ANALISIS EKSPRESI GEN AGAMOUS2, SQUAMOSA1, DAN
EGAD1 ORGAN REPRODUKTIF DAN VEGETATIF
Elaeis guineensis Jacq
DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
ABSTRAK
DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT. Analisis Ekspresi Gen
AGAMOUS2, SQUAMOSA1 dan EGAD1 Organ Reproduktif dan Vegetatitif
Elaeis guineensis Jacq. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan ASMINI
BUDIANI.
Salah satu kendala perbanyakan kelapa sawit melalui kultur jaringan
adalah abnormalitas. Salah satu gen yang ekspresinya dilaporkan sejalan dengan
terjadinya abnormalitas pada kelapa sawit adalah EGAD1, gen yang terkait
dengan sistem ketahanan. Abnormalitas juga dipengaruhi oleh gen-gen
pembungaan, antara lain AG dan SQUA. Penelitian bertujuan menganalisis tingkat
ekspresi gen AG2, SQUA1, dan EGAD1 organ reproduktif dan vegetatif tanaman
kelapa sawit normal dan abnormal. Isolasi RNA dilakukan dari bunga dan daun
kelapa sawit abnormal dan normal. Ekspresi gen AG2, SQUA1 dan EGAD1
diamati dengan metode RT-PCR, selanjutnya kuantitas ekspresi gen dianalisis
dengan perangkat lunak UnScan gel IT. Ekspresi gen AG2 tidak ditemukan pada
daun kelapa sawit abnormal maupun normal. Ekspresi gen SQUA1 dan EGAD1
daun kelapa sawit normal lebih tinggi dibandingkan dengan daun kelapa sawit
abnormal. Kuantitas ekspresi SQUA1 dan EGAD1 berturut-turut pada daun kelapa
sawit normal sebesar 80.20 ng/mL dan 15.96 ng/mL. Ekspresi AG2, SQUA1, dan
EGAD1 bunga abnormal lebih tinggi dibandingkan bunga normal. Nilai kuantitas
AG2, SQUA1, dan EGAD1 bunga abnormal berturut-turut 174.20 ng/mL, 120.72
ng/mL, dan 130.55 ng/mL.
ABSTRACT
DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT. An Analysis of the AGAMOUS2,
SQUAMOSA1 and EGAD1 Expression on Reproductive and Vegetative Organs of
Elaeis guineensis Jacq. Under the direction of I MADE ARTIKA and ASMINI
BUDIANI.
One of the major problems encountered in micropropagation of oil palm
through tissue culture is mantled abnormality. One of genes reported to involve in
the mantled is EGAD1, a gene coding for putative plant defensin. Abnormality
also influenced by floral genes, for example AG2 and SQUA1. This experiment
aimed to analyze of the AG2, SQUA1 and EGAD1 expression on reproductive
and vegetative organs of abnormal and normal oil palm. RNA was isolated from
flower and leaf of abnormal and normal oil palm. The AG2, SQUA1 and EGAD1
expression observed by RT-PCR method. To further confirm the result, UnScan
gel IT software was also utilized. Expression of AG2 not found in abnormal and
normal oil palm leaf. SQUA1 and EGAD1 expression in normal oil palm leaf
higher than abnormal. Expression quantity of SQUA1 and EGAD1 in normal oil
palm leaf is 80.20 ng/mL and 15.96 ng/mL. In contrast, expression of AG2,
SQUA1, dan EGAD1 in abnormal oil palm flower higher than normal. AG2,
SQUA1, dan EGAD1 quantity in abnormal oil palm flower is 174.20 ng/mL,
120.72 ng/mL, dan 130.55 ng/mL.
ANALISIS EKSPRESI GEN AGAMOUS2, SQUAMOSA1, DAN
EGAD1 ORGAN REPRODUKTIF DAN VEGETATIF
Elaeis guineensis Jacq
DONALD JOHN CALVIEN HUTABARAT
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
Judul Skripsi : Analisis Ekspresi Gen AGAMOUS2, SQUAMOSA1, dan
EGAD1 Organ Reproduktif dan Vegetatif Elaeis guineensis
Jacq
Nama : Donald John Calvien Hutabarat
NIM : G84052119
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr.Ir. I Made Artika, M.App.Sc Dr. Asmini Budiani, M.Si
Ketua Anggota
Diketahui
Dr.Ir. I Made Artika, M.App. Sc
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Tri Tunggal karena atas
segala berkat dan kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.
Penelitian yang bertema analisis ekspresi gen AGAMOUS2, SQUAMOSA1 dan
EGAD1 organ reproduktif dan vegetatitif Elaeis guineensis Jacq ini dilaksanakan
di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) Bogor.
Selesainya penelitian ini tidak lepas dari dukungan beberapa pihak. Oleh
karena itu, ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Dr.Ir. I Made Artika,
M.App. Sc dan Dr. Asmini Budiani, M.Si selaku pembimbing yang telah memberi
masukan dan arahan. Penulis menyampaikan terima kasih Bapak, Mama, dan
Kakak yang telah memeberi bimbingan moril maupun material. Tidak lepas juga
kepada Martungtung yang tetap sabar dan setia membantu dalam terlaksananya
penelitian serta pembuatan skripsi ini. Penulis berterimakasih kepada Mba‟ Arlyn
Esti, dan teman-teman Biokimia 42 yang membantu dalam penelitian ini. Penulis
juga berterimakasih kepada semua pihak yang telah membantu dan mendukung
penulis dalam mencari literatur dan beberapa referensi lainnya.
Penulis sadar penelitian ini masih terdapat kekurangan oleh karena itu,
penulis terbuka untuk segala saran dan kritik yang membangun guna perbaikan.
Penulis berharap agar penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Agustus 2010
Donald John Calvien Hutabarat
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Berastagi pada tanggal 4 Pebruari 1987 dari ayah
Marsuan Hutabarat dan ibu K. Magda R br Marbun. Penulis merupakan anak
ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri I Berastagi
dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan
Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih mayor dari Departemen Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam serta Supporting Course (SC)
sebagai pendukung mata kuliah.
Penulis melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium
Mikrobiologi-Recorvery Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT di Kawasan
PUSPIPTEK Serpong, Tangerang selama periode Juli sampai Agustus 2008
dengan judul Pengaruh Media dan Lama Proses Fermentasi Terhadap Produksi
Antibiotika oleh Aktinomiset Endofit BioMCCAE-00048. Selain itu penulis
pernah aktif di beberapa organisasi kemahasiswaan, antara lain Comminity of
Research and Education in Biochemistry (CREBs) periode 2007/2008,
Persekutuan Mahasiswa Kristen IPB (PMK IPB) sebagai anggota komisi
kesenian, dan Ikatan Mahasiswa Karo (IMKA) Bunga Ncole. Pengalaman lain
pengurus yaitu sebagai Sie Logstran pada acara LKIP, Pesta Sains Nasional 2007.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...................................................................................................
DAFTAR GAMBAR...........................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................\
PENDAHULUAN......................................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA.............................................................................................
Kelapa Sawit..................................................................................................
Mantled..........................................................................................................
Gen-Gen Pembungaan Tanaman...................................................................
EGAD1...........................................................................................................
Isolasi RNA....................................................................................................
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)....................
BAHAN DAN METODE....................................................................................
Alat dan Bahan..........................................................................................
Metode Penelitian...........................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN...........................................................................
RNA Total Bunga dan Daun Kelapa Sawit...............................................
Konsentrasi dan Kemurnian RNA Total......................................................
Kualitas RNA Total Hasil Isolasi................................................................
Sintesis cDNA dan Amplifikasi Gen..........................................................
Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1 pada Daun Kelapa Sawit....
Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1 pada Bunga Kelapa Sawit.......
SIMPULAN DAN SARAN.....................................................................................
DAFTAR PUSTAKA...............................................................................................
LAMPIRAN............................................................................................................
ix
ix
ix
1
1
1
2
2
3
3
4
4
4
4
6
6
6
7
7
8
9
10
11
13
DAFTAR TABEL Halaman
1 Konsentrasi dan kemurnian RNA total.............................................................
2 Konsentrasi dan kemurnian cDNA total.........................................................
3 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi EGAD1 dan SQUA1...............................
4 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi EGAD1, AG2, dan SQUA1........................
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Model gen ABC untuk proses pembentukan organ bunga...................................
2 Perbedaan tingkat ekspresi mRNA dari gen EGAD1.......................................
3 Tandan bunga kelapa sawit..............................................................................
4 RNA daun dan bunga kelapa sawit................................................................
5 Elektroforegram hasil RT-PCR pada daun kelapa sawit......................................
6 Elektroforegram hasil RT-PCR pada bunga kelapa sawit..................................
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Diagram alir penelitian.......................................................................................
2 Pembuatan bufer ekstraksi..............................................................................
3 Prosedur elektroforesis gel agarosa.....................................................................
4 Komposisi mix untuk sintesis cDNA.................................................................
5 Komposisi mix untuk amplifikasi dengan PCR (cDNA 600ng)........................
6 Susunan nukleotida primer dan kondisi PCR....................................................
6
8
9
10
14
15
16
17
17
17
2
3
5
7
8
10
“And whatever things you ask in prayer, believing, you will receive.”
Matthew 21: 22
PENDAHULUAN
Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.)
merupakan komoditas penting penyumbang
devisa negara terbesar dari sektor pertanian.
Pada tahun 2006, total devisa yang dihasilkan dari produk berbasis kelapa sawit mencapai 7
miliar dollar AS (Suwito 2007). Ekspor CPO
dan produk turunannya selama Agustus 2009
naik tajam 49% menjadi 1,62 juta ton
dibandingkan dengan Juli yang 1,09 juta ton
(Anonim 2009).
Untuk memenuhi permintaan minyak
sawit yang terus meningkat dilakukan usaha
peningkatan produksi, salah satunya melalui
penggunaan bibit unggul. Aplikasi teknik
kultur jaringan untuk menghasilkan bibit unggul klonal diharapkan dapat mendukung
usaha peningkatan produksi kelapa sawit.
Asmono et al (2004) melaporkan bahwa
produksi kelapa sawit klonal meningkat
menjadi 8.5 ton CPO/ha/tahun dari 7.8
tons/ha/tahun. Sedangkan Agrocom di
Malaysia melaporkan bahwa setelah 7 tahun
ditanam, tanaman kelapa sawit klonal
menghasilkan tandan buah segar dan minyak
masing-masing 40% dan 50% lebih tinggi
dibandingkan tanaman asal biji. Namun dalam
aplikasinya, pada beberapa perkebunan ternyata dideteksi terjadinya abnormalitas
pembungaan dan pembuahan pada tanaman
kelapa sawit hasil kultur jaringan dengan
persentase yang bervariasi (5-100%), sehingga
produksinya justru menurun.
Mantled merupakan sebuah contoh dari
abnormalitas yang terbentuk dalam kultur
jaringan kelapa sawit. Berbagai hasil
penelitian menunjukkan bahwa karakter
mantled bersifat epigenetik (Rival et al 1998;
Matthes et al 2001). Fenomena terjadinya bunga mantled juga berhubungan dengan
metilasi DNA (Kaeppler & Phillips 1993;
Jaligot et al 2000; Matthes et al 2001).
Salah satu gen yang ekspresinya
dilaporkan sejalan dengan terjadinya variasi
somaklonal pada kelapa sawit adalah EGAD1,
gen penyandi protein yang terkait dengan
sistem ketahanan (Tregear et al 2002). Hasil
penelitian menunjukkan bahwa akumulasi
transkrip EGAD1 pada infloresen abnormal
jauh lebih kuat dibandingkan dengan
infloresen yang normal. Perbedaan tersebut juga terjadi pada tingkat kalus. Kalus dan
tunas pucuk yang dikulturkan dari tanaman
abnormal hasil kultur jaringan
mengakumulasikan mRNA EGAD1 jauh lebih
tinggi dibandingkan dengan kalus dan tunas
pucuk yang ditumbuhkan dari tanaman asal
biji maupun dari tanaman normal asal kultur
jaringan.
Tregear et al (2002) menyebutkan bahwa
abnormalitas tanaman kelapa sawit hasil
kultur jaringan mirip dengan mutan tipe B
pada Arabidopsis thaliana maupun
Antirrhinum majus (Coen & Mayerowitz
1991). Mutan semacam ini terjadi pada gen
AP3 dan PI. Sementara itu, AP1 Arabidopsis
merupakan regulator dari gen pembungaan
tipe B AP3 dan PI (Ng & Yanofsky 2001). Di dalam alur genetika pembungaan tanaman
Arabidopsis, penginduksi ekspresi gen AP1
adalah faktor transkripsi dari gen LFY (Pineiro
& Coupland 1998). Menurut Santoso et al
(2004) ekspresi AP1 pada tanaman kakao
terkait erat dengan perkembangan organ
pembungaan. Gen SQUAMOSA (SQUA)
adalah suatu anggota dari suatu keluarga
MADS-box yang homolog dengan gen AP1.
Gen AGAMOUS (AG) diketahui berperan
dalam menentukan identitas organ bunga. Gen ini pada buah kakao diekspresikan secara
diferensial sejalan dengan perkembangannya.
Penelitian ini bertujuan menganalisis
tingkat ekspresi gen AGAMOUS2 (AG2),
SQUAMOSA1 (SQUA1) dan EGAD1 dari
organ reproduktif dan vegetatif tanaman
kelapa sawit normal dan abnormal. Hasil
penelitian ini akan digunakan untuk
mengembangkan teknologi molekuler deteksi
dini abnormalitas kelapa sawit hasil kultur
jaringan. Hipotesis yang diajukan yaitu terdapat perbedaan ekspresi gen AG2, SQUA1
dan EGAD1 pada organ reproduktif dan
vegetatif antara tanaman kelapa sawit normal
dan abnormal.
Analisis tingkat ekspresi gen AG2,
SQUA1 dan EGAD1 diharapkan menambah
informasi ilmiah tentang kaitan antara
akumulasi transkrip gen-gen tersebut dengan
kejadian abnormalitas bunga kelapa sawit
sehingga dapat digunakan sebagai dasar untuk
mengembangkan teknologi molekuler deteksi
dini abnormalitas kelapa sawit hasil kultur jaringan.
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit
Kelapa sawit (Elaies guineensis Jacq.)
termasuk ordo monokotil, famili Arecaceae, subfamili Cocoieae dan genus Elaies (Pahan
2006). Tanaman kelapa sawit merupakan
tanaman asli Afrika (Corley 1976). Kata
„elaeis‟ berasal dari bahasa Yunani yaitu
Elaeion yang berarti minyak, sedangkan
2
„guineensis‟ berasal dari kata Guinea yaitu
nama pantai di Afrika dan „Jacq‟ adalah orang
yang pertama kali memberi nama Elaeis
guineensis pada kelapa sawit (Lubis 1992).
Tanaman kelapa sawit berakar serabut
yang sebagian besar berada dekat permukaan
tanah yaitu pada kedalaman 15-30 cm.
Batangnya tegak tidak bercabang, berdiameter
40-75cm, tinggi batang dalam pembudidayaan
tidak lebih 15-18 m. Kelapa sawit berdaun
majemuk dengan pelepah daun tersusun melingkari batang berbentuk spiral. Panjang
pelepah daun kelapa sawit mencapai 9 m
dengan helai daun mencapai 1.2 m berjumlah
100-160 pasang. Jumlah pelepah yang
dipertahankan dalam perkebunan kelapa sawit
adalah sekitar 30-50 pelepah (Harley 1971).
Abnormalitas
Perbanyakan kelapa sawit diperlukan
terutama untuk memenuhi kebutuhan kelapa
sawit yang tumbuh dan berkembang dengan cepat di Indonesia. Kultur jaringan digunakan
untuk multiplikasi genotipe unggul kelapa
sawit selama beberapa tahun. Namun
penggunaan secara massal proses ini ternyata
menimbulkan masalah baru yaitu munculnya
fenotipe abnormal (mantled) (Corley et al
1986) salah satu keragaman somaklonal dari
kelapa sawit yang disebut dengan mantled
fruit (buah bersayap).
Fenotipe bunga mantled ditunjukkan
dengan terbentuknya daun buah semu dari struktur stamen yang berasal baik dari bunga
jantan atapun dari bunga betina. Pada kasus
yang ekstrim akan menimbulkan bunga yang
steril sehingga tanaman gagal berbuah.
Pertama kali dilaporkan oleh Corley et al
(1986) kejadian ini hanya dideteksi sebanyak
5-10%. Namun, di Laboratorium Bakasawit
Malaysia kejadian bunga mantled meningkat
hingga 80% selama 3-4 tahun proses
regenerasi kultur (Eeuwens et al 2002).
Gen-gen Pembungaan Tanaman
Organ bunga dalam proses
perkembangannya membentuk susunan
lingkaran dari luar ke dalam dengan urutan
sebagai berikut: sepal, petal, stamen dan
karpel (Coen & Carpanter 1993). Hasil
penelitian pada tanaman Arabidopsis thaliana
menunjukkan bahwa perkembangan identitas
organ bunga dipengaruhi oleh ekspresi
beberapa gen pembungaan yaitu APETALA1 (AP1), APETALA2 (AP2), APETALA3 (AP3),
PISTILATA (PI) dan AGAMOUS (AG) (Taiz
dan Zeiger 2002). Berdasarkan aktifitasnya
gen-gen tersebut dikelompokkan menjadi 3
tipe atau kelompok gen yaitu tipe A, B, dan C
yang berpengaruh dalam perkembangan
identitas organ bunga, yang kemudian dikenal
sebegai model ABC (Taiz & Zeiger 2002).
Aktifitas tipe A disandikan oleh gen AP1
dan AP2 yang mengontrol perkembangan
identitas organ pada lingkaran pertama dan kedua yaitu pembentukan sepal dan petal.
Tipe B disandikan oleh gen AP3 dan PI yaitu
mengontrol perkembangan identitas organ
pada lingkaran kedua dan ketiga yaitu
pembentukan petala dan stamen. Tipe C
disandikan oleh gen AG yang mengontrol
perkembangan identitas organ pada lingkaran
ketiga dan keempat yaitu pembentukan
stamen dan karpel (Pinero & Coupland 1998;
Taiz & Zeiger 2002).
Berdasarkan hubungan antara masing-masing gen ABC tersebut diperoleh tiga
bentuk fenotipik bunga (Gambar 1): (B)
Apabila gen pembungaan yang bekerja hanya
gen A dan B saja, maka bunga yang terbentuk
hanya memiliki sepal dan petal sehingga
bunga tersebut tidak mempunyai kelamin
jantan maupun betina. (C) Sedangkan bila
hanya gen B dan C saja yang bekerja, maka
bunga yang terbentuk hanya memiliki stamen
dan karpel saja tidak memiliki sepal dan petal.
Gambar 1 Model gen ABC untuk proses pembentukan organ bunga (Taiz & Zeiger 2002).
3
(D) Apabila gen yang bekerja hanya gen A
dan C, maka bunga yang terbentuk hanya
memiliki sepal dan karpel saja sehingga
kehilangan petal dan stamen. (Coen &
Mayerowitz 1991; Taiz & Zeiger 2002).
Dengan semakin pesatnya kemajuan
penelitian gen pembungaan pada tanaman,
maka model gen ABC berkembang menjadi
model ABCDE, yang disebut dengan model
MADS-box (Pinyopich et al 2003). Tipe D
dibutuhkan untuk perkembangan bakal buah (ovule) (Colombo et al 1995; Theissen 2001;
Ditta et al 2004), dan tipe E dibutuhkan untuk
perkembangan seluruh organ bunga dari
tanaman (Pelaz et al 2000; Honma & Goto
2001). Tipe A terdiri gen SQUAMOSA
(SQUA) subfamili, tipe B terdiri kelas gen
GLOBOSA (GLO) dan DEFICIENS (DEF),
tipe C dan D AGAMOUS (AG), dan tipe E
terdiri dari gen AGAMOUS-like2 (AGL2).
Gen AG adalah keluarga gen MADS-box
yang diperlukan dalam pembentukan identitas organ bunga. Gen ini berperan dalam
pembentukan dan perkembangan stamen
(kepala dan benang sari) dan karpel (putik).
Tingkat ekspresi gen AG dapat ditekan oleh
gen lain seperti BELLRINGER (BELL)
sehingga pengaruh gen AG dalam
pembentukan meristem bunga dan inflorensia
menjadi terhambat (Bao et al 2004).
Mizukami & Ma (1997), melaporkan adanya
fungsi ektopik gen AG yang mempengaruhi
proses transisi SAM (shoot apical meristem) dari pertumbuhan vegetatif ke generatif. Gen
SQUA adalah suatu anggota dari suatu
keluarga MADS-box yang homolog dengan
gen AP1.
EGAD1
Tregear et al (2002) mengungkap salah
satu gen yang tingkat ekspresinya berasosiasi
dengan kejadian abnormalitas mantled. Gen
tersebut adalah gen EGAD1 yang mempunyai
Gambar 2 Perbedaan tingkat ekspresi mRNA
dari gen EGAD1 dibandingkan
dengan ekspresi rRNA pada
beberapa tahapan perkembangan
proses kultur in vitro (Tregear et al
2002).
tingkat homologi tinggi dengan gen defensin
(salah satu gen pertahanan) dari tumbuhan.
Tingkat ekspresi gen EGAD1 dengan kalus
normal lebih rendah dari kalus abnormal
(Gambar 2). Perbedaan tingkat ekspresi
tersebut diduga akibat proses kultur in vitro
yang secara langsung atau tidak langsung
menyebabkan terjadinya perubahan susunan
DNA pada promoter gen EGAD1.
Isolasi RNA
Ribonucleic Acid (RNA) merupakan
senyawa kimia pembawa informasi genetik
yang terdiri atas monomer ribonukeotida
monofosfat yang dihubungkan oleh ikatan
fosfodiester (Goodenough 1988). Dalam sel,
RNA memiliki beberapa bentuk, yaitu: rRNA
(ribosomal RNA), tRNA (transfer RNA), dan
mRNA (messenger RNA). rRNA merupakan
komponen utama penyusun ribosom yang
berperan dalam sintesis rantai protein, tRNA
berfungsi menterjemahkan kodon yang terdapat pada mRNA menjadi satu jenis asam
amino pada proses translasi, sedangkan
mRNA merupakan model cetakan dalam
proses penyusunan asam-asam amino pada
rantai polipeptida dan disandi oleh ruas khas.
Isolasi RNA dilakukan melalui
pemecahan dinding sel, pemisahan protein
dan DNA, dan pemurnian RNA. Untuk
menghilangkan protein dalam larutan
digunakan isoamil alkohol (mengikat protein)
dan kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Untuk
menghilangkan molekul DNA dari larutan,
digunakan DNAse yang berfungsi
mendegradasi molekul tersebut.
Untuk mengetahui kuantitas RNA
digunakan spektofometer. Penyerapan iradiasi
sinar UV secara maksimal oleh RNA dicapai
pada λ 260 nm. Apabila serapan λ ini bernilai
satu, maka konsentrasi molekul mRNA setara
dengan 40 μg/mL (Sambrook et al 1989).
Kualitas RNA dianalisis dengan
elektroforesis. RNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah elektroda yang
bermuatan positif.
Pengamatan hasil elektroforesis
dilakukan dengan bantuan EtBr (Ethidium
Bromide) di bawah sinar UV. Molekul RNA
yang tersisipi EtBr dapat berfluoresensi di
bawah cahaya UV. Jumlah molekul EtBr yang
dapat membentuk interkelasi dengan molekul
RNA sebanding dengan jumlah RNA,
sehingga intensitas pita-pita RNA yang
diamati dalam gel sebanding dengan kuantitas RNA.
4
Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
merupakan suatu reaksi in vitro untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada
target tertentu dengan cara mensintesis
molekul DNA baru yang berkomplemen
dengan molekul DNA tersebut dengan
bantuan enzim DNA polymerase dan
oligonukleotida sebagai primer dalam suatu
termocycler (Glick dan Pasternak 1994). Prinsip pelipatgandaan jumlah molekul
DNA pada target yang diinginkan melalui
teknik PCR adalah: (1) Denaturasi, sehingga
struktur DNA berubah dari untai ganda
menjadi rantai tunggal. Biasanya suhu yang
digunakan adalah 95ºC. (2) Penempelan
(annealing), yaitu penempelan primer pada
DNA yang diinginkan. Suhu yang digunakan
bergantung pada panjang dan komposisi
primer, dan (3) pemanjangan primer
(extension). Setelah primer menempel, enzim polimerase mulai mensintesis molekul DNA
baru yang dimulai dari ujung 3‟ dari masing-
masing primer. Dengan demikian, satu
molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya
menjadi dua molekul DNA. Setelah itu
diulang kembali proses denaturasi,
penempelan, pemanjangan dan seterusnya.
Proses tersebut disebut satu siklus. Jumlah
DNA hasil proses PCR adalah 2n (n = siklus).
Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) merupakan kombinasi dari sintesis cDNA (complementary DNA) dan
PCR. Berbeda dengan PCR, template untuk
RT-PCR berupa RNA total atau RNA yang
mengandung poli (A)+. Primer yang
digunakan dapat berupa primer acak, oligo
(dT), atau sebuah primer spesifik. Sintesis
utas pertama cDNA dilakukan oleh enzim
reverse transcriptase menggunakan primer
oligo dT atau random heksamer. DNA
komplementer utas pertama menjadi template
dalam reaksi PCR tersebut yang menggunakan
primer spesifik dengan enzim polimerase. Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction dapat dilakukan melalui satu tahap
ataupun dua tahap. Pada RT-PCR dua tahap,
sintesis cDNA dilakukan pertama kali dalam
buffer RT, kemudian dilanjutkan dengan
proses PCR. Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) yang
menggunakan satu tahap, sintesis cDNA dan
PCR terjadi dalam satu tabung pada mesin
PCR. Metode RT-PCR dapat digunakan untuk
menganalisis elspresi gen tanpa perlu mengkonstruksi pustaka cDNA.
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah sentrifus
Beckman Coulter Allegra 64R, Eppendorf
sentrifuge 5417R, Beckman coulter-DU 530,
pH meter (Cyberscan 510), GeneAmp PCR System 2400, transluminator UV, autoklaf
(ALP KT-305), microwave (Kenmore), neraca
analitik (Scaltec), mikropipet (Biohit Proline
& Eppendorf), magnetic stirrer, tabung PCR,
tabung mikro (Axygen), tabung sentrifus, gelas
ukur, gelas piala, labu Erlenmeyer, mortar,
dan sudip.
Bahan penelitian yang digunakan adalah
daun serta bunga tanaman kelapa sawit
normal dan abnormal hasil penelitian BPBPI
yang ditanam di kebun kelapa sawit Balai Penelitian Karet Sembawa (BPKS)
Palembang. Bunga dan daun kelapa sawit
dipotong-potong kemudian disimpan pada
suhu -70ºC sampai digunakan. Bahan kimia
yang digunakan adalah N2 cair, PVPP
(polyvinyl poly pyrolidone), trizma base, LiCl,
EDTA, thiourena, aurinitrikarboksilat, 2-
merkaptoetanol, larutan fenol: kloroform:
isoamilalkohol (25:24:1), larutan kloroform:
isoamilalkohol (24:1), natrium asetat 3 M pH
5.2, etanol absolut, DEPC-ddH2O, LiCl 8 M,
etanol 70%-DEPC, etidium bromoda 1% (b/v), agarose, diethyl pyrocarbonate (DEPC),
tris borate EDTA (EDTA) 0.5x, DNA loading
buffer, Super ScriptTM First-Strand cDNA
Synthesis (Invitrogen), DNase, RNase dan
DFS-Taq DNA Polymerase (Invitrogen).
Metode Penelitian
Isolasi RNA
Sebanyak 1.5 g daun atau bunga kelapa
sawit (Gambar 3) digerus hingga halus dengan
penambahan PVPP dan N2 cair, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang
berisi 10 mL buffer ekstraksi. Campuran
dikocok dan divorteks selama 2 menit.
Ekstraksi dilanjutkan dengan menambahkan
fenol: klorofrom: isoamilalkohol 25:24:1
(P:C:I) sebanyak 1 volume. Sampel
dihomogenkan kemudian disentrifus selama
15 menit pada suhu 4°C dan kecepatan 15.000
rpm (F0630 30º, Beckman Coulter Allegra
64R). Supernatan diekstraksi kembali dengan
P:C:I (25:24:1) dengan perlakuan yang sama.
Supernatan yang diperoleh kemudian ditambah klorofrom:isoamilalkohol 24:1 (C:I)
sebanyak 1 volume, dan disentrifus 15.000
5
rpm (F0630 30º, Beckman Coulter Allegra
64R), selama 15 menit dengan suhu 4°C.
Ekstraksi ini dilakukan dua kali.
Supernatan yang diproleh ditambah
1/30xV Na asetat dan 1/10xV etanol absolut,
dihomogenkan dan disimpan dalam es selama
30 menit, untuk memisahkan asam nukleat dari senyawa organik. Setelah itu, campuran
disentrifus selama 15 menit pada suhu 4°C
dan kecepatan 15.000 rpm (F0630 30º,
Beckman Coulter Allegra 64R). Supernatan
yang diproleh ditambah 1/30 v Na asetat dan 3
v etanol absolut dihomogenkan dan disimpan
pada suhu -70ºC selama semalam. Setelah itu
campuran disentrifusi selama 30 menit pada
suhu 4°C dan kecepatan 15.000 rpm (F0630
30º, Beckman Coulter Allegra 64R). Endapan
yang diperoleh dibilas dengan etanol 70% dan
dipindahkan dalam tabung mikro 2 mL kemudian disentrifus selama 3 menit pada
suhu 4°C dan kecepatan 8.000 rpm (FA-45-
24-11, Eppendorf sentrifuge 5417R),
kemudian dikering anginkan. Endapan
dilarutkan dalam 1000 µL DEPCddH2O dan
ditambahkan LiCl 8 M hingga konsentrasi
akhirnya 2 M kemudian diinkubasi selama
semalam pada suhu 4°C untuk
mengendapakan RNA.
RNA yang telah diendapkan disentrifus
selama 30 menit pada suhu 4ºC dan kecepatan 12.000 rpm (FA-45-24-11, Eppendorf
sentrifuge 5417R). Pelet yang diperoleh
dibilas dengan EtOH DEPC 70 % dan
dikeringkan. Supernatan dibuang dan pelet
dilarutkan dengan DEPCddH2O 50 μL.
Uji Kualitatif dan Kuantitatif RNA Total
Hasil Isolasi
Uji kualitatif dan kuantitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%
dan pengukuran absorbansi pada λ 260 nm,
280 nm dan 230 nm. Uji kuantitatif dilakukan
untuk mengetahui konsentrasi RNA.
Konsentrasi RNA diperoleh dari perbandingan
nilai absorbansi 1 pada panjang gelombang
260 nm sama dengan RNA yang memiliki
konsentrasi 40 µg/mL (Sambrook et al 1989)
sehingga konsentrasi RNA dapat ditentukan
dengan persamaan berikut:
[RNA] = A260 x 40 µg/mL x fp
[RNA] : konsentrasi RNA (µg/mL)
A260 : absorbansi pada λ 260nm
Fp : faktor pengenceran
Sedangkan uji kualitatif untuk
menganalisis kemurnian RNA ditentukan
berdasarkan perbandingan absorbansi pada λ
260 nm dengan λ 280 nm untuk kemurnian
RNA terhadap protein dan perbandingan
absorbansi pada λ 260 nm dengan λ 230 nm
yang menunjukkan kemurnian RNA terhadap polisakarida.
Gambar 3 Tandan bunga kelapa sawit A: tanda kelapa sawit abnormal; B: tanda kelapa sawit
normal yang telah dibuka selongsongnya dari phylotaxis ke-12.
A
B
6
Analisis Ekspresi Gen-Gen Target dengan
RT-PCR
Sintesis Utas Pertama Complementary
DNA (cDNA). Utas pertama cDNA disintesis
dengan menggunakan kit Super ScriptTM
First-Strand cDNA Synthesis. Total volume
reaksi yang digunakan sebanyak 20 µL. Ke
dalam tabung mikro steril dimasukkan 2 µg
RNA, 1 µL dNTPs 10 mM dan 1 µL oligo
(dT)12-18 10 pmol/µL serta MFW (molecular free water) steril hingga 10µL, kemudian
diinkubasi pada suhu 65ºC selama 5 menit.
Setelah itu, campuran segera dimasukkan ke
dalam es dan ditambah dengan 2µL buffer RT
10x, 4µL MgCl2 25mM, 2µL DTT 0.1M dan
1µL RNaseOUTTM Recombinant RNase
Inhibitor. Setelah itu campuran diinkubasi
pada suhu 42ºC selama 2 menit, dan
campuran reaksi ditambah dengan Super
ScriptTM II reverse Transcrptase, kemudian
diinkubasi selama 50 menit. Setelah reaksi selesai, inaktivasi enzim dilakukan dengan
inkubasi campuran pada suhu 70ºC selama 15
menit. RNaseH ditambah ke dalam campuran
reaksi untuk menghilangkan RNA,
dilanjutkan inkubasi pada 37ºC selama 20
menit dan terakhir suhu dikondisikan pada
10ºC.
Amplifikasi Fragmen Gen Target
dengan Primer Spesifik. Reaksi PCR
dilakukan dengan total volume 30 µl yang terdiri dari 600ng cDNA utas pertama (first
strand cDNA) sebagai cetakan, pasangan
primer EGAD1, AG2, dan SQUA1 masing-
masing dengan konsentrasi 10 mM sebanyak
1 µl, 3 µl buffer PCR 10x, 0.6 µl dNTPs 10
mM, 0.3 µl Taq DNA polymerase 5 unit/µl
dan NFW (nuclease free water) sampai
mencapai volume 30 µl. Program PCR terdiri
dari pre-denaturasi pada suhu 94ºC selama 30
detik dilanjutkan dengan siklus tertentu yang
terdiri dari denaturasi pada suhu 94ºC selama
30 detik, suhu annealing yang sesuai selama 45 detik, dan elongasi pada suhu 72ºC selama
1 menit 30 detik. Hasil PCR di cek dengan
elektroforesis pada gel agarosa 1.2 %. Primer
EF digunakan sebagai kontrol. Setiap primer
memiliki suhu anealing dan jumlah siklus
yang berbeda-beda (Lampiran 6).
Kuantifikasi Hasil RT-PCR. Hasil
elektroforesis dari PCR dianalisis kuantitas
ekspresi setiap gen menggunakan perangkat
lunak UnScan gel IT.
HASIL DAN PEMBAHASAN
RNA Total Bunga dan Daun Kelapa Sawit
Tahapan isolasi RNA total terdiri atas 3
tahap utama, yaitu pemecahan dinding sel,
ekstraksi dan permurnian RNA. Pemecahan
dinding sel berfungsi membebaskan
sitoplasma dan RNA dalam sel. Nitrogen cair
digunakan karena merupakan cara yang
efektif untuk membekukan jaringan sehingga
mudah dihancurkan, selain itu kondisi suhu
yang dingin dapat membuat RNAse inaktif (Wilkins dan Smart 1996). Penambahan PVPP
dan β-merkaptoetanol berfungsi menghambat
kerja enzim polifenol oksidase yang
menyebabkan terjadinya oksidasi senyawa
fenol pada sampel.
Tahap kedua, yaitu ekstraksi yang
meliputi penggunaan senyawa pengekstrak
dan pengendapan RNA. Pengekstrak P:C:I
(25:24:1) dan C:I (24:1) berfungsi
memisahkan lemak, protein, glukosa, dan
kontaminan DNA. Pengendapan RNA
dilakukan dengan penambahan Na-asetat dan etanol absolut. Tahap selanjutnya merupakan
pemurnian dengan penambahan LiCl 8M dan
pencucian dengan etanol 70%. Isolasi harus
dikerjakan secara hati-hati karena RNA sangat
sentitif terhadap panas dan keberadaan RNAse
dapat mendegradasi RNA.
Kosentrasi dan Kemurnian RNA Total
Hasil Isolasi Uji kuantitatif dengan spektrofotometer
UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dapat diamati pada Tabel 1. Konsentrasi
RNA hasil isolasi berdasarkan pengukuran
pada λ 260 nm, nilai 1 unit absorban
sebanding dengan μg/ml RNA (Wilson &
Walker 2000). Berdasarkan Sambrook et al
(1989) konsentrasi RNA didapat dari
perkalian nilai absorban dengan faktor
pengenceran dan 40 μg/ml.
Kosentrasi RNA total pada semua sampel
berkisar antara 344-884 ng/μL. Hasil
pengukuran kemurnian RNA menggunakan
spektrofotometer menunjukkan bahwa rasio serapan pada λ 260/280 umumnya lebih besar
dari 1.7 kecuali pada DA sebesar 1.420 ng/μL.
Perbandingan serapan pada λ 260/280
menunjukkan kemurnian RNA terhadap
kontaminan protein. Perbandingan 1.80
hingga 2.00 menunjukkan kemurnian yang
cukup baik dan sedikitnya kontaminan protein
dalam larutan ekstrak RNA (Boyer 1986).
Hal ini menunjukkan sedikitnya kontaminasi
7
Tabel 1 Konsentrasi dan kemurnian RNA
total hasil isolasi
Sampel Konsentrasi
(ng/μL)
Kemurnian
260/280 260/230
DA 344 1.464 1.258
DN 264 1.711 1.579
BA 884 1.871 1.763
BN 672 2.053 2.011 Ket : DA : Daun kelapa sawit abnormal
DN : Daun kelapa sawit normal
BA : Bunga abnormal
BN : Bunga normal
protein pada larutan RNA baik dari daun
maupun bunga kelapa sawit
Ditinjau dari rasio serapan pada λ
260/230 umumnya lebih besar dari 1.5 kecuali
DA sebasar 1.258 ng/μL. Perbandingan yang
diharapkan lebih besar atau sama dengan 1.80
(Luebbehesun 2004), maka diketahui RNA
yang diekstrak terkontaminasi polisakarida. Kemungkinan hal ini disebabkan tingginya
kandungan serat pada buah kelapa sawit.
Ketidakakuratan pengukuran konsentrasi
karena spektrofotmeter UV pada λ 260 nm
mengukur RNA dan DNA (Sambrook et al
1989) secara total sehingga kontaminan DNA
pun terbaca. Oleh karena itu diperlukan
konfirmasi lebih lanjut untuk mengetahui
konsentrasi RNA yang sebenarnya
menggunakan visualisasi dengan gel agarosa.
Kualitas RNA Total Hasil Isolasi
Analisis kualitatif RNA total diamati
menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%.
Gambar 4 menyajikan hasil elektroforesis
RNA total yang diisolasi dari daun dan bunga
kelapa sawit normal dan abnormal.
Penggunaan konsentrasi RNA dalam jumlah
yang sama (250 ng) untuk setiap sampel pada
elektroforesis gel agarosa bertujuan
mengetahui kesamaan kualitas intensitas
masing-masing sampel. Intensitas pita RNA
yang dihasilkan dapat mengkonfirmasi nilai konsentrasi hasil perhitungan dengan
spektrofotometer sehingga diketahui
konsentrasi RNA hasil isolasi yang
sebenarnya.
Sampel DA dan DN pada visualisasi
dengan gel agarosa memiliki intensitas setiap
Gambar 4 RNA daun dan bunga kelapa sawit
pita lebih tebal dibandingkan dengan intesitas
pita BA dan BN. Namun pengukuran
spektrofotometer (Tabel 1) DA dan DN
memiliki konsentrasi lebih rendah.
Perbedaan intensitas pita ini
menunjukkan konsentrasi RNA yang beragam
pada masing-masing sampel, hal ini perlu
diperhatikan karena akan mempengaruhi hasil
uji ekspresi. Intensitas pita yang dihasilkan
merupakan visualisasi dari jumlah konsentrasi
yang sama pada masing-masing sampel (250 ng). Penggunaan konsentrasi RNA pada uji
ekspresi dengan metode RT-PCR memerlukan
konsentrasi RNA yang sama karena akan
mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk.
Hasil elektroforegram RNA total
menunjukkan adanya 2 (dua) pita RNA yang
dominan pada RNA total yang diisolasi dari
daun maupun bunga kelapa sawit abnormal
dan normal yang kemungkinan adalah RNA
ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 4).
Hal ini menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi
sehingga sangat baik digunakan sebagai
cetakan untuk sintesis cDNA total. Selain itu
juga menunjukkan bahwa RNA yang diisolasi
tidak mengalami degradasi.
Berdasarkan Gambar 4 dan Tabel 1
tersebut diduga bahwa RNA hasil isolasi
dapat digunakan untuk analisis ekspresi
gennya dengan metode RT-PCR. Pada
penelitian ini digunakan RT-PCR melalui
pembentukan first strand cDNA terlebih dahulu baru kemudian diteruskan dengan
proses PCR.
Sintesis cDNA dan Amplifikasi Gen
EGAD1, AG2, dan SQUA1
Penelitian ini menggunakan kit Super
ScriptTM First-Strand cDNA Synthesis
(Invitrogen). Reaksi dimulai dengan
penambahan primer oligo(dT), primer ini akan
berpasangan dengan adenin pada mRNA (ekor
poli A). Komponen nukleotida (dNTPs)
dengan bantuan reverse transcrptase berpasangan dengan basa komplemennya
pada mRNA sehingga terbentuk utas pertama
cDNA. Proses selanjutnya mRNA dipisahkan
dari hibrid (mRNA-cDNA) dengan cara
mendegradasi mRNA menggunakan enzim
RNaseH.
Sebelum cDNA digunakan dalam PCR
terlebih dahulu diukur konsentrasinya (Tabel
2). Penggunaan konsentrasi cDNA pada uji
ekspresi dengan metode RT-PCR memerlukan
konsentrasi cDNA yang sama karena akan mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk.
28S
18S
8
Sebanyak 600ng cDNA diamplifikasi
menggunakan PCR. Teknik ini digunakan
untuk mendeteksi gen AG2, SQUA1, dan
EGAD1 bunga dan daun kelapa sawit normal
dan abnormal menggunakan primer spesifik
gen EGAD1, AG2, dan SQUA1 kelapa sawit
yang telah dirancang pada penelitian
sebelumnya. Primer EF digunakan sebagai
kontrol.
Elongation Factor (EF) adalah salah satu
house keeping enzim yang berfungsi pada proses sintesis protein. Oleh karena itu, gen
penyandi EF banyak digunakan sebagai
kontrol dalam reaksi RT-PCR untuk studi
ekspresi suatu gen. Enzim tersebut akan
terekspresi terus menerus (konstitutif) dalam
jumlah yang sama pada setiap sel karena EF
mampu meningkatkan kerja enzim polimerase
dan menekan penghentian proses transkripsi
(Lehninger 1992).
Tabel 2 Konsentrasi dan kemurnian cDNA
total dari organ reproduktif dan vegetatif kelapa sawit
Sampel Konsentrasi
(ng/μL)
Kemurnian
260/280 260/230
DA 459.54 1.506 1.661
DN 472.86 1.561 1.700
BA 546.12 1.473 1.643
BN 542.79 1.492 1.633
Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1
pada Daun Kelapa Sawit
Uji ekspresi pada penelitian ini dilakukan
menggunakan teknik RT-PCR. Sampel yang
diuji merupakan sampel daun kelapa sawit
abonormal dan normal. Molekul cDNA hasil
sintesis selanjutnya diamplifikasi dengan
primer AG2, SQUA1, dan EGAD1. Molekul
DNA hasil RT-PCR selanjutnya
dielektroforesis pada agarosa 2%.
Tingkat ekspresi setiap gen diamati
melalui perbedaan intesitas pita yang
dihasilkan oleh masing-masing sampel pada
agarosa. Intensitas berbanding lurus dengan
ekspresi gen. Intensitas pita hasil
elektroforesis dikuantifikasi dalam satuan
ng/mL menggunakan perangkat lunak UnScan gel IT. Perangkat lunak ini menbandingkan
piksel pita sampel dengan piksel standar
(marker yang telah diketahui konsentrasinya)
sehingga didapat konsentrasi pita sampel.
Pita DNA yang dihasilkan pada Gambar 5
merupakan elektroforegram hasil RT-PCR
pada daun kelapa sawit abnormal dan normal
menggunakan primer EF (sebagai kontrol),
EGAD1, dan SQUA1. Perbedaan intesitas pita
setiap gen pada setiap sampel menunjukkan
tingkat ekspresi yang berbeda. RT-PCR untuk AG2 pada daun yang diteliti tidak
menghasilkan amplikon baik dari kelapa sawit
abnormal maupun normal. Ini menguatkan
laporan Adam et al (2007) yang menyatakan
gen AG2 tidak terekspresi pada daun kelapa
sawit.
Secara visual tampak bahwa akumulasi
mRNA EGAD1 daun kelapa sawit abnormal
memiliki intensitas infloresen lebih rendah
dibandingkan dengan daun kelapa sawit
normal dengan ukuran sekitar 300 bp. Akumulasi transkrip mRNA EGAD1 pada DA
dan DN secara berurutan sebesar 5.82 ng/mL
dan 15.96 ng/mL (Tabel 3). Ini menguatkan
hasil penelitian Karunanandaa et al (1994)
Gambar 5 Elektroforegram hasil RT-PCR pada daun kelapa sawit abnormal dan normal (M :
Marker 1 kb plus DNA ladder; 1: kontrol EF; 2 : gen EGAD1; 3 : gen SQUA1; DA :
daun kelapa sawit abnormal ; DN : daun kelapa sawit normal).
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
9
yang menyebutkan bahwa gen EGAD1
terdapat pada keseluruhan jaringan tanaman.
Ekspresi SQUA1 pada daun kelapa sawit
memiliki pola yang sama dengan ekspresi
EGAD1. Dimana daun kelapa sawit abnormal
memiliki ekspresi yang lebih rendah
dibandingkan dengan ekspresi daun kelapa
sawit normal. Hal ini didukung hasil
kuantifikasi UnScan gel IT, kuantitas DA
sebesar 51.59 ng/mL dan DN sebesar 80.20
ng/mL (Tabel 3). Masiero et al (2002) dan Fornara et al (2004) menyatakan gen ini
diekspresikan pada daun tanaman. Adam et al
(2006) menyebutkan akumulasi mRNA
SQUA1 kelapa sawit terdapat pada daun
namun akumulasinya sangat rendah.
Nilai kuantitas didapatkan dari hasil
perbandingan nilai kuantitas gen dengan nilai
kuantitas EF. Pola nilai kuantitas melihat
kekonsistenan pola ekspresi setiap gen pada
daun kelapa sawit abnormal maupun daun
kelapa sawit normal. Hasil nilai kuantitas menunjukkan bahwa daun kelapa sawit
abnormal lebih rendah dibandingkan daun
kelapa sawit normal baik pada ekspresi
EGAD1 maupun SQUA1. Ini menunjukkan
ekspresi EGAD1 dan SQUA1 konsisten pada
daun kelapa sawit.
Tabel 3 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi
EGAD1 dan SQUA1 pada daun
kelapa sawit normal dan abnormal
dengan program UnScan gel IT
Sampel
Akumulasi
EGAD1
(ng/mL)
Akumulasi
EF (ng/mL)
Nilai
Kuantitas
(EGAD1/EF)
DA 5.82 68.03 0.08
DN 15.96 44.42 0.36
Sampel
Akumulasi
SQUA1
(ng/mL)
Akumulasi
EF (ng/mL)
Nilai
Kuantitas
(SQUA1/EF)
DA 51.59 68.03 0.76
DN 80.20 44.42 1.80
Ekspresi mRNA EGAD1, AG2, dan SQUA1
pada Bunga Kelapa Sawit
Analisis ekspresi EGAD1, AG2, dan
SQUA1 pada bunga kelapa sawit sama halnya
dengan analisis ekspresi pada daun kelapa
sawit. Elektroforegram (Gambar 6)
menunjukkan adanya ekspresi EGAD1, AG2,
dan SQUA1 pada bunga kelapa sawit
abnormal maupun normal. Kisaran ukuran
EGAD1, AG2, dan SQUA1 yang dihasilkan
secara berurutan sekitar 300 bp, 500 bp dan
400 bp.
Akumulasi transkrip mRNA EGAD1 pada
bunga abnormal memiliki intensitas infloresen
yang lebih tinggi dibandingkan bunga normal.
Hasil kuantifikasi EGAD1 yaitu BA memiliki
konsentrasi sebesar 130.55 ng/mL dan BN
sebesar 105.77 ng/mL (Tabel 4). Ini
menguatkan laporan Treager et al (2002) yang
menyatakan akumulasi transkrip mRNA
EGAD1 pada infloresen bunga abnormal lebih
tinggi dibandingkan dengan bunga normal.
Akumulasi transkrip EGAD1 bunga
abnormal dan normal berbeda-beda dapat
disebabkan interaksi dengan hormon tumbuh, yang dimulai dari tingkat kalus (Eeuwens et al
2002). Pada bunga kelapa sawit sebagai organ
reproduksi, tingkat ekspresi EGAD1 dapat
tergganggu oleh mikroorganisme. EGAD1
menyandi protein yang melindungi organ
reproduksi tanaman dari serangan
mikroorganisme (Karunanandaa et al 1994).
Berbeda dengan daun, AG2 terekspresi
pada bunga abnormal dan normal. Adam et al
(2007) menyebutkan AG2 terkspresi pada
bunga kelapa sawit. Akumulasi transkrip mRNA AG2 pada bunga abnormal memiliki
intensitas infloresen lebih tinggi dibandingkan
dengan bunga normal. Nilai kuantitas yang
didapatkan yaitu BA sebesar 174.20 ng/mL
dan BN sebesar 151.01 ng/mL (Tabel 4).
Hasil ini sesuai dengan hasil penelitian Riyadi
(2008) yang menyatakan ekspresi AG2 yang
dihasilkan organ reproduktif abnormal lebih
tinggi dibandingkan pada organ normal.
Adam et al (2007) menyebutkan gen AG2
pada kelapa sawit terlibat dalam kontrol indentitas organ bunga jantan dan bunga
betina. Jika akumulasi gen AG2 pada bunga
menjadi lebih tinggi akan terganggunya
kontrol identitas organ reproduktif terutama
kontrol bunga jantan sehingga menyebabkan
Tabel 4 Hasil dan nilai kuantifikasi ekspresi
EGAD1, AG2, dan SQUA1 pada
bunga kelapa sawit normal dan
abnormal dengan program UnScan
gel IT
Sampel
Akumulasi
EGAD1
(ng/mL)
Akumulasi
EF (ng/mL)
Nilai
Kuantitas
(EGAD1/EF)
BA 130.55 145.79 0.89
BN 105.77 141.28 0.74
Sampel Akumulasi
AG2(ng/mL)
Akumulasi
EF (ng/mL)
Nilai
Kuantitas
(AG2/EF)
BA 174.20 145.79 1.20
BN 151.01 141.28 1.06
Sampel
Akumulasi
SQUA1
(ng/mL)
Akumulasi
EF (ng/mL)
Nilai
Kuantitas
(SQUA1/EF)
BA 120.72 145.79 0.80
BN 94.75 141.28 0.67
10
abnormalitas (Coen & Mayerowitz 1991 &
Taiz & Zeiger 2002). Dimana menurut Corley
et al (1986) abnormalitas berupa terbentuknya
rangkaian bunga jantan andromorphic dan
buah mantled sebagai akibat adanya kesalahan
fungsi dari organ-organ reproduksi.
Gen AG2 dan EGAD1, memiliki
hubungan pengaturan terhadap organ
reproduktif dari tumbuhan (Karunanandaa et
al 1994, Coen & Mayerowitz 1991, dan Taiz & Zeiger 2002). Dengan demikian adanya
gangguan mikroorganisme dapat juga
menyebabkan ekspresi AG2 terganggu.
Akumulasi transkrip mRNA SQUA1 pada
bunga kelapa sawit abnormal dan normal
menguatkan hasil penelitian Adam et al
(2006), yang menyebutkan SQUA1
terekspresi pada bunga kelapa sawit. Hasil
yang diperoleh intensitas infloresen bunga
abnormal lebih tinggi dibandingkan dengan
bunga normalnya. Kuantitas yang dimiliki
hasil oleh BA sebesar 120.72 ng/mL sedangkan kuantitas BN sebesar 94.75 ng/mL.
Adam et al (2007) gen SQUA1 pada
kelapa sawit banyak ditemukan pada stamen
dan petal. Gen SQUA1 merupakan gen tipe A
pada MADS-Box sehingga diduga jika gen ini
ekspresi berlebihan maka dapat terjadi bunga
fertil yaitu tidak memiliki bunga jantan
maupun betina.
Pola kuantitas ekspresi EGAD1, AG2, dan
SQUA1 bunga kelapa sawit memiliki pola
yang sama, yakni bunga abnormal memiliki tingkat ekspresi yang lebih tinggi
dibandingkan bunga normal. Pola ini sama
dengan nilai kuantitas (konsentrasi akumulasi
setiap gen dibandingkan dengan konsentrasi
akumulasi kontrol EF). Pola nilai kuantitas
dari EGAD1, AG2, dan SQUA1 yakni bunga
abnormal memiliki nilai kuantitas lebih tinggi
dibandingkan nilai kuantitas bunga normal.
Ini menyakinkan bahwa ekspresi dari gen
EGAD1, AG2, dan SQUA1 konsisten pada
bunga kelapa sawit.
Akumulasi transkrip gen EGAD1, AG2, dan SQUA1 yang berbeda antara bunga
abnormal dan bunga normal diduga terkait
dengan metilasi sekuen spesifik DNA
genomik. Mathhes et al (2001)
mengemukakan bahwa adanya korelasi antara
hipometilasi dan variasi somaklonal
pembungaan mantled pada kelapa sawit.
Hipometilasi menyebabkan struktur kromatin
menjadi longgar sehingga memudahkan
terjadinya transkrip. Dengan demikian
akumulasi transkripsi yang dihasilkan lebih
banyak dan ekspresi gen meningkat (Griffths et al 2000).
SIMPULAN DAN SARAN
Ekspresi gen EGAD1 dan SQUA1 pada
daun kelapa sawit abnormal lebih rendah
dibandingkan dengan daun kelapa sawit normal. Tidak ditemukan akumulasi mRNA
AG2 pada daun kelapa sawit abnormal dan
normal. Ekspresi gen EGAD1, AG2, dan
SQUA1 pada bunga abnormal lebih tinggi
dibandingkan dengan bunga normal.
Gambar 6 Elektroforegram hasil RT-PCR pada bunga kelapa sawit abnormal dan normal (M :
Marker 1 kb plus DNA ladder; 1: kontrol EF; 2 : gen EGAD1; 3 : gen AG2; 4 :gen
SQUA1; BA : bunga kelapa sawit abnormal; BN : bunga kelapa sawit normal).
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
11
Saran yang diajukan adalah perlu
dilakukannya analisis akumulasi gen EGAD1,
AG2, dan SQUA1 pada organ vegetatif dari
tanaman kelapa sawit muda dan pembibitan
untuk mengkonfirmasi kuantitas pola
ekspresinya.
DAFTAR PUSTAKA
Adam H et al. 2006. MADS Box Genes in Oil
Palm (Elaeis guineensis): Patterns in
the Evolution of the SQUAMOSA,
DEFECIENS, GLOBOSA,
AGAMOUS, and SEPALLATA
Subfamilies. J Mol Evol 62:15-31.
Adam H et al. 2007. Functional
characterization of MADS box genes involved in the determination of oil
palm flower structure. J Exp Bot
58:1245-1259.
[Anonim]. 2009. Volume Ekspor CPO RI
Naik Tajam Agustus [terhubung
berkala]. http://detiklagi.com [20 Jan
2010].
Bao X, Franks RG, Levin JZ & Liu Z. 2004.
Repression of AGAMOUS by
BELLRINGER in Floral and
Inflorescene Meristems. Plant Cell
16:1478-1489.
Chaidamsari T et al. 2006. Isolation and
characterization of an AGAMOUS
homologue from cocoa. Plant Sci
170:968-975.
Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple
and efficient method for isolating
RNA from pine trees. Plant Mol Biol
Rep 11:113-116.
Coen ES, Meyerowitz. 1991. The war of the
whorls: genetic interactions
controlling flower development. Nat 353:31-37.
Coen ES, Carpenter R. 1993. The
metamorphosis of flowers. Plant Cell
5:1175-1181.
Colombo L et al. 1995. The petunia MADS-
box gene FBP11 determines ovule
identity. Plant Cell 7:1859–1868.
Corley RHV, Gray BS. 1976. Growth and
Morphology. In. Corley RHV, JJ
Hordon, BJ Wood (eds).
Development in crop science 1- oil
palm research. Amsterdam: Elsevier
Scientific.
Corley RHV. 1976. The Genus Elaeis. In.
Corley RHV, JJ Hordon, BJ Wood
(eds). Development in crop science
1-oil palm research. Amsterdam:
Elsevier Scientific.
Corley RHV, Lee CH, Law LH, Wong CY.
1986. Abnormal development in oil
palm clones. The Planter Kuala
Lumpur 62:233-240.
Euweens CJ et al. 2002. Effects of Tissue
Culture Conditions during Embroid
Multiplication on The Incidence of
“Mantled” Flowering in Clonally
Propagated Oil Palm. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 70:311-
323.
Ditta G, Pinyopich A, Robles P, Pelaz S,
Yanofsky MF. 2004. The SEP4 gene
of Arabidopsis thaliana functions in
floral organ and meristem identity. Curr Biol 14:1935–1940.
Fornara F et al. 2004. Functional
characterization of OsMADS18,
amember of the AP1/SQUA
subfamily of MADS box genes.
Plant Physiol 135:2207–2219.
Glick BR, Pasternak JJ. 1994. Molecular
Biotechnology: Principles and
Applications of Recombinant DNA.
ASM Pr. Washington. p. 19-22; 34;
71-75.
Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT,
Lewontin RC, Gelbart WM. 200. An
introduction to Genetic Analysis.
Edisi ke-7. Freeman WH. New York.
359-360.
Honma T, Goto K. 2001. Complexes of
MADS-box proteins are sufficient to
convert leaves into floral organs.
Nature 409:525–529.
Jaligot E, Rival E, Beulẻ T, Dussert S,
Verdeil JL. 2000. Somaclonal
Variation in Oil Palm (Elaeis guineensis Jacq.): The DNA
Methylation Hypothesis. Plant Cell
Rep 19:684-690.
Kaeppler SM, Phillips SR. 1993. Tissue
Culture-Induced DNA Methylation
Variation in Maize. In Proceedings
of National Academy of Sciences.
USA 90:8773-8776.
12
Karunanandaa B, Singh A, Kao T H. 1994.
Characterization of predominantly
pistil-expressed gene encoding a γ-
thionin-like protein of Petunia
inflate. Plant Mol Biol 26:459-464.
Lubis AU. 1992. Kelapa Sawit (Elaeis
guineensis Jacq.) di Indonesia. Pusat
Penelitian Perkebunan Marihat-
Bandar Kuala, Sumatera Utara.
422hal.
Masiero S et al. 2002. Ternary complex formation between MADS-box
transcription factors and the histone
fold protein NF-YB. J Biol Chem
277:26429–26435.
Matthes M, Singh R, Cheah SC, Karp A.
2001. Variation in Oil palm (Elaeis
guineensis Jacq.) Tissue Culture-
Derived Regenerats Revealed by
AFLPs With Methylation-Sensitive
Enzyms. TAG 102:971-979.
Mizukami Y, H Ma. 1997. Determination of Arabidopsis Floral Meristem Identity
by AGAMOUS. The Plant Cell
9:393-408.
Ng M, Yanofsky. 2001. Activation of
Arabidopsis by APETELA1. Plant
Cell 13:739-753.
Okayama H, Berg P. 1982. High efficiency
cloning of full-length cDNA. Mol
Cell Biol 2:161.
Pahan I. 2006. Panduan Lengkap Kelapa
Sawit: Manajemen Agribisnis dari Hulu hingga Hilir. Penebar Swdaya:
Jakarta. Hal. 68-78.
Pelaz S et al. 2000. B and C floral organ
identity function require Asepallata
MADS-box genes. Nature 405:200-
203.
Pinero M, Coupland G. 1998. The Control of
Flowering Time and Floral Identity
in Arabidopsis. Plant Physiol. 117:
1-8.
Pinyopich A et al. 2003. Assessing the
redundancy of MADS-box genes during carpel and ovule
development. Nature 424:85-88.
Rival A et al. 1998. Suitability of RAPD
Analysis for The Detection of
Somaclonal Variants in Oil Palm
(Elaeis guineensis Jacq.). Plant
Breeding 117:73-76.
Riyadi I. 2008. Studi ekspresi gen penyandi
AGAMOUS dan LEAFY tanaman
kelapa sawit (Elaeis guineensis
Jacq.) normal dan abnormal hasil
kultur jaringan [tesis]. Bogor:
Program Pascasarjana, IPB.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning a Laboratory
Manual. Ed ke-2. New York: Cold
Spring Harbor Laboratory.
Santoso D et al. 2004. Molecular and genetic engineering studies toward
improvement of cacao bean
production. RUTi ANNUAL
REPORT 2004, IBRIEC-PRI, 54p.
Suwito. 2007. Kebutuhan Dukungan
Kebijakan, Pendanaan dan
Teknologi Terkini untuk Revitalisasi
Perkebunan Kelapa sawit. Seminar,
Pameran da Promosi Inovasi
Teknologi Perkebunan 2007 untuk
Mendukung Revitalisasi Perkebunan, 20-21 November 2007. Jakarta.
Taiz L, Zeiger E. 2002. Plant Physiology.
Sinauer Associate Inc. p:559-589.
Theissen G. 2001. Development of floral
organ identity: stories from the
MADS house. Curr Opin Plant Biol.
4:75–85.
Tregear JW et al. 2002. Characterization of a
Defensin Gene Expressed in Oil
Palm Inflorescence: Induction
During Tissue Culture and Possible Association with Epigentic
Simaclonal Variaton Events. Exp
Botany 53:1387-1396.
Wilkins TA, Smart LB. 1996. Ioslation of
RNA from plant tissue. Di dalam: A
Laboratory Guide to RNA Isolation,
Analysis and Synthesis. Kreig PA,
editor. New York: Wiley-Liss Inc.
Wilson K, Walker J. 2000. Principles and
Techniques of Practical
Biochemistry. UK: Cambrige
University.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Isolasi RNA
Uji kualitatif dan
kuantitatif RNA total
Sintesis utas pertama
complementary DNA
(cDNA)
Amplifikasi cDNA
dengan primer
EGAD1.2, AGAMOUS
dan SQUA
Analisis ekspresi dengan
UnScan gel IT
15
Lampiran 2 Pembuatan buffer ekstraksi
Trizma base 2.4228g + LiCl
1.2717g + EDTA 0.3722g
Larutkan dengan 80mL
akuades
pH diatur menjadi 8.5
dengan HCl pekat
Tera ke labu takar 100mL
dan di homogenkan
Letakkan di
pengaduk magnetik
Di pindahkan ke botol
larutan
Di tambahkan PVP 1%
(w/v)
Sterilasi dengan
autoclave
Sesaat sebelum di gunakan 70 mL larutan
ditambahkan Thiourena 0.0266g,
aurinitrikarboksilat 0.0294g dan 2-
Merkaptoetanol 700µL
16
Lampiran 3 Prosedur elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al. 1989)
0.15 gram (untuk 0.5%) atau 0.3 gr (untuk 1 %) atau 0.45 gr
(untuk 1.5%) agarosa ditimbang dan dilarutkan dalam 30 mL
bufer TBE 0.5x. Pemanasan dilakukan untuk membantu
pelarutan.
Larutan didiamkan hingga cukup hangat.
EtBr sebanyak 1.5 µL
ditambahkan
Larutan dituang dalam cetakan
yang telah disusun bersama
sisirnya.
Setelah gel memadat,
sisir diambil
17
Lampiran 4 Kompisisi mix untuk sintesis cDNA
Komposisi sampel (2µg RNA) µL
DNTPs 1
Oligo dT 1
DEPC x
Total 10
Komposisi mix (2µg RNA) µL
Buffer 2
2.5mM MgCl2 4
0.1M DTT 2
RNAse out 1
Lampiran 5 Komposisi mix untuk amplifikasi dengan PCR (cDNA 600ng)
Komposisi mix µL
Buffer 3
MgCl2 1
dNTPs 0.6
Taq polymerase 0.3
Primer F 1
Primer R 1
NFW x
Total 30
Lampiran 6 Susunan nukleotida primer dan kondisi PCR untuk analisis ekspresi
Primer Susunan nukleotida Suhu Anealing
(ºC) Jumlah silklus
PCR
EGAD1-F 5‟-CTGAGCGTGTGTTAGCTAGTGTGTT-3‟ 55 35
EGAD1-R 5‟-TACCACAAAGGATAGAACAGAGCAAC-3‟
SQUA-F 5‟-ACTGCAGGAGCAGAACAAGATGC-3‟ 65
25 (Bunga) 35 (Daun) SQUA-R 5‟-CACTTAAGGTTCCCACAGCCCC-3‟
AG-F 5‟TGATGGGAGATTCTCTTGGCTCC-3‟ 65 35
AG-R 5‟ATGAAAGGCTACCAACTCGGGC-3‟
Top Related