Download - Cover Laporan Praktikum Asf1

Transcript
Page 1: Cover Laporan Praktikum Asf1

TUGAS

BIOTEKNOLOGI

DISUSUN OLEH

Anggota 1 NANDA SURYANING ROHMA 122210101032

2 YASMIN 122210101034

3 MIA RISWANI 122210101042

4 GALUH SINOARSIH 122210101050

Dosen Evi Umayah Ulfa SSi MSi Apt

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2014

SOAL

1 Sebutkan macam-macam vektor

2 Gambarkan 1 macam contoh vektor dan beri penjelasannya

3 Bagaimana cara memasukkan vektor dan DNA sisipan yang sudah bersatu kedalam inang

4 Bagaimana cara seleksi

5 Bagaimana cara deteksi

JAWABAN

1 Vektor adalah Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA

Persyaratan suatu vektor yaitu

Replikasi autonom dalam inang

Berpenanda untuk seleksi

Berposisi kloning tunggal

Berberat molekul kecil

Memiliki beberapa kopi pada setiap sel

Tidak berkonjugasi

Contoh dari vektor yaitu

a PLASMID

Plasmid adalah dna ekstrakromosomal berbentuk sirkular tertutup berpita ganda

Karakteristik plasmid yaitu

Replikasi (autonom)

Ekstra kromosom

Stabil

Ukuran 1-300 kb

Jenis-jenis plasmid yaitu

o F-plasmid F adalah singkatan dari fertility Plasmid ini mengandung perangkat gen-

gen tra (fertilitasrarrkonjugasi)

o R-plasmid R adalah singkatan dari resistance (resistensirarrantibiotika)

o Col-plasmid adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi

senyawa bakteriosin (ColE1 dari Ecoli)

o Degradative plasmid plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak

umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)

o Virulence plasmid adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid Tumour

inducing plasmide)

b FAGE

Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri tersusun atas molekul

DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus)

- Fage λ

Bentuk kepala dan ekor

Siklus hidup (1) lisis (2) lisogeni

Ukuran genom 49 kb utas ganda

Kedua ujung situs cosrarr(1) sirkuler (2) situs pemotongan

- Fage M13

Bentuk batangfilamen

Ukuran genom 6407 kb linier

Perbanyakan tanpa lisis sel inang

c COSMID

Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen

Cos Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa

bereplikasi didalam E coli Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan

Hohn (1978)

Karakteristik cosmid yaitu

Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal

Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur

bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri

Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA

dengan ukuran 37 sampai 57 kb

Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb

d YAC (Yeast Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari khamir

- Butuh kloning dengan kapasitas besar

Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi

(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A memiliki ukuran 190 kb

sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola

segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb

- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)

- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu

Dikembangkan dari plasmid pBR322

Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3

Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)

Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast

e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari bakteri

- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F

- Mengandung

oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel

inang

parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas

insersi

- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)

- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar

- Konstruksi pustaka genom

2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan

plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan

terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki

kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini

sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin

pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T

Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert

dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)

Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran

tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan

memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih

mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung

tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy

Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303

DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat

digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan

bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri

Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri

plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa

informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi

dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain

plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of

replication) (Nicholl 1994)

Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA

dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens

Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)

Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal

ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya

promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah

promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya

sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti

pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen

gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter

untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp

Citovsky 2002)

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu

Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu

gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama

ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu

Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan

sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 2: Cover Laporan Praktikum Asf1

SOAL

1 Sebutkan macam-macam vektor

2 Gambarkan 1 macam contoh vektor dan beri penjelasannya

3 Bagaimana cara memasukkan vektor dan DNA sisipan yang sudah bersatu kedalam inang

4 Bagaimana cara seleksi

5 Bagaimana cara deteksi

JAWABAN

1 Vektor adalah Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA

Persyaratan suatu vektor yaitu

Replikasi autonom dalam inang

Berpenanda untuk seleksi

Berposisi kloning tunggal

Berberat molekul kecil

Memiliki beberapa kopi pada setiap sel

Tidak berkonjugasi

Contoh dari vektor yaitu

a PLASMID

Plasmid adalah dna ekstrakromosomal berbentuk sirkular tertutup berpita ganda

Karakteristik plasmid yaitu

Replikasi (autonom)

Ekstra kromosom

Stabil

Ukuran 1-300 kb

Jenis-jenis plasmid yaitu

o F-plasmid F adalah singkatan dari fertility Plasmid ini mengandung perangkat gen-

gen tra (fertilitasrarrkonjugasi)

o R-plasmid R adalah singkatan dari resistance (resistensirarrantibiotika)

o Col-plasmid adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi

senyawa bakteriosin (ColE1 dari Ecoli)

o Degradative plasmid plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak

umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)

o Virulence plasmid adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid Tumour

inducing plasmide)

b FAGE

Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri tersusun atas molekul

DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus)

- Fage λ

Bentuk kepala dan ekor

Siklus hidup (1) lisis (2) lisogeni

Ukuran genom 49 kb utas ganda

Kedua ujung situs cosrarr(1) sirkuler (2) situs pemotongan

- Fage M13

Bentuk batangfilamen

Ukuran genom 6407 kb linier

Perbanyakan tanpa lisis sel inang

c COSMID

Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen

Cos Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa

bereplikasi didalam E coli Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan

Hohn (1978)

Karakteristik cosmid yaitu

Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal

Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur

bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri

Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA

dengan ukuran 37 sampai 57 kb

Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb

d YAC (Yeast Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari khamir

- Butuh kloning dengan kapasitas besar

Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi

(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A memiliki ukuran 190 kb

sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola

segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb

- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)

- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu

Dikembangkan dari plasmid pBR322

Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3

Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)

Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast

e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari bakteri

- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F

- Mengandung

oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel

inang

parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas

insersi

- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)

- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar

- Konstruksi pustaka genom

2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan

plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan

terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki

kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini

sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin

pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T

Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert

dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)

Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran

tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan

memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih

mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung

tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy

Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303

DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat

digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan

bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri

Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri

plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa

informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi

dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain

plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of

replication) (Nicholl 1994)

Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA

dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens

Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)

Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal

ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya

promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah

promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya

sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti

pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen

gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter

untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp

Citovsky 2002)

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu

Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu

gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama

ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu

Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan

sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 3: Cover Laporan Praktikum Asf1

o Degradative plasmid plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak

umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)

o Virulence plasmid adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid Tumour

inducing plasmide)

b FAGE

Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri tersusun atas molekul

DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus)

- Fage λ

Bentuk kepala dan ekor

Siklus hidup (1) lisis (2) lisogeni

Ukuran genom 49 kb utas ganda

Kedua ujung situs cosrarr(1) sirkuler (2) situs pemotongan

- Fage M13

Bentuk batangfilamen

Ukuran genom 6407 kb linier

Perbanyakan tanpa lisis sel inang

c COSMID

Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen

Cos Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa

bereplikasi didalam E coli Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan

Hohn (1978)

Karakteristik cosmid yaitu

Sekuen cos berasal dari phage λ yang merupakan sekuen berpita tunggal

Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur

bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri

Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA

dengan ukuran 37 sampai 57 kb

Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb

d YAC (Yeast Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari khamir

- Butuh kloning dengan kapasitas besar

Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi

(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A memiliki ukuran 190 kb

sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola

segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb

- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)

- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu

Dikembangkan dari plasmid pBR322

Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3

Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)

Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast

e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari bakteri

- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F

- Mengandung

oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel

inang

parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas

insersi

- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)

- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar

- Konstruksi pustaka genom

2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan

plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan

terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki

kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini

sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin

pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T

Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert

dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)

Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran

tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan

memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih

mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung

tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy

Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303

DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat

digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan

bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri

Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri

plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa

informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi

dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain

plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of

replication) (Nicholl 1994)

Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA

dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens

Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)

Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal

ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya

promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah

promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya

sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti

pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen

gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter

untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp

Citovsky 2002)

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu

Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu

gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama

ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu

Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan

sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 4: Cover Laporan Praktikum Asf1

sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola

segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb

- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)

- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu

Dikembangkan dari plasmid pBR322

Memiliki komponen gen yeast SUP4 7RP1 HIS3 dan URA3

Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)

Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast

e BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

- Kromosom buatan dari bakteri

- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F

- Mengandung

oriS repE ndash F replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel

inang

parA and parB pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas

insersi

- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)

- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar

- Konstruksi pustaka genom

2 Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan

plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan

terhadap ampisilin (Amp) Plasmid ini mengandung multy cloning site Karena memiliki

kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang) plasmid ini

sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin

pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu Plasmid pGEM-T

Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert

dalam suatu inang (Kendrew amp Lawrence 1994)

Selain itu pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp Ukuran

tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan

memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar Vektor berukuran kecil lebih

mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung

tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al 1991)

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy

Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303

DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat

digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan

bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri

Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri

plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa

informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi

dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain

plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of

replication) (Nicholl 1994)

Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA

dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens

Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)

Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal

ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya

promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah

promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya

sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti

pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen

gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter

untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp

Citovsky 2002)

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu

Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu

gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama

ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu

Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan

sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 5: Cover Laporan Praktikum Asf1

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy

Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303

DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat

digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan

bereplikasi sendiri di dalam sel DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri

Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap Ciri-ciri

plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen membawa

informasi genetik terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi

dengan DNA kromosom dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri Ciri lain

plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of

replication) (Nicholl 1994)

Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA

dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens

Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus)

Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid Hal

ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya

promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah

promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya

sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti

pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen

gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter

untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp

Citovsky 2002)

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu

Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu

gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama

ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu

Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan

sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 6: Cover Laporan Praktikum Asf1

ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid Tersedianya

promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik

monokotil maupun dikotil Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah

promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya

sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti

pollen (Tzfira amp Citovsky 2002) Selain itu pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA Gen

gusA (1049109-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter

untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira amp

Citovsky 2002)

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3 Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu

Transformasi ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu

gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks Proses ini pertama

ditemukan Frederick Griffith tahun 1982 Contoh Streptococcus pnemoniaeu

Haemophillus Bacillus Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan

sifatnya ke bakteri lain Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 7: Cover Laporan Praktikum Asf1

Transduksi pemindahan materi genetik dengan perantara virus Virus dapat

menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag Ketika

terbentuk virus baru di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang

diinfeksinya Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel

transduksi (transducing particle) Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg

Konjugasi merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke

bakteri lain melalui suatu kontak langsung Artinya terjadi transfer DNA dari sel

bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut Kemampuan sel donor

memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )

4 Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu

metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi Metode ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi

berdasarkan warna Untuk proses seleksi ini digunakan enzim β-galaktosidase β-

galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ Gen ini diatur

ekspresinya oleh operon lac Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang

dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ

Mekanisme

Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri

dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional

enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang

dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat

pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya

ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada

pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk

sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-

putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen

lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase

tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 8: Cover Laporan Praktikum Asf1

X- GALrarr biru

X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih

5 Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain

Elektroforesis gel (analisis migrasi analisis restriksi PCR) dan penentuan urutan DNA

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan

mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe) yang pembuatannya

dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan

melalui cara hibridisasi koloni Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane

nilon di lisis agar isi selnya keluar dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga

tinggal tersisa DNAnya saja Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di

dalam larutan pelacak Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak

dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate) Dengan demikian kita

bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih
Page 9: Cover Laporan Praktikum Asf1

REFERENSI

Gupta PK 2008 Molecular Biology and Genetic Engineering New Delhi Rastogi

Nicholl DST 1994 An Introduction to Genetic Engineering New York Cambridge

University Press

Kendrew SJ Lawrence E 1994 The Encyclopedia of Molecular Biology Cambridge

Blackwell Science

Sambbrook J Russell DW 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Ed ke-3 New

York Cold Spring Harbor Laboratory

Tzfira T Citovsky V 2002 Partners-ininfection host proteins involved in the transformation

of plant cells by Agrobacterium Trends in Cell Biology 12 121ndash130

  • Mekanisme
  • Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim β-galaktosidase yaitu enzim yang terdiri dari 2 subunit yaitu peptida α dan peptida ω Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional enzim ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah substrat laktosa atau X-gal Gen penyandi peptida ω biasanya terdapat pada kromosom sedangkan gen penyandi peptida α terdapat pada plasmid Bila hanya ada peptida ω yang diekspresikan oleh gen pada kromosom maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida α maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim β-galaktosidase yang terbentuk sempurna Oleh karena itu komplementasi α dapat membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau transformasi Pada MCS terdapat gen lacZ mengkode galaktosidase DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih
  • X- GALrarr biru
  • X ndashGAL rarr tidak diuraikan putih