1.1 PENDAHULUAN
Produk biologi sangat penting untuk banyak aplikasi termasuk biotransformasi, diagnostik,
penelitian dan pengembangan, dan dalam makanan, farmasi, dan industri kosmetik. Untuk
aplikasi tertentu, produk biologi dapat digunakan sebagai ekstrak kasar dengan pemurnian
sedikit atau tidak ada. Namun, biasanya biopharmaceuticals membutuhkan kemurnian yang
tinggi, membuat pengolahan hilir merupakan komponen penting dari proses keseluruhan. Dari
sudut pandang peraturan, proses produksi sendiri mendefinisikan produk biofarmasi definisi
render yang tepat yang efektif dan pengolahan hilir efisien langkah awal penting dalam proses
pembangunan. Saat ini, protein adalah biopharmaceuticals paling penting. Sejarah
perkembangan mereka sebagai produk industri akan kembali lebih dari setengah abad. Darah
fraksinasi plasma adalah skala pertama biofarmasi industri dengan produksi tahunan saat ini di
100 - skala ton [1, 2]. Pengendapan dengan pelarut organik telah dan terus menjadi alat
pemurnian utama dalam plasma fraksinasi, meskipun, baru-baru ini, proses pemisahan
kromatografi juga telah telah diintegrasikan ke dalam industri ini. Anti - racun dan anti antibodi
lainnya – racun diambil dari sumber hewani adalah contoh tambahan biopharmaceuticals awal,
juga dimurnikan dengan kombinasi presipitasi, filtrasi dan kromatografi. Sebaliknya, saat ini
hampir seluruh biopharmaceuticals secara eksklusif diproduksi oleh teknologi rekombinan
DNA. Kromatografi dan filtrasi membran yang berfungsi sebagai alat utama untuk pemurnian
dalam produk ini.
Gambar 1.1 menunjukkan bahwa pada tahun 2006 terdapat berbagai biopharmaceuticals.
Sekitar satu - ketiga adalah antibodi atau fragmen antibodi [3], hampir 20% adalah
erythropoietins, dan 14% adalah insulin. Sisanya adalah enzim, faktor pertumbuhan dan sitokin
[3]. Meskipun banyak non - protein biomolekul seperti plasmid, virus atau polisakarida yang
kompleks saat ini sedang dikembangkan, ada kemungkinan bahwa protein akan terus
mendominasi sebagai biopharmaceuticals. Protein ditoleransi dengan baik, dapat menjadi
sangat kuat, dan sering dimiliki setengah kehidupan yang panjang setelah administrasi,
membuat mereka menjadi yang efektif. Beberapa sifat ini juga membuat protein yang
berpotensi berguna dalam kosmetik, meskipun aplikasi di bidang ini yang rumit dalam sebagian
oleh AS dan kerangka hukum Eropa yang tidak memungkinkan penggunaan senyawa
farmakologis aktif dalam kosmetik. Saat ini hanya sedikit protein yang digunakan di daerah ini.
Yang paling menonjol adalah toksin botulinum, Botox ®, digunakan untuk perawatan kulit [4].
1
Ini dan yang sejenis senyawa yang secara eksklusif dikelola oleh dokter dan dengan demikian
tidak dianggap sebagai kosmetik.
Gambar 1.1 Biopharmaceuticals pada tahun 2006. Sekitar 160 protein terapi telah
mendapatkan persetujuan di Amerika Serikat dan Uni Eropa. Data dari La Merie Business
Intelligence (www.lamerie.com).
1.2 Bioproduk dan kontaminasinya
Bab ini memberikan gambaran tentang kimia dan sifat biofisik protein dan kontaminan
utamanya seperti DNA dan endotoksin. Penjelasan rinci tentang kimia protein dan DNA berada
di luar cakupan ini .
1.2.1 Biomolekul: kimia dan strukturnya
1.2.1.1 Protein
Protein merupakan biopolimer amfoter kelas besar dengan massa molekul mulai dari 5
sampai 20 000 kDa, yang didasarkan pada asam amino sebagai blok-blok bangunan. Ada variasi
besar dalam struktur dan sifat dalam kelas ini. Insulin, misalnya, peptida dengan massa molekul
5808 Da, memiliki struktur yang relatif sederhana dan jelas. Di sisi lain, glikoprotein multimerik
besar dengan massa molekul 20000 kDa, memiliki struktur yang sangat kompleks yang terdiri
dari hingga 80 subunit, yang masing-masing 250 kDa massa. Kebanyakan protein memiliki
massa molekul yang baik, biasanya antara 15 dan 200 kDa. Protein umumnya adalah molekul
2
yang lebih kompak, namun cukup fleksibel untuk mengalami perubahan konformasi substansial
dalam lingkungan yang berbeda, di interfase, setelah mengikat substrat atau setelah adsorpsi
pada permukaan.
Protein adalah molekul-molekul yang sangat terstruktur dan struktur nya umumnya
berkaitan dengan fungsi biologisnya. Struktur ini dibagi menjadi empat tingkatan yang berbeda:
primer, sekunder, tersier, dan kuarterner. Struktur primer ditentukan oleh urutan asam amino,
struktur sekunder oleh lipatan rantai polipeptida dan struktur tersier didefinisikan oleh
gabungan beberapa domain struktur sekunder. Yang terakhir, struktur kuaterner didefinisikan
oleh gabungan beberapa rantai polipeptida yang terlipat. Hasil akhir adalah supra struktur tiga
– dimensi yang kompleks yang dihubungkan oleh berbagai interaksi intra- dan antarmolekul.
Seringkali unsur non - asam amino dimasukkan ke dalam protein.
Struktur Primer: Blok-blok bangunan protein adalah asam amino. Selama biosintesis,
mengikuti transkripsi dan translasi, molekul-molekul ini dihubungkan bersama-sama melalui
ikatan peptida untuk membentuk rantai polipeptida dalam urutan yang unik yang ditentukan
oleh kode genetik. Struktur umum asam amino dan pembentukan ikatan peptida ditunjukkan
pada Gambar 1.2.
Urutan asam amino yang diatur dalam rantai polipeptida disebut protein 'primer
struktur’. Perhatikan bahwa meskipun asam amino merupakan molekul kiral dengan L - dan D -
isomer, hanya L-isomer yang ditemukan dalam protein alami. 20 asam amino alami ditemukan
dalam protein tercantum dalam Tabel 1.1 . Pada protein yang khas, rata-rata massa molekul
komponen asam amino adalah 109 Da. Dengan demikian, perkiraan massa molekul protein
dapat dengan mudah diperkirakan dari jumlah asam amino dalam rantai polipeptida
Ikatan peptida terbentuk ketika asam amino yang dihubungkan bersama-sama memiliki
karakter ikatan ganda parsial. Struktur ini membatasi rotasi dalam rantai peptida yang
mungkin membuat rotasi bebas hanya dalam dua dari tiga obligasi. Sebagai akibatnya, struktur
unik yang terbentuk tergantung pada urutan tertentu dari asam amino. Konformasi tertentu
3
tidak diperbolehkan karena rotasi terbatas, sementara yang lain secara aktif diperkenankan
karena untuk pembentukan ikatan hidrogen dan interaksi intramolekul lainnya. Rantai
samping asam amino dapat bermuatan, polar, atau hidrofobik (lihat Tabel 1.1), sehingga
menentukan sifat biofisik protein.
4
Kelompok-kelompok bermuatan adalah asam dan basa mempunyai kekuatan atau
pKa yang berbeda-beda.Dengan demikian, kelompok-kelompok ini akan menentukan muatan
protein rantai samping hidrofobik, di sisi lain,juga menentukan karakter hidrofobik struktur
utama, yang memainkan peran penting dalam menentukan pola lipat dari rantai polipeptida.
Asam amino sistein dan prolin memainkan peran tertentu. Molekul sistein bebas dapat
menjalani reaksi oksidasi untuk membentuk ikatan disulfi atau jembatan yang menghasilkan
sistin seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.3.
5
Ketika sistein membentuk bagian dari sebuah rantai polipeptida, jembatan ini bisa sebaga
intramolekul (dalam rantai polipeptida yang sama) atau antarmolekul untuk menghubungkan
rantai polipeptida yang berbeda. Di satu sisi, jembatan ini berkontribusi pada stabilisasi
struktur protein dan jembatan lainnya dapat membantu untuk membentuk formasi struktur
protein multimeric ikatan secara kovalen.
Pembentukan jembatan disulfida umumnya reversibel. Ikatan -ikatan yang terbentuk pada
keadaan oksidasi bisa dirusak dengan kondisi reduksi sehingga terjadi destabilisasi struktur
lipatan protein dan pembentukan asosiasi pengganggu. Sifat ini digunakan, misalnya,dalam
metode analisis pemisahan resolusi tinggi seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS (SDS -
PAGE) yang sering dilakukan di bawah kondisi reduksi.
Prolin juga memainkan peran khusus dalam struktur protein yang terdefinisi. Prolin adalah
suatu asam imino siklik dan bisa dalam bentuk cis dan trans. Pada gilirannya, bentuk-bentuk
ini menularkan konformasi dari rantai polipeptida. Dalam penyelesaiannya, bentuk isomerik
ini berada dalam kesetimbangan. Namun, dalam polipeptida, yang interkonversi dari bentuk
isomerik ini sering lambat dan dapat menjadi langkah yang membatasi tingkat pembentukan
struktur protein terlipat.
Struktur Sekunder
Rantai polipeptida ditemukan dalam protein tidak untuk membentuk knot atau cincin dan
bukan merupakan β bercabang. Namun, rantai ini dapat membentuk α heliks,lembar-lembar β
, dan loop-loop yang mendefinisikan struktur sekunder protein.
α - heliks terdiri dari susunan spiral rantai polipeptida yang terdiri dari 3,6 residu asam
amino per giliran. Helix distabilkan oleh ikatan hidrogen intramolekul dan hidrofobik,
amphipathic atau hidrofilik, tergantung pada urutan tertentu asam amino dalam struktur
primer. Contoh heliks tersebut diberikan pada Gambar 1.4.
6
Dalam setiap kasus karakter α - helix dapat diprediksi dengan menempatkan
masing-masing residu asam amino dalam sebuah spiral pada interval 100 derajat sehingga
akan ada 3,6 residu per giliran. Seperti yang terlihat pada Gambar 1.4, untuk sintase sitrat,
residu hidrofobik dominan dan terdistribusi secara merata sehingga -helixα tersebut akan
menjadi hidrofobik. Dalam kasus terakhir, troponin C, residu yang bermuatan tidak hanya
dominan tetapi juga merata sehingga dihasilkan helix yang akan menjadi hidrofilik.
Sehingga, pada residu alkohol hidrofobik dehidrogenase bermuatan didistribusikan secara
tidak merata yang menghasilkan helix amphipathic yang salah satu sisinya hidrofilik dan
hidrofobik di sisi lain.
Lembar β adalah elemen struktur sekunder yang sangat stabil yang juga terjadi
sebagai akibat dari ikatan hidrogen. Meskipun satu ikatan hidrogen membentuk suatu
energi bebas dari ikatan ( Δ G) hanya sekitar 1 kJ mol-1, sejumlah besar dari ikatan tersebut
di lembar β membuat nya sangat stabil. Lembaran β memiliki struktur planar, yang bisa
paralel, anti - paralel, atau campuran tergantung pada keselarasan arah dari rantai
polipeptida yang membentuk struktur. Pembentukan lembaran β sering diamati selama
proses agregasi protein yang ireversibel. Karena adanya kekuatan antarmolekul yang kuat
dalam struktur ini, agen pendenaturasi yang kuat diperlukan untuk mengganggu hasil
agregat. Urea, pemutus ikatan hidrogen yang kuat, dapat digunakan untuk tujuan ini.
Namun, konsentrasi urea yang tinggi dibutuhkan untuk mengganggu ikatan hidrogen yang
akan mengakibatkan destabilisasi lengkap dan berlangsung pada seluruh
struktur protein.Protein amiloid dan serat mengandung sejumlah besar lembar β- yang
menjelaskan sebagian sifat-sifat kelas protein agregasi .
7
Loops adalah bagian protein yang sangat flexibel dan sering terhubung elemen
struktrur sekunder lain dengan satu sama lain. Sebagai contoh, loop sering menghubungkan
bagian dari rantai polipeptida yang membentuk anti - daerah paralel lembaran atauβ
membentuk hubungan antara berbagai α heliks dan domain lembar β. Beberapa. Loops
juga memainkan peran penting dalam fusi artifisial protein yang berbeda seperti dalam
kasus antibodi rantai tunggal. Antibodi artifisial ini dihubungkan dengan loop yang
mengkontribusi secara signifikan untuk stabilitas protein.
Jumlah relatif dari elemen struktur sekunder yang ada dalam sebuah kaleng protein
dapat diukur dengan metode spektroskopi antara lain circular dichroism (CD) dan
spektroskopi infra merah. Pada panjang gelombang tertentu perbedaan antara
absorbansi kiri sirkuler terpolarisasi (AL) dan absorbansi kanan sirkuler terpolarisasi (AR)
cahaya adalah :
AΔ = Al- Ar
Scan panjang gelombang yang digunakan untuk menampilkan isi dari struktur sekunder
dari protein dan merupakan ukuran penting dari integritas. Hal ini sering digunakan untuk
konfirmasi struktur asli protein (Gambar 1.6).
(ATR FT - IR) spektroskopi juga digunakan untuk mempelajari perubahan konformasi 3D -
struktur protein dalam situ. Perubahan pada elemen struktur sekunder dapat dinilai
8
dengan ATR FT – IR bahkan dalam suspensi dan larutan keruh. amida I di wilayah spektral
1600-1700 cm - 1 digunakan untuk mengevaluasi perubahan struktural .
Struktur tersier
Struktur tersier dibentuk ketika elemen-elemen dari struktur sekunder (helix,
lembar-lembar dan loop) dilipat bersama-sama dalam 3 tatanan dimensional. Interaksi
hidrofobik dan jembatan disulfida bertanggung jawab secara dasar dalam stabilisasi
struktur tersier yang digunakan sebagai petunjuk oleh kumpulan amfipatik (helix ke ikatan
4helix ). Pada struktur ini residu hidrofobik terikat secara sukar pada inti, terlindung dari
pengepungan lingkungan cair, ketika bagian polar dan residu tetap yang bermuatan
terlindung pada permukaannya.
Struktur kuartener
Struktur kuartener ditetapkan ketika 2 atau lebih rantai polipeptida diasosiasikan
dalam bentuk superstruktur, yang , pada banyak kasus, sangat perlu sekali untuk fungsi
biologi. Salah satu contoh yang diketahui adalah hemoglobin, yang terdiri dari 4 unit
polipeptida bersama-sama diikat oleh ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Pada kasus
ini, fleksibilitas struktur kuartener pada respon untuk mengikat oksigen adalah sangat
kritis untuk mengambil dan melepaskan oksigen pada paru-paru dan lingkungan
pembuluh darah kapiler. Atibodi adalah contoh lain protein dengan struktur kuartener.
Molekul2 ini terdiri dari 4 rantai polipeptida (2 ringan dan 2 berat) terikat secara
bersama-sama oleh jembatan disulfida. Struktur yang dihasilkan biasanya sangat stabil,
memungkinkan antibodi untuk beredar secara bebas didalam plasma.
Struktur protein diklasifikasikan dalam beberapa hirarki. Protein diklasifikasikan
dalam beberapa kelas dan melekuk sehingga diketahui keasliannya dan pola
perkembangannya bisa diidentifikasi. Bagaimanapun juga , akan dicatat bahwa meskipun
protein termasuk dalam kelas yang sama dapat berkelakuan secara berbeda behkan sejak
subtitusi asam amino yang menghasilkan variasi sifat bifisik. Tabel 1.2 menunjukkan kelas
kelas protein:
9
10
Dengan demikian, kromatografi dapat digunakan sebagai alat untuk memisahkan isoform
yang sesuai. Glikosilasi adalah penambahan molekul karbohidrat, baik gula sederhana atau
oligosakarida kompleks, ke molekul protein.Glikosilasi menjadikan protein lebih hidrofilik dan
dengan demikian lebih mudah larut. Selain itu, karena karbohidrat terminal dari olssigosakarida
tersebut biasanya asam neuraminic (umumnya dikenal sebagai asam sialat) dengan pH 3, glikosilasi
juga mempengaruhi muatan bersih dan titik isoelektrikprotein. Akibatnya, pemisahan kromatografi
berdasarkan muatan yang berbeda dari glycovariants adalah mungkin.
Sebagai contoh, Gambar 1.10 menunjukkan isoelectric focusing (IEF) pemisahan gel
erythropoietin manusia rekombinan (rhEPO - saat ini penjualan terbesar kedua di industri
biofarmasi). Seperti dapat dilihat dalam gambar, bahan awal berisi beberapa varian dengan titik
isoelektrik antara 3,5 dan 5,5. Loading start materi pada kolom penukar anion dan eluting dengan
peningkatan konsentrasi garam menghasilkanfraksi terelusi yang telah secarasubstansial
mengurangi heterogenitas. Kemudian fraksi eluting mengandung varian lebih asam dengan nilai
isoelektrik rendah Varian ini lebih bermuatan negatif dan mengelusi hanya pada garam konsentrasi
tinggi dari penukar anion bermuatan positif. rhEPO tinggiglikosilasi dan glyco variants yang
memiliki bioaktivitas berbeda. Dengan demikian, kontrol pola glikosilasi pola dan, dalam beberapa
kasus, pemisahan varian tertentu yang tidak diinginkan diperlukan untuk menjaga kualitas produk
yang konsisten.
11
Deamidasi juga dapat memiliki efek dramatis baik pada bioaktivitas dan perilaku
kromatografi. Deamidasi melibatkan transformasi kimia dari asparagin dan glutamin, yang
bermuatan asam amino polar, menjadi asam aspartat dan asam glutamat masing-masing, baik yang
bermuatan negatif pada pH di atas4. Residu deamidasi asparagine lebih sering diamati dari pada
glutamin, namun proses ini sangat tergantung pada lokasi residu tersebut dalam struktur protein.
Residu permukaan cenderung paling terpengaruh, sementara yang terbenam dalam inti protein
biasanya lebih terlindungi. Deamidasi umumnya difasilitasi oleh nilai pH yang lebih tinggi dan suhu
yang lebih tinggi dan terjadi melalui mekanisme yang di ilustrasikan pada Gambar 1.11. Dalam
proses ini, gugus amino dipecah dari asparagin membentuk L - siklik imida intermediate.
Intermediate (produk antara) umumnya tidak stabil dan selanjutnya diubah menjadi peptida L-
Aspartyl dan L - iso - Aspartyl. Keduanya memasukkan muatan negatif dan menurunkan titik
isoelektrik dariprotein. Perlu dicatat bahwa amida L-siklik juga dapat mengalami racemization
membentuk amida D - siklik, yang kemudian diubah menjadi peptida D - Aspartyldan D -isoaspartyl.
Hasil akhirnya adalah pengenalan D - asam amino keprotein. Penghapusan varian terdeamidasi
merupakan tugas penting karena varian inidapat memiliki bioaktivitas berbeda dan
penghapusannya adalah tantangan bagi proses hilir. Pemisahan dengan kromatografi penukar ion
adalah mungkin, tetapisering terjadi kesulitan karena perbedaan muatan bersih antara bentuk asli
dan terdeamidasi kecil, menghasilkan selektivitas yang rendah.
12
1.2.1.2. Oligonukleotida dan polynucleotides
Oligonukleotida dan polinukleotida, keduanya dapat merupakan kontaminan atau mungkin
merupakan produk. Misalnya, dalam produksi DNA plasmid untuk aplikasi terapigen, DNA
genom adalah kontaminan. Sebaliknya, dalam produksiobat-obatanprotein, baik genomik dan
DNA plasmid adalah kontaminan.
Polynucleotides hadir dalam sel baik sebagai asam deoksiribonukleat (DNA) atau
sebagai ribonukleat acid (RNA). DNA atau RNA mengkodekan informasi genetik. Pada
manusia,hewan atau tumbuhan DNA adalah materi genetik, sedangkan RNA ditranskripsi
dari itu.Dalam beberapa organisme lain seperti virus RNA, RNA merupakan bahan genetik
dan, dalam mode terbalik, DNA ditranskripsi dari itu. Molekul nukleotida terdiri dari gugus
fosfat,kelompokgula, dan kelompok nukleosida nitrogen. Nukleotida lebihhidrofilik dan
bermuatan negatif karena ada gugus asam fosfat. Pada DNA, nukleotida disusun atas heliks
beruntai ganda yang terbentuk oleh ikatan hidrogen yang lemah antara pasangan nukleotida.
13
Molekulmenyerupai 'tangga' memutar, di mana sisi dibentuk oleh gugus gula dan fosfat,
sedangkan 'anaktangga' dibentuk oleh basis nukleosida yang tergabung dalamikatan
hidrogen.
Ada empat nukleotida dalam DNA, masing-masing berisi basis nukleosida yang
berbeda:adenin (A), guanin (G), sitosin (C), atau timin (T). Pasangan basa terbentuk secara
alamihanya antara A dan T dan antara C dan G sehingga urutan dasar masing-masinguntai
tunggal DNA secara sederhana dapat disimpulkan dari untai mitranya.
RNA mirip dengan DNA dalam struktur, tetapi mengandung ribosa bukan deoksiribosa.Ada
beberapa kelas molekul RNA termasuk messenger RNA, transferRNA dan RNA ribosom.
Mereka memainkan peran penting dalam sintesis protein dan kegiatan sel lainnya. miRNAs
adalah regulator global ekspresi gen. miRNAs adalah non-coding double-stranded.Molekul
RNA terdiri dari 19 sampai 22 nukleotida yang mengatur ekspresi gen di tingkat post-
transkripsi yang membentuk struktur untai tunggal dan menunjukkan antisense yang saling
melengkapi yang awalnya diidentifikasi pada nematoda Caenorhabditiselegans.
DNA dan RNA secara kimiawi merupakan molekul sangat stabil kecuali enzim DNAse atau.
Kehadiran enzimdengan cepat akan terdegradasi. Polynucleotida juga sangat sensitif
terhadap pergeseran mekanik.Setelah lisis sel, DNA dan RNA dilepaskan ke dalam
supernatandan dengan dramatis mengubah viskositas kaldu fermentasi sebagai akibat dari
ukuran dan struktur filament.
DNA genomik ada dalam inti organisme eukariotik selalu dikaitkan dengan protein yang
sangat dasar yang dikenal sebagai histon. Plasmid DNA hadir dalam sitoplasma organisme
prokariotik dan bukan histon tapi adadalam bentuk fisik yang berbeda yaknisuperkoil,
circular, linier, dan agregatseperti yang diilustrasikan pada Gambar 1.12.
14
Bentuk-bentuk ini berbeda dalam ukuran memberikan dasar untuk pemisahan
dengan gel elektroforesis atau dengan kromatografi eksklusi ukuran. Polynucleotida
bermuatan negatif atasberbagai pH karena berkenaan dengan gugus fosfat. Dengan
demikian, mereka sangatterikat oleh permukaan bermuatan positif. Akibatnya, aplikasi
proses hilir dapat diterapkan secara nyaman dan efisien dilakukan dengan resin penukar
anionatau dengan membran bermuatan positif.
1.2.1.3.Endotoksin
Endotoksin, juga dikenal sebagai pirogen, merupakan komponen dari dinding sel
bakteri Gram negatif yang terus dikeluarkan oleh bakteri dan di mana-mana dalam
Bioproces.Endotoksin sangat beracun ketika memasuki aliran darahdan manusia adalah
salah satu organisme yang paling sensitive terhadap endotoksin. Dengan demikian
penghilangan total darisuatu produk jadi diperlukan. Seperti ditunjukkan dalamGambar
1.13, endotoksinlipopolisakarida yang terdiri dari sebagian lipid A , inti wilayah, dan
antigen O atau S.Sebagian lipid A adalah komponen yang paling dilestarikan dan ditemukan
di semuaendotoksin. Ini juga merupakan bagian dari molekul yang bertanggung jawab
untuk toksisitas.Antigen O atauS sangat bervariasi dan strain spesifik. Ukuran dan struktur
juga tergantung pada kondisi pertumbuhan.
15
Endotoksin menargetkan sel-selimun responsifseperti makrofag, monosit, sel
endotel, neutrofil dan granulosit. Mereka menginduksi ekspresidari interleukin, tumor
necrosis factor, koloni - stimulating factor, dan leukotrien dan oksigen radikal dalam sel.
Sebagai konsekuensi dari adanya endotoksin dalamaliran darah, pasien mengalami
peradangan jaringan dan demam, penurunantekanandarah, shock, palpitasi, penurunan
permeabilitas pembuluh darah, komplikasi pernapasan, dan bahkan kematian. Gejala yang
sama terjadi dengan infeksi bakteri yang parah, sehingga disebut syok septik. Toksisitas
Hati yang parah dan gangguan hematologi telah diamati terjadi pada manusia dalam respon
sedikitnya 8 ng endotoksin per kg berat badan. Sebaliknya, endotoksin jauh kurang beracun
bagi banyakhewan. Sebagai contoh, LD 50 sebanyak 200 - 400 mg / hewan pada tikus.
Untukparenteral biopharmaceuticals tingkat ambang batas untuk aplikasi intravena5
endotoksin Unit s (EU) per kg berat badan per jam. Uni Eropa mendefinisikan aktivitas
biologi endotoksin dengan 1 UE sesuai dengan 100 pg dari EC-5 standar endotoksin atau
120 pg dari endotoksin berasal dari strain E. coli O111: B4. Deteksi endotoksin sulit dan
dilakukan dengan menggunakan bioassay. Di masa lalu kelinci telah digunakan untuk tujuan
ini. Kali ini penggunaan tes telah digantikan oleh uji yang disebut Limulusamoebocyte lisat
(LAL), yang menggunakan Hemolimf dari kepiting tapal kuda. LAL menggumpal beberapa
menit dengan adanya sejumlah endotoksin (lihat Gambar 1.14) membentuk suatu dasar
untuk tes dengan batas deteksi endotoksin serendah dari 10 pg per ml. Pedoman umum
dijelaskan di USP di Bab 79 pada compounding and sterile preparations (CSP).
Tabel1.4 memberikan ringkasan berbagai solusi dari tipe endotoksin. Endotoksin hadir
dalam konsentrasi yang besar dalam protein yang berasal dari fermentasi bakteri, tetapi
juga dapat hadir sebagai agen adventif dalam banyak sistem lain.
16
Dalam produksi industri farmasi untuk penggunaan parenteral, perawatan khusus
digunakan untuk mencegah kontaminasi endotoksin. Misalnya, endotoksin–bebas air
digunakan dalam penyusunan media kultur dan buffer kromatografi, diresirkulasi pada
suhu tinggi untuk menghindari pertumbuhan bakteri dan akibatnya pembentukan
endotoksin. Meskipun endotoksin stabil terhadap panas, mereka hancur pada pH basa. Jadi,
membersihkan peralatan pengolahan, tank, membran, dan media kromatografi dengan
larutan natrium hidroksida umumnya diperlukan untuk menjamin penghilangan lengkap
dari kontaminan ini.
1.2.2. Biomolekul: physiochemical Properti
1.2.2.1 Absorbansi UV
Konsentrasi proteindalam larutan sering diukur dengan absorbansi Uv terutama karena
penyerapan oleh tirosin asam amino aromatik, triptofan, dan fenil alanin dan jembatan disulfida.
Absorbansi panjang gelombang maksimum dan koefisien ekstingsi untuk komponen ini
dirangkum dalam Tabel 1.5.
17
Karena absorbansi kuat triptofan, absorbansi maksimum untuk protein biasanya sekitar
280 nm dan panjang gelombang ini paling sering digunakan untuk penentuan kuantitatif.
Menurut hukum Lambert-Beer, absorbansi dari larutan protein pada panjang gelombang
tertentu berhubungan linier dengan konsentrasi molar dari analit, c, persamaannya sebagai
berikut:
A=
A= εmlc
di mana Io adalah intensitas cahaya sebelum melewati sampel, I adalah intensitas cahaya
setelah melewati sampel, εmadalah koefisien ekstingsi dan l adalah panjang atau jarak cahaya
18
yang melewati sampel. Validitas Persamaan diatas umumnya relatif terbatas untuk larutan
protein yang encer dan jalan cahayanya pendek, dimana A kurang dari 2. Pada nilai yang lebih
tinggi, rasio yang ditransmisikan dan cahaya yang melewati sampel menjadi terlalu kecil untuk
penetapan suatu determinasi. Dengan demikian, penentuan kuantitatif penentuan konsentrasi
larutan protein membutuhkan dilusi atau cahaya yang sangat pendek.Seperti terlihat pada Tabel
1.6, absorbansi spesifik dari protein yang khas bervariasi dengan adanya asam amino aromatic
Trp dan Try dan, jembatan disulfida. Karena isi protein relatif bervariasi, teka dempiris
diperlukan untuk penentuan kuantitatif yang tepat.
Untuk alternative, koefisien molar dapat diperkirakan dengan akurasi relatif sebagai
kombinasi linear dari residu Trp dan Tyr jembatan disulfida menurut persamaan berikut:
dimana nTrp, nTyr, dan nSS adalah jumlah residu Trp Tyr dan ikatan disulfida
Perlu dicatat bahwa asam nukleat memiliki absorbansi maksimum pada 260 nm
dan dapat mengganggu secara substansial penentuan protein pada 280 nm. Dengan demikian,
ketikaasam nukleat hadir simultan dalam larutan, koreksi harus dilakukan dalammenentukan
konsentrasi protein dariabsorbansi pada 280 nm.Kelompok protein peptida menyerap cahaya
dalam kisaran UV jauh (180-230 nm)dan nilai-nilai absorbansi yang sangat tinggi diamati di
daerah ini bahkan untuk kondisi yang sangat encer. Akibatnya, deteksi dalam analitis
kromatografi sering dilakukan pada 218 nm, dimana absorbansinya sekitar 100 kali lebih
besar.Protein dengan chromophores tambahan menyerap di UV dekat atau terlihat di daerah
sinar tampak. Contoh umum adalah protein yang mengandung besi
sepertihemoglobin,mioglobin dan transferrin yang berwarna merah, atau Cu - Zn superoxide
dismutase yang hijau.
Asam nukleat menunjukkan absorbansi yang kuat di daerah 240-275 nm daerah transisi -π
*dari π cincin nukleosida pirimidin dan purin. Polimer DNA danRNA menyerap pada daerah
yang luas pada maksimum dekat 260 nm. Massa spesifik koefisien ekstingsiDNA adalah 20
(mg ml-1cm-1). Kemurnian DNA diperkirakan oleh rasio absorbansi pada 260 dan 280 nm.
Kemurnian DNA untai ganda dan RNA rasio E260/E280 adalah antara 1,8 dan 2,0. Pengukuran lebih
dapat diandalkan pada pH basa. Berbeda dengan protein, absorbansi asam nukleat cukup
sensitif terhadap pH, dan menurun pada pH rendah.
19
1.2.2.2 Ukuran
larutan dan suspensi ditemukan dalam produk bioteknologi proses hilir mengandung
molekul dan partikel dengan berbagai ukuran seperti digambarkan pada Tabel 1.7. Protein
globular berada di kisaran 3 - 10 nm, sedangkan asam nukleat bisa jauh lebih besar. Plasmid
terapetik berada di kisaran 100 nm. Virus dan partikel seperti virus berada di kisaran 50 nm
sampai 400 nm, sedangkan sel berada di jangkauan mikrometer.
Sementara sel-sel dan puing-puing sel mudah dipisahkan dengan sentrifugasi karena
memiliki kecepatan sedimentasi tinggi (Tabel 1.7), protein dan asam nukleat memerlukan
metode lebih canggih seperti kromatografi dan filtrasi membran. Pemisahan protein dengan
ultra sentrifugasi hanya dilakukan untuk tujuan analisis karena tingkat rotasi yang diperlukan
sangat tinggi (setinggi 50 000 rpm).Ukuran diberikan dalam Tabel 1.7 untuk protein globular
terlipat. Struktur protein cukup padat (kepadatan massa ~ 1,4 g cm-3), bentuknya bulat atau
mirip elips. Namun, protein menyimpang dari bentuk-bentuk kompak seperti yang telah
didenaturasi, fibrosa, batang, atau disk. Dalam kasus ini, ukuran dari protein dan
makromolekul lainnya sering digambarkan oleh parameter lain termasuk jari-jari rotasi, rg,
jari-jari hidrodinamik, rh, jari-jari dibentuk dengan memutar protein sekitar pusat
geometrisnya, rr, dan jari-jari, setara dengan bola dengan massa yang sama dan kepadatan
sebagai molekul yang sebenarnya, rm.
20
Jari-jari rotasi dapat diukur dengan hamburan cahaya statis. Hal ini seringdilakukan dengan
size kromatografi eksklusi (SEC) sehingga memungkinkan pencampuran protein yang akan
dianalisa. Ada suatu hubungan umum antara radius rotasi dan jumlah cahaya yang tersebar,
yang berbanding lurus dengan produk dari berat- massa molar rata-rata dan konsentrasi
protein.
Sebuah alternatif, biasanya metode yang digunakan untuk penentuan ukuran protein adalah
size exclusion chromatography (SEC). Ukuran molekul yang berbeda tidak semua menembus
pori-pori media SEC pada tingkat yang sama sehingga mengarah ke berbagai retensi dalam
kolom. Kolom SEC dapat dikalibrasi dengan standar protein yang diketahui massa molekulnya
yang memungkinkan ukuran protein yang tidak diketahui untuk dapat diperkirakan.
Metode lain untuk penentuan ukuran molekul protein adalah SDS - gel poliakrilamida
elektroforesis (SDS - PAGE) yang memberikan informasi tentangmassa molekul,
ultrasentrifugasi yang menyediakan informasi mengenai radius hidrodinamika, dan teknik
hamburan lain seperti small angle X–rayscattering (SAXS).
1.2.2.3. Muatan
Protein adalah molekul amfoter dengan muatan negatif dan positif, yang berasal dari rantai
samping asam amino asam dan basa (Tabel 1.1) dan dari ujung amino dan karboksil masing-
masing rantai polipeptida. Memiliki nilai pK masing-masing sekitar 8,0 dan 3,1. Modifikasi dari
rantai samping asam amino secara substansial dapat mengubah muatan protein. Contoh
penting adalah glikosilasi dengan asam sialat, misalnya, disitus N-glikosilasi dalam anti bodi
atau eritropoietin, dan deamidasiresi dua sparagin dan glutamin. Keduanya merupakan
modifikasi post-translasi membuat protein lebih asam dan dengan demikian lebih tinggi
muatan negatif. Dalam banyak kasus dapat mempengaruhi waktu paruh protein in-vivo,
sehingga kontrolini menjadi tujuan pentingdalam bioteknologi proses hilir.
1.2.2.4. Hidrofobitas
Hidrofobisitas protein di tentukan oleh rantai samping non-polar asam amino.
Meskipun istilah hidrofobisitas sering digunakan, tetapi definisinya sulit dan di
perdebatkan secara luas. Pengalihan senyawa apolar kedalam cairan polar seperti air yang
berhubungan dengan panas dan sebagai kuantifikasi bebas energy. Efek hidrofobik
meningkat saat efek entropis dominan. Efek hidrofobik meningkat dengan tegangan
permukaan air yang di sebabkan oleh Daya tarik antar molekul di dalam cairan yang di
21
sebabkan oleh berbagai kekuatan antar molekul. Efek hidrofobik demikian terutama
disebabkan oleh ikatan hidrogen yang kuat dalam air, sedangkan gaya van der Waals
umumnya memainkan peran kecil.
Hidrofobisitas protein secara teoritis dihitung dari transfer energi asam amino dari
pelarut apolar ke dalam air (lihat Gambar 1.20).
Gambar 1.20. Kalkulasi hidrofobisitas dari kalkulasi Cu-Zn seuperoxide dismutase manusia
menurut skala perbedaan hidrofobisitas : Hopp dan Wood [22] {kiri} dan Kyte dan Doolittle
[23] {kanan}.
Dalam rantai peptida - gugus amino dan gugus karboksil tidak ada karena gugus tersebutα
harus bereaksi untuk membentuk ikatan peptida. Dengan demikian energi bebas dari
transfer asam amino tidak benar-benar menggambarkan hidrofobisitas dari protein dan
sangat tergantung pada skala hidrofobik yang digunakan untuk menghitung hidrofobisitas
protein.
Distribusi dari residu hidrofobik surface-exposed dalam protein tidak homogen. Hal
ini digambarkan untuk lisozim pada Gambar 1.21.
22
Gambar 1.21. Distribusi dari kultur hidrofobik di permukan lysozyme (kiri) dan serum
albumin manusia (kanan) pada pH netral. Kuning dan biru bercahaya menunjukkan
hidrofobik dan hidrophilik bertambal, berturut.
Densitas dan distribusi dari residu permukaan protein adalah dasar untuk
hydrophobic interaction chromatography (HIC) di mana permukaan hidrofobik residu
berinteraksi dengan matriks hidrofobik ringan. Pada lipat yang salah dapat menyebabkan
variasi dalam jumlah dari permukaan residu hidrofobik terbuka, HIC dapat digunakan
sebagai alat untuk memisahkan protein asli dari isoform gagal melipat.
Pendekatan lain untuk mengukur hidrofobisitas protein adalah dengan mengukur
retensi dalam kolom kromatografi yang dikemas dengan media hidrofobik. Di kasus ini, jika
protein tidak terungkap, retensi ini terkait dengan jumlah sisi rantai asam amino hidrofobik
yang memempel pada permukaan [24]. Hidrofobisitas diperoleh dengan metode ini relatif
dan tergantung pada metodologi yang digunakan, sehingga hanya berguna untuk tujuan
peringkat
1.2.2.5. Solubilitas
Kelarutan sering menjadi pertimbangan penting dalam pengolahan hilir, karena
berbeda drastis dengan pH, kekuatan ionik, dan jenis garam. Memprediksi kelarutan dari
protein dalam media air dari strukturnya sangat sulit dan biasanya memerlukan
pengukuran empiris. Kelarutan protein bervariasi secara dramatis. Beberapa protein,
misalnya Cu - Zn superoxide dismutase, memiliki kelarutan setinggi 400 mgml–1 sementara
yang lain, misalnya interferon- rekombinan, yang larut pada konsentrasi kurang dari 10γ
mgml-1. Secara umum, kelarutan protein terendah pada titik isoelektrik, di mana muatan
bersih adalah nol, tetapi bervariasi dengan kekuatan ion, yang merupakan gambaran
sebagai berikut :
(1.16)
dimana Cj adalah konsentrasi ion j dan Zj muatannya. Kelarutan dari -lactoglobulin sebagaiβ
fungsi dari konsentrasi garam dan pH, yang dapat di lihat seperti contoh pada gambar 1.22.
23
Gambar. 1.22. Kelarutan dari β-lactoglobulin seperti fungsi pH paa empat konsentrasi yang
berbeda dari NaCl (sodium clorida).
Secara umum, garam pada konsentrasi rendah meningkatkan kelarutan protein,
yang prosesnya disebut sebagai 'salting in'. Sebaliknya, pada konsentrasi tinggi garam
mengurangi kelarutan protein, yang disebut sebagai 'salting out'. Besarnya efek ini sangat
tergantung pada jenis garam, seperti yang ditunjukkan dalam contoh Gambar 1.23
Gambar 1.23 Kelarutan carboxyhemoglobin dalam larutan encer dengan perbedaan
elektrolit pada 250C. S dan S0 yang di gunakan sebagai pengganti w atau w0.
Untuk carboxyhemoglobin. Kecendrungan kelarutan protein dapat dijelaskan dari
bentuk perpanjangan teori Debye –Hückel. Dapat di lihat dari persamaan:
24
(1.17)
dimana w adalah kelarutan protein dalam larutan yang sebenarnya, w 0 kelarutan dari
protein dalam air, z1 dan z2 nilai garam, dan Ks dan A adalah garam dan protein parameter
empiris spesifik. Pada kekuatan ion tinggi, Persamaan 1,17 tereduksi menjadi hubungan
log-linear sebagai berikut:
(1.18)
yang ditampilkan untuk berbagai protein pada Gambar 1.24.
Gambar 1.24 Kelarutan protein dalam larutan ammonium sulfat.
Pengaruh jenis garam pada kelarutan protein secara resmi dijelaskan yang pertama
oleh Hofmeister yang menjelaskan peringkat anion dan kation sesuai dengan kemampuan
mereka untuk mengendapkan protein, yang umumnya dikenal sebagai Hofmeister atau seri
lyotropic:
25
Interpretasi sempel sederhana dari seri ini adalah ion tertentu yang mengikat
bebas air menurun kemampuan protein untuk tetap dalam larutan. Menariknya garam
dalam seri Hofmeister juga berkorelasi dengan begitu so-called Jones-Doyle koefisien-B
koefisien dan hidrasi entropi sehingga tampaknya baik berhubungan dengan efek dari
garam pada struktur air.
Intinya, perlu dicatat bahwa dalam prakteknya, pemilihan garam untuk digunakan
dalam hilir pengolahan tidak hanya tergantung pada seri Hofmeister, tetapi juga pada
faktor-faktor seperti nilai ketersediaan, biokompatibilitas, dan nilai pembuangan.
1.2.2.6. Stabilitas
Dua jenis stabilitas perlu dipertimbangkan untuk protein: Stabilitas termodinamika
atau Konformasi dan stabilitas kinetik atau koloid. Stabilitas konformasi protein
digambarkan oleh energi bebas G dari keseimbangan antara alami dan lipatan membuka.Δ
Transisi lipatan alami dari N, ke dalam bentuk lipatan, U, digambarkan oleh reaksi kimia
berikut :
di mana k1 dan k-1 adalah konstanta laju. Keseimbangan yang sesuai konstanta K eq
= [U] / [N] biasanya sangat rendah dalam larutan air, karena protein folding umumnya
termodinamika disukai sebagai akibat dari konsentrasi hidrofobik residu dalam inti protein.
The G yang sesuai diberikan pada persamaan berikut:Δ
Perwakilan nilai yang diberikan dalam Tabel 1.8 bersama dengan pencairan yang
sesuai 'melting temperature', yang merupakan sebagai gambaran suhu di mana setengah
dari protein ini dalam keadaan tidak dilipat.
26
Kosmotropic (atau cosmotropic) garam dan poliol seperti sorbitol atau sukrosa
menstabilkan protein sementara chaotropic garam atau urea pada konsentrasi yang lebih
tinggi memiliki efek destabilisasi di protein konformasi.
Stabilitas kinetik, di sisi lain, dapat digambarkan sebagai berikut persamaan:
yang menunjukkan lebih lanjut langkah kinetically-driven dari keadaan tidak dilipat
kedaerah aggregat ireversibel. Protein dengan k2 tinggi menunjukkan stabilitas kinetik
rendah. Keseluruhan stabilitas demikian tergantung pada efek termodinamika dan kinetik.
mungkin, misalnya, untuk di tambahkan garam untuk mengurangi stabilitas kinetic,
sementara meningkatkan stabilitas secara keseluruhan sebagai akibat dari efek
termodinamika. Namun, efek ini sering susah untuk diprediksi, sehingga dalam prakteknya,
stabilitas keseluruhan dan shelf-life diukur secara empiris.
1.2.2.7. Viskositas
Banyak larutan dan suspensi yang di temui dalam Bioprocessing sangat kental. Hal
ini terutama berlaku untuk kaldu fermentasi yang mengandung DNA dan untuk konsentrasi
larutan protein tinggi. Secara umum, viskositas ( ), berkaitan dengan tegangan geser ( ),η τ
dan laju geser (ý) , Dengan persamaan sebagai berikut:
(1.22)
27
Untuk fluida Newtonian, adalah konstan dan hubungan antara tegangan geser dan lajuη
geser yang linear. Untuk non-fluida Newtonian, bagaimanapun, bervariasi dengan geserη
Tingkat dan hubungan yang non - linear. Misalnya, perilaku fluida pseudoplastik
digambarkan oleh persamaan berikut:
(1.23)
di mana K dan n adalah konsistensi dan flow indeks, masing-masing. Untuk sangat
terkonsentrasi larutan protein unuk banyak kultur supernatan, n lebih kecil dari satuan,
menunjukkan bahwa viskositas jelas, = ý, menurun dengan meningkatnya laju geser.η τ
Rentang suku geser untuk berbagai larutan dan suspense ditemui dalam Bioprocessing
ditunjukkan pada Tabel 1.9.
Viskositas Khas yang dihadapi dalam Bioprocessing ditunjukkan pada Tabel 1.10.
Pada umumnya, kultur sel supernatan memiliki viskositas rendah dari 10 MPa s, sedangkan
sel homogenat jauh lebih kental dengan - nilai hingga 40 mPa s. KOntribusi terbesarη
terhadap viskositas kaldu fermentasi mentah adalah DNA. Namun, Untungnya baik DNA
genomik dan plasmid sangat sensitif terhadap geser dan sering terdegradasi mekanis pada
awal proses hilir. Enzim DNAse, baik alami atau ditambahkan sengaja, juga membantu
untuk menurunkan molekul-molekul, sehingga mengurangi viskositas.
Viskositas intrinsik [ ] adalah ukuran dari kontribusi zat terlarut ke viskositas larutan danη
merupakan gambaran sebagai berikut:
(1.24)
28
dimana 0 adalah viskositas tanpa adanya zat terlarut dan c konsentrasi zat terlarut. Padaη
batas semi-encer, dapat digambarkan sebagai fungsi dari c oleh ekpresi polinomialη
berikut:
(1.25)
Pada konsentrasi protein yang sangat tinggi, namun, model semi-empiris yang
diperlukan. Sebagai contoh, Gambar 1,25 menunjukkan viskositas relatif ( / 0) IgGη η
larutan sebagai fungsi konsentrasi IgG. Untuk konsentrasi yang lebih rendah sekitar 100 ml
mg–1 data kira-kira sesuai dengan Persamaan 1.25. Namun, pada konsentrasi yang lebih
tinggi viskositas meningkat secara eksponensial.
Gambar 1.25 Viskositas dari larutan IgG manusia, sapi, dan babi seperti fungsi dari
konsentrasi IgC.
Tabel 1.11 daftar viskositas intrinsik dari perwakilan biomolekul. Sepertinya dapat
diduga dari data tersebut, viskositas intrinsik tergantung pada bentuk molekul. Misalnya,
bentuk batang protein memiliki viskositas intrinsik yang lebih tinggi daripada bentuk
globular.
29
Sebuah hubungan empiris antara [ ] dan massa molekul M r adalah ditunjukkan oleh Mark -η
Houwink persamaan:
(1.26)
di mana a adalah parameter yang terkait dengan 'kekakuan' dari rantai polimer. Secara
teoritis, a = 2 untuk batang kaku, 1 untuk gulungan, dan 0 untuk bola keras. Secara empiris,
bagaimanapun, nilai a, = 0,6 0,7, dan 0,5 telah ditemukan untuk BSA, ovalbumin, dan
lisozim, masing-masing. Literature data (misalnya [33]) menunjukkan hubungan umum
antara viskositas intrinsik dan jumlah residu asam amino, yang dapat dinyatakan sebagai
berikut dengan [ ] dalam mlgη -1:
(1.27)
Dengan demikian, protein yang lebih besar dan agregat protein memiliki viskositas protein
tinggi yang lebih kecil dan bentuk monomer.
30
1.2.2.8. Difusivitas
Koefisien molekul difusi atau difusivitas dalam larutan, D0 adalah fungsi dari
ukuran zat terlarut, dalam larutan viskositas dan suhu. Seperti sebelumnya mencatat
persamaan Stokes-Einstein menggambarkan hubungan ini sebagai:
(1.28)
di mana kb adalah konstanta Boltzmann dan rh adalah radius hidrodinamika zat terlarut.
Diffusivities ditemui dalam rentang Bioprocessing luas dari 1 × 10 – 5 cm2s-1 untuk garam
dan molekul kecil lainnya 1 × 10-9 cm2s-1 untuk biomolekul besar seperti DNA. Protein
diffusivities dalam larutan encer umumnya dalam kisaran 10-6 sampai 10-7 cm2s-1.
Tabel 1.12 menyediakan ringkasan diffusivities khas dalam larutan encer pada suhu
kamar. Secara umum, diffusivities protein 10 - 100 kali lebih rendah daripada molekul kecil.
Plasmid memiliki nilai lebih kecil dengan faktor sebanyak 1000.
Gambar 1.26 menggambarkan efek dari massa molekul pada difusivitas pada
larutan encer berair pada suhu kamar. Tyn dan Gusek telah mengikuti korelasi untuk
protein globular:
(1.29)
di mana D adalah 0 dalam cm2s- 1, di mPa s, T di K, dan M r di Da, yang memiliki akurasiη
dari ± 10%.
31
Gambar 1.26 difusi protein globular dalam larutan encer cair pada temperature ruangan.
Beberapa pendekatan yang tersedia untuk penentuan eksperimental difusivitas
contohnya, oleh Cussler [35]. Umumnya digunakan pendekatan untuk protein termasuk
hamburan cahaya dinamis (lihat Bagian 1.1.2.2), sel difusi, Taylor berbasis dispersi, dan
microinterferometry.
1.3 Bioproses
Dalam bab ini kita akan membahas sistem ekspresi yang umum digunakan dan struktur
umum dari proses hilir yang diperlukan untuk mencapai kemurnian produk yang diinginkan.
Penekanan khusus dalam hal ini adalah pada produksi protein rekombinan melalui fermentasi dan
kultur sel, yang memainkan peran utama dalam industri bioteknologi.
1.3.1 Sistem Ekspresi
Banyak sistem ekspresi yang berbeda telah dikembangkan dalam protein rekombinan,
mulai dari bakteri yang sangat sederhana sampai pada tanaman dan hewan. Namun, jumlah sel
inang yang digunakan dalam produksi industri biofarmasi protein sangat terbatas. Strain bakteri
yang paling populer adalah E. coli, BL21, yang digunakan untuk memproduksi protein dimana
aktivitas biologis dari strain bakteri ini tidak memerlukan modifikasi pasca translasi. Ekspresi
protein dalam E. coli dapat terjadi dalam tiga cara yang berbeda. Protein dapat disekresi ke dalam
periplasma yang merupakan ruang antara membran sel dan dinding sel; protein dapat
diekspresikan dalam sitoplasma sebagai protein terlarut; atau dapat terakumulasi dalam sel
sebagai badan inklusi. Masing-masing sistem efektif untuk protein tertentu. Sitoplasma E. coli
32
merupakan lingkungan reduksi yang kuat yang menghalangi pembentukan jembatan disulfida,
sedangkan periplasma menawarkan lingkungan oksidasi yang memungkinkan pembentukan
jembatan ini sehingga memudahkan folding protein. Beberapa protein yang beracun bagi sel-sel
atau yang memiliki waktu hidup pendek dalam sitoplasma atau periplasma telah berhasil
diproduksi sebagai badan inklusi. Dalam hal ini, protein membentuk agregat yang tidak dapat
diserang oleh enzim protease. Di sisi lain, meskipun tidak sepenuhnya terdenaturasi, protein yang
dinyatakan sebagai badan inklusi umumnya tidak dalam konformasi asli mereka. Dengan demikian,
prosedur refolding biasanya diperlukan untuk menghasilkan bentuk aktif sepenuhnya. Meskipun
refolding dapat memerlukan biaya yang besar, bila dapat tercapai keseimbangan dalam pendekatan
ini, biaya akan menjadi lebih ekonomis karena tingkat ekspresi dalam sistem tubuh inklusi yang
didapat melalui proses ini sangat tinggi dan prosedur untuk mencuci protein yang dihasilkan
sederhana dan dapat digunakan untuk menghilangkan sebagian besar protein sel inang sehingga
menghasilkan kemurnian yang relatif tinggi. Gambar 1.27 menunjukkan contoh sel E. coli yang
mengekspresikan protein sebagai badan inklusi dan hasil analisis SDS-PAGE pada berbagai tahap
proses.
33
Sel ragi Saccharomyces cerevisae dan Pichia pastoris telah berhasil digunakan untuk
mengekspresikan berbagai macam protein rekombinan termasuk insulin dan albumin.
Saccharomyces cerevisiae juga digunakan untuk produksi antigen permukaan hepatitis. Namun, sel-
sel mamalia lah yang dibutuhkan untuk menghasilkan sebagian besar protein biofarmasi. Meskipun
kultur sel mamalia umumnya lebih kompleks, sel-sel ini dapat membawa keluar hasil modifikasi
pasca translasi, seperti glikosilasi, yang penting untuk aktivitas biologis dan farmakologis yang
tepat. Hamster Ovarium Cina (CHO) sel adalah sistem ekspresi mamalia yang paling umum
digunakan, terutama untuk antibodi rekombinan. Sel manusia, PerC6, telah dikembangkan baru-
baru ini dan juga digunakan untuk produksi beberapa protein rekombinan. CHO dan PerC6 mampu
mengekspresikan antibodi dalam konsentrasi 15 mg ml-1. Titer produk yang dicapai tinggi, hal ini
terutama dikarenakan ekspresi protein dalam sistem ini umumnya independen dalam hal
pertumbuhan. Akibatnya, sel-sel dapat dipertahankan dalam bioreaktor untuk waktu yang lama
dalam keadaan produktif dan dapat dikembangbiakan untuk mencapai densitas yang sangat tinggi,
hingga 108 sel per ml.
Sel mamalia lainnya yang digunakan dalam produksi protein rekombinan adalah sel ginjal
bayi hamster (BHK), sel Vero, dan sel ginjal anjing Madin - Darbyn (MDCK). Beberapa faktor
koagulasi yang membutuhkan - carboxylation diproduksi di BHK. Sel Vero, berasal dari ginjalγ
monyet, dan sel-sel MDCK digunakan untuk produksi vaksin. Sel serangga seperti sel-sel dari
jaringan ovarium kepompong ulat Spodoptera frugiperda (Sf9), juga telah diusulkan untuk
mengekspresikan protein rekombinan. Sel-sel ini dapat terinfeksi virus serangga seperti virus
polihedral California Autograph nuklir yang juga dikenal sebagai baculovirus. Meskipun mudah
untuk menanganinya, sistem sel serangga belum berlisensi untuk dapat diproduksi pada industri
protein biofarmasi.
Pada masa lalu, hewan transgenik dianggap memiliki sistem produksi yang sangat baik
sejak protein dapat disekresikan kedalam susu dengan titer sampai 5 mg ml -1. Satu dekade yang
lalu, titer tidak dapat dicapai dengan kultur sel mamalia. Dengan demikian, pada saat itu sistem
ekspresi sering disukai. Kemajuan modern dalam kultur sel, bagaimanapun, telah memungkinkan
tercapainya titer yang lebih tinggi. Sistem transgenik membutuhkan prosedur yang sangat
membosankan dalam mengembangkan keturunan dengan karakteristik ekspresi yang tepat.
Pemurnian protein dari susu juga bisa jadi merepotkan, terutama ketika penghilangan kasein
melalui pengendapan acid-induced yang tidak kompatibel dengan produk protein. Selain itu,
sebagai 'sistem produksi terbuka', hewan transgenik mungkin rentan terhadap masalah keamanan
34
dan kontaminasi eksternal. Keuntungan dari budidaya sel mamalia dalam sistem bioreaktor
tertutup ditambah dengan titer lebih tinggi daripada yang dicapai dalam susu transgenik dan
penggunaan proses pengolahan hilir yang sederhana mungkin adalah alasan rasional mengapa
kultur sel umumnya disukai dalam industri biofarmasi.
Tanaman dan sel tumbuhan juga menjadi kandidat yang potensial untuk ekspresi protein.
Meski berbeda dengan sel mamalia, modifikasi pasca translasi juga memungkinkan dalam
organisme ini. Namun, ekspresi dalam daun, batang, atau biji menyajikan tantangan proses
penanganan dan pemurnian karena jaringan atau benih harus ditumbuk atau ditekan dan
diekstraksi yang nantinya akan menghasilkan campuran yang sangat kompleks. Sebuah sistem
ekspresi yang menarik adalah rhizo-secretion, dimana protein yang disekresi ke dalam cairan
budidaya dari akar berbulu. Sel tumbuhan, di sisi lain, menyajikan sedikit kesulitan dalam
pengolahan hilir karena sel-sel tumbuh dalam media yang sangat sederhana. Sistem lain yang
menarik adalah 'teknologi olesins'. Dalam kasus ini, lipid diakumulasikan dalam sel tanaman dalam
bentuk tetesan kecil. Protein, yang dikenal sebagai olesins ini dapat terkonsentrasi sebagai
monolayer pada permukaan tetesan ini. Setelah menggabungkan protein rekombinan ke olesins,
penanganan utama protein target dapat dicapai oleh proses yang relatif sederhana melalui panen
tetesan minyak.
1.3.2 Komposisi Sel Inang
Komposisi sel inang memiliki efek penting pada pengolahan hilir ketika produk merupakan
intrasel, karena dalam hal ini komponen seluler merupakan kotoran besar. Komponen sel inang
juga ditemukan secara luas sebagai pengotor dalam produk sekresi, karena lisis sel selalu terjadi
sampai batas tertentu selama proses fermentasi. Kenyataannya, dalam beberapa kasus, prosedur
budidaya yang menghasilkan titer tinggi, seperti yang digunakan untuk antibodi, merupakan hasil
produksi lisis sebagian dari sel yang pada gilirannya menyebabkan kontaminasi dari produk
dengan komponen sel inang. Sebuah gambaran karakteristik komposisi dan fisik dari sel inang
utama digambarkan pada tabel 1.13 dan 1.14.
35
Seperti yang dapat dilihat dari tabel ini, sel mamalia mengandung lebih banyak protein
tetapi sedikit asam nukleat daripada bakteri. Bakteri dan ragi juga mengandung banyak komponen
dinding sel. Komponen ini sering tidak larut dan secara efisien dapat dihilangkan selama langkah
proses awal. Langkah-langkah awal secara signifikan dipengaruhi oleh kepadatan sel dan viskositas
dari kaldu. Kepadatan sel yang sangat tinggi dapat diperoleh pada ragi, terutama pada P. pastoris,
dimana telah dilaporkan bahwa sel kepadatannya bisa sampai 400 g sel per liter. Suspensi tersebut
sangat sulit untuk diklarifikasi. Suspensi ini seringkali harus diencerkan dengan tujuan untuk
mensentrifus kaldu. Asam nukleat hadir dalam bentuk DNA dan berbagai bentuk RNA. Senyawa ini
yang bertanggung jawab terhadap viskositas kaldu yang tinggi tetapi cepat terdegradasi akibat
adanya gaya geser mekanis atau nuklease endogen.
36
Pertimbangan terakhir adalah stabilitas mekanik dari sel inang. Bakteri dan sel-sel ragi
umumnya secara mekanis sangat stabil dan tingkat geser diatas 106 s-1 diperlukan untuk
memecahkan sel-sel ini. Tingkat geser yang tinggi hanya dapat dicapai dengan menggunakan
peralatan khusus seperti high-pressure homogenizers atauFrench presses. Sebagai perbandingan, sel
mamalia jauh lebih lemah untuk memecahkan sel-sel. Kekuatan peledak yang mungkin diperlukan
untuk menghancurkan sel ragi adalah pada kisaran 90 N sedangkan kekuatan ledakan untuk selμ
mamalia berkisar 2 - 4 N.μ
1.3.3 Media Kultur
Biofarmasi modern biasanya diproduksi bersama media dimana komponennya secara
kimiawi terkarakterisasi. Di masa lampau, ragi, daging, dan ekstrak kedelai diproduksi melalui
degradasi proteolitik dan ekstraksi, yang biasa digunakan untuk budidaya bakteri dan sel-sel ragi.
Standarisasi bahan baku sangat sulit karena dapat menghasilkan variasi antar batch. Sampai saat
ini umumnya dilakukan penambahan media budidaya untuk sel mamalia dengan serum janin sapi,
dengan konsentrasi sampai dengan 10%. Selain menambahkan kompleksitas dan biaya, suplemen
tersebut dapat memperkenalkan agen adventif yang tidak diinginkan, seperti prion, yang secara
37
signifikan dapat meningkatkan proses pengolahan hilir. Walaupun pengujian untuk agen tersebut
masih mungkin diperlukan, namun penggunaan media dimaksudkan untuk menyederhanakan
pengolahan hilir.
Media untuk budidaya bakteri pada tingkat industri biasanya sangat sederhana dan
menyediakan sumber-sumber penting dari karbon, nitrogen dan fosfat. Contoh media terpapar
dalam Tabel 1.15.
Ketika pH fermentasi dikendalikan oleh penambahan NaOH, konduktivitas setinggi 40 cm
mS-1 dapat dicapai pada akhir periode budidaya. Konduktivitas yang tinggi tersebut dapat
mengganggu operasi pengolahan hilir seperti pertukaran ion, sehingga langkah-langkah seperti
pengenceran atau diafiltrasi diperlukan. Kesulitan ini dapat dihindari dengan menggunakan amonia
untuk mengontrol pH, yang biasanya menghasilkan konduktivitas yang lebih rendah dari
supernatan kultur.
Selain garam dan gula, yang diperlukan untuk metabolisme sel, produksi protein
rekombinan pada bakteri biasanya membutuhkan penambahan induser, seperti isopropil - - D -β
thiogalactopyranoside (IPTG), yang digunakan untuk mengaktifkan ekspresi protein saat kepadatan
sel tertentu tercapai. Penggunaan senyawa alam sebagai induser menguntungkan karena spesies
tersebut mudah terdegradasi dalam kultur dan kotoran tidak signifikan. Di sisi lain, deterjen atau
minyak ditambahkan ke kultur sebagai agen anti-foaming, meskipun hadir dalam jumlah yang
relatif kecil, dapat mempengaruhi proses hilir karena mereka cenderung dapat mengotori
membran dan matriks kromatografi.
38
Kultur media untuk ragi mirip dengan yang digunakan untuk E. coli. Metanol sering
digunakan sebagai inducer untuk sistem ekspresi berbasis promotor oksidase alkohol (AOX).
Kultur sel mamalia, di sisi lain, memerlukan medium jauh lebih kompleks termasuk glukosa sebagai
sumber karbon, asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, asam lemak, nukleotida, piruvat,
dan butirat. Medium basal ini dilengkapi dengan protein untuk transportasi oksigen, hormon, dan
faktor pertumbuhan. Protein transport oksigen seperti transferin mengandung zat besi dalam
bentuk terikat. Dalam rangka mendapatkan media bebas protein, protein ini sering diganti dengan
chelators besi seperti besi sitrat, asam iminodiaectic besi, amonium sitrat besi dan tropolone (2 -
hidroksi - 2,4,6 - cycloheptatrien - 1 - one). Namun, senyawa ini juga dapat mengganggu pengolahan
hilir. Ditambah lagi, dalam kondisi sedikit asam, sitrat besi dapat membentuk gel, yang sulit untuk
dipisahkan dari protein dan biomakromolekul lainnya.
Beberapa aditif lainnya yang mungkin ada dalam media kultur sel: pH indikator seperti
fenol red, ditambahkan ke media kultur skala laboratorium dalam bentuk terikat sebagai
pertukaran ion resin dan sebaiknya dihindari pemakaiannya untuk budidaya skala besar. Polimer,
seperti poli (propilen glikol) atau poli (etilen glikol), sering diperlukan dalam konsentrasi sampai
0,02% untuk melindungi sel-sel dari tegangan geser. pH dalam kultur sel mamalia biasanya diatur
dengan penambahan CO2, meskipun kultur dengan kepadatan tinggi mungkin memerlukan
penambahan NaOH. Konduktivitas akhir kurang dari 17 mS cm-1 adalah khas dan dapat membuat
penangkapan langsung melalui pertukaran ion lebih mudah daripada menangkap dari ragi dan
homogenat E. coli.
1.3.4 Komponen Kultur Kaldu
Secara umum, sebelum panen, kultur kaldu mengandung komponen-komponen berikut: sel
utuh, puing-puing dari sel lisis, komponen intraseluler sel inang, media komponen yang tidak
digunakan, senyawa yang disekresikan oleh sel, dan secara enzimatik atau kimiawi dikonversikan
oleh komponen media. Oksigen habis karena selama proses penanganan utama suplai oksigen
dimatikan dan residu oksigen yang terlarut sangat cepat dikonsumsi. Kandungan oksigen yang
rendah dapat menyebabkan nekrosis dan kematian sel-sel serta dapat dengan cepat terjadi lisis
selama fase ini. Beberapa jenis sel mulai autolisis hanya sekitar 30 menit tanpa oksigen. Akibatnya,
pemisahan jenis sel yang cepat dari sel-sel supernatan kaldu sangat diperlukan untuk
mempertahankan tingkat kotoran sel inang dalam jumlah rendah. Konsentrasi tinggi dari CO2 yang
39
dapat diproduksi oleh sel-sel sisa dalam kultur kaldu akan pecah dan menggeser pH menuju
wilayah asam. CO2 jauh lebih mudah larut dalam larutan air daripada oksigen, sehingga konsentrasi
substansial mungkin hadir. CO2 terlarut dapat dengan cepat dibebaskan ketika pH disesuaikan
pada proses pengolahan hilir dan membentuk gelembung yang kemudian dapat masuk kedalam
kolom kromatografi dan mengganggu pada kemasan.
Komponen sel inang intraseluler yang ada sebagai pengotor dalam supernatan kultur dapat
diperkirakan dari persamaan berikut:
dimana konsentrasi komponen intraseluler dapat diperkirakan dari Tabel 1.13 dan 1.14. Dengan
demikian, dari perspektif pengolahan hilir, viabilitas sel yang tinggi sangat diperlukan, ini tidak
selalu mungkin. Misalnya, dalam high-titer produksi antibodi oleh kultur sel, sel-sel sering lisis
dalam tahap akhir dari budidaya. Akibatnya, supernatan dari kultur sel mamalia tumbuh akan
mengandung protein sel inang dalam kisaran 1 - 3 mg ml-1 (1000 sampai 3000 ppm). Tingkat ini
harus dikurangi menjadi kurang dari 100 ppm dalam produk akhir.
1.3.5 Persyaratan Kualitas Produk
Pembuatan produk biologi untuk aplikasi farmasi harus mengikuti pedoman umum yang
telah ditetapkan oleh regulasi. Tiga kata kunci persyaratan kualitas produk utama: kemurnian,
potensi, dan konsistensi. Secara industri, persyaratan ini harus dipenuhi melalui proses yang
ekonomis dan dapat membawa produk ke pasar dengan cepat. Proses hilir harus dirancang untuk
memperoleh kemurnian yang cukup dan tetap menjaga potensi atau aktivitas farmakologi secara
konsisten.
1.3.5.1 Jenis Pengotor
Persyaratan kemurnian untuk biofarmasi bervariasi tergantung pada aplikasi tertentu.
Dengan demikian, tidak mungkin untuk menentukan nilai absolut. Namun, sebuah perbedaan
penting dapat dibuat antara zat pengotor, yang sering dikategorikan sebagai kritis atau non-kritis.
Sebuah pengotor non-kritis adalah senyawa inert tanpa relevansi biologis. Hal ini dapat terjadi,
misalnya, PEG sisa dari proses ekstraksi atau komponen berbahaya inangnya seperti lipid. Di sisi
40
lain, endotoksin atau sekresi faktor pertumbuhan ke dalam supernatan kultur adalah contoh
pengotor kritis, karena mereka menimbulkan aktivitas biologis yang merugikan. Pengotor ini perlu
ditelusuri sepanjang proses. Pengotor dapat berasal baik dari proses budidaya atau dari bahan
tambahan yang digunakan. Contoh dari proses terkait pengotor diantaranya kelarutan enhancer,
redoks - buffer, inhibitor enzim, dan senyawa yang dilepaskan dari filter atau media kromatografi.
Monomer yang bocor dari bahan polimer akan datang dan masuk dalam bentuk kontak dengan
produk kadang-kadang perlu menjadi perhatian khusus. Pengujian ekstensif dan dokumentasi
penghilangan mereka harus dan wajib dilakukan.
Istilah agen adventif ini digunakan untuk menggambarkan pengotor yang berpotensi
menular yang belum ditambahkan dengan sengaja dan tidak penting untuk proses tapi biasanya
sangat berbahaya. Mereka mungkin dapat masuk kedalam proses sebagai akibat bahan baku yang
terkontaminasi atau sel. Contoh-contoh zat adventif adalah virus, virus-like partikel, dan prion yang
mampu mengubah agen ensefalitis spongiform. Beberapa bahan kimia beracun juga dapat
dipertimbangkan untuk menjadi agen adventif. Terakhir, bioburden yang berasal dari kontaminasi
mikroba dari udara atau personil atau dari peralatan yang tidak cukup bersih, juga dapat memiliki
efek serius dan harus secara hati-hati dipantau dan dikendalikan.
Tabel 1.16 merangkum langkah-langkah yang diperlukan untuk menghilangkan agen
adventif dan pengotor lainnya. Demonstrasi ini biasanya dilakukan dalam percobaan skala kecil
karena jelas akan kontraproduktif yang dapat mencemari pabrik produksi oleh agen adventif.
Untuk penentuan ini, dikenal sebagai percobaan spiking, sebuah bolus dari agen adventif, misalnya
virus, akan ditambahkan ke aliran bahan baku dan memasuki langkah proses pemurnian. Titer
virus sebelum pemurnian a'= log10 (Feed titer) dan setelah pemurnian a''= log10 (titer Harvest) harus
ditentukan dan nilai faktor log - virus reduksi (LVR) dihitung sebagai berikut:
41
Dalam rangka untuk menjelaskan efek perubahan volume (misalnya hanya 1:10 pelarut
yang dihasilkan dalam LVR 1), faktor reduksi individu, Ri, dapat dihitung:
di mana V' dan V" adalah masing-masing volume makanan dan panen. Akhirnya, LVR dari
langkah-langkah proses individu ditambahkan bersama-sama sampai mencapai LVR kumulatif
untuk seluruh proses. Tabel 1.17 menggambarkan izin skema virus khas untuk proses pemurnian
antibodi.
42
Meskipun hampir semua sel mamalia yang terinfeksi virus harus membuat validasi
pemberantasan virus, upaya untuk menghilangkan prosedur ini sering dilakukan dengan
memanfaatkan proses platform yang telah menunjukkan nilai efisiensi clearance.
1.3.5.2 Peraturan Aspek dan Validasi
Kualitas produk biofarmasetik dan proses validasi harus tunduk pada peraturan oleh
masing-masing pemerintah. Di Amerika Serikat, kerangka hukum ini diterbitkan dalam Code of
Federal Regulation 21 (21 CFR), Subchapter F Biologics. US Food and Drug Administration (US FDA)
bertanggung jawab atas pelaksanaannya. Kode US ini mendefinisikan produk biologi sebagai
berikut: 'produk biologis berarti virus, serum terapi, racun, antitoksin, atau produk serupa yang
digunakan untuk pengobatan, pencegahan atau penyembuhan penyakit atau cedera manusia'.
Plasmid, sel dan jaringan yang tidak disebutkan secara eksplisit, tetapi dianggap sebagai bagian
dari definisi ini. Di Uni Eropa (UE), kerangka hukum masih di bawah kedaulatan negara-negara
anggota, meskipun Uni Eropa telah mendirikan Badan Kedokteran Eropa (EMEA), dengan tujuan
harmonisasi struktur peraturan di negara anggota Uni Eropa. Pedoman untuk produk obat yang
diperoleh dalam bioteknologi sebagaimana diatur oleh Commission of European Community,
mendefinisikan biologis sebagai produk yang berasal dari:
1. darah, cairan tubuh lain manusia atau jaringan manusia
2. darah binatang
3. mikroorganisme atau komponen mikroorganisme
4. hewan atau mikroorganisme untuk imunisasi aktif atau pasif
5. antibodi monoclonal
6. produk DNA rekombinan.
Adanya peraturan-peraturan tersebut menambah kompleksitas industri biofarmasetik.
Dengan demikian, Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) dibentuk untuk
mengembangkan kerangka peraturan umum internasional tersebut. ICH menyatukan kewenangan
Eropa, Jepang dan Amerika Serikat, serta ahli dari industri farmasi dari tiga wilayah untuk
membahas aspek-aspek ilmiah dan teknis terkait registrasi produk. Tujuannya adalah untuk
membuat rekomendasi tentang cara-cara untuk mencapai harmonisasi dalam penafsiran dan
penerapan pedoman teknis dan persyaratan untuk registrasi produk. Sementara kemajuan sedang
dibuat dalam proses harmonisasi, kerangka peraturan masing-masing negara tetap berlaku.
43
Selama bertahun-tahun, Pusat Penelitian dan Evaluasi Biologis (CBER) dari FDA AS telah
mengeluarkan rekomendasi rinci untuk pembuatan produk biologis didalam seri makalah 'Poin
Pertimbangkan'. Pertama kali makalah ini dirilis pada tahun 1983 dengan judul 'Prosedur Uji
Interferon: Poin Pertimbangan dalam Produksi dan Pengujian Interferon yang Ditujukan untuk
Penggunaan Investigational pada Manusia'. Makalah selanjutnya meliputi:
1. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Produksi dan Pengujian Obat Baru dan Produksi
Produk Biologis melalui Teknologi Rekombinan DNA - 1985/04/10
2. Pedoman Validasi Uji Limulus Amebocyte lisat sebagai Tes Produk Akhir Endotoksin
untuk Obat Parenteral Manusia dan Hewan, Produk Biologi dan Alat Kesehatan -
12/1987
3. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Industri dan Pengujian Produk Terapi untuk
Manusia yang Menggunakan Hewan Transgenik – 1995
4. Hal yang Perlu Dipertimbangkan dalam Industri dan Pengujian Produk Antibodi
Monoklonal untuk Penggunaan pada Manusia - 1997/02/28
5. Pedoman Industri: Penggunaan Antibodi Monoklonal sebagai Reagen dalam Produksi
Obat - 2001/03/29
Validasi merupakan aspek penting dari proses pengembangan biofarmasetik. Menurut
definisi ICH yang ada, parameter penting yang dapat mempengaruhi kualitas produk perlu
divalidasi. Setelah validasi, protokol operasi standar (SOP) harus ada, yang menggambarkan proses
dan variasi yang diperbolehkan. Parameter operasional yang kritis didefinisikan sebagai proses
parameter sub-set terbatas yang secara signifikan mempengaruhi atribut kualitas produk kritis
ketika memiliki variasi bermakna diluar jangkauan operasional, sempit (atau sulit untuk dikontrol).
Misalnya, operasi langkah pemurnian kromatografi. Seperti terlihat pada Tabel 1.18 operasi ini
akan membutuhkan definisi dari sejumlah kondisi operasi sebagai input, yang pada gilirannya akan
menghasilkan karakteristik kinerja tertentu, yang didefinisikan sebagai output.
Dalam rangka untuk memvalidasi proses, parameter input harus lebih bervariasi
menyesuaikan rentang dan output yang diukur. Parameter kritis kemudian ditetapkan berdasarkan
percobaan ini, yang biasanya dilakukan dalam skala kecil. Rentang operasional disesuaikan dengan
interval yang telah ditetapkan untuk parameter ini serta untuk non - parameter kritis. Karena yang
terakhir tidak mempengaruhi atribut produk kualitas kritis, range mereka biasanya akan lebih luas
daripada parameter kritis (lihat Gambar 1.28).
44
1.3.5.3 Persyaratan Kemurnian
Sulit untuk menjelaskan persyaratan kemurnian mutlak karena mereka bergantung pada
tujuan penggunaan biofarmasetik, dosis, perbandingan risiko-manfaat, dll. Tabel 1.19
menggambarkan nilai perkiraan kemurnian yang dimaksudkan sebagai pedoman umum.
Agregat merupakan perhatian penting bagi banyak protein biofarmasetik. Hal ini
ditunjukkan bahwa agregat dapat menginduksi reaksi kekebalan tubuh atau menyebabkan efek
samping lainnya. Selain itu, agregat mungkin merupakan awal terjadinya pengendapan dan
mengurangi umur simpan produk. Akibatnya, kontrol pada persentase dimer, oligomer dan bentuk
agregat yang lebih tinggi sering dan sangat diperlukan. Kebocoran ligan atau bahan kimia lainnya
yang dapat dilepaskan dan terjadi pada media kromatografi dan membran juga menjadi perhatian
penting karena bahan-bahan tersebut bisa imunogenik dan beracun. Kontaminasi virus jelas
merupakan isu penting dan telah bertanggung jawab untuk banyak penyakit iatrogenik, seperti
45
yang terjadi karena produk darah yang terkontaminasi. Sejak penghilangan absolut agen-agen
adventif tidak mungkin dilakukan, terdapat batasan yang didirikan atas dasar analisis resiko-
manfaat. Misalnya, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menerima kasus satu vaksin yang
merugikan dalam 109 aplikasi - maka, nilai probabilitas 10-9 yang disarankan dalam Tabel 1.19.
Dalam prakteknya, kesulitan untuk mencapai probabilitas rendah seperti ini, tentu saja, tergantung
pada dosis. Sebagai contoh, tingkat umum set 10 pg DNA per dosis relatif mudah untuk mencapai
untuk vaksin Hepatitis B, di mana satu dosis mungkin berisi hanya sekitar 12 g protein. Di sisiμ
lain, persyaratan seperti itu mungkin agak sulit untuk bertemu dalam kasus antibodi rekombinan,
di mana satu dosis dapat terdiri dari sebanyak 500 mg protein.
Seperti telah disebutkan sebelumnya, biofarmasetik kebanyakan tidak sepenuhnya
didefinisikan sebagai entitas molekul individu, mereka terdiri dari sejumlah besar isoform serupa
atau bervariasi (beberapa produk antibodi rekombinan berisi 200 varian yang diidentifikasi).
Karena aktivitas biologis dan farmakologis dapat bervariasi di antara isoform yang berbeda, untuk
itu penting untuk menjaga distribusi varian dalam rentang yang dapat diterima. Karena
kompleksitas sistem bioproduksi, konsistensi yang sama juga harus dipertahankan untuk profil
pengotor seperti yang ditentukan dari tes analitis, untuk menjamin keamanan produk. Akhirnya,
sistem pengujian harus ditetapkan untuk mengendalikan potensi in vitro dan, jika perlu, in vivo.
46
Hormon / Insulin
Teknologi Pemisahan pada Obat
Hormon adalah unsur kimia yang mengatur efek metabolisme dan aktivitas organ. Bekerja
sama dengan sistem saraf, mengkoordinasikan semua fungsi tubuh. Sebuah mekanisme kontrol
yang rumit yang memastikan interaksi hormon pada fungsi tubuh. Teknologi pemisahan GEA
memainkan peran penting dalam produksi hormon, misalnya insulin.
Diabetes merupakan penyakit gangguan metabolik yang ditandai dengan gula darah
(glukosa) tinggi, yang disebabkan dari kerusakan sekresi insulin sehingga tubuh tidak mampu
memproduksi atau menggunakan insulin untuk mengubah gula dan makanan lainnya menjadi
energi. Bila menderita diabetes, tubuh pastinya tidak membuat cukup insulin atau tidak dapat
menggunakan insulin sendiri sebagaimana mestinya, atau keduanya. Sekitar 150 juta orang di
seluruh dunia saat ini menderita gangguan metabolik ini. Mereka harus menyuntikkan insulin
tambahan sehari-hari untuk mencegah penyakit kardiovaskular atau ginjal yang serius.
Mesin pemisah dari GEA Westfalia Separator Group memainkan peranan penting dalam
proses produksi. Pemisah nosel beroperasi dalam proses seperti yang digambarkan, di mana bahan
padat diekstrak terus menerus dengan konsentrasi konstan. Produksi biosintesis insulin manusia
dikonduksi oleh bakteri atau ragi. Setelah fermentasi, atau konversi bahan baku kimia oleh mikro-
organisme, biomassa diekstraksi oleh pemisah nozzle. Tahap selanjutnya, bahan aktif dicuci dan
47
dipekatkan. Mesin GEA Westfalia Separator Grup juga digunakan dalam tahap kristalisasi
berikutnya, misalnya GEA Westfalia Separator hycon dan pemisah chamber.
Protein Produk farmasi
Bioproduk yang dimodifikasi secara genetik
48
Proses bioteknologi dapat diartikan sebagai proses menggunakan mikroorganisme hasil
rekayasa genetika. Hal ini mampu menghasilkan produk biologi yang tidak dapat dibuat secara
alami. Rantai DNA yang dimodifikasi dan faktor hereditas yang dimanifulasi secara genetik
dikembangbiakkan dengan cara fermentasi pada mikroorganisme. Produk sel yang diinginkan
mungkin terdapat pada intrasel atau ekstrasel.
Produk ekstraseluler
Setelah proses fermentasi, mikroorganisme diekstraksi dengan separator yang beroperasi
secara terus menerus. Untuk meningkatkan hasil, bahan padat dicuci dan diekstraksi lagi dengan
pemusingan. Semua material yang digunakan harus disterilkan pada suhu 121 °C. Untuk menjaga
proses sesederhana mungkin, biomassa dimatikan secara langsung setelah fermentasi dalam
fermentor baik dengan metode panas atau dengan metode kimia. Secara tertutup, uap sentrifus
steril yang bekerja dalam proses ini dapat terhubung ke peralatan lain secara steril.
Produk Intraseluler dan badan inklusi
Dalam proses intraseluler, hal ini dibedakan apakah produk yang diinginkan terkandung
dalam cairan intraseluler atau dalam badan inklusi. Berbeda dengan bioproduksi ekstraseluler,
pada produk intraseluler biomassa dicuci dan terkonsentrasi secara homogen, yaitu sel-sel yang
rusak dan cairan intraseluler dan badan inklusi dilepaskan. Semua ini dipisahkan dari fragmen sel,
dicuci dan terkonsentrasi di tahap selanjutnya dari proses sentrifugal pada GEA Westfalia
Separator Grup. Untuk produk intraseluler yang diperoleh dari cairan sel, padatan diekstraksi
dengan separator yang beroperasi secara terus menerus.
49
Kultur Sel Mamalia
Budidaya kultur sel mamalia menjadi semakin menarik bagi industri farmasi. Dengan sel-
sel, protein dapat diproduksi secara efektif (quartiary struktur). Dibandingkan dengan produksi
oleh mikroorganisme (bakteri / ragi), tahapan hilir pada proses dapat dikurangi secara substansial.
Selain itu, risiko seperti infeksi dalam produksi protein manusia dapat dihindari.
Optimalisasi pada proses produksi
Dalam proses ini, perhatian khusus harus diberikan pada efek dari pengaruh asing seperti
perubahan dari perilaku dan produktivitas sel. Karena keadaan ini, mesin dioptimalkan untuk
mengurangi perubahan pada sel. Proses ini mendapatkan signifikansi untuk industri.
"Hydrohermetic inlet" yang dikembangkan oleh GEA Westfalia Separator Group
mengurangi gaya geser menjadi minimum. Kultur sel khas yang diproses adalah CHO, BHK,
hibridoma dan sel-sel serangga.
Fraksinasi Plasma Darah Manusia
Terapi dengan komponen darah secara eksplisit dapat memerangi berbagai penyakit lama
yang dikembangkan dari transfusi darah sederhana.
50
Fraksinasi merupakan pemisahan protein dalam fase plasma oleh proses fisika dan kimia.
Hal ini didasarkan pada perubahan tiga parameter yaitu temperatur, konsentrasi alkohol dan nilai
pH, yang mempengaruhi kelarutan protein dalam air. Darah manusia terdiri dari fase yang
berwarna merah dan fase plasma yang bersih. Fase yang berwarna merah, sekitar 40 persen dari
darah, dipisahkan oleh sentrifugal khusus dalam kantong donor. Plasma akan membeku setelah
diekstraksi dan diproses oleh peralatan fraksinasi. Hanya sekitar 5 persen dari plasma terdiri dari
komponen yang berharga, yang harus difraksinasi, siisanya adalah air dan elektrolit.
Terapi dengan komponen darah
Zat berharga dapat diekstraksi dari protein. Kriopresipitat, persiapan pembekuan "Faktor
VIII konsentrat" dan kompleks prothrombin (PPSB) dapat diperoleh dari plasma segar secara
langsung setelah mencair. Plasma yang tersisa masuk dalam fraksi etanol dengan proses Cohn, di
mana fraksi individu seperti fibrinogen, globulin gamma, alpha dan beta globulin dan albumin
diendapkan. Partikel-partikel pada plasma protein digunakan untuk mencegah dan mengobati
pendarahan, mengontrol perdarahan selama operasi, berbagai penyakit menular, kekurangan
protein, malnutrisi dan meningkatkan proporsi plasma darah. Setelah fraksinasi, protein
diperlakukan dengan berbagai metode yang spesifik sebelum digunakan untuk tujuan klinis.
Peran kromatografi dalam proses hilir
51
Kromatografi adalah alat yang penting digunakan untuk pemurnian biofarmasi. Hal ini
dapat dijelaskan dengan keuntungan tertentu dari kromatografi disbanding unit operasi lainnya.
Keuntungan kromatografi :
1. Kromatografi memberikan efisiensi pemisahan yang sangat tinggi, yang
memungkinkan campuran yang kompleks dengan sifat molekul yang sangat mirip.
Kolom kromatografi dirancang dapat memiliki efisiensi pemisahan ratusan atau
bahkan ribuan. Sebagai perbandingan, ekstraksi dan filtrasi membran biasanya
terbatas hanya beberapa tahap.
2. Kolom kromatografi dikemas dengan adsorben kapasitas tinggi yang ideal untuk
menangkap molekul dari larutan encer yang dilakukan dalam Bioproses. Dalam
sistem tersebut, ada kontak antara efisiensi larutan volume besar dan adsorben
dengan jumlah kecil yang berada dalam kolom, sehingga menghilangkan
kontaminan yang ada dalam konsentrasi kecil. Sebagai perbandingan, sistem
ekstraksi cair – cair biasanya memerlukan volume yang hampir sama dari dua fase
agar dapat berfungsi dengan baik, sehingga konsentrasi tidak dapat dikerjakan
dengan mudah.
3. Kromatografi dapat dilakukan dalam suatu sistem tertutup dan fase diam dapat
dengan mudah diregenerasi. Sehingga, metode kromatografi cocok dalam banyak
proses manufaktur biofarmasi dan alat yang sesuai dan bahan sudah tersedia.
Kelemahan yang dirasakan dari kromatografi adalah kesulitan dalam skala tinggi pada industri
biofarmasi . Seperti yang ditunjukkan oleh Kelley, proses pemurnian kromatografi cocok dan
secara teknis dan ekonomis untuk pemurnian protein pada skala setinggi 20 ton per tahun.
Meskipun tidak ada produk yang saat ini dibuat pada skala yang besar, popularitas biofarmasi
meningkat dengan cepat sehingga skala tersebut dapat dibayangkan di masa depan.
Larutan yg mengandung beberapa bahan terlarut diinjeksikan pada satu ujung kolom, dan eluent
membawa larutan melewati fase diam ke ujung kolom. Tiap bahan terlarut bergerak pada laju yg
proporsional dengan afinitas relatifnya thd fase diam dan keluar pada ujung kolom sebagai band
yang terpisah. Tergantung pada tipe adsorben atau interaksi bahan terlarut dengan adsorben,
kromatografi dipisahkan atas kromatografi adsorpsi, pertukaran ion, affinitas, dan filtrasi gel.
Kromatografi filtrasi gel
52
Memisahkan protein berdasarkan ukurannya. Pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan
pergerakan relatif dari masing-masing protein melalui suatu molecular sieve. Molecular sieve
yang digunakan biasanya merupakan suatu gel polisakarida dalam bentuk bulatan kecil
(granula). Gel yang sering digunakan : dekstran (polimer gula) yang larut dalam air dan
telah mengalami cross linkage dengan bantuan epikhlorhidrin
Kromatografi penukar ion
Memanfaatkan perbedaan afinitas molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa
tidak reaktif yang berfungsi sebagai pengisi kolom yang muatannya berlawanan. Senyawa
tidak reaktif yang digunakan adalah polimer yang bersifat elastik yang mengandung
kerangka resin sintetik : seperti Polistiren. Pada polimer tersebut dikaitkan gugus
fungsional tertentu yang berupa penukar anion atau kation. Jenis penukar ion yang banyak
digunakan : CMC dan DEAE (dietanolaminoetil) selulosa.
Pemakaian penukar kation dilakukan dengan penambahan
buffer pH 5 dan 10 mM kation (biasanya Na+) untuk
menciptakan kondisi penyerapan yang kuat. Kromatografi
pertukaran ion banyak digunakan dalam pemurnian enzim.
53
Kromatografi afinitas
Kromatografi dengan dasar interaksi biokimia. Pemisahan terjadi karena interaksi spesifik
antara pasangan senyawa enzim dengan substrat, kofaktor, allosterik, efektor atau
inhibitor. Prinsip : ligan yang terikat secara kovalen pada matrik yang tidak larut air akan
menyerap salah satu/beberapa dari komponen campuran. Komponen yang diserap
mempunyai afinitas yang spesifik dengan ligan. Komponen yang tidak memiliki afinitas
akan melaju dan keluar. Molekul yang sudah diserap dilepaskan dengan mengubah kondisi
elusi (dengan larutan bebas ligan, perubahan pH atau kekuatan ion
Keuntungan :
Sifat interaksinya spesifik
Jumlah adsorben yang digunakan dapat disesuaikan dengan zat yang akan
diadsorbsi
Adsorben dapat diregenrasi beberapa kali
Ligan dapat berupa :
Substrat yang termodifikasi
Inhibitor spesifik
Kofaktor
Efektor biologis
54
Sistem kromatografi afinitas yang baik ditentukan oleh jenis matriks dan ligan yang
digunakan. Matriks pengisi kolom : matriks gel dengan sifat :
Mempunyai gugus fungsional yang ampuh untuk bereaksi dengan jenis protein dan
ligan yang diinginkan,
Tahan terhadap mikroba
Stabil,
Tahan lama
Bersifat hidrofilik
Ddapat diregenrasi
Mempunyai kapasitas yang besar terhadap enzim atau ligan,
Dapat melewatkan pelarut,
Kromatogafi interaksi hidrofobik
Protein enzim dapat diikat oleh matriks melalui interaksi hidrofobik pada lingkungan
polaritas dan kekuatan ion yang tinggi. Matriks yang digunakan bersifat non polar,
misalnya sefarosa. Enzim dipisahkan dari ikatan dengan menggunakan eluen yang
polaritasnya diturunkan. Eluen yang digunakan : beberapa jenis garam. Peningkatan
polaritas dapat dilakukan dengan menggunakan konsentrasi ion yang berbeda : Ba2+, Ca2+,
Mg2+, Li+, Cs+, Na+, K+, Rb+ dan NH4 + (untuk kation), atau SCN-, I-, ClO4-, NO3-, Br-,Cl-,
CH3COO-, SO2 2- dan PO43- (untuk anion).
55
Gambar diatas menggambarkan struktur dari proses generik untuk recovery dan
pemurnian produk biologi dengan fermentasi mikroba atau kultur sel hewan. Langkah awal di
mana sel-sel dipisahkan disebut sebagai primary recovery. Langkah ini membutuhkan strategi yang
berbeda tergantung pada apakah produk dikeluarkan ke dalam media kultur atau ditunjukkan
dalam sel, baik sebagai inklusi, dalam bentuk cairan dalam sitosol atau periplasm, atau menuju ke
membrane. Umumnya, kromatografi memainkan peran kecil dalam langkah-langkah awal, yang
difokuskan pada penghilangan padatan suspense seperti sel-sel atau bagian - bagian sel.
Sedimentasi, sentrifugasi, deep bed filtration, dan mikrofiltrasi atau kombinasi biasanya digunakan
untuk langkah-langkah awal. Namun, kromatografi, dilakukan melalui penggunaan fluidized atau
expand bed juga dapat digunakan untuk menangkap langsung protein dikeluarkan dari supernatan
kultur sel.
Dalam sistem ini aliran cairan ke atas melalui dasar awal yang menetap pada partikel
adsorben padat. Kecepatan aliran tertentu expand bed dan partikel menjadi fluidized
memungkinkan membebaskan bagian dari sel dan padatan tersuspensi lainnya sementara produk
secara langsung ditangkap oleh adsorben. Pendekatan ini bisa efektif untuk suspensi encer, tapi
karena ekspand bed langsung dipengaruhi oleh kepadatan dan viskositas, operasi cenderung kritis
56
dipengaruhi oleh variasi dalam komposisi kaldu. Dalam prakteknya, viskositas tinggi dan densitas
sel ditemui dalam teknologi fermentasi modern (sampai 400 mg ml - 1 massa sel basah untuk P.
pastoris atau 200 mg ml -1 untuk E. coli) membuat kesulitan untuk menerapkan pendekatan ini
pada skala industri. Alternatif yang mungkin untuk penangkapan awal tanpa klarifikasi adalah
menggunakan adsorpsi yang memenuhi bed dengan partikel besar, disebut “big beads”. Jika
diameter partikel lebih besar dari 400µm, ruang interpartikel cukup besar untuk bagian sel dan
bagian – bagian sel. Walaupun efisiensi penangkapan berkurang oleh keterbatasan diffusional
dengan diameter partikel yang lebih besar, pengurangan ini dalam langkah dapat memberikan
keuntungan ekonomi secara keseluruhan dan operasional. Tidak seperti expanded bed, proses
packed bed tidak terlalu sensitif untuk memberi viskositas bahan sehingga operasi yang handal
dengan diameter beads besar dapat dicapai bahkan dengan bahan baku kental.
Gambar 1.30 menunjukkan contoh purifikasi dari antibodi rekombinan. Dalam proses ini,
capture direalisasikan menggunakan adsorben selektif yang terdiri dari Protein stafilokokus A
bergerak dalam beads berpori. ligan sangat selektif memungkinkan pemuatan langsung kultur
kaldu ke kolom capture, dan kemudian secara selektif mengikat antibody. Pada tahap selanjutnya,
pemurnian dan polishing dilakukan dengan pertukaran ion dan kolom interaksi hidrofobik untuk
menghilangkan protein sel inang dan varian protein menyimpang. Perhatikan bahwa intermediate,
57
non - kromatografi, langkah ini juga disertakan. Pertama, inkubasi pada pH rendah dan kemudian
langkah 'virus filtration' di implementasikan untuk pemberantasan virus. Kedua, langkah
diafiltration termasuk untuk pertukaran buffer dan formulasi akhir.
PROSES HILIR
1. ENZIM (Proses percepatan sebagai biokatalisator)
Enzim adalah senyawa protein organik kompleks yang terdapat pada setiap sel yang
hidup, dimana didalam sel tersebut enzim akan diproduksi. Enzim yang dihasilkan tersebut
dapat mempercepat proses organik, seperti pemecahan pati, protein lemak, atau gula sebagai
katalis, tanpa ikut dalam proses atau reaksi tersebut.
Produksi enzim intraseluler
Glukosa isomerase adalah contoh dari enzim yang mengubah glukosa menjadi fruktosa dan
merupakan pati yang sangat dibutuhkan dalam industri. Enzim diproduksi dan digunakan
dalam sel-sel mikro-organisme. Untuk digunakan dalam proses tersebut, fase cair dari
kaldu fermentasi dipisahkan dengan sentrifugasi setelah dilakukan fermentasi.
Mikroorganisme yang telah mengalami fermentasi tersebut diperlakukan lebih lanjut
setelah disentrifugasi. Dinding sel dar mikroorganisme akan rusak, Tergantung pada
konsistensi suspensi, suspensi itu diencerkan sebelum fragmen sel dipisahkan oleh mesin
pemisah.
58
Produksi enzim ekstraseluler
Mesin pemisah dan mesin pendekantasi telah didesain sedemikian rupa untuk perlakuan
optimal terhadap pencucian enzim serbuk. Udara yang telah dimurnikan dan disterilkan
disuntikkan ke dalam fermentor yang dilengkapi dengan agitator (pengaduk). Gelembung
udara didistribusikan dalam larutan nutrien, yang terdiri dari karbohidrat, protein, growth
agent, dan nutrisi. Kemudian disterilkan, dipanaskan sampai suhu optimum dan kemudian
diinokulasi dengan kultur yang dimurnikan dari mikroorganisme patogenik.
Mikroorganisme memelihara (memberi makan) diri mereka sendiri dengan mengubah zat
dan sekaligus menghasilkan enzim. Ini kemudian diekskresikan ke kaldu fermentasi.
Setelah fermentasi, mikroorganisme dipisahkan dengan menambahkan flocculent dan
dilakukan sentrifugasi serta dekantasi. Keberhasilan proses tersebut akan diperoleh
peningkatan hasil dan kemurnian dari enzim.
59
2. KULTUR MIKROBA MAKANAN
Kultur mikroba pada makanan dapat dibagi menjadi kultur awal (starter) dan produk
probiotik, keduanya digunakan dalam banyak segmen industri makanan. Kultur Starter
merupakan bagian tetap dari industri makanan, produk medis dan hewan. Mereka bertanggung
jawab atas kualitas produk dan merupakan kontrol dari proses produksi. Produk probiotik juga
penting, karena bersifatnya menguntungkan kesehatan. Pemisahan secara steril menjadi lebih
penting untuk memulihkan produk tersebut, probiotik ini dapat digunakan dalam berbagai cara
dan mungkin hasil dan kekuatan kultur dapat ditingkatkan kembali.
60
Pengkulturan, Pengolahan, dan Pemanenan
Produksi biakan (kultur) biang dapat dibagi menjadi dua bagian. Setelah pengkulturan
di fermentor, bakteri diproses dan dipisahkan dari larutan fermentasi. Ini terdiri dari
laktobasilus dan sisa larutan nutrien termasuk asam laktat yang dihasilkan. Pertama, mikro-
organisme yang telah mengalami fermentasi dipisahkan dari fase cair. Pemisah nozzle dan
piringan pembersih disterilisasi uap. Laktobasilus yang telah mengalami fermentasi kemudian
dilewatkan pada freeze drier. Pada tahap akhir, kultur (biang) yang dikemas dalam kedap udara
dan disimpan pada suhu rendah. Hal tersebut dapat mempertahankan aktivitas probiotik
selama berbulan-bulan sebelum mereka diproses, dikenal sebagai "kultur hidup" dalam yoghurt
probiotik.
3. VAKSIN (Proteksi terhadap penyakit )
Vaksin adalah obat yang mengimunisasi manusia atau hewan terhadap penyakit.
Organisme akan dilindungi berulang kali dengan adanya sejumlah kecil antigen (dalam vaksin)
atau antibodi dalam bentuk serum. Hal ini dilakukan untuk meningkatkan atau mencapai
kekebalan.
Proses pembuatan vaksin
Ketika strain virus yang cocok telah dipilih, kemudian diisolasi dalam ampul dan disimpan
pada suhu -192 ° C dalam nitrogen cair. Pembiakan kemudian dilakukan dimulai dengan
pra-fermentor dan dilanjutkan dalam fermentor utama. Proses fermentasi dilengkapi
dengan larutan nutrien. Nutrien dilarutkan dalam tangki nutrien dan ditambahkan ke
proses fermentasi setelah difiltrasi. Sel-sel tersebut kemudian dipisahkan dari fase clear
dengan sentrifugasi. Vaksin mentah dimasukan ke bejana pencampuran, di mana imunogen
dari vaksin tersebut meningkat dengan penambahan adjuvant, stabilisator dan pengawet
(preservative).
Vaksin hidup (Live-Vaccine)
Salah satu cara adalah terapi dengan vaksin hidup. Ini adalah kuman dengan virus yang
telah dilemahkan atau erat terkait dengan kuman patogen yang biasa disebut antigen, tetapi
tanpa efek patogen. Vaksin ini berasal dari mutasi virus (kuman) dengan tingkat patogen
yang rendah, yang cocok untuk produksi vaksin.
61
Non-live vaksin
Dalam terapi serum, organisme yang terinfeksi diberikan serum yang diproduksi dengan
antibodi dari individu yang diimunisasi. Serum diperoleh dengan membiakkan bakteri
dalam larutan nutrien yang sesuai. Serum yang diproduksi selama fermentasi diekskresikan
oleh sel-sel ke dalam larutan fermentasi. Serum ini kemudian diisolasi dengan memisahkan
biomassa di dalam alat sentrifugasi. Dalam proses produksi vaksin dan sera ini di butuhkan
teknik aseptik dalam prosesnya.
62
63