB yang telah memberikan saran dan bantuan atas terselesaikannya karya ilmiah ini.
Penulis juga menyampaikan ungkapan terima kasih kepada Mama, Papa, Adik, Rezki
Ariefianto, serta seluruh keluarga atas doa, kasih sayang, pengertian, dan dukungannya. Terima
kasih pula penulis ucapkan kepada ibu Ika, pak Ace, ibu Diana, pak Pras, pak Jaka, kak Wenny,
Isna, Olin, Goki, dan Malibu Crew yang selalu membantu selama penulis bekerja di laboratorium
dan senantiasa memberi semangat. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada teman-teman di
Laboratorium Mikrobiologi dan rekan-rekan “Biologi 45” atas bantuan dan dukungannya, serta
seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas doa dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat, bagi penulis maupun pembaca.
Bogor, Agustus 2012
Cindy Theresia Octivianti
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 20 Oktober 1990 dari pasangan ayah Anthony
Bernard Simanjuntak dan ibu Siti Zulfiah. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan di SMA Marsudirini Sedes Sapientiae Semarang pada tahun
2008. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan
Mahasiswa Baru pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama masa perkuliahan penulis menerima Beasiswa BBM (Bantuan Belajar Mahasiswa).
Penulis juga berpartisipasi dalam kegiatan yang diselenggarakan HIMABIO seperti Biology on
Experiment (2010) dan Grand Biodiversity dan Temu Alumni (2011). Pada tahun 2010, penulis
melaksanakan studi lapangan di Taman Wisata Alam dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul
laporan “Bakteri Penghasil Agarase yang Berasosiasi dengan Alga” di bawah bimbingan Ibu Prof.
Dr. Anja Meryandini. Pada tahun 2011, penulis melaksanakan praktik lapangan di PT Nyonya
Meneer Semarang dengan judul laporan “Pengawasan Mutu Produk Jamu Di PT Nyonya Meneer
Semarang” di bawah bimbingan Ibu Dr. Nunik Sri Ariyanti, M.Si.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ............................................................................................................................. 1
Tujuan .......................................................................................................................................... 2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................................................... 2
Bahan ........................................................................................................................................... 2
Metode ......................................................................................................................................... 2
Penyiapan Kolagen Sebagai Substrat dan Media Pertumbuhan .......................................... 2
Peremajaan Isolat dan Pembuatan Inokulum ...................................................................... 2
Pengamatan Laju Pertumbuhan Sel dan Produksi Kolagenase ........................................... 2
Uji Aktivitas Kolagenase dan Penentuan Kadar Protein ..................................................... 2
HASIL
Laju Pertumbuhan Sel dan Produksi Kolagenase ........................................................................ 3
Perbandingan Aktivitas Kolagenase Terbaik B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 pada Media
LBC, LBHC, dan CLG........................................................................................................ 4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 5
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 6
SARAN ......................................................................................................................................... 6
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6
LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 9
DAFTAR TABEL Halaman
1 Aktivitas kolagenase terbaik isolat F-11.1 dan F-11.4 pada tiga media produksi ......................... 4
DAFTAR GAMBAR Halaman
1 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.1 pada
media LBC ............................................................................................................................. 3
2 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.1 pada
media LBHC .................................................................................................................................. 3
3 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.1 pada
media CLG ..................................................................................................................................... 3
4 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.4 pada
media LBC ..................................................................................................................................... 4
5 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.4 pada
media LBHC .................................................................................................................................. 4
6 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.4 pada
media CLG ..................................................................................................................................... 4
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Metode pengukuran aktivitas kolagenase menurut Moore & Stein (1954) ................................. 10
2 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) .................................................................... 11
3 Kurva standar protein Bradford ................................................................................................... 12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim merupakan molekul polimer yang
dihasilkan oleh semua sel hidup dan memiliki
peranan penting sebagai biokatalisator pada
reaksi biokimia. Spesifitas, efisiensi, dan kerja
yang selektif membuat industri enzim
berkembang pesat dan menempati posisi
penting dalam dunia industri. Protease
merupakan salah satu enzim komersial yang
telah digunakan secara luas dalam bidang
industri. Berdasarkan aktivitasnya, protease
dibedakan menjadi proteinase (endopeptidase)
yang menghidrolisis molekul protein menjadi
polipeptida dan peptidase (eksopeptidase)
yang menghidrolisis polipeptida menjadi asam
amino (Rao et al. 1998).
Salah satu enzim golongan protease ialah
kolagenase. Kolagenase adalah endopeptidase
yang mampu mendegradasi ikatan polipeptida
kolagen (Kim et al. 2002). Kolagen
merupakan protein berbentuk serabut
penyusun tubuh makhluk hidup. Protein ini
merupakan struktur utama pada kulit dan
tulang hewan (Bama et al. 2010). Kolagen
terdiri atas tiga rantai polipeptida yang
berulang dan mengandung lebih dari 1000
residu asam amino. Asam amino yang
terkandung dalam kolagen antara lain, 35%
glisin, 11% alanin, serta 21% prolin dan
hidroksiprolin (Lehninger 1993).
Konformasi triple helix pada kolagen
menyebabkan protein ini resisten terhadap
sebagian besar proteinase. Namun, kolagenase
mampu memecah tripolipeptida ini. Pada
penelitian Chung et al. (2004), kolagenase
bekerja efektif dan dapat memecah protein
kolagen pada suhu tubuh 37oC. Menurut
Sternlicht & Werb (2001), degradasi
makromolekul kolagen oleh kolagenase
berperan dalam proses biologis pada tubuh
manusia seperti, embriogenesis, morfogenesis
organ, dan perbaikan jaringan.
Kolagen telah banyak diekstraksi dari
berbagai jenis ikan dan kulit hewan mamalia
seperti sapi. Jenis ikan yang telah dilaporkan
sebagai penghasil kolagen antara lain, ikan
sardin (Sardinops melanosticus), ikan red sea
bream (Pagrus major), dan ikan japanese sea
bass (Lateobrax japonicus). Kulit, tulang, dan
sisik merupakan bagian yang berpotensi
sebagai sumber kolagen (Nagai et al. 2004).
Pemanfaatan kolagen dari kulit ikan
mempunyai resiko lebih rendah
terkontaminasi patogen seperti bovine
spongiform enchepalopathy (BSE) daripada
kolagen dari kulit sapi. Selain itu, kolagen dari
kulit ikan juga relatif mudah diekstraksi dan
memberikan hasil yang lebih tinggi
dibandingkan kolagen dari kulit sapi (Yunoki
et al. 2003).
Kolagenase dapat digunakan dalam proses
pelunakan daging dan hidrolisis protein.
Hultmann & Rustad (2004) melaporkan
bahwa kolagenase endogen pada ikan salmon
mampu memisahkan ikatan antara serat-serat
daging dengan mycotoma sehingga daging
ikan menjadi lunak. Hidrolisis protein secara
enzimatik dapat meningkatkan kualitas
protein. Proses hidrolisis yang sempurna dapat
menghasilkan hidrolisat yang terdiri atas
campuran 18-20 macam asam amino. Pada
penelitian Kumaila (2008), hidrolisis protein
kerang hijau dengan kolagenase menghasilkan
kadar α-amino nitrogen bebas sebesar 0,184
g/100 g. Enzim kolagenase juga berperan
dalam proses penyembuhan luka (Riley &
Herman 2005) dan perbaikan jaringan pada
peradangan (Chung et al. 2004).
Kolagenase dihasilkan oleh beberapa
mikroorganisme seperti, Streptomyces sp.
strain 3B (Petrova et al. 2006), Clostridium
hystolyticum (Bond & Wart 1984), Bacillus
subtilis FS-2 (Nagano & To 1999), Bacillus
subtilis CN2 (Tran & Nagano 2002), Vibrio
alginolyticus (Reid et al. 1980),
Achromobacter iophagus (Reid et al. 1978),
Klebsiella pneumoniae CNL3, dan Bacillus
cereus CNA1 (Suphatharaprateep et al. 2011).
Kolagenase dilaporkan juga ditemukan di
organ dalam ikan makarel (Park et al. 2002)
dan organ dalam ikan filefish (Kim et al.
2002).
Sumber kolagenase yang digunakan dalam
penelitian ini ialah Bacillus licheniformis F-
11. Pada penelitian yang dilakukan Waldeck
et al (2006), bakteri ini termasuk termofil dan
digunakan untuk deproteinasi kulit udang
pada produksi kitin dengan suhu optimum
55oC. Waldeck et al (2006) melaporkan
bahwa bakteri ini dapat menggunakan kolagen
sebagai substrat pertumbuhan.
Bacillus licheniformis F-11 yang
digunakan dalam penelitian ini telah
mengalami perlakuan mutagenik pada operon
PGA (Asam Poliglutamat) dan Kitinase-AB
menjadi strain F-11.1 dan F-11.4 (Hoffmann
et al. 2010). Kedua strain tersebut berpotensi
menghasilkan kolagenase karena kemampuan
B. licheniformis F-11 menggunakan kolagen
sebagai substrat. Baehaki et al. (2012)
melaporkan bahwa kedua strain ini merupakan
penghasil kolagenase.
Protein memegang peranan penting pada
peningkatan kesehatan manusia karena nilai
2
gizinya yang tinggi. Hidrolisis secara
enzimatik berperan meningkatkan nutrisi dan
fungsional protein pangan (Suhartono 1989).
Hidrolisat protein, khususnya dari ikan telah
dilaporkan bersifat antioksidatif (Shahidi et al.
1995). Produksi enzim kolagenase diharapkan
dapat meningkatkan nilai tambah limbah hasil
perikanan untuk digunakan dalam proses
hidrolisis protein khususnya kolagen.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk
memproduksi kolagenase dari Bacillus
licheniformis F-11.1 dan F-11.4.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Desember 2011 sampai Mei 2012 bertempat
di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia
Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB) IPB, Laboratorium
Mikrobiologi, dan Laboratorium Mikologi,
Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini ialah isolat Bacillus licheniformis F-11.1
dan F-11.4 yang merupakan koleksi dari
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia
Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Metode
Penyiapan Kolagen Sebagai Substrat dan
Media Pertumbuhan Pembuatan substrat kolagen menggunakan
metode Yuniarti (2010). Substrat kolagen
yang digunakan berasal dari kulit ikan
bandeng yang diperoleh dari pasar tradisional.
Kulit ikan bandeng dibersihkan dari sisa
daging, lemak, dan kotoran lainnya. Kulit
kemudian dipotong sebesar 3x3 cm dan
direndam dalam asam asetat 1,5% selama 24
jam dengan perbandingan (b/v) sebesar 1:2.
Selanjutnya, kulit dicuci dengan akuades
hingga pHnya mendekati netral (pH 7). Kulit
yang telah mengembang diekstraksi
menggunakan akuades dengan perbandingan
(b/v) sebesar 2:1. Ekstraksi dilakukan selama
3 jam pada suhu 40oC. Hasil ekstraksi disaring
dengan kertas saring menjadi larutan kolagen.
Peremajaan Isolat dan Pembuatan
Inokulum
Biakan bakteri disimpan dan diremajakan
pada media agar-agar miring Luria Bertani
(LB). Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada
suhu 50oC untuk isolat B. licheniformis F-11.1
dan 40oC untuk isolat F-11.4. Sebanyak 2 lup
isolat F-11.1 dan F-11.4 masing-masing
ditumbuhkan pada 75 ml media kaldu LB
sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi
dengan kecepatan 110 rpm selama 24 jam
pada suhu 50oC untuk isolat F-11.1 dan 40
oC
untuk isolat F-11.4.
Pengamatan Laju Pertumbuhan Sel dan
Produksi Kolagenase
Sebanyak 10% inokulum (OD= 0,8 pada
λ= 620 nm) dimasukkan ke dalam erlenmeyer
yang berisi 200 ml media produksi dan
diinkubasi dengan kecepatan 110 rpm.
Produksi kolagenase dilakukan pada suhu
50oC untuk isolat F-11.1 dan 40
oC untuk
isolat F-11.4. Media produksi yang digunakan
antara lain, LB + 5% kolagen (LBC), LB 50%
+ kolagen 5% (LBHC), dan 5% kolagen
(CLG). Turbiditas sel diukur pada panjang
gelombang 620 nm dengan spektrofotometer
(Genesys 20) setiap selang waktu 5 jam
selama 50 jam. Pada masing-masing waktu
pengamatan diukur aktivitas enzim dan kadar
proteinnya.
Ekstraksi kolagenase dilakukan dengan
cara sentrifugasi media pertumbuhan bakteri
dengan alat Tomy MRX-152 dengan
kecepatan 4000 rpm suhu 4oC selama 20
menit. Supernatan yang mengandung ekstrak
kasar enzim dipisahkan dari endapannya dan
diuji aktivitasnya serta kadar protein.
Uji Aktivitas Kolagenase dan Penentuan
Kadar Protein
Aktivitas enzim kolagenase diuji dengan
metode Moore & Stein (1954) dimodifikasi
dalam jumlah dan pereaksi untuk pewarnaan
(Kim et al. 2002) (Lampiran 1). Sebanyak 0,1
ml larutan enzim ditambah dengan 5 ml
larutan kolagen 5% (b/v) dan 1 ml 50mM
bufer fosfat pH 9, campuran diinkubasi di
inkubator pada 37oC selama 1 jam. Reaksi
dihentikan dengan penambahan 0,2 ml 0,5%
asam trikloroasetat (TCA). Setelah 10 menit
pada suhu ruang, larutan disentrifugasi pada
5000 rpm selama 20 menit. Filtrat sebanyak
0,2 ml direaksikan dengan 1,0 ml larutan
ninhidrin dan diinkubasi pada 100oC selama
20 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang.
Campuran kemudian dilarutkan dalam 5 ml
50% 1-propanol dan diukur serapannya
menggunakan spektrofotometer (Genesys 20)
pada panjang gelombang 570 nm. Blanko
sebagai faktor koreksi dan standar dibuat
dengan cara yang sama. Blanko menggunakan
3
akuades, sementara standar menggunakan L-
leusin 5mM. Satu unit aktivitas enzim
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
menghasilkan 1 μmol leusin per menit.
Aktivitas spesifik kolagenase (U/mg)
merupakan nisbah aktivitas kolagenase (U/ml)
terhadap kadar protein (mg/ml).
Penentuan kadar protein menggunakan
metode Bradford (1976) (Lampiran 2).
Sebanyak 100 µl enzim direaksikan dengan 5
ml larutan Bradford dan dikocok kuat. Larutan
diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang
dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm
sebagai sampel. Bovin Serum Albumin (BSA)
digunakan sebagai standar dengan konsentrasi
0-0,5 mg/ml (Lampiran 3). Blanko
menggunakan 100 µl akuades dicampur
dengan 5 ml pereaksi Bradford, lalu dikocok
dan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 595 nm. Pengukuran kadar protein
dan uji aktivitas enzim kolagenase masing-
masing dilakukan dengan tiga kali ulangan.
HASIL
Laju Pertumbuhan Sel dan Produksi
Kolagenase
Produksi kolagenase optimum selama
pertumbuhan diketahui dari kurva
pertumbuhan dan aktivitas spesifik enzim.
Pengamatan pertumbuhan bakteri
menggunakan metode turbidimetrik. Bakteri
yang tumbuh akan menghasilkan pertambahan
jumlah sel sehingga kurva pertumbuhannya
dapat dibuat berdasarkan kekeruhan sel dalam
media. B. licheniformis isolat F-11.1 dan F-
11.4 yang ditumbuhkan pada tiga macam
media yaitu, LBC, LBHC, dan CLG
menghasilkan aktivitas kolagenolitik yang
berbeda pada 50 jam waktu inkubasi.
Pertumbuhan isolat F-11.1 pada media
LBC menunjukkan bahwa selama waktu
inkubasi 50 jam terjadi peningkatan jumlah
sel dari jam ke-0 hingga jam ke-5, selanjutnya
relatif stabil hingga jam ke-30. Aktivitas
spesifik tertinggi terjadi pada jam ke-15 yaitu
sebesar 2,057 U/mg, kemudian mengalami
penurunan pada jam ke-20 (Gambar 1).
Aktivitas spesifik kolagenase tertinggi dicapai
saat fase stasioner.
Isolat F-11.1 di media LBHC mengalami
pertambahan jumlah sel mulai dari jam ke-0
hingga jam ke-10 lalu mengalami penurunan
pada jam ke-15. Peningkatan jumlah sel
seiring dengan peningkatan nilai aktivitas
spesifik kolagenase yang dihasilkan. Aktivitas
spesifik tertinggi di media ini terjadi pada jam
ke-10 yaitu sebesar 2,037 U/mg (Gambar 2).
Nilai tertinggi aktivitas spesifik ini dicapai
pada akhir fase eksponensial.
Berdasarkan kurva pertumbuhan, isolat F-
11.1 pada media CLG mengalami kenaikan
jumlah sel mulai jam ke-0 hingga jam ke-10
waktu inkubasi, kemudian memasuki fase
stasioner pada jam ke-15. Aktivitas spesifik
tertinggi pada media CLG dicapai pada akhir
fase eksponensial yaitu jam ke-10 dengan
nilai 0,807 U/mg (Gambar 3).
Waktu fermentasi (jam)
OD
62
0 n
m
Ak
tiv
ita
s S
pe
sif
ik (
U/m
g)
0 10 20 30 40 50 600.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
OD 620nm
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Ak
tiv
ita
s K
ola
ge
na
se
(U
/ml)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Aktivitas Kolagenase (U/ml)
Gambar 1 Kurva tumbuh, aktivitas
kolagenase, dan aktivitas spesifik
enzim isolat F-11.1 pada media
LBC.
Waktu fermentasi (jam)
OD
62
0 n
m
Ak
tiv
ita
s S
pe
sif
ik (
U/m
g)
0 10 20 30 40 50 600.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
OD 620 nm
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Ak
tiv
ita
s K
ola
ge
na
se
(U
/ml)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Aktivitas Kolagenase (U/ml)
Gambar 2 Kurva tumbuh, aktivitas
kolagenase, dan aktivitas spesifik
enzim isolat F-11.1 pada media
LBHC.
Waktu fermentasi (jam)
OD
62
0 n
m
Ak
tiv
ita
s S
pe
sif
ik (
U/m
g)
0 10 20 30 40 50 600.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
OD 620 nm
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Ak
tiv
ita
s K
ola
ge
na
se
(U
/ml)
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Aktivitas Kolagenase (U/ml)
Gambar 3 Kurva tumbuh, aktivitas
kolagenase, dan aktivitas spesifik
enzim isolat F-11.1 pada media
CLG.
4
Selama waktu inkubasi 50 jam, jumlah sel
isolat F-11.4 di media LBC mengalami
peningkatan yang signifikan hingga jam ke-
20, lalu relatif stabil pada jam ke-25 dan mulai
menurun pada jam ke-40. Pertambahan
jumlah sel ini diikuti pula dengan nilai
aktivitas spesifiknya. Aktivitas spesifik
tertinggi di media ini dicapai saat fase
stasioner pada jam ke-35 yaitu sebesar 4,695
U/mg (Gambar 4).
Berdasarkan kurva pertumbuhan isolat F-
11.4 di media LBHC terlihat bahwa isolat ini
mengalami pertambahan jumlah sel hingga
jam ke-10, lalu relatif stabil pada jam ke-15.
Aktivitas spesifik tertinggi di media ini terjadi
saat fase stasioner yaitu pada jam ke-25
dengan nilai sebesar 2,811 U/mg (Gambar 5).
Isolat F-11.4 yang tumbuh di media CLG
mengalami fase lag yang panjang hingga jam
ke-40, lalu memasuki fase eksponensial pada
jam ke-45. Aktivitas spesifik tertinggi di
media CLG dicapai saat fase adaptasi yaitu
pada jam ke-35 dengan nilai sebesar 0,306
U/mg (Gambar 6).
Waktu fermentasi (jam)
OD
62
0 n
m
Ak
tiv
ita
s S
pe
sif
ik (
U/m
g)
0 10 20 30 40 50 600.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
OD 620nm
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Ak
tiv
ita
s K
ola
ge
na
se
(U
/ml)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Aktivitas Kolagenase (U/ml)
Gambar 4 Kurva tumbuh, aktivitas
kolagenase, dan aktivitas spesifik
enzim isolat F-11.4 pada media
LBC.
Waktu fermentasi (jam)
OD
62
0 n
m
Ak
tiv
ita
s S
pe
sif
ik (
U/m
g)
0 10 20 30 40 50 600.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
OD 620 nm
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Ak
tiv
ita
s K
ola
ge
na
se
(U
/ml)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Aktivitas Kolagenase (U/ml)
Gambar 5 Kurva tumbuh, aktivitas
kolagenase, dan aktivitas spesifik
enzim isolat F-11.4 pada media
LBHC.
Waktu fermentasi (jam)
OD
62
0 n
m
Ak
tiv
ita
s S
pe
sif
ik (
U/m
g)
0 10 20 30 40 50 600.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
OD 620 nm
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Ak
tiv
ita
s K
ola
ge
na
se
(U
/ml)
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Aktivitas Kolagenase (U/ml)
Gambar 6 Kurva tumbuh, aktivitas
kolagenase, dan aktivitas spesifik
enzim isolat F-11.4 pada media
CLG.
Perbandingan Aktivitas Kolagenase
Terbaik B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4
pada Media LBC, LBHC, dan CLG
Dari ketiga media produksi yang
digunakan, media LBC dan LBHC lebih dapat
meningkatkan aktivitas spesifik kolagenase
pada isolat B. licheniformis F-11.1, sedangkan
untuk isolat B. licheniformis F-11.4 aktivitas
spesifiknya maksimum dicapai pada media
LBC (Tabel 1). Aktivitas spesifik kolagenase
kedua isolat B. licheniformis di media CLG
lebih rendah dibandingkan pada media LBC
dan LBHC.
Tabel 1 Aktivitas kolagenase terbaik isolat F-11.1 dan F-11.4 pada tiga media produksi.
Isolat Media
Produksi
Waktu
inkubasi (Jam)
Aktivitas
Kolagenase
(U/ml)
Kadar Protein
(mg/ml)
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
F-11.1 LBC 15 0,356 ± 0,039 0,173 ± 0,011 2,057 ± 0,092
LBHC 10 0,132 ± 0,028 0,065 ± 0,018 2,037 ± 0,124
CLG 10 0,063 ± 0,003 0,078 ± 0,007 0,807 ± 0,109
F-11.4 LBC 35 0,566 ± 0,024 0,121 ± 0,000 4,695 ± 0,206
LBHC 25 0,250 ± 0,043 0,089 ± 0,010 2,811 ± 0,179
CLG 35 0,026 ± 0,000 0,086 ± 0,001 0,306 ± 0,001
5
PEMBAHASAN
Media optimum untuk produksi enzim
perlu dicari untuk mengetahui pertumbuhan
terbaik dari bakteri dan aktivitas enzim
tertinggi dalam suatu media. Apabila sel
tumbuh baik dalam suatu media berarti media
tersebut cocok untuk pertumbuhannya dan sel
bakteri akan menghasilkan enzim-enzim
ekstraseluler selama fase pertumbuhannya.
Keadaan lingkungan yang baik bagi sintesis
enzim biasanya juga baik bagi pertumbuhan
bakteri (Suhartono 1992).
Pertumbuhan bakteri B. licheniformis F-
11.1 dan F-11.4 lebih baik pada media LBC
dibandingkan dengan media lain yaitu, media
LBHC dan media CLG. Rendahnya
pertumbuhan kedua isolat B. licheniformis
pada media LBHC dan CLG dapat disebabkan
karena nutrisi yang minim di kedua media
tersebut. Media LBHC terdiri atas LB 50%
dan 5% kolagen, sementara media CLG hanya
terdiri atas 5% kolagen. Suhartono (1989)
menyatakan bahwa mikrob memerlukan
nutrien dengan komposisi tertentu untuk
tumbuh dan membelah diri. Luria Bertani
(LB) yang terkandung pada media LBC dan
LBHC terdiri atas ekstrak khamir, tripton, dan
NaCl. Penambahan atau pengurangan ekstrak
khamir dalam medium dapat mempengaruhi
kualitas nutrisi medium karena ekstrak khamir
mengandung vitamin B dan substansi lain
yang menunjang pertumbuhan seperti nitrogen
organik dan senyawa karbon. Tripton
merupakan sumber utama nitrogen organik
(Pelczar & Chan 2007).
Bacillus licheniformis F-11.4 yang
ditumbuhkan di media CLG mengalami fase
lag dari jam ke-0 hingga jam ke-40. Hal
tersebut karena komposisi media produksi
berbeda dengan media inokulum sehingga
bakteri melakukan adaptasi untuk
menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungan
yang baru. Pada fase adaptasi ini belum terjadi
pembelahan sel karena beberapa enzim belum
disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin
tetap, namun kadang-kadang menurun.
Jumlah awal sel yang semakin tinggi akan
mempercepat fase adaptasi (Fardiaz 1992).
Kedua isolat B. licheniformis pada media
LBC dan LBHC tidak mengalami fase
adaptasi karena bakteri ditumbuhkan dalam
media dan lingkungan yang sama dengan
media inokulum. Selain jenis media, faktor
pH, suhu, aerasi, dan ketersediaan oksigen
juga mempengaruhi pertumbuhan bakteri
(Suhartono 1992).
Berdasarkan hubungan antara kurva
pertumbuhan dengan aktivitas spesifik
kolagenase, diketahui bahwa produksi
kolagenase B. licheniformis F-11.1 maksimum
dicapai pada media LBC dan LBHC. Produksi
kolagenase tertinggi di media LBC terjadi saat
fase stasioner pada jam ke-15 yaitu sebesar
2,057 U/mg. Isolat F-11.1 di media LBHC
mencapai produksi kolagenase tertinggi ketika
fase eksponensial pada jam ke-10 yaitu
sebesar 2,037 U/mg. Sementara, di media
CLG isolat F-11.1 mencapai produksi
kolagenase tertinggi saat sel berada dalam
fase eksponensial pada 10 jam inkubasi. B.
licheniformis F-11.1 di tiga media produksi
memiliki waktu optimum produksi kolagenase
yang hampir sama dengan Achromobacter
iophagus di medium pepton yaitu pada 10-12
jam inkubasi. Aktivitas kolagenase tertinggi
Achromobacter iophagus juga dicapai pada
fase stasioner sebesar 0,156 U/ml (Reid et al.
1978). Nilai aktivitas tersebut lebih kecil bila
dibandingkan dengan aktivitas kolagenase B.
licheniformis F-11.1 di media LBC dan
LBHC.
Produksi kolagenase Bacillus
licheniformis F-11.4 maksimum dicapai pada
media LBC. Aktivitas spesifik tertingginya
terjadi pada jam ke-35 saat fase stasioner yaitu
sebesar 4,695 U/mg. Umumnya enzim
dihasilkan dalam jumlah sedikit selama fase
pertumbuhan, tetapi terakumulasi dalam
jumlah besar selama fase stasioner (Brock &
Madigan 1991). Isolat F-11.4 yang tumbuh di
media LBHC, produksi kolagenase tertinggi
dicapai saat fase stasioner pada jam ke-25.
Isolat F-11.4 di media LBHC memiliki waktu
produksi optimum kolagenase yang sama
dengan Klebsiella pneumoniae CNL3 yaitu
pada 25 jam inkubasi (Suphatharaprateep et
al. 2011). Sementara isolat F-11.4 di media
CLG mencapai produksi kolagenase
maksimumnya saat fase adaptasi pada jam ke-
35. Produksi kolagenase maksimum saat fase
adaptasi diduga karena masih banyak dan
aktifnya enzim-enzim yang berasal dari
inokulum dan dari sel-sel bakteri yang
tumbuh. Kolagenase yang dihasilkan Bacillus
licheniformis F-11.4 di tiga media produksi
lebih kecil bila dibandingkan kolagenase dari
Klebsiella pneumoniae CNL3 dan Bacillus
cereus CNA1. Penelitian Suphatharaprateep et
al (2011) menghasilkan aktivitas kolagenase
sebesar 11 U/ml untuk Klebsiella pneumoniae
CNL3 dan sebesar 24 U/ml untuk Bacillus
cereus CNA1.
Produksi kolagenase kedua isolat B.
licheniformis pada tiga media produksi
6
mengalami penurunan setelah waktu optimum
tercapai. Hal tersebut karena substrat enzim
telah berkurang. Selain itu, tingginya
kandungan asam amino dalam media dapat
berperan sebagai represor sintesis enzim atau
terjadinya penguraian oleh enzim itu sendiri
(autolisis) karena tidak ada lagi protein yang
dapat digunakan sebagai substrat (Suhartono
1989).
Laju produksi enzim dapat dipengaruhi
oleh umur inokulum karena menyebabkan
lamanya fase lag. Fase lag terjadi karena
penumpukan bahan-bahan toksik dan
habisnya nutrien esensial di dalam sel selama
pertumbuhan sebelumnya (Hadiutomo 1988).
Kondisi tersebut dapat menghambat laju
produksi enzim. Hal ini dapat dihindarkan
dengan menggunakan inokulum yang berada
pada fase eksponensial.
Bakteri umumnya mensintesis protease
ekstraseluler untuk menghidrolisis substrat
protein (polipeptida) di lingkungannya
menjadi molekul yang lebih kecil (peptida
atau asam amino) sehingga dapat diserap oleh
sel. Penambahan kolagen 5% ke dalam media
produksi berfungsi untuk menginduksi sel
bakteri dalam mensintesis kolagenase.
Beberapa enzim ada yang bersifat inducible
enzyme (enzim yang terinduksikan). Enzim
jenis ini dihasilkan oleh sel sebagai tanggapan
terhadap adanya substrat (Pelczar & Chan
2007).
Produksi kolagenase kedua isolat B.
licheniformis yang ditumbuhkan di media
LBC dan LBHC lebih tinggi dibandingkan di
media CLG. Hal tersebut karena adanya
perbedaan faktor nutrisi. Tingginya aktivitas
spesifik kolagenase di media LBC dan LBHC
karena nutrisi yang terkandung di media
tersebut lebih besar dibandingkan pada media
CLG. Media Luria Bertani (LB) merupakan
salah satu media yang dapat meningkatkan
produksi protease. Hal ini didukung oleh
penelitian Joo et al. (2002) yang
menumbuhkan Bacillus horikoshii pada media
LB dan menghasilkan aktivitas protease
sebesar 29,8 U/ml pada jam ke-18 saat fase
eksponensial. Banerjee & Bhattacharya dalam
Anwar & Saleemuddin (1998) menyatakan
bahwa penambahan nitrogen organik pada
media tumbuh dapat meningkatkan produksi
protease. Pepton dan tripton sebagai sumber
nitrogen organik juga digunakan sebagai
induser untuk meningkatkan produksi
kolagenase dari Vibrio alginolyticus (Reid et
al. 1980).
SIMPULAN
Media LBC (Luria Bertani + 5% kolagen)
merupakan media optimum untuk
pertumbuhan sel Bacillus licheniformis F-11.1
dan F-11.4. B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4
menghasilkan kolagenase pada ketiga media
produksi yaitu, LBC, LBHC, dan CLG.
Produksi kolagenase isolat F-11.1 maksimum
dicapai pada media LBC dan LBHC, yaitu
masing-masing sebesar 2,057 U/mg dan 2,037
U/mg. Produksi kolagenase isolat F-11.4
maksimum dicapai pada media LBC dengan
aktivitas spesifik sebesar 4,695 U/mg.
Produksi kolagenase kedua isolat B.
licheniformis di media CLG lebih rendah
dibandingkan pada media LBC dan LBHC.
Media LBC dan LBHC merupakan media
terbaik untuk produksi kolagenase dari isolat
B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk
menentukan kondisi optimum pertumbuhan
Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 serta
produksi kolagenase pada berbagai pH, suhu,
dan kecepatan agitasi.
DAFTAR PUSTAKA
Anwar A, Saleemuddin M. 1998. Alkaline
proteases: A review. Bioresources Technol
64: 175-183.
Baehaki A, Suhartono MT, Sukarno, Syah D,
Sitanggang AB, Setyahadi S, Meinhardt F.
2012. Purification and characterization of
collagenase from Bacillus licheniformis
F11.4. Afr J Microbiol Res 6(10): 2373-
2379.
Bama P, Vijayalakshimi M, Jayasimman R,
Kalaichelvan PT, Deccaraman M,
Sankaranarayanan S. 2010. Extraction of
collagen from cat fish (Tachysurus maculatus)
by pepsin digestion and preparation and
characterization of collagen chitosan
sheet. Int J Pharm Pharm Sci 2(4): 133-
137.
Bond MD, Wart HE. 1984. Purification and
separation of individual collagenases of
Clostridium histolyticum using red dye
ligand chromatography. Biochem 23:
3077-3085.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Anal Biochem 72:
248-254.
7
Brock TD, Madigan MT. 1991. Biology of
Microorganisms. Ed ke-6. New Jersey:
Prentice Hall.
Chung L, Dinakarpandian D, Yoshida N,
Fields JL, Fields GB, Visse R, Nagase H.
2004. Collagenase unwinds triple helical
collagen proir to peptide bond hydrolysis.
J EMBO 23: 3020-3030.
Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1.
Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Hadiutomo RS. 1988. Metode-metode Untuk
Bakteriologi. Bogor: Pusat Antar
Universitas Bioteknologi, Institut
Pertanian Bogor.
Hoffmann K, Daum G, Koster M, Kulicke
WM. 2010. Genetic improvement of
Bacillus licheniformis strains for efficient
deproteinization of shrimp shells and
production of high molecular mass chitin
and chitosan. Appl Environ Microbiol
76(24): 8211-8221.
Hultmann L, Rustad T. 2004. Iced storage of
Atlantic salmon (Salmo salar) – effects on
endogenous enzymes and their impact on
muscle proteins and texture. Food Chem
87: 31-41.
Joo HS, Kumar CG, Park GC, Kim KT, Paik
SR, Chang CS. 2002. Optimization of the
production of an extracellular alkaline
protease from Bacillus horikoshii. Process
Biochem 38: 155-159.
Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. 2002.
Purification and characterization of
collagenase from the tissue of filefish,
Novoden modestrus. J Biochem Mol Biol
35(2): 165-171.
Kumaila R. 2008. Ekstraksi, karakterisasi, dan
aplikasi enzim kolagenase dan organ
dalam ikan tuna (Thunnus sp.) [skripsi].
Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Lehninger. 1993. Dasar-dasar Biokimia 1.
Suhartono MT, penerjemah. Jakarta:
Erlangga. Terjemahan dari: Principles of
Biochemistry.
Moore S, Stein WH. 1954. A modified
ninhydrin reagent for the photometric
determination of amino acids and related
compounds. J Biol Chem 211: 907-913.
Nagai T, Izumi M, Ishii M. 2004. Fish scale
collagen. Preparation and partial
characterization. Int J Food Sci Technol
39: 239-244.
Nagano H, To KA. 1999. Purification of
collagenase and specificity of its related
enzyme from Bacillus subtilis FS-2. Biosci
Biotechnol Biochem 63(7): 181-183.
Pelczar MJ, Chan ECS. 2007. Dasar-Dasar
Mikrobiologi 1. Hadioetomo RS, Imas T,
Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah.
Jakarta: UI Press. Terjemahan dari:
Elements of Microbiology.
Petrova D, Derekova A, Vlahov S. 2006.
Purification and properties of individual
collagenases from Streptomyces sp. strain
3B. Folia microbiol 51(2): 93-98.
Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS,
Deshpande VV. 1998. Molecular and
biotechnological aspects of microbial
proteases. Microbiol Mol Biol Rev 62(3):
597-635.
Reid GC, Woods DR, Robb FT. 1978.
Regulation of extracellular collagenase
production in Achromobacter iophagus. J
Gen Microbiol 109: 149-154.
. 1980. Peptone induction and
rifampin-insensitive collagenase
production by Vibrio alginolyticus. J
Bacteriol 142(2): 447-454.
Riley KN, Herman IM. 2005. Collagenase
promotes the cellular responses to injury
and wound healing in vivo. J Burns
Wound 4:112-124.
Shahidi F, Han XQ, Synowiecki J. 1995.
Production and characteristics of protein
hydrolysates from capelin (Mallotus
villosus). Food Chem 53: 285-293.
Sternlicht MD, Werb Z. 2001. How matrix
metalloproteinases regulate cell behavior.
Annu Rev Cell Dev Biol 17: 463–516.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan
Bioteknologi. Bogor: Depdikbud, DIKTI,
Pusat Antar Universitas Bioteknologi,
Institut Pertanian Bogor.
Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor:
Depdikbud, DIKTI, Pusat Antar
Universitas Bioteknologi, Institut
Pertanian Bogor.
Suphatharaprateep W, Cheirsilp B,
Jongjareonrak A. 2011. Production and
properties of two collagenases from
bacteria and their application for collagen
extraction. New Biotechnol 28(6): 649-
655.
Tran LH, Nagano H. 2002. Isolation and
characteristics of Bacillus subtilis CN2
and its collagenase production. J Food Sci
67: 1184-1187.
Waldeck J, Daum G, Bisping B, Meinhardt F.
2006. Isolation and molecular
characterization of chitinase-deficient
Bacillus licheniformis strains capable of
deproteinization of shrimp shell waste to
obtain highly viscous chitin. Appl Environ
Microbiol 72(12): 7879–7885.
8
Yuniarti T. 2010. Purifikasi dan karakterisasi
kolagenase dari organ dalam ikan bandeng
(Chanos chanos, Forskal) [tesis]. Bogor:
Program Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Yunoki S, Suzuki T, Takai M. 2003.
Stabilization of low denaturation
temperature collagen from fish by physical
cross-linking methods. J Biosci Bioeng
96(6): 575-577.
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Metode pengukuran aktivitas kolagenase menurut Moore & Stein (1954)
Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml) Standar (ml)
Substrat kolagen 5% (b/v) 5,00 5,00 5,00
Bufer fosfat 50mM pH 9 1,00 1,00 1,00
Akuades 0,10 - -
L-leusin standar 5mM - - 0,10
Enzim - 0,10 -
Diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit
TCA 50% 0,20 0,20 0,20
Diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, lalu disentrifugasi pada 5000 rpm selama 20 menit
Filtrat 0,20 0,20 0,20
Ninhidrin 0,1% 1,00 1,00 1,00
Diinkubasi pada suhu 1000C selama 20 menit
1-propanol 50% 5,00 5,00 5,00
Diukur dengan spektrofotometer pada λ=570 nm
Aktivitas enzim dihitung menurut rumus:
UA=
x P x
Keterangan: UA = Jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk leusin per
menit (U/ml)
A = Absorbansi
P = Faktor pengenceran
T = Waktu inkubasi (menit)
11
Lampiran 2 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976)
Komposisi pereaksi Bradford (Bradford 1976) lima kali terdiri atas:
Coomasie brilliant blue G-250 0,025 g
Etanol 95% 12,5 ml
Asam ortofosfat 25 ml
Akuades 250 ml
Sebelum digunakan untuk mengukur kadar protein, pereaksi diencerkan dengan akuades
(perbandingan 1:4) dan larutan stok BSA (bovin serum albumin) yang digunakan adalah dengan
konsentrasi akhir 1 mg/ml.
Kurva standar BSA dibuat dengan menambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam 0,1 ml
larutan BSA dengan konsentrasi 0,00 mg/ml – 0,50 mg/ml. Selanjutnya campuran tersebut
diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang
595 nm. Sedangkan blanko dibuat dengan mencampurkan 0,1 ml akuades dengan pereaksi
Bradford, kemudian dikocok dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.
Sampel yang akan diukur kadar proteinnya diperlakukan sama. Sebanyak 5 ml pereaksi
Bradford ditambahkan ke dalam 0,1 ml sampel dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.
Selanjutnya absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm.
12
Lampiran 3 Kurva standar protein Bradford
y = 0.759x + 0.288
R² = 0.988
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
OD
59
5 n
m
Konsentrasi standar (mg/ml)
Top Related