ANALISA PROFIL PROTEIN ISOLAT Escherichia coli S1
HASIL IRADIASI SINAR GAMMA
IKMALIA 103096029804
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2008 M / 1429 H
Motto:
“Jika engkau kesulitan dalam pekerjaanmu, jangan putus asa, jangan gelisah dan jangan
ragu. Percayalah, jalan keluar akan segera datang”.
“Jalan kebahagiaan ada di depanmu. Carilah ia dalam lautan ilmu, amal shaleh
dan akhlak yang mulia. Bersikaplah obyektif dalam setiap hal, niscaya engkau
akan bahagia”.
“Ya Allah, Engkau adalah Tuhanku. Tidak ada Tuhan selain Engkau.
Engkau telah menciptakan aku dan aku adalah hamba-Mu. Aku berada
dalam janji dan akan menepati perjanjian itu semampuku. Aku berlindung
dari buruk yang aku perbuat. Aku mengakui nikmat-Mu padaku. Aku
mengakui dosa dosaku. Ampunilah aku, sesungguhnya tidak ada yang
mengampuni dosa kecuali Engkau”.
Skripsi ini kupersembahkan untuk
Ibunda dan Ayahanda tercinta
Kakanda dan Adinda tersayang
Serta seorang adam terkasih
Semoga Allah meridhoinya.
ABSTRAK
IKMALIA. Analisa Profil Protein Isolat Escherichia coli S1 Hasil Iradiasi Sinar Gamma. Dibawah bimbingan IRAWAN SUGORO dan SANDRA HERMANTO.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil protein Escherichia coli S1 hasil iradiasi sinar gamma sebagai bahan vaksin mastitis inaktif. Kultur sel (1013 sel/ml) diiradiasi dengan dosis 0, 50, 200, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 Gy dengan laju dosis 1089,59 Gy/Jam. Kultur sel dianalisis kandungan protein intraselular dan ekstraselular dengan metoda Lowry. Profil protein dianalisis menggunakan SDS-PAGE dengan konsentrasi gel 10% dan protein standar (marker) dengan berat molekul 10 – 220 kDa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri E. coli mampu diinaktivasi pada dosis diatas 800 Gy. Pada dosis inaktivasi menunjukan tidak ada pengaruh yang signifikan (Sign > 5%) terhadap profil protein yang dihasilkan, bila dibandingakan dengan kontrol. Hal ini menunjukan bahwa protein hasil iradiasi pada dosis inaktif dapat digunakan sebagai bahan vaksin mastitis inaktif.
Kata Kunci: Vaksin, Protein, Escherichia coli, Iradiasi sinar gamma, dan SDS-PAGE.
ABSTRACT
IKMALIA. Analyze the protein profile of Escherichia coli S1 which irradiated by gamma rays. Advisor IRAWAN SUGORO and SANDRA HERMANTO.
The experiment has been conducted to study the protein profile of Escherichia coli S1 which irradiated by gamma rays as inactive mastitis vaccine. Cell culture (1013 cells/ml) was irradiated with dose 0, 50, 200, 500, 600, 700, 800, 900, and 1000 Gy with dose rate of 1089,59 Gy/Jam. The cell culture was analyzed for total intracellular and extra cellular protein by Lowry method. The protein profile was analyzed by SDS-PAGE with 10% gel concentration and standard protein (marker) of molecular weight was 10 – 220 kDa. The result showed that E. coli cells could be inactivated by doses higher than 800 Gy. The profile protein of inactivated doses weren’t affected significantly than control. Based on the result, the protein of inactivated doses can be used as inactive mastitis vaccine. Key words: Vaccine, protein, Escherichia coli, gamma ray irradiation, and SDS-
PAGE.
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum wr. wb.
Segala puji serta syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah
melimpahkan rahmat serta hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi ini dengan judul “Analisa Profil Protein Isolat Escherichia coli S1 Hasil
Iradiasi Sinar Gamma”.
Shalawat serta salam semoga senantiasa dilimpahkan kepada Nabi
Muhammad SAW beserta segenap keluarga, para sahabat dan para pengikutnya
hingga yaumul kiyamah.
Terselesaikannya skripsi ini tidak lepas dari peranan berbagai pihak yang telah
ikut secara langsung maupun tidak langsung. Penulis sadar sepenuhnya, bahwa
bagaimanapun usaha yang ditempuh tanpa adanya bimbingan dan bantuan dari
pihak lain, penulisan skripsi ini tidak akan terselesaikan dengan baik. Maka dalam
kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada:
1. Bapak DR. Syopiansyah Jaya Saputra, M.Sis, selaku dekan Fakultas Sains
dan Teknologi.
2. Ibu Sri Yadial Chalid, M.Si, selaku ketua Program Studi Kimia dan dosen
Penguji I.
3. Bapak Irawan Sugoro, M.Si, selaku dosen Pembimbing I yang telah
banyak memberikan dukungan, bantuan dalam penelitian maupun
penulisan.
4. Bapak S. Hermanto, M.Si, selaku dosen Pembimbing II yang telah banyak
membantu dan memberikan kritik dan saran yang membangun dalam
analisa hasil dan penulisan.
5. Bapak DR. Mirzan T. Razzak,M.Eng.,APU, selaku dosen Penguji II.
6. Ibunda dan Ayahanda tercinta yang kasih sayangnya sepanjang masa dan
telah memberikan dukungan moril, materil serta spiritual, serta kakanda
dan adinda tersayang.
7. Ahmad Hudori yang selalu mendampingi, meluangkan waktu, dan
memberi semangat serta dukungan baik moril maupun spiritual.
8. Ibu Nuniek dan bapak Dinar yang ikut membantu pada penelitian dan
teman-teman seperjuangan khususnya Ericca, Rizkina, Ai, Eva dan Septi
yang memberikan motivasi dan kenangan.
Tak ada gading yang tak retak dan tidak ada sesuatu apapun yang
sempurna di dunia kecuali Allah SWT, sehingga penulis sangat menyadari
akan masih banyak kekurangan dan kelemahan dalam penulisan skripsi ini.
Saran dan kritik yang membangun demi perbaikan sangat diharapkan.
Akhirnya, penulis hanya dapat berdo’a semoga semua amal baik yang
telah diberikan tersebut mendapat balasan yang berlipat ganda dari Allah
SWT. Dan semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan pemikiran demi
kemajuan dan keberhasilan bersama. Amin Ya Mujibas Sailin.
Wassalamu’alaikum wr. wb.
Jakarta, April 2008
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR.................................................................................... i DAFTAR ISI................................................................................................... iii DAFTAR TABEL .......................................................................................... v DAFTAR GAMBAR...................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. vii BAB I PENDAHULUAN............................................................................... 1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ...................................................................................... 3 1.3 Tujuan Penelitian ....................................................................................... 3 1. 4 Hipotesis.................................................................................................... 4 1.5 Manfaat Penelitian ..................................................................................... 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA.................................................................... 2.1 Bakteri Escherichia coli ............................................................................. 5 2.2 Protein ........................................................................................................ 11 2.3 Antigen....................................................................................................... 16 2.4 Faktor Virulensi Mikroba........................................................................... 18 2.5 Vaksin ........................................................................................................ 21 2.6 Radiasi dan Iradiasi .................................................................................... 29 2.7 Sinar Gamma.............................................................................................. 36 2.8 Elektroforesis ............................................................................................. 41
BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan................................................................. 44 3.2 Bahan dan Alat........................................................................................... 44 3.3 Metoda Kerja.............................................................................................. 45 3.4 Prosedur Kerja............................................................................................ 46 3.4.1 Pembuatan Kurva Tumbuh Escherichia coli .......................................... 46 3.4.2 Penentuan Dosis Iradiasi Inaktivasi sel E. coli dengan Sinar Gamma.... 46 3.4.3......................................................................................................Pengukuran Protein Sel E. coli Metode Lowry........................................................ 47 3.4.4......................................................................................................Karakteristik Profil Protein Bakteri E. coli.............................................................. 47 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 4.1 Pertumbuhan bakteri E. coli ...................................................................... 50 4.2 Hasil Inaktivasi Sel E. coli dengan Iradiasi Sinar Gamma ........................ 51 4.3 Konsentrasi Protein sel E. coli Hasil Iradiasi............................................. 53 4.4 Karakteristik Profil Protein Bakteri E. coli ................................................ 55 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 5.1 Kesimpulan ................................................................................................ 59 5.2 Saran........................................................................................................... 59 DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 60 LAMPIRAN.................................................................................................... 65
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Morfologi bakteri Escherichia coli ................................................ 5 Gambar 2. Bagian yang terdapat pada bakteri gram negatif ............................ 6 Gambar 3. Skema ilustrasi komponen-komponen bakteri gram negatif.......... 7 Gambar 4. Faktor-faktor yang mempengaruhi terjadinya mastitis .................. 9 Gambar 5. Proses infeksi mastitis pada ambing sapi ....................................... 11 Gambar 6. Struktur primer protein................................................................... 13 Gambar 7. Struktur sekunder protein ............................................................... 14 Gambar 8. Beberapa jenis ikatan yang terdapat pada polipeptida ................... 15 Gambar 9. Struktur kuartener protein globular yang kompleks....................... 15 Gambar 10. Sketsa proses denaturasi protein (Winarno, 2002)....................... 16 Gambar 11. Mekanisme kerja vaksin (Scorvia, 2000)..................................... 22 Gambar 12. Efek radiasi terhadap sel yang dapat dimanfaatkan untuk
pembuatan bahan vaksin iradiasi ................................................. 26
Gambar 13. Peristiwa terjadinya eksitasi dan ionisasi ..................................... 31 Gambar 14. Formula asam amino .................................................................... 34 Gambar 15. Efek fotolistrik.............................................................................. 37 Gambar 16. Efek penghamburan compton....................................................... 37 Gambar 17. Pertumbuhan Bakteri E. coli dalam medium TSB yang diinkubasikan pada suhu 370C dan agitasi 120 rpm .................... 50 Gambar 18. Hubungan dosis iradiasi sinar gamma terhadap jumlah sel bakteri E. coli.............................................................. 52 Gambar 19. Konsentrasi protein E. coli hasil iradiasi...................................... 54 Gambar 20. Profil protein bakteri E. coli S1 hasil iradiasi sinar gamma......... 56
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Beberapa enzim ektraselular yang turut menentukan virulensi mikroba .............................................................................. 20
Tabel 2. Vaksin iradiasi yang telah dihasilkan................................................. 24
Tabel 3. Jumlah sel E. coli S1 hasil iradiasi sinar gamma ............................... 52
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Komposisi buffer sampel dan Komposisi larutan Lowry............ 65 Lampiran 2. Skema kerja ................................................................................. 66 Lampiran 3. Kurva standar protein .................................................................. 67 Lampiran 4. Kurva standar pertumbuhan bakteri E. coli S1............................ 68 Lampiran 5. Hasil analisis LabImage 1D 2006................................................ 69 Lampiran 6. Hasil analisis statistik SPSS 11.5 ................................................ 74 Lampiran 7. Gambar bakteri E. coli S1 dan Inkubator shaker......................... 75 Lampiran 8. Gambar LabImage 1D 2006 ........................................................ 76 Lampiran 9. Gamma Chamber 4000 A dan Bahan-bahan SDS-PAGE........... 77 Lampiran 10. Mini-Protein gel elektroforesis, Atto dan Cara memasukkan
gel ke dalam Mini-Protein gel electrophoresis, Atto ................. 78
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Mastitis merupakan penyakit yang mengakibatkan peradangan pada kelenjar
susu (ambing), akibat infeksi oleh mikroba. Apabila sapi perah mengalami
penyakit mastitis, maka produksi susu yang dihasilkan akan lebih sedikit karena
terdapat penyumbatan pada ambing susu sapi, atau bahkan dapat menyebabkan
kematian dan kerusakan bagian organ tubuh pada sapi. (Tetriana dan Sugoro,
2007).
Mastitis juga merupakan hal yang komplek dan tidak ditemukan suatu solusi
yang sederhana untuk mengontrolnya. Beberapa aspek telah banyak dikaji dan di
dokumentasikan dalam literatur ilmiah. Ada yang kontrovesial dan ada opini yang
didasarkan pada fakta. Ada 3 faktor penyebab yang mempermudah terjadinya
mastitis, yaitu kondisi sapi sebagai inang, kondisi lingkungan yang buruk dan
mikroorganisme sebagai agen penyebab penyakit. Salah satu mikroorganisme
penyebab mastitis adalah Escherischia coli, akibatnya produksi susu sapi menurun
(Sugoro, 2004).
Selama ini pengobatan penyakit mastitis dengan menggunakan antibiotika
menimbulkan resistensi pada mikroba dan adanya residu pada susu sehingga perlu
dicari alternatif lain untuk mencegah penyakit ini. Salah satunya adalah
pembuatan vaksin. Penggunaan vaksin di Indonesia belum banyak digunakan,
karena kurangnya informasi dan harga yang relatif mahal dan penggunaan vaksin
komersil tidak cocok dengan strain lokal. Salah satu produk vaksin yang beredar
di pasaran adalah J5 Bacterin dan Mastiguard untuk bakteri Coliform dan
Endovac bovi untuk bakteri Gram negatif. Vaksin-vaksin tersebut ini telah banyak
digunakan oleh para peternak di Amerika Serikat, Selandia Baru dan Australia
serta dapat menurunkan kejadian mastitis sampai dengan 60% (Ruegg, 2001).
Penelitian ini didasarkan pada pembuatan vaksin dengan cara menginaktivasi
sel bakteri. Vaksin dapat diperoleh dengan cara konvensional, baik secara kimia
maupun pemanasan. Alternatif lainnya adalah dengan menggunakan iradiasi sinar
gamma untuk menginaktivasi sel bakteri. Keuntungan metode iradiasi, yaitu dapat
mengaktifkan seluruh fase sistem imun, meningkatkan respon imun terhadap
seluruh antigen (proses inaktivasi dapat menyebabkan perubahan antigenitas),
durasi imunitas lebih panjang, biaya lebih murah, lebih cepat menimbulkan respon
imunitas dan mudah dibawa ke lapangan. Tetapi vaksin jenis ini memiliki
beberapa kelemahan di mana vaksin ini kurang baik apabila digunakan pada
daerah tropis dan pada penderita penyakit immunodeficiency serta adanya
kemungkinan terjadi mutasi balik yang menyebabkan daya virulensi menjadi
tinggi (Tetriana dan Sugoro, 2007).
Vaksin adalah bahan antigenetik yang digunakan untuk menghasilkan
kekebalan aktif terhadap suatu penyakit, dan salah satu vaksin penghasil antibodi
yaitu protein yang berperan untuk melawan bakteri penyakit yang biasa disebut
antigen. Salah satu bagian sel bakteri yang berperan sebagai faktor virulensi
adalah protein (Lehtolainen, 2004).
Inaktivasi bakteri dengan cara iradiasi sinar gamma akan mengubah
konfigurasi molekuler dari sel bakteri, salah satunya adalah molekul protein yang
diasumsikan bahwa konfigurasi 3 dimensinya berubah menjadi terbuka dan siap
melakukan suatu reaksi (Darussalam, 1996). Namun demikian, untuk mendukung
hal tersebut perlu dilakukan analisis profil protein sebelum dan sesudah diiradiasi.
Analisa tersebut dapat dilakukan melalui elektroforesis SDS-PAGE (Sodium
dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis), sehingga dapat diketahui
apakah protein bakteri tersebut mengalami perubahan yang signifikan atau tidak
setelah proses iradiasi.
1.2 RUMUSAN MASALAH
Dari uraian latar belakang di atas, maka masalah penelitian yang dapat
dirumuskan adalah bagaimana kecenderungan profil protein isolat E. coli S1 hasil
iradiasi sinar gamma sebagai bahan vaksin mastitis inaktif?
1.3 TUJUAN PENELITIAN
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengetahui dosis iradiasi sinar gamma yang dapat menginaktivasi sel
bakteri E. coli.
2. Mengetahui pengaruh dosis iradiasi sinar gamma terhadap profil protein
yang dihasilkan pada sel bakteri E. coli.
1.4 HIPOTESIS
Hipotesis yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut:
H0 = Ada pengaruh yang signifikan antara dosis iradiasi terhadap profil
protein yang dihasilkan.
H1 = Tidak ada pengaruh yang signifikan antara dosis iradiasi terhadap
profil protein yang dihasilkan.
1.5 MANFAAT PENELITIAN
Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
dosis iradiasi sinar gamma yang maksimal untuk inaktivasi bakteri E. coli S1
sebagai bahan vaksin mastitis.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Bakteri Escherischia coli
Klasifikasi Ilmiah
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Familia : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : E. coli
Gambar.1. Morfologi Bakteri E. coli (Feng, et. al, 2002)
Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies
utama bakteri Gram-negatif fakultatif anaerobik dan tidak berspora, dengan
ukuran panjang 2 μm dan tebal 0,8 μm. Dinding sel dari Gram-negatif secara khas
terdiri dari tiga lapisan, yaitu (1) Membran sitoplasmik (membran yang
menyelubungi sitoplasma tersusun atas lapisan fosfolipid dan protein), (2) Lapisan
peptidoglikan (gabungan protein dan polisakarida), (3) membran bagian luar
(terdiri atas fosfolipid, protein dan lipopolisakarida). Sedangkan di dalam
sitoplasma terdapat beberapa substansi, yaitu:
1. Ribosom, merupakan partikel kecil yang tersebar dalam sitoplasma terdiri
dari 35% protein dan 65% asam ribonukleat (RNA), berfungsi sebagai
tempat sintesis protein.
2. Granul, merupakan tempat penyimpanan makanan berupa polisakarida,
lipida, polifosfat, metafosfat, sulfur, dan poli beta hidroksi asam butirat
(PBH).
3. Bahan Nukleus, merupakan untaian ganda DNA mencapai 1,2 mm, tetapi
terlipat menjadi diameter 2 nm, berfungsi sebagai pembawa informasi
genetik.
4. Mesosom, merupakan lipatan membran sitoplasma kedalam sitoplasma.
Bakteri gram negatif mempunyai alat gerak berupa flagel yang tersusun dari
sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah
dengan ukuran diameter 12-18 nm dan panjang lebih dari 20 nm, serta terdapat
pili mirip flagel tetapi lebih pendek dengan panjang 12 nm, kaku dan berdiameter
lebih kecil dan tersusun dari protein, pili dapat berfungsi sebagai jalan
pemindahan DNA saat konjugasi. Selain itu, mempunyai kapsul atau lapisan
lendir yang merupakan polisakarida tebal dan air yang melapisi permukaan luar
sel.
(a) Flagel (b) Pili
Gambar 2. Bagian permukaan membran luar yang terdapat pada bakteri gram negatif
Pada E. coli terdapat tiga jenis antigen, yaitu O-antigen yang merupakan inti
lipopolisakarida dan unit-unit polisakarida, K-antigen yang merupakan kapsul,
dan H-antigen yang merupakan flagel (Lehtolainen, 2004).
Dalam sitoplasma sel E. coli dijumpai adanya ribosom yang berfungsi untuk
sintesis protein. E. coli merupakan bakteri yang mudah untuk dikultivasi dalam
media cair yang mengandung glukosa dan ion-ion anorganik (Mg, Ca, Fe, Co, Zn,
Cu, Mn, atau Ni). Bakteri ini akan membelah dalam waktu 60 menit (waktu
generasi = 60 menit ). Waktu generasi pada bakteri ini dapat diperpendek menjadi
20 menit apabila dalam media ditambahkan basa purin dan basa pirimidin yang
merupakan bahan pokok pembentukan asam nukleat dan asam amino (Juwono
dan Zulfa, 2000).
Gambar 3. Skema ilustrasi komponen-komponen bakteri gram negatif
Pada mulanya E. coli dianggap makhluk hidup terkecil yang dapat dibiakkan
secara in-vitro, tetapi ternyata terdapat makhluk hidup lain yang mempunyai
ukuran lebih kecil yang juga dapat dibiakkan secara in-vitro yaitu PPLO
(Pleuropneumonia Like Organism) yang merupakan penyebab penyakit pada
binatang maupun manusia, PPLO ini mempunyai ukuran diameter 0,1-0,25
mikron berarti jauh lebih kecil daripada bakteri apalagi sel-sel manusia (Juwono
dan Zulfa, 2000).
Terdapat 3 (tiga) jenis bakteri E. coli, yaitu (1) Enteric - termasuk jenis yang
paling umum. Tanda klinis utama yang ditimbulkan pada inangnya adalah diare
hebat. Apabila Pedet (anak sapi) terserang bakteri ini, maka akan cepat menjadi
lemas dan mengalami dehidrasi. Biasanya diawali dulu dengan demam yang
kemudian dengan cepat kembali normal, atau mendekati normal, dan dapat
Peptidoglikan
Lipopolisakarida
O antigen
Membran luar
Gel periplasmik
Membran sitoplasmik
Lipoprotein
Protein
Fosfolipid
menyebabkan kematian. (2) Enterotoxigenic - Disebabkan oleh bakteri E. coli dari
jenis K-99. Infeksi dari strain ini berakibat fatal. Racun menyebabkan cairan yang
dipompa ke dalam usus sedemikian banyak sehingga pedet (anak sapi) biasanya
mati bahkan sebelum gejala diare (mencret) muncul. Diare seperti ini adalah salah
satu diare yang dapat muncul pada umur pedet (anak sapi) di bawah 3 hari. (3)
Septicemic - Jenis ini bekerja mirip bakteri Salmonella. Metodanya adalah dengan
menginfeksi aliran darah dan masuk ke dalam jaringan tubuh sehingga
menyebabkan infeksi global. Luka dan jejak dari infeksi bakteri jenis ini biasanya
tidak tampak secara jelas. Ini merupakan jenis E. coli yang ganas, seringkali
menyebabkan kematian tanpa gejala klinis diare terlebih dahulu. Pedet (anak sapi)
yang tidak mendapat atau dihentikan pemberian kolostrum, biasanya mati karena
jenis septisemik ini (Manglayang, 2006).
Infeksi Bakteri
Bakteri E. coli menginfeksi pada masa laktasi hari ke-60. Ada 3 (tiga) faktor penyebab yang mempermudah
terjadinya mastitis, yaitu kondisi sapi sebagai inang, kondisi lingkungan yang buruk dan mikroorganisme sebagai agen
penyebab penyakit (Gambar 4).
Lingkungan
Sapi
Mikroorganisme
Gambar 4. Faktor-faktor yang mempengaruhi terjadinya mastitis.
Kondisi sapi yang sakit karena infeksi alat reproduksi (radang rahim), infeksi
saluran pencernaan (mencret), radang kuku, dan penyakit kulit (kutil, eksim, dan
cacar) akan mempermudah terinfeksi mastitis. Selain itu bentuk ambing, pakan,
umur dan stadium laktasi pun dapat mempengaruhi, ambing yang bergantung
sangat rendah akan mudah kontak dengan lantai kandang sehingga beresiko
terserang mastitis. Kuantitas dan kualitas pakan yang tidak memadai (kurang gizi)
menyebabkan hewan menjadi kurus, kelemahan dan terganggunya metabolisme.
Makin tua sapi maka semakin peka, di mana mekanisme penutupan lubang puting
susu semakin menurun dan proses penyembuhan semakin lama. Stadium laktasi,
terutama pada minggu pertama dan minggu terakhir beresiko pula terinfeksi
mastitis (Fuad, 2006).
Luka atau lecet pada ambing atau puting susu yang diakibatkan oleh lantai kandang yang kasar, kuku panjang atau
tajam, sikat yang keras, memerah susu dengan cara kasar, memerah dengan cara menarik puting dapat menyebabkan
mastitis di mana luka akan mendatangkan lalat (Tetriana dan Sugoro, 2007).
Kondisi lingkungan yang mempermudah kejadian mastitis adalah kondisi
kandang ternak yang basah dan kotor dan peternak/pemerah/pekerja tidak
memelihara tubuh seperti kuku yang panjang, memakai pakaian kotor dan lain
sebagainya (Sugiwaka, 2005).
Pada umumnya mastitis disebabkan oleh bakteri seperti Streptococcus
agalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus.
uberis, Streptococcus bovis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, dan Enterobacter
aerogenes.
Kerugian yang diakibatkan mastitis adalah berkurangnya produksi susu hingga
25-30% atau berhenti sama sekali, kualitas susu menjadi turun sehingga tidak
dapat dijual atau dikonsumsi, biaya perawatan meningkat, dan sapi dapat diafkir
lebih awal (Fuad, 2006).
Mastitis terjadi karena masuknya bakteri melalui saluran puting dan
berkembang biak dengan cara pembelahan di dalam susu yang diproduksi jaringan
sehingga menimbulkan radang (Gambar 5). Mikroorganisme akan menembus
saluran puting dengan berbagai cara diantaranya pemerahan, di mana
mikroorganisme masuk melalui saluran puting atau hasil perpindahan secara fisik
dari ujung puting yang ditekan akibat pergerakan sapi. Selama pemerahan dengan
mesin, mikroorganisme mungkin terdorong masuk atau melalui saluran puting
masuk ke dalam puting. Penularan dari ambing yang terinfeksi mastitis ke ambing
sehat dapat terjadi melalui kain lap ambing yang digunakan untuk seluruh ternak,
tangan pemerah yang kotor, urutan pemerahan yang salah dan peralatan
pemerahan yang kotor (Tetriana dan Sugoro, 2007).
Mikroba masuk ke dalam ambing melalui lubang puting
Mikroba berkembang di dalam ambing
Gambar 5. Proses infeksi mastitis pada ambing sapi
2.2 Protein
Protein yang berasal dari kata proteos (utama atau pertama) merupakan
senyawa makromolekul yang memiliki peranan penting pada setiap makhluk
hidup. Protein dihasilkan dari proses ekspresi genetik molekul DNA yang terdapat
di dalam sel (Lehninger, 1982). Protein adalah suatu polipeptida dengan bobot
molekul yang sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Disamping
berat molekul yang berbeda-beda, protein mempunyai sifat yang berbeda-beda
pula (Poedjiadi, 1994), dengan fungsi yang spesifik ditentukan oleh gen yang
sesuai (Lehninger, 1982).
Pada sel E. coli protein terbagi atas 2 (dua) bagian, yaitu protein intraselular
dan protein Ekstraselular. Protein intraselular adalah protein yang terdapat dalam
membran sel, ribosom, dan bahan nukleus. Sedangkan protein ekstraselular adalah
protein yang terdapat dalam dinding sel, membran luar, dan flagel (Yatim, 1999).
Proses pembentukan air susu menjadi terganggu
Hasil metabolisme mikroba akan merusak dan menggangu fungsi sel-sel alveole
Berdasarkan fungsi dan aktifitas biologisnya protein dikelompokkan menjadi
beberapa golongan, antara lain enzim yang merupakan biokatalisator dari hampir
semua reaksi yang terjadi pada makhluk hidup. Protein lain berfungsi sebagai
protein transport seperti hemoglobin yang mengikat dan membawa oksigen
menuju jaringan peri-peri dan lipoprotein yang membawa lipid dari hati ke organ
lain, sementara protein lainnya berfungsi sebagai protein nutrien seperti
ovalbumin dan kasein, serta protein pelindung seperti immunoglobulin yang
berperan dalam sistem kekebalan tubuh. Di samping itu terdapat pula protein yang
berperan sebagai protein pengatur seperti hormon insulin yang berperan dalam
mengatur keseimbangan kadar glukosa dalam darah (Lehninger, 1982).
Struktur protein
Protein tanpa memandang fungsi dan aktivitas biologisnya bangun oleh
susunan dasar yang sama yaitu 20 asam amino yang molekulnya sendiri tidak
memiliki aktivitas biologis. Masing-masing asam amino dalam suatu protein
terintegrasi melalui ikatan peptida yang tersusun secara kovalen membentuk
struktur yang beragam bergantung dari proses pembentukan dan fungsi dari
protein tersebut (Hermanto, 2003).
Struktur protein terdiri dari struktur primer, sekunder, tersier, dan kuaterner.
Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis dan urutan asam amino dalam
molekul protein. Oleh karena ikatan antar asam amino ialah ikatan peptida, maka
struktur primer protein juga menunjukkan ikatan peptida yang urutannya
diketahui.
Gambar 6. Struktur primer protein
Struktur sekunder protein merupakan struktur protein yang dihasilkan oleh
adanya interaksi ikatan hidrogen. Struktur sekunder terdiri dari α- heliks (spiral)
dan β- sheets (lembaran berlipat).
Ada dua bentuk struktur β- sheets, yaitu paralel dan anti paralel. Bentuk paralel
terjadi apabila rantai polipeptida yang berikatan melalui ikatan hidrogen itu sejajar
dan searah, sedangkan bentuk anti paralel terjadi apabila rantai polipeptida
berikatan dalam posisi sejajar tetapi berlawanan arah.
α- heliks β- sheets (paralel) β- sheets (anti paralel)
Ikatan Peptida
Gambar 7. Struktur sekunder protein
Struktur tersier menunjukkan kecenderungan polipeptida membentuk lipatan
atau gulungan, dan dengan demikian membentuk struktur yang lebih kompleks.
Struktur ini dimantapkan oleh adanya beberapa ikatan antara gugus R pada
molekul asam amino yang membentuk protein. Beberapa jenis ikatan tersebut
misalnya (a) ikatan elektrostatik, (b) ikatan hidrogen, (c) interaksi hidropob antara
rantai samping non polar, (d) interaksi dipol-dipol dan (e) ikatan disulfida yaitu
suatu ikatan kovalen antara residu sistein (Gambar 8) (Poedjiadi, 1994).
Gambar 8. Beberapa jenis ikatan yang terdapat pada polipeptida.
Struktur kuartener menunjukkan adanya interaksi intermolekuler antar unit-
unit protein. Sebagian besar protein globular terdiri atas beberapa rantai
polipeptida yang terpisah. Rantai polipeptida ini saling berinteraksi membentuk
persekutuan. Gambar 9 menunjukkan suatu model struktur kuartener yang terdiri
atas dua unit protein globular.
Gambar 9. Struktur kuartener protein globular yang kompleks.
Stabilitas Protein
Stabilitas struktur protein yang terbentuk karena adanya interaksi
intramolekuler dan interaksi intermolekuler sangat dipengaruhi oleh kondisi
lingkungan di sekitarnya. Kondisi eksternal seperti perubahan pH yang ekstrim
atau pengaruh panas dapat menyebabkan struktur tiga dimensi protein rusak dan
kehilangan aktivitas biologisnya. Oleh karenanya protein memerlukan kondisi
tertentu yang memungkinkan senyawa tersebut dapat menjalankan aktivitas
biologisnya secara optimal (Hermanto, 2003).
Ada beberapa jenis protein sangat peka terhadap perubahan lingkungannya.
Apabila konformasi molekul protein berubah, misalnya oleh perubahan suhu, pH
atau karena terjadi suatu reaksi dengan senyawa lain, ion-ion logam, maka
aktivitas biokimiawinya berkurang. Perubahan konformasi alamiah menjadi
konformasi tidak menentu (random coil) merupakan suatu proses yang disebut
denaturasi (Poedjiadi, 1994).
Gambar 10. Sketsa porses denaturasi protein (Winarno, 2002)
2.3 Antigen
Antigen ialah suatu substansi yang bila memasuki inang vertebrata,
menimbulkan respons kekebalan yang membawa kepada terbentuknya kekebalan
dapatan. Respon kekebalan ini mengakibatkan pembentukan antibodi spesifik
yang beredar di dalam aliran darah (imunitas humoral) atau merangsang
peningkatan jumlah sel-sel reaktif khusus yang disebut limfosit (imunitas yang
diperantarai sel atau cell-mediated immunity) atau keduanya. Limfosit ini telah
memperoleh kemampuan yang lebih tinggi untuk menghancurkan sel-sel lain.
Baik antibodi maupun limfosit khusus bereaksi dengan antigen yang digunakan
sebagai bahan untuk membentuk kekebalan. Dengan cara ini kekebalan dapatan
memungkinkan tubuh dapat menghancurkan atau menetralkan mikroorganisme
penyerang ataupun toksinnya. Ini merupakan jalur utama pertahanan internal
tubuh terhadap mikroba patogenik (Pelchzar dan Chan, 1988).
Sifat-sifat antigen
Pada umumnya makin asing komposisi kimiawi dan struktur antigen terhadap
individu yang diimunisasi maka makin efektif antigen tersebut dalam merangsang
respons kekebalan. Hanya ada dua kelompok senyawa, secara alamiah yang jelas
bersifat imunogenik, artinya mempunyai kemampuan untuk merangsang respons
kekebalan. Senyawa yang dimaksud ialah protein dan polisakarida. Protein pada
umumnya lebih efektif dalam merangsang pembentukan antibodi dibandingkan
dengan polisakarida. Namun, polisakarida kompoleks berukuran besar, seperti
polisakarida pada kapsul pneumokokus, merupakan antigen yang baik karena
menimbulkan reaksi kekebalan yang kuat. Oligosakarida, lipid, dan asam-asam
nukleat tidak merangsang pembentukan antibodi bila berdiri sendiri, tetapi dapat
melakukannya bila bergabung dengan protein, yang disebut hapten (Pelchzar dan
Chan, 1988).
Antigen dapat berupa substansi yang dapat larut seperti toksin bakteri atau
protein serum (bagian zat alir dari darah yang terkoagulasi). Antigen dapat pula
bersifat partikulat, seperti sel bakteri atau virion. Antigen partikulat biasanya lebih
ampuh daripada antigen yang dapat larut. Antigen alami salah satunya adalah
antigen bakteri yang diekskresikan sebagai eksotoksin dan enzim atau komponen
struktural sel (Pelchzar dan Chan, 1988).
2.4 Faktor Virulensi Mikroba
Pada kebanyakan kasus, sifat-sifat yang menyebabkan virulensi suatu
mikroorganisme patogenik itu tidak jelas atau belum diketahui. Namun, telah
diketahui bahwa beberapa bakteri mengekskresikan substansi, sedangkan yang
lain mempunyai struktur khusus yang turut menyumbang kepada virulensinya.
Beberapa faktor mikrobial tersebut antara lain:
1. Toksin.
Beberapa mikroorganisme menghasilkan zat beracun yang dikenal sebagai
toksin. Kemampuan suatu mikroorganisme untuk menghasilkan suatu toksin
yang mempunyai efek buruk terhadap inang dan keampuhan toksin tersebut
merupakan faktor penting di dalam kemampuan organisme tersebut untuk
menyebabkan penyakit. Toksin yang dihasilkan mikroorganisme mungkin
diekskresikan ke medium di sekitarnya (eksotoksin) atau di simpan di dalam
selnya (endotoksin) sebagai bagian dari sel tersebut (Pelchzar dan Chan,
1988).
Eksotoksin.
Eksotoksin dapat berdifusi dan diekskresikan dari sel mikroba yang
menghasilkannya ke dalam medium biakan atau ke dalam sistem peredaran
dan jaringan inang. Eksotoksin adalah protein. Toksisitasnya akan hilang bila
dipanaskan atau diberi perlakuan dengan zat kimia. Fenol, formaldehid, β–
propiolakton, dan berbagai asam dapat memodifikasi eksotoksin secara
kimiawi sehingga toksisitasnya lenyap; dalam hal demikian maka disebut
toksoid. Toksin dan toksoid mempunyai kemampuan untuk merangsang
pembentukan antitoksin, yaitu substansi yang menetralkan toksisitas toksin di
dalam tubuh inang. Kemampuan ini penting untuk melindungi inang yang
rentan terhadap penyakit-penyakit yang disebabkan oleh toksin bacterial
(Pelchzar dan Chan, 1988).
Endotoksin.
Banyak mikroorganisme, terutama bakteri gram negatif, tidak
mengekskresikan toksin terlarut dari sel yang utuh lagi hidup, tetapi
menghasilkan endotoksin yang dilepaskan hanya bila selnya hancur. Adanya
substansi beracun di dalam populasi bakteri semacam itu disebabkan karena
terlisisnya beberapa dari sel itu. Endotoksin bakteri gram negatif terletak pada
dinding sel dan merupakan substansi kompleks yang mengandung fosfolipid
dan karbohidrat (lipopolisakarida). Dibandingkan dengan eksotoksin,
endotoksin itu (1) relatif stabil terhadap panas (2) tidak membentuk toksoid,
dan (3) kurang toksik (Pelchzar dan Chan, 1988).
2. Enzim ekstraselular.
Virulensi beberapa mikroorganisme sebagian disebabkan oleh produksi
enzim ekstraseluler (lihat tabel 1). Kendati tidak ada satu pun enzim
ekstraselular tunggal yang telah diperlihatkan tanpa meragukan sebagai satu-
satunya faktor penyebab virulensi, tidak disangsikan lagi enzim-enzim
semacam itu berperan di dalam proses patogenik (Pelchzar dan Chan, 1988).
Tabel 1. Beberapa enzim ekstraselular yang turut menentukan virulensi mikroba.
Enzim Kerjanya Bakteri Yang Menghasilkan
Enzim (Contoh)
Hialuronidase
Koagulase
Hemolisin
Lesitinase
Kolagenase
Merombak asam
hialuronat (suatu
komponen jaringan)
Menggumpalkan plasma
Melisis sel-sel darah
merah
Menghancurkan sel-sel
darah merah dan jaringan
lain
Menguraikan kolagen
Stafilokokus, streptokokus, dan
klostridia
Staphylococcus aureus
Stafilokokus, streptokokus, dan
klostrida
Clostridium perfringens
Cl. Perfringens
Leukosidin
(suatu serat jaringan)
Membunuh leukosit
Staphylococcus aureus
Sumber: Pelchzar dan Chan, 1988.
3. Kapsul
Virulensi bakteri dalam banyak hal dipengaruhi oleh ada atau tidak adanya
kapsul. Bila patogen kehilangan kapsulnya, misalnya oleh mutasi, maka
mereka kehilangan kemampuannya sebagai penyebab penyakit. Nampaknya
bertambahnya virulensi pada galur berkapsul disebabkan oleh kemampuan
polisakaride kapsul untuk mencegah fagositosis atau penelanan oleh fagosit
inang. Kemampuan ini mungkin disebabkan oleh sifat-sifat permukaan kapsul
yang mencegah fagosit sehingga tidak membentuk kontak yang cukup erat
dengan bakteri yang menelannya (Pelchzar dan Chan, 1988).
4. Pili
Banyak bakteri nonpagotenik memiliki pili, sama halnya seperti banyak
bakteri pagotenik memiliki kapsul. Organel-organel ini dapat meningkatkan
virulensi beberapa patogen. Telah dilaporkan bahwa dimilikinya pili
membantu organisme melekat dengan lebih baik pada permukaan sel inang
dan jaringan inang (Pelchzar dan Chan, 1988).
2.5 Vaksin
Vaksin berasal dari kata vaccinia merupakan suatu suspensi mikroorganisme
yang dapat menimbulkan penyakit tetapi telah dimodifikasi dengan cara
mematikan atau menatenuasi (menghentikan transkripsi DNA pada suatu kodon,
sehingga mRNA yang terbentuk lebh pendek dari biasanya), sehingga tidak akan
menimbulkan penyakit dan dapat merangsang pembentukan kekebalan/antibodi
bila di inokulasikan (Sugoro, 2004), atau hasil-hasil pemurniannya seperti protein,
peptida, partikel serupa virus, dan sebagainya (Pelchzar dan Chan, 1988).
Bila unsur asing ini menyerang tubuh, maka sistem kekebalan akan
mengaktifkan sel-sel tertentu untuk menghancurkan unsur asing tersebut. Jika
tubuh diserang ulang bakteri atau virus di masa datang, sel ingatan akan diaktifkan
dan menjawab lebih cepat dan lebih kuat untuk menghancurkan bakteri atau virus.
Vaksin juga bisa membantu sistem kekebalan tubuh melawan sel-sel degeneratif
seperti kanker (Medical Research News, 2006).
Pada gambar 11 menunjukkan mekanisme kerja vaksin, di mana ketika
vaksinasi berlangsung, vaksin yang berasal dari virus, bakteri atau organisme
yang telah mati maupun yang sudah dalam bentuk aman, disuntikkan ke dalam
sistem (kiri). Vaksin merangsang sistem kekebalan tubuh untuk memproduksi
Gambar 11. Mekanisme kerja vaksin (Scorvia, 2000)
Vaksin Vaksin Antibodi Antibodi Organisme
penyakit
antibodi terhadap suatu organisme (tengah). Kapanpun tubuh terserang oleh
kuman ini setelah vaksinasi, antibodi pada sistem kekebalan tubuh menyerang dan
menghentikan infeksi (kanan).
Aplikasi Teknik Nuklir Dalam Bidang Vaksin
Infeksi merupakan masalah besar dalam kesehatan dan telah menghabiskan
dana yang sangat besar. Hilangnya harapan hidup atau produktivitas akibat
penyakit infeksi bukan sekedar masalah kesehatan semata, tetapi juga menyangkut
permasalahan sosial dan ekonomi. Infeksi ini dapat menyerang manusia maupun
hewan sebagai inang atau vektor (Tetriana dan Sugoro, 2007).
Infeksi ataupun penyakit akibat infeksi pada manusia telah menyebabkan
kematian sebesar 13 juta orang di seluruh dunia setiap tahun, terutama di negara-
negara berkembang seperti Indonesia (IAEA, 2000). Empat puluh tiga persen
kematian di negara berkembang disebabkan oleh penyakit infeksi sedangkan di
negara maju hanya sebesar satu persen. Kematian yang besar tersebut dapat
dicegah jika dilakukan diagnosa yang cepat dan tepat serta didukung oleh
penanganan yang efektif dan efisien (Machi, S, 2002). Pada hewan, penyakit
infeksi telah menurunkan tingkat produksi dan kualitas hasil ternak. Selain itu,
terinfeksi suatu penyakit menyebabkan hewan di karantina atau dibunuh
(Tetriana dan Sugoro, 2007).
Penyakit infeksi timbul sebagai akibat serangan organisme patogen.
Organisme ini dapat berada di mana saja, misalnya di tanah, air, udara, hewan,
maupun menggunakan hewan sebagai perantara. Infeksi organisme patogen dapat
terjadi melalui kulit, membran mukosa, transfusi darah, ataupun kontaminasi dari
makanan dan minuman. Oleh karena itu diperlukan penanganan yang tepat dalam
mengendalikan penyakit infeksi. Tujuan utama dari penanganan adalah
menghilangkan atau membunuh organisme patogen penyebab infeksi. Beberapa
penanganan yang umumnya dilakukan adalah mencegah kontaminasi dari
lingkungan, memutuskan siklus hidup dari organisme patogen, memutuskan
hubungan antara inang dan vektor, menghancurkan reservoir host dan mencegah
perkembangan organisme patogen melalui pengobatan dan vaksinasi (Machi, S,
2002).
Salah satu alternatif yang dapat digunakan dalam penangan penyakit infeksi
ini adalah dengan menggunakan teknik nuklir. Berbagai penyakit yang bersumber
dari virus, bakteri, protozoa dan cacing telah banyak yang memanfaatkan teknik
nuklir dalam proses pembuatan bahan vaksinnya (Tabel 2). Vaksin dapat
merangsang sistem imun pada inang untuk melawan infeksi organisme patogen
(Tetriana dan Sugoro, 2007; Ramamoorthy,S., et. al., 2006).
Tabel 2. Vaksin iradiasi yang telah dihasilkan
Penyakit Jenis vaksin Target vaksinasi
Porcine parvovirus
Ebola Zaire
Marburg Musake
VEE 1A/B
WEE CBA 87/4
Leukimia
Influenza
Virus DNA, inaktif
Virus RNA, inaktif
Virus RNA, inaktif
Virus RNA, inaktif
Virus RNA, inaktif
Virus DNA, inaktif
Virus DNA, inaktif
Manusia
Manusia
Manusia
Manusia
Manusia
Manusia
Manusia
TBC
Listeria
Brucella abortus
Malaria
Trypanosoma
Koksivet
Neospora caninum
Dictyocaulus
Fasciolosis
HHVI
Schistosomiasis
Bakteri, inaktif
Bakteri, inaktif
Bakteri, inaktif
Protozoa, aktif
Protozoa, aktif
Protozoa, aktif
Protozoa, aktif
Cacing, inaktif
Cacing, aktif
Cacing, aktif
Cacing, aktif
Manusia, Hewan
Manusia
Hewan
Manusia
Manusia
Hewan
Hewan
Hewan
Hewan
Manusia
Manusia
Sumber: Ramamoorthy,S., et. al., 2006
Young (1981), dalam percobaannya menyatakan bahwa iradiasi dapat
mengubah agen penyakit patogen menjadi non patogen yang mampu
menstimulasi sistem kekebalan dalam tubuh. Smith (1992), juga menyatakan
bahwa teknik nuklir/ iradiasi dapat melemahkan agen penyakit tanpa
menghilangkan daya imunogeniknya dan mampu meningkatkan daya kekebalan
pada hewan yang dicobakan.
Radiasi yang ditimbulkan dari inti tidak stabil dapat dimanfaatkan untuk
pembuatan bahan vaksin, terutama dari radiasi pengion, seperti sinar gamma (γ),
beta (β), alfa (α), dan neutron. Dalam pembuatan bahan vaksin, jenis radiasi yang
biasanya digunakan adalah sinar γ yang memiliki sifat daya tembus tinggi dan
ionisasi rendah. Besar kecilnya efek radiasi sinar γ tergantung dari energi dan
jarak sumber radioaktif. Energi sinar γ yang dipancarkan sumber terhadap target
dapat diatur dengan cara pemakaian shielding (Hall, E.J., 1994).
Berdasarkan bahan dasarnya, vaksin dibagi menjadi empat tipe yaitu (1)
vaksin dengan bahan dasar organisme patogen yang dimatikan atau inaktif; (2)
vaksin dengan parasit yang dilemahkan atau daya virulensinya rendah; (3) vaksin
dengan subunit protein hasil purifikasi, rekombinasi atau proses kimia; dan (4)
vaksin asam nukleat baik DNA maupun RNA (Nature, 2005).
Teknologi iradiasi telah banyak dikembangkan untuk pembuatan vaksin
dengan memanfaatkan efek radiasi. Pada Gambar 12 menunjukkan target utama
bagian sel adalah DNA yang merupakan sumber informasi genetik. Perubahan
genetik akan berakibat pada terganggunya kinerja atau kematian sel. DNA yang
terkena radiasi akan mengalami pemutusan rantai dan dapat kembali menyusun
ulang urutan basa nitrogennya. Hasil penyusunan kembali tersebut bisa sama atau
berbeda dengan semula. Penyusunan ulang yang berbeda dapat berakibat pada
kematian sel, mutasi atau transformasi (Hall, E.J., 1994).
Suatu materi hidup seperti sel, apabila terkena sinar gamma akan mengalami
kerusakan secara langsung atau tidak langsung. Efek langsung adalah terjadinya
pemutusan ikatan senyawa-senyawa penyusun sel. Efek tidak langsung terjadi
karena materi sel terbanyak adalah air yang apabila terkena sinar gamma akan
mengalami hidrolisis dan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas inilah yang
akan menyebabkan kerusakan materi sel seperti molekul enzim, DNA, RNA, dan
yang lainnya. Mengingat bahwa 80% komposisi organisme hidup terdiri dari air,
maka hampir setiap efek radiasi terhadap sistem biologi sebagian besar diawali
Vaksin inaktif Vaksin aktif
Vaksin aktif
Gambar 12. Efek radiasi terhadap sel yang dapat dimanfaatkan untuk pembuatan bahan vaksin iradiasi.
Akibat kerusakan DNA
Iradiasi Sinar γ
Tingkatan Molekular
Tingkatan sel
Sel mati Mutasi Transformasi
Akibat kerusakan DNA
Memperbaiki DNA
Radikal bebas
CO-60
oleh peristiwa pengaktifan (radiolisis) molekul air (Hall, E.J., 1994 ; Darussalam
1996).
Vaksin yang menggunakan iradiasi dibagi menjadi dua macam, yaitu vaksin
aktif dan vaksin inaktif. Vaksin aktif adalah vaksin dengan bahan dasar organisme
hidup yang telah dilemahkan dengan proses iradiasi, sedangkan vaksin inaktif
adalah vaksin dengan bahan dasar organisme mati hasil iradiasi. Vaksin inaktif
sendiri dibagi menjadi dua, yaitu vaksin inaktif rekombinan dan non rekombinan.
Vaksin inaktif rekombinan diperoleh dengan cara melemahkan organisme terlebih
dahulu melalui teknik rekombinan setelah itu diinaktivasi dengan iradiasi. Vaksin
inaktif non rekombinan adalah pemakaian iradiasi untuk inaktivasi organisme
patogen secara langsung (Nature, 2005).
Vaksin aktif yang telah dilemahkan biasanya digunakan untuk parasit yang
bersifat intraselular yang berasal dari protozoa dan cacing. Beberapa penelitian
vaksin yang saat ini dikembangkan baik pada manusia maupun hewan
menggunakan teknik iradiasi untuk melemahkan organisme patogen, seperti
protozoa dan cacing (Jenkins, 2002).
Keuntungan vaksin jenis ini adalah dapat mengaktifkan seluruh fase sistem
imun, meningkatkan respon imun terhadap seluruh antigen (proses inaktivasi
dapat menyebabkan perubahan antigenisitas), durasi imunisitas lebih panjang,
biaya lebih murah, lebih cepat menimbulkan respon imunitas, mudah di bawa ke
lapangan, dapat mengurangi wild type. Tetapi vaksin jenis ini memiliki beberapa
kelemahan di mana vaksin ini kurang baik apabila digunakan pada daerah tropis
dan pada penderita penyakit immunodeficiency serta adanya kemungkinan terjadi
mutasi balik yang menyebabkan daya virulensi menjadi tinggi (Tetriana dan
Sugoro, 2007).
Hasil percobaan terdahulu menunjukkan bahwa booster yang diberikan akan
bermanfaat apabila diberikan pada saat tingkat produksi/ titer antibodi menjelang
puncaknya, sehingga akan meningkatkan daya kekebalan pada hewan yang
bersangkutan. Di samping itu pertambahan bobot badan hewan tidak terganggu
karena parasit penantang yang diberikan tidak bisa berkembang dan tidak aktif
lagi (Arifin, 2006).
Vaksin inaktif contohnya Leishmania, yaitu penyakit Kala-azar yang
ditimbulkan oleh protozoa. Keuntungan vaksin ini adalah memberikan imunitas
humoral yang tinggi bila booster diberikan, tidak menyebabkan mutasi atau
reversion, dapat digunakan untuk pasien immuno-defisiensi, cocok digunakan
untuk daerah tropis tetapi vaksin jenis ini membutuhkan biaya yang lebih tinggi
karena membutuhkan booster (Gaffar, A., 2006).
Vaksin inaktif rekombinan contohnya untuk penyakit yang disebabkan bakteri
Brucella abortus, yaitu penyakit menyebabkan keguguran pada ternak ruminansia
maupun manusia. Rekombinasi dilakukan untuk melemahkan bakteri dengan cara
menginsersikan gen plasmid bakteri E. coli sehingga B. abortus memiliki
karakteristik membran yang sama dengan E. coli. Selanjutnya mutan tersebut
yang diinaktivasi dengan iradiasi sinar gamma dengan dosis 300 Gy
(Ramamoorthy,S., et al., 2006).
2.6 Radiasi dan Iradiasi
Radiasi merupakan proses yang kejadiannya berlangsung tanpa unsur
kesengajaan atau tanpa adanya perlakuan khusus, misalnya: bentuk mutasi pada
tanaman dapat terjadi secara alamiah (spontan) akibat radiasi sinar kosmik di
alam. Sedangkan iradiasi merupakan proses yang kejadiannya berlangsung karena
adanya perlakuan khusus terhadap sesuatu obyek yang dilakukan secara disengaja
(misalnya untuk tujuan melakukan suatu pengamatan atau penelitian), contoh:
bahan makanan yang telah diiradiasi (the irradiated food) dengan sinar gamma
dapat menjadi awet dan tidak cepat membusuk ataupun rusak (Darussalam, 1996).
Beberapa macam radiasi dapat bersifat letal (mematikan) terhadap sel-sel
mikroba dan juga sel-sel organisme lain. Radiasi macam ini meliputi bagian dari
spektrum elektromagnetik (radiasi ultraviolet, gamma, dan sinar X) dan sinar-
sinar katode (elektron berkecepatan tinggi).
Proses perubahan materi akibat radiasi sangatlah kompleks, tetapi untuk
penyederhanaannya dapat digambarkan dalam empat tahapan:
1. Tahap Fisik Awal
Tahap awal ini berlansung hanya kira-kira 10-16 detik, energi terdeposit di
dalam sel dan menyebabkan ionisasi. Di air reaksinya dapat dinyatakan
sebagai: H2O → H2O+ + e-. (H2O+ adalah ion positif dan e- ion negatif).
Peristiwa ionisasi terjadi bilamana radiasi dengan energi yang cukup besar
melintas mendekati ataupun menumbuk suatu atom dan menyebabkan
terlemparnya suatu elektron (-) keluar dari orbitnya. Radiasi yang dapat
menyebabkan terjadinya ionisasi disebut radiasi pengion. Pada saat menembus
materi, radiasi pengion dapat menumbuk elektron orbit sehingga elektron
terlepas dari atom. Akibatnya timbul pasangan ion positif dan ion negatif.
Menurut sifat kejadiannya, ionisasi dikelompokkan ke dalam ionisasi-
langsung dan ionisasi-tak-langsung. Ionisasi-langsung terjadi jika radiasi
menyebabkan ionisasi pada saat itu juga ketika berinteraksi dengan atom
materi, dan proses ini bisa disebabkan oleh partikel bermuatan listrik seperti
alpha dan beta. Berbeda dengan yang terjadi pada interaksi partikel
bermuatan, interaksi radiasi yang berupa gelombang elektromagnetik (sinar
gamma atau sinar-X) ataupun partikel yang tidak bermuatan listrik (neutron)
tidak secara langsung menimbulkan ionisasi. Partikel yang dihasilkan dalam
interaksi yang pertama ini kemudian menyebabkan terjadinya ionisasi. Proses
seperti ini dikenal sebagai ionisasi-tak-langsung. Sedangkan peristiwa eksitasi
terjadi apabila radiasi yang berinteraksi dengan atom tidak cukup energinya
untuk menghasilkan ionisasi langsung, maka dapat mengakibatkan suatu
elektron orbit tertentu berpindah ke tingkat energi yang lebih tinggi, atau ke
keadaan tereksitasi. Energi eksitasi tersebut akan dilepaskan kembali dalam
bentuk radiasi elektromagnetis, pada saat elektron tersebut kembali ke orbit
dengan tingkat energi yang lebih rendah. (Darussalam, 1996; Yudi, 2008).
Gambar 13. Peristiwa terjadinya ionisasi dan eksitasi
2. Tahap Kimia – Fisik
Tahap ini berlangsung kira-kira 10-6 detik. Ion-ion berinteraksi dengan
molekul air lainnya yang menghasilkan beberapa produk baru. Sebagai
contoh, ion positif terdisosiasi :
H2O+ → H+ + OH-
Ion negatif, yaitu elektron yang terikat pada molekul air netral yang
selanjutnya terdisosiasi
H2O+ + e- → H2O
H2O- → H + OH-
Sehingga produk dari reaksinya adalah H+ , OH- ,H dan OH. Dua ion
pertama yang ada dalam sebagian besar air, tidak mengambil bagian dalam
reaksi berikutnya. Dua produk lainnya, H dan OH disebut radikal bebas, yaitu
mereka yang mempunyai elektron yang tidak berpasangan dan secara kimia
sangat reaktif. Hasil reaksi lainnya adalah hidrogen peroksida H2O2, yang
merupakan oksidan yang sangat kuat dan terbentuk dengan reaksi: OH + OH
→ H2O2
3. Tahap Kimia
Tahap kimia berlangsung hanya beberapa detik, dimana hasil reaksi
berinteraksi dengan molekul-molekul organik yang penting dalam sel. Radikal
bebas dan oksidan dapat menyerang molekul komplek yang membentuk
kromosom. Misalnya, sebagai contoh radikal tersebut dapat mengikatkan
dirinya ke molekul atau meyebabkan ikatan rantai panjang menjadi putus.
Perubahan tingkat molekular secara kimia dapat diakibatkan oleh:
a) Kerja langsung radiasi (direct action), dimana perubahan atau kerusakan
terjadi pada molekul-molekul biologi yang menyerap lansung energi
radiasi.
b) Kerja tidak lansung radiasi (indierct action), dimana perubahan atau
kerusakan pada molekul-molekul terjadi akibat pengaruh senyawa radikal-
radikal bebas dan pengoksida. Sedangkan senyawa radikal-radikal bebas
dan pengoksida merupakan hasil peristiwa radiolisis molekul air dalam
plasma akibat radiasi (Darussalam, 1996).
4. Tahap Biologi
Tahap biologi mempunyai waktu yang bervariasi dari puluhan menit
sampai puluhan tahun bergantung pada gejala khusus yang muncul. Proses
biologi menyusul perubahan atau kerusakan molekul secara kimiawi dan
biokimiawi, serta merupakan respon biologi yang timbul seperti efek genetik,
efek somatik, efek fisiologis maupun kematian sel organisme.
1. Efek fisiologis radiasi, bersifat sementara dan dapat pulih kembali
(recovery). Contoh: penghambatan pertumbuhan dan gangguan sifat
permeabilitas selaput (dinding) sel.
2. Efek genetik radiasi, menghasilkan bentuk mutasi pada keturunan
organisme dengan sifat-sifat yang berbeda dari induknya. Kejadian mutasi
menyusul kerusakan pada molekul DNA dan kromosom.
3. Efek somatik radiasi, menghasilkan bentuk sel-sel somatik abnormal
sebagai hasil pembelahan sel secara mitosis.
Terdapat 2 (dua) macam efek somatik radiasi:
a. Jenis stokastik, yaitu merupakan efek tertunda. Contoh:
terjadinya kanker pada darah (leukimia), tulang dan paru-paru.
b. Jenis stokastik, di mana terdapat hubungan antara dosis paparan
radiasi dan efek radiasi. Contoh: luka bakar pada kulit
(erythema), katarak mata, penurunan jumlah sel-sel gonad
(kemandulan).
4. Efek lethal (mematikan) radiasi, terjadi akibat beberapa peristiwa
kegagalan yang serius pada fungsi tubuh yang penting. Contoh: gangguan-
gangguan pada fungsi jaringan hemapoietik (darah), saluran pencernaan
dan mekanisme pernapasan. Lalu peningkatan infeksi berat oleh mikroba.
Usaha menghindari kematian organisme akibat radiasi antara lain melalui
perbaikan intraselular, proses regenerasi sel yang rusak, transplantasi
sumsum tulang dan lain sebagainya (Darussalam, 1996).
O
CHNH2
ROH
Efek Radiasi terhadap Molekul Penting
a) Protein
Protein terdiri dari beberapa asam amino yang secara karakteristik di tandai
oleh adanya gugus -NH2, gugus -COOH dan rantai samping R.
Gambar 14. Formula asam amino
Gugus -NH2 dan rantai samping –R asam amino yang paling radiosensitif di
antara tiga kelompok di atas. Kerusakan fungsi protein sebagian besar disebabkan
oleh timbulnya perubahan pada rantai samping (-R) yang kritis. Diasumsikan
bahwa radiasi dapat mempengaruhi konfigurasi 3 dimensi molekul protein
sehingga menjadi terbuka dan siap melakukan suatu reaksi. (Darussalam, 1996).
b) Kromosom
Radiasi dapat menyebabkan perubahan atau kerusakan struktur kromosom
(aberasi). Perubahan atau kerusakan itu dapat berupa antara lain: pelengketan,
translokasi, inversi, defisiensi, dan lain sebagainya (Darussalam, 1996).
c) Molekul Asam Deoksiribonukleat (DNA)
Radiasi dapat menyebabkan berbagai macam perubahan dan kerusakan
pada molekul Asam Deoksiribonukleat (DNA). Perubahan dan kerusakan pada
molekul DNA tersebut dapat berupa antara lain: perubahan susunan triplet
molekul DNA, pelengketan, patahan, kehilangan basa, deaminasi, dan
sebagainya.
Setiap Asam nukleat (nucleic acid) merupakan makromolekul yang
berperan sebagai pembawa informasi genetik. Kerusakan secara biokimiawi
yang terjadi pada molekul DNA dapat mengarah kepada kejadian mutasi baik
pada sel-sel germa maupun pada sel-sel somatik. Bentuk mutasi pada sel-sel
germa akan tampak pada keturunan berikutnya, sementara bentuk mutasi pada
sel-sel somatik terlihat pada bentuk abnormal pada sel-sel anakan hasil
pembelahan mitosis (Darussalam, 1996).
d) Enzim
Radiasi dapat menyebabkan kerusakan biokimiawi pada struktur enzim.
Kerusakan enzim dapat mengakibatkan penurunan pada fungsi enzim, yaitu
terjadinya penurunan daya katalisasi enzim dalam proses reaksi kimia tertentu
(Darussalam, 1996).
e) Lemak
Radiasi dapat menimbulkan perubahan dan kerusakan pada bagian ikatan
rangkap asam lemak (Darussalam, 1996).
f) Karbohidrat
Radiasi dapat menimbulkan penguraian dan kerusakan (degradasi) pada
rantai karbohidrat (Darussalam, 1996).
Efek Radiasi terhadap Pembelahan Sel
Radiasi dapat menghambat atau menghalangi pembelahan sel sebagai akibat
perubahan atau kerusakan pada kromosom. Beberapa fragmen kromosom mulai
terlihat pada stadia metafase, yang disusul kemudian oleh timbulnya jembatan
kromosom pada stadia anafase ataupun telofase. Semua ini dapat mengarah
kepada tertundanya atau terhentinya proses pembelahan sel. Jika proses
pembelahan sel dihambat atau dihalangi secara terus-menerus dapat menimbulkan
kematian sel atau jaringan (Darussalam, 1996).
2.7 Sinar Gamma
Sinar gamma (seringkali dinotasikan dengan huruf Yunani gamma, γ) adalah
sebuah bentuk energi dari radiasi elektromagnetik tinggi yang diproduksi oleh
transisi energi karena percepatan elektron atau radioaktifitas atau proses nuklir
atau subatomik yang lainnya seperti penghancuran elektron-positron.
Sinar gamma merupakan gelombang elektromagnetik yang bergerak dengan
kecepatan sangat tinggi, hampir menyamai kecepatan cahaya. Arahnya tidak
dipengaruhi medan magnet dan mempunyai daya ionisasi kecil serta daya tembus
yang tinggi. Dalam hal ionisasi, radiasi gamma berinteraksi dengan bahan melalui
tiga proses utama, yaitu:
1. Efek fotolistrik
Pada efek fotolistrik, energi foton diserap oleh elektron orbit, sehingga
elektron tersebut terlepas dari atom. Elektron yang dilepaskan akibat efek
fotolistrik disebut fotoelektron. Efek fotolistrik terutama terjadi pada foton
berenergi rendah yaitu antara energi + 0,01 MeV hingga + 0,5 MeV.
Disamping itu efek fotolistrik banyak terjadi pada material dengan Z yang
besar. Sebagai contoh efek fotolistrik lebih banyak terjadi pada timah hitam
(Z=82) daripada tembaga (Z=29) (Yudi, 2008).
Gambar 15. Efek fotolistrik
2. Efek penghamburan Compton
Pada efek Compton, foton dengan energi hv berinteraksi dengan elektron
terluar dari atom, selanjutnya foton dengan energi hv dihamburkan dan
elektron tersebut dilepaskan dari ikatannya dengan atom dan bergerak dengan
energi kinetik tertentu (Yudi, 2008).
Gambar 16. Efek penghamburan Compton
3. Efek produksi pasangan
Proses produksi pasangan hanya terjadi bila foton datang / 1,02 MeV. Apabila
foton semacam ini mengenai inti atom berat, foton tersebut akan lenyap dan
sebagai gantinya timbul sepasang elektron-positron. Positron adalah partikel
yang massanya sama dengan elektron dan bermuatan listrik positif yang
RADIASI
FOTOLISTRIK
besarnya juga sama dengan muatan elektron. Proses ini memenuhi hukum
kekekalan energi:
hv = (2m 0C2) + (K+) + (K-)
Keterangan: K+ = energi kinetik positron
K- = energi kinetik elektron
Oleh karena itu proses ini hanya bisa berlangsung bilamana energi foton yang
datang minimal. 2m0C2 (= 1,20 MeV), m0 adalah massa diam elektron dan c
adalah kecepatan cahaya. Berkaitan dengan uraian ini maka nilai atau besaran
absorpsi linier akan bergantung pada energi foton yang datang disamping
bergantung pada jenis media/materi/zat yang dilaluinya atau bergantung pada
nomor atom (Z) media/materi yang dilaluinya (Yudi, 2008).
Sinar gamma mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek daripada
sinar X sehingga mempunyai energi yang lebih tinggi. Pada umumnya sinar
gamma yang digunakan untuk radiasi adalah hasil peluruhan inti atom Cobalt-60.
Cobalt-60 adalah sejenis metal yang mempunyai karakteristik hampir sama
dengan besi/nikel. Cobalt-60 memancarkan dua sinar gamma dengan energi
masing-masing sebesar 1,17 MeV dan 1,33 MeV yang mempunyai waktu paruh
5,27 tahun (Wayudi P., et. al., 2005; GIDAE, 1992 )
Sinar gamma dapat ditahan oleh materi dengan jumlah massa besar, yaitu
yang memiliki nomor atom dan densitas tinggi, contohnya timbal. Dosis dan laju
dosis sinar gamma dapat ditentukan dengan mengatur penahan dan jarak. Sinar
gamma menghasilkan kerusakan yang mirip dengan yang disebabkan oleh sinar-X
seperti terbakar, kanker, dan mutasi genetika (Pelchzar dan Chan, 1988).
Dosimeter Standar
Dosimeter standar adalah alat untuk mengukur dosis iradiasi sinar gamma
dosis tinggi, nilai dosis dapat ditentukan secara langsung dengan dosimeter
standar, atau diukur dengan dosimeter lain yang sebelumnya telah dikalibrasi
terhadap dosimeter standar. Ada dua jenis dosimeter standar yang hingga kini
sering dimanfaatkan untuk dosimetri gamma dosis tinggi, yaitu dosimeter Fricke
dan Ceri-cero (McLaughlin, 1989; IAEA, 1977).
1. Dosimeter Fricke
Dosimeter Fricke merupakan salah satu jenis pengukur dosis serap yang
dipakai sebagai dosimeter acuan karena absorbsinya yang tinggi dan
mempunyai hubungan yang linier terhadap dosis serap (ICRU). Dosimeter ini
dibuat dari bahan kimia Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O (ferro ammonium sulfat), NaCl
(natrium klorida) dan H2SO4 (asam sulfat) (Scrad, 1971).
Proses iradiasi dapat menghasilkan oksidasi ion dari Fe2+ menjadi Fe3+.
Oksidasi ini akan menyebabkan terjadinya perubahan rapat optik pada larutan
dosimeter. Jumlah ion yang terbentuk sebanding dengan besar perubahan rapat
optik dan dapat diukur dengan Spektrofotometer Varian pada panjang
gelombang serapan maksimal ion ferri pada 305 nm. Penentuan laju dosis
pada suatu titik penyinaran dilakukan dengan cara meletakkan dosimeter pada
titik tertentu dan diradiasi dengan gamma dalam waktu tertentu. Perubahan
rapat optik pada dosimeter Fricke diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 305 nm. Sedang laju dosis pada titik dimana dosimeter
tersebut disinari dihitung menggunakan persamaan SCHESTED (Bjerbakke,
1970).
Keunggulan dari dosimeter Fricke ini antara lain adalah laju dosis dari
sumber yang diukur tidak melebihi 2 x 107 Gy/det dan temperatur tidak
menyimpang selama proses iradiasi, sehingga laju dosis sumber tidak
berpengaruh terhadap hasil pengukuran. International Commission on
Radiation Units and Measurements (ICRU) juga menganjurkan penggunaan
dosimeter Fricke untuk pengendalian mutu faktor kalibrasi alat ukur radiasi
standar nasional, yaitu laju dosis serap yang ditentukan dengan dosimeter
Fricke digunakan untuk mengevaluasi faktor kalibrasi alat ukur radiasi standar
nasional yang diperoleh sebelumnya (Thamrin, 1997).
2. Dosimeter Ceri-Cero
Dosimeter Ceri-cero juga dapat dipakai sebagai dosimeter standar dalam
pengukuran radiasi gamma dosis tinggi. Dosimeter ceri-cero sulfat untuk
mengukur dosis tinggi dengan dengan jangkauan 10-1000 KGy sudah umum
digunakan dalam proses radiasi. Larutan ceri sulfat dibuat menggunakan
reagen Ce(SO4)2.4H2O, H2SO4 dan H2O2 30% yang dilarutkan dalam pelarut
tridest (Bjerbakke, 1970). Dosimeter Ceri-cero telah ditetapkan oleh ICRU
sebagai dosimeter acuan karena cukup stabil sebelum dan sesudah iradiasi
serta memiliki ketelitian yang sangat baik ( + 1%). Apabila larutan ceri-cero
sulfat disinari dengan gamma dosis tinggi, maka akan terjadi proses reduksi
ion ceri (Ce4+) menjadi ion cero (Ce3+). Semakin besar dosis radiasi, semakin
banyak pula ion ceri yang tereduksi menjadi cero, sehingga akan terdapat
perbedaan jumlah ion cero pada larutan yang diradiasi dengan larutan yang
tidak diradiasi. Perubahan kerapatan optik pada dosimeter ceri-cero yang
menerima paparan radiasi diukur menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 320 nm (Thamrin, 1997).
Untuk keperluan pengukuran dosis secara rutin, kedua jenis dosimeter
tersebut tidak tersedia dalam bentuk siap pakai, jadi pemakai harus meracik
sendiri dosimeter sesuai dengan petunjuk yang telah dibakukan (McLaughlin,
1989; Scrad, 1971; Bjerbakke, 1970). Ada beberapa faktor yang membuat
dosimeter tersebut kurang praktis apabila dipakai untuk keperluan rutin,
misalnya Dosimeter Fricke, sangat peka terhadap pengotor organik dan cahaya
(Spink, 1976). Untuk mendapatkan dosimeter yang baik diperlukan syarat-
syarat yang ketat seperti kemurnian pelarut dan kebersihan peralatan.
Pengukuran dosis pada dosimeter ceri-cero ini biasanya menggunakan
spektrofotometer yang merupakan masalah tersendiri di lapangan karena
berukuran besar dan tidak mungkin dibawa ke mana-mana. Selain itu, dalam
proses pengukuran juga harus melakukan pengenceran berulang-ulang dan
makan waktu yang relatif lama (Thamrin, 1997).
2.8 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung
pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat
digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi
molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Menurut Yuwono (2005), elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan
molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik
yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan
terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Yuwono,
2005).
Kegunaan elektroforesis antara lain:
1. Menentukan berat molekul (estimasi). Penetapan BM secara lebih teliti
dapat dilakukan dengan ultrasentrifuge, meskipun dengan elektroforesis
cukup memenuhi syarat.
2. Dapat mendeteksi terjadinya pemalsuan bahan.
3. Dapat mendeteksi terjadinya kerusakan bahan seperti protein dalam
pengolahan dan penyimpanan.
4. Untuk memisahkan spesies molekul yang berbeda secara kualitatif
maupun kuantitatif, yang selanjutnya masing-masing spesies dapat
dianalisis.
5. Menetapkan titik isoelektrik protein.
Salah satu jenis elektroforesis adalah elektroforesis SDS-PAGE. Sodium
dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) terutama
dilakukan untuk mengetahui apakah suatu protein monometrik ataukah
oligometrik, selain itu untuk menetapkan berat molekul dan jumlah rantai
polipeptida sebagai subunit atau monomer.
Pada mekanisme SDS PAGE, protein bereaksi dengan SDS yang merupakan
deterjen anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif. Protein akan
terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS, berbentuk
elips atau batang, dan berukuran sebanding dengan berat molekul protein. Protein
dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini terpisahkan berdasarkan
muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid.
Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang
telah diketahui berat molekulnya (Ummubalqis, 2000).
SDS-PAGE dilakukan pada pH netral. Pada metoda ini digunakan SDS dan
beta-merkaptoetanol. SDS merupakan anionic detergent yang bersama dengan
beta-merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi
protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini disebabkan oleh terpecahnya
ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus sulfihidril. SDS
akan membentuk kompleks dengan protein dan kompleks ini bermuatan negatif
karena gugus-gugus anion dari SDS. Pada pH 7, SDS 1% dan merkaptoetanol 0,1
M sebagian besar rantai protein mengikat sekitar 1,4g SDS per gram protein,
dengan demikian jumlah SDS yang terikat oleh protein adalah tetap. Oleh karena
itu protein dapat dipisahkan hanya berdasarkan ukurannya (BM), di mana
kompleks SDS protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil
dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil (Hames, 1998).
BAB III
METODA PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi, Kesehatan dan
Reproduksi Ternak, Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR), Badan
Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Pasar Jum’at Jakarta Selatan, mulai dari
bulan Agustus 2007 sampai dengan bulan September 2007.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan:
Isolat bakteri E. coli S1 yang didapat dari Laboratorium Nutrisi, Kesehatan
dan Reproduksi Ternak, Pusat Apalikasi Tenaga Isotop dan Radiasi (PATIR),
Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Pasar Jum’at Jakarta Selatan.
Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah: alkohol 95%,
aquades steril, aquabides, Media NB (Nutrient Broth), Media NA (Nutrient Agar),
larutan Lowry I dan II (Lampiran 1), 30% Acrylamide solution, Separating gel
buffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8), Stacking gel buffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8),
sampel buffer (Lampiran 1), Running buffer (Tris-Glisin), 10% Ammonium
persulfate, N,N,N’,N’, Tetramethylethylenediamine (TEMED), coomassie brilliant
blue staining, dan destain solution coomassie R-250.
Alat:
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: autoklaf (Hitachi),
sonikator (Branson 2210), gelas beker, penangas air, bunsen, cawan petri, tabung
Eppendorf , laminar flow, mikropipet, tabung reaksi, timbangan analitik, vortex,
erlenmeyer, shaker inkubator, kuvet, gamma chamber 4000 A, spektrofotometer
vissble (Genesys), sentrifuge (Hitachi CR21G II 10000 rpm), mikro sentrifuge
(Hitachi), vial gelas, tip kecil dan tip besar, Mini-Protein Gel Electrophoresis
(Atto).
3.3 Metoda Kerja
Pada penelitian ini dilakukan beberapa metode analisa, yaitu pengukuran
absorban dengan spektrofotometer vissible, inaktivasi bakteri dengan iradiasi sinar
gamma dengan laju dosis 1089,59 Gy/jam menggunakan Gamma Chamber 4000
A, pengukuran kandungan protein dengan metode Lowry, dan analisa profil
protein dengan elektroforesis SDS-PAGE.
3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Pembuatan kurva tumbuh Escherichia coli
Kultur bakteri berumur 1 hari pada medium NA diinokulasikan sebanyak 3
ose ke dalam 30 ml medium NB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC
dan agitasi 120 rpm sebagai kultur inokulum. Setelah itu kultur diukur
absorbannya dengan spektrofotometer vissible pada panjang gelombang 660 nm.
Kultur diukur pada menit ke-0, 30, 60, 90, 150, 210, 270, 330, dan 390. Hasil
pengukuran dibuat kurva dengan axis (waktu) dan ordinat (absorbansi).
3.4.2 Penentuan Dosis Iradiasi Inaktivasi sel E. coli dengan Sinar Gamma
Kultur pada fase mid log disentrifuge 10000 rpm dan dibilas dengan aquades
steril sebanyak 2 kali. Pelet yang diperoleh diencerkan hingga jumlah sel
diperoleh 1013 sel/ml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10 ml.
Selanjutnya diiradiasi sinar gamma dengan dosis 0Gy, 50Gy, 200Gy, 500Gy,
600Gy, 700Gy, 800Gy, 900Gy, dan 1000Gy di Gamma Chamber 4000 A dengan
laju dosis 1089,59 Gy/jam. Selanjutnya kultur hasil iradiasi diencerkan hingga
jumlah sel diperoleh 1011 sel/ml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10
ml. Kultur hasil iradiasi kemudian dihitung jumlah selnya dengan metode droptest
(untuk uji inaktivasi). Hasil yang diperoleh dibuat kurva dengan axis (dosis
iradiasi) dan ordinat (jumlah sel).
3.4.3 Pengukuran Protein Sel E. coli Metode Lowry
Kultur hasil iradiasi diukur kandungan protein ekstraselular dan intraselular.
Untuk mengetahui kandungan protein ekstraselular langsung menggunakan kultur
hasil iradiasi, sedangkan untuk protein intraselular dipecah terlebih dahulu dengan
melarutkan kultur hasil iradiasi ke dalam aseton (1 : 1) dan disonikasi selama 15
menit. Kemudian 1 ml sampel (ekstra dan intraselular) ditambahkan 5 ml larutan
Lowry I (Lampiran 1) dan dibiarkan selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan
0,5 ml larutan Lowry II (Lampiran 1) dan dibiarkan selama 30 menit. Setelah itu,
dibaca dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang 700 nm, dan
dibandingkan dengan standar BSA.
3.4.4 Karakteristik Profil Protein Bakteri E. coli
Pada penelitian ini menggunakan metode elektroforesis 1 dimensi SDS-
PAGE dengan sistem buffer Laemmli. Konsentrasi gel poliakrilamida yang
digunakan adalah 10%.
a. Preparasi sampel
Kultur hasil iradiasi sinar gamma dengan dosis yang berbeda diambil
sebanyak 40 µl dengan mikropipet ke dalam tabung effendorf, ditambahkan
aseton sebanyak 40 µl dan disonikasi selama 15 menit, lalu ditambahkan
buffer sampel sebanyak 20 µl dan divortek hingga homogen, kemudian
dididihkan selama + 5 menit, setelah itu disentrifuge selama 5 menit.
b. Preparasi gel elektroforesis
- Separating gel (10%)
30% Acrylamide solution 6 ml ditambahkan separating gel buffer (1,5 M
Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 4,5 ml, kemudian aquabides 7,5 ml dan 10%
Ammonium persulfate 0,08 ml serta TEMED 0,01 ml.
- Stacking gel (45%)
30% Acrylamide solution 0,9 ml ditambahkan stacking gel buffer (0,5 M
Tris-HCl, pH 6,8) sebanyak 1,5 ml, kemudian aquabides 3,6 ml dan 10%
Ammonium persulfate 0,02 ml serta TEMED 0,01 ml.
c. Pembuatan kolom gel
Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit
ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan aquabides
untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku
dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu pasang sisir pembentuk
kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu diangkat sisirnya. Kemudian
dipasang hasil gel tersebut pada perangkat elektroforesis.
d. Loading sampel
Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel
sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati-hati lalu
dielektroforesis selama + 100 menit pada 200 Volt, 40 mA.
e. Pewarnaan gel
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining gel warna
biru Coomassie R-250, selama + 1 jam.
f. Pencucian gel
Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250, selama + 1 hari.
Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan LabImage 1D
2006 dan SPSS 11.5.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pertumbuhan Bakteri E. coli
Gambar 17 menunjukkan kurva pertumbuhan Isolat bakteri E. coli yang
ditumbuhkan dalam media NB. Berdasarkan gambar tersebut bahwa kurva
tumbuh tidak mengalami fase adaptasi (lag phase), tetapi langsung memasuki fase
eksponensial (fase log). Dalam fase eksponensial terdapat suatu pertambahan
semua komponen selular yang lain seperti DNA, RNA, dan protein secara teratur,
kemudian setelah menit ke-330, pertumbuhan bakteri memasuki fase statis
(stationary phase).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 100 200 300 400 500
Waktu (menit)
Abs
orba
nsi
Gambar 17. Pertumbuhan Bakteri E. coli dalam medium TSB yang
diinkubasikan pada suhu 370C dan agitasi 120 rpm
Menurut Pelchzar dan Chan (1988), bahwa kurva pertumbuhan bakteri terdiri
dari 3 fase, yaitu periode awal yang tampaknya tanpa pertumbuhan (fase
adaptasi), diikuti oleh suatu periode pertumbuhan yang cepat (fase log), kemudian
210 menit
mendatar (fase seimbang atau stationary phase) dan akhirnya diikuti oleh suatu
penurunan populasi sel hidup (fase kematian).
Kurva tumbuh ini digunakan untuk menentukan fase mid log, yaitu fase
pertumbuhan dimana terjadi kecepatan pembelahan sel tertinggi. Fase ini terjadi
pada menit ke-210, dengan kecepatan pertumbuhan berdasarkan nilai absorbansi
adalah 0,09/menit. Fase mid log digunakan karena sel-sel dalam kondisi aktif
melakukan metabolisme. Pada fase tersebut terjadi pembelahan yang cepat
sehingga dinding selnya tipis dan efek radiasi dapat terjadi secara maksimal
(Tetriana dan Sugoro, 2007). Menurut Alatas (2005), bahwa sel yang paling
sensitif adalah sel dengan tingkat proliferasi yang tinggi (aktif melakukan
pembelahan) dan tingkat diferensiasi yang rendah. Sedangkan sel yang resisten
atau tidak mudah rusak akibat pengaruh radiasi yaitu sel dengan tingkat
diferensiasi yang tinggi dan tidak aktif melakukan pembelahan.
4.2 Hasil Inaktivasi sel E. coli dengan Iradiasi Sinar Gamma
Pada gambar 18 menunjukkan hasil iradiasi sinar gamma yang dilakukan pada
dosis 0 Gy – 1000 Gy dengan laju dosis 1089,59 Gy/Jam menunjukkan terjadinya
penurunan jumlah sel yang sebanding dengan meningkatnya dosis iradiasi. Dosis
iradiasi yang diperlukan untuk menginaktivasi sel bakteri E. coli yaitu berkisar
800 Gy – 1000 Gy, karena pada dosis tersebut sudah tidak terlihat adanya
pertumbuhan sel E. coli.
-202468
10121416
0 200 400 600 800 1000 1200
Dosis (Gy)
Log
Jum
lah
sel/m
l
Gambar 18. Hubungan dosis iradiasi sinar gamma terhadap jumlah sel bakteri E. coli
Tabel 3. Jumlah sel E. coli hasil iradiasi sinar gamma.
Dosis (Gy) Jumlah sel/ml % Viabilitas 0 2,1 x 1013 100 50 2 x 1013 95,2 200 5 x 1011 2,4 500 2 x 1011 0,95 600 1,8 x 1010 0,09 700 2 x 1005 9,5 x 10-7
800 0 0 900 0 0 1000 0 0
Kondisi inaktif dapat terjadi karena terganggunya metabolisme sel yang
menyebabkan sel bakteri tidak mampu bereplikasi atau hilangnya kemampuan
membelah diri. Efek radiasi terhadap molekul-molekul penting, sel ataupun
jaringan telah menimbulkan berbagai macam perubahan, gangguan ataupun
kerusakan pada sistem biologi, seperti molekul protein, kromosom, molekul
DNA, molekul enzim, lemak dan karbohidrat (Darusalam, 1996).
Dosis Inaktif
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Trampuz, et al. (2006), disebutkan
bahwa pada fase stasioner bakteri E. coli dapat diinaktivasi hingga dosis 4000 Gy
(laju dosis 9,35 Gy/menit). Pada dosis tersebut sel bakteri E. coli telah mengalami
kerusakan yang cukup parah, sehingga sel tidak dapat melakukan metabolisme,
dan mengalami kematian. Dengan demikian, dosis tersebut dapat digunakan untuk
bahan vaksin mastitis.
Menurut Alatas (2005), kerusakan yang terjadi pada DNA dan kromosom
dapat menyebabkan sel tetap hidup atau mati. Bila tingkat kerusakan yang dialami
sel tidak terlalu parah dan proses perbaikan berlangsung dengan baik dan tepat,
maka sel bisa kembali normal seperti sebelum terpajan radiasi. Bila proses
perbaikan berlangsung tetapi tidak tepat maka akan dihasilkan sel yang tetap dapat
hidup tetapi telah mengalami perubahan. Artinya sel tersebut tidak lagi seperti sel
semula, tetapi sudah menjadi sel yang baru atau abnormal tetapi hidup. Selain itu,
bila tingkat kerusakan yang dialami sel sangat parah dan bila proses perbaikan
tidak berlangsung dengan baik maka sel akan mati.
4.3 Konsentrasi Protein Sel E. coli Hasil Iradiasi
Konsentrasi protein sel E. coli yang diukur dengan metoda Lowry,
sebagaimana tampak pada Gambar 19 menunjukkan adanya perubahan
konsentrasi protein sel E. coli yang bervariasi dengan perlakuan dosis yang
berbeda. Jumlah konsentrasi protein intraselular cenderung lebih besar
dibandingkan dengan jumlah konsentrasi protein ekstraselular, tetapi tidak
menghasilkan perbedaan yang nyata dengan kenaikan dosis iradiasi.
0
100
200
300
400
Kon
sent
rasi
(mg/
ml)
Dosis (Gy)Ekstaselular 104 103 126 134 135 113 87.9 91.8 113
Intraselular 154 178 182 202 190 177 165 169 170
Total 257 281 308 336 325 290 253 261 283
0 50 200 500 600 700 800 900 1000
Gambar 19. Konsentrasi protein E. coli hasil iradiasi
Pada dosis 0 Gy (kontrol). Jumlah protein intraselular, yaitu 154 mg/ml dan
protein ekstraselular, yaitu 104 mg/ml. Kandungan protein total cenderung
meningkat dibandingkan kontrol, tetapi pada dosis 800 Gy mengalami penurunan,
yaitu 253 mg/ml. Perubahan konsentrasi protein total tertinggi terjadi pada dosis
500 Gy, yaitu 336 mg/ml kemudian meningkat lagi pada dosis iradiasi 900Gy dan
1000 Gy, yaitu 261 mg/ml dan 283 mg/ml.
Hal ini diduga karena, dosis yang diberikan tidak terlalu besar dan sifat acak
dari kerusakan yang ditimbulkan oleh iradiasi sinar gamma. Pengurangan dan
pertambahan konsentrasi protein dapat disebabkan oleh kerusakan dan gangguan
pada protein tersebut, baik aktifitas maupun strukturnya. Menurut Syaifudin
(2005), komposisi protein dan elektrolit dalam serum akan bervariasi setelah
iradiasi. Konsentrasi masing-masing protein dapat meningkat melalui sintesis atau
melalui pelepasan selular yang nyata akibat kerusakan jaringan sel.
Wahyudi (2005), menambahkan bahwa adanya kemungkinan kecepatan
peningkatan aktifitas pembelahan sel terjadi pada dosis tertentu, tidak selalu
mengikuti interval peningkatan dosisnya. Seperti halnya sel kanker yang
disebabkan oleh radiasi atau radikal bebas, sehingga protein bersifat karsinogenik.
Harliansyah (2005), juga menyatakan jika radikal bebas menyerang asam-asam
nukleat, akan menimbulkan gangguan terhadap molekul DNA yang berakibat
terbentuknya mutasi basa-basa nitrogen serta berakhir dengan pembentukan
karsinogenesis.
4.4 Karakteristik Profil Protein Bakteri E. coli
Hasil elektroforesis SDS-PAGE protein sel E. coli, sebagaimana tampak pada
Gambar 20 menunjukkan pola yang hampir sama, tetapi intensitasnya berbeda.
Protein dari sel E. coli yang diiradiasi dengan dosis 0 Gy – 1000 Gy memiliki
jumlah pita protein relatif berbeda dengan berat molekul berkisar 10 kDa – 220
kDa.
Gambar 20. Profil Protein bakteri E. coli S1 hasil iradiasi sinar gamma (elektroforesis SDS-PAGE). M (marker/standar protein), 1 (0 Gy sebagai kontrol), 2 (50 Gy), 3 (200 Gy), 4 (500 Gy), 5 (600 Gy), 6 (700 Gy), 7 (800 Gy), 8 (900Gy), dan 9 (1000 Gy).
Intensitas protein yang berbeda, kemungkinan disebabkan karena jumlah
protein yang dielektroforesis relatif rendah. Hal ini sesuai dengan hasil penentuan
kadar protein yang telah ditentukan sebelumnya.
Hasil analisa anova satu arah (analysis of variance) menunjukkan nilai
signifikansi sebesar 0,996 atau 99,6% yang berarti lebih besar dari 5% data
menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan (H0 ditolak). Hal ini
memperkuat hasil konsentrasi protein. Dengan demikian iradiasi sinar gamma
sebagai metode untuk inaktivasi berpotensi besar dalam pembuatan vaksin, karena
komposisi protein relatif tetap walaupun konsentrasinya bervariasi dengan
bertambahnya dosis iradiasi.
Protein yang biasanya mengalami gangguan dan kerusakan akibat denaturasi,
yaitu pada struktur sekunder dan tersier protein. Hal ini diketahui sejak denaturasi
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
220 kDa 160 kDa 120 kDa 100 kDa 80 kDa 50 kDa 40 kDa 30 kDa 20 kDa 15 kDa
tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer
protein tetap sama setelah proses denaturasi (Ophart, C.E., 2003). Dalam
penelitian Vuckovic, M., et. al (2005), menunjukkan bahwa pada dosis iradiasi
1,5 kGy profil protein tidak mengalami perubahan yang signifikan.
Menurut Winarno (2002), protein yang terdenaturasi mengalami dua
kemungkinan, yaitu pembukaan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi
unit yang lebih kecil. Terjadinya kedua jenis denaturasi ini tergantung pada
keadaan molekul, yang pertama terjadi pada rantai polipeptida intramolekuler,
sedangkan yang kedua terjadi pada bagian-bagian molekul yang bergabung dalam
bentuk protein oligomer. Ikatan-ikatan yang dipengaruhi oleh proses denaturasi
ini adalah: ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik misalnya pada leusin, valin,
fenilalanin, triptofan yang saling berlekatan membentuk suatu micelle dan tidak
larut dalam air, ikatan ionik antara gugus bermuatan positif dan negatif, dan ikatan
intramolekular seperti yang terdapat pada gugus disulfida dalam sistin (Winarno,
2002).
Selain terjadinya denaturasi protein, iradiasi juga mampu mendegradasi
protein. Degradasi protein dapat menyebabkan protein tersebut kehilangan fungsi
dan aktivitas biologisnya, degradasi struktur dapat berasal dari hilangnya gugus
samping seperti deaminasi asam amino atau dari rearrangement kimia dan
modifikasi biomolekul. Dosis 0 – 1000 Gy tidak cukup untuk memutuskan ikatan
peptida (Syaifudin, 2005).
Efektifitas antigen yang digunakan dalam pembuatan vaksin ditentukan oleh
spesifitas epitop-epitop yang hanya dikenali oleh satu antibodi bagi setiap jenis
antigen yang ditentukan, sehingga akan mensinyalir respon imunitas humoral
yang tinggi bila booster diberikan. Dengan demikian, penggunaan dosis iradiasi
yang tidak terlalu tinggi cukup efektif dalam menginaktivasi sel bakteri tanpa
harus menghilangkan kemampuan antigennya, karena secara keseluruhan total
protein yang dihasilkan dari proses iradiasi tidak mengalami perubahan yang
signifikan.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Dosis iradiasi untuk menginaktivasi E. coli S1 adalah 800 Gy -1000 Gy
dengan laju dosis 1089,59 Gy/Jam.
2. Iradiasi sinar gamma terhadap bakteri E. coli S1 hingga dosis 1000 Gy
mampu menghasilkan sel E. coli S1 inaktif dengan profil protein total
yang tidak mengalami perubahan yang signifikan (Sign > 5%). Dengan
nilai signifikan 0,996.
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan laju dosis yang berbeda, optimasi
dosis inaktif dan penelitian lanjutan mengenai spesifikasi protein yang
diasumsikan sebagai faktor virulensi, agar dihasilkan antigen yang lebih murni
dan efektif dalam produksi vaksin mastitis.
DAFTAR PUSTAKA
Alatas, Zubaidah, M.Sc. 2005. Efek Paparan Radiasi Pada Manusia. Pusat Penelitian dan Pengembangan Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir. Badan Tenaga Nuklir Nasional
Arifin, M. 2006. Pengaruh Vaksin Radiasi Fascioliosis terhadap Ternak Ruminansia. Jurnal Gakuryoku Vol. II. Bogor
Benneth, C, et. Al,. 2002. Comparison of gamma-irradiated and triazol-treated RNA viruses using the joint biological agent identification and diagnostic, Idaho Technology Inc. Salt Lake City. UT
Bjerbakke, E. 1970. Manual on Radiation Dosimetry. Marcel Dekker Inc. pp. 323. New York
Darussalam, M. 1996. Radiasi dan Radioisotop Prinsip Kegunaannya Dalam Biologi, Kedokteran, dan Pertanian. Bandung: TARSITO
Feng P, et. al,. (2002-09-01). Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria Bacteriological Analytical Manual (8th ed.). FDA/Center for Food Safety & Applied Nutrition. Retrieved on 2007-01-25.
Fuad, Asep A. 2006. Manajemen Kesehatan Pemerahan. BPPT Sapi Perah Bumikasih
Gaffar, A. 2006. Parasitology : Blood and Tissue, Download from: http://www.med.sc.edu:85/parasitology/blood-proto.htm, University of South California,
Gibco Invitrogen Corporation. 2000. Effectiveness of inactivation by gamma irradiation for powder trypsin products. Grand Island. USA
Government of India Department of Atomic Energy (GIDAE). 1992. Radiation Safety Aspects of High Intensity Irradiators. Bhabha Atomic Research Center Bombay 400 085
Hall, E.J. 1994. Radiobiology for the radiobiologist, Lippincott Williams and Walkin. Philadelphia
Hames. B.D. 1998. Gel Electrophoresis of Proteins. Oxford University Press. New York Tokyo
Harliansyah. 2005. Mengunyah Halia Menyah Penyakit. Jabatan Biokimia, Fakulti Perubatan, Universiti Kebangsaan Malaysia, 43600 UKM Bangi, Selangor Darul Ehsan, Malaysia. pp 92-97
Hermanto, S. 2003. Spesifitas dan Sensitifitas Antibodi Anti eRF3 Ragi Saccharomyces cerevisiae. ITB
Hilmy, N. 2001. The Application of Nuclear Science and Technology for Human Welfare. Proc.of The Public. Informa. Seminar Jointly Organized by IAEA and BATAN. Jakarta
IAEA. 1977. Manual of Food Irradiation Dosimetry (Technical Report Series 178). IAEA, Vienna
IAEA. 2000. Combating infection in developing countries. Vienna Austria
Jenkins, M.C. 2002. Advances and prospects for subunit vaccines againsts protozoa of veterinary importance. Veterinary Parasitology 101, Elsevier, pp 291-310
Juwono dan Zulfa J. Ahmad. 2000. Biologi Sel. Buku Kedokteran EGC. Jakarta
Kogan, GD, et. al.1996. Structural and immunochemical Characterization of Type VIII group B Streptococcus Capsular Polysacharide. J. Bio. Chem.271: 8786-8790
Leammli, U.K. 1970. Nature 227: 680-685
Lehninger, L. Albert. 1982. Principles of Biochemistry. Worth Publisher, Inc., USA
Lehtolainen, Tanja. 2004. Escherchia coli Mastitis Bacterial factors and host response. Department of Clinical Veterinary Sciences Faculty of Veterinary Medicine University of Helsinki. Finland
Machi,S. 2002. Nuclear techniques serve mankind. Japan Atomic Industrial Forum (JAIF),Inc.
Manglayang Farm Online. 2006. Diare Pada Sapi Pedet. Artikel. Ditemukan di http://manglayang.blogsome.com/2006/04/06/kct-diare-pada-sapi-pedet/trackback/.
Medical Research News. 2006. Using gamma radiation preserves T-cell
responses in bacterial vaccine. http://www.news-medical.net/?id=19078.
University of California, San Diego (UCSD) School of Medicine.
Ditemukan pada tanggal 26 juli 2006, di http://www.ucsd.edu
McLaughlin, W.L., et. al. 1989. Dosimetry for Radiation Processing. Taylor & Francis, London
Muslim LW. 1995. Mikrobiologi Lingkungan. Universitas Hasanuddin. Jakarta
Nature publishing group. 2005. Nature reviews/immunology
Ophart, C. E. 2003. Virtual Chembook. Elmhurst College.
Poedjiadi A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press
Pelchar, Michael J., Jr., dan Chan E.C.S. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1 dan jilid 2. Jakarta: UI-Press
Ramamoorthy,S, et. al. 2006. Vaccination with gamma-irradiated Neospora caninum tachyzoites protects mice against acute challenge with N.caninum, J. Eukaryot. Microbiol. 53(2). pp. 151-156
Ruegg Pamela L., DVM, MPVM. 2001. Evaluating the Effectiveness of Mastitis Vaccines. University of Wisconsin – Madison
Sanakkayala, N, et. al. 2005. Induction of antigen-specific Th1-type Immune Responses by Gamma-Irradiated recombinant Brucella abortus RB51., Clinical and diagnostic laboratory immunology, American Society for Microbiology
Schroeder, J.W. 1997. Mastitis Control Program : Bovine Mastitis and Milking Management. AS-129. North Dakota State University
Scorvia, Imelda. 2000. How Vaccines Work. Ditemukan di http://www.mayoclinic.com/invoke.cfm?id=ID00023
Scrad – AAMP. 1971. Phys. Med. Biol. 16, pp. 379 – 396
Sugiri, Nawangsari. 1992. Biologi Sel. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat antar Universitas Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor. Bogor
Sugiwaka, Teruo. 2005. Japan International Cooperation Agency
Sugoro, I. 2004. Pengontrolan Penyakit Mastitis dan Manajemen Pemerahan Susu. Artikel PATIR BATAN
Sumarsih, I. 2003. Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar. Jurusan Ilmu Tanah, Fakultas Pertanian UPN Veteran. Yogyakarta
Smith, N.C. 1992. Concepts and strategies for anti-parasite immunoprophylaxis and therapy, Int. J. For Parasite 22. 1047
Spink, J.W.T. dan Woods, R.J. 1976. An Introduction to Radiation Chemistry. John Willey and Sons Inc. New York
Syaifudin, M. 2005. Indikator Biokimia Sel terhadap Radiasi Pengion. Buletin ALARA. Vol. 6. No. 3. pp. 125-131
Tetriana, D dan Sugoro, I. 2007. Aplikasi Teknik Nuklir Dalam Bidang Vaksin. Jurnal Alara Vol. I. PTKMR – BATAN, PATIR – BATAN Pasar Jum’at. Jakarta
Tuasikal,B.J., Sugoro,I., Tjiptosumirat,T., dan Marialina. 2003. Pengaruh Iradiasi Sinar Gamma terhadap Pertumbuhan Sreptococcus agalactiae sebagai Bahan Vaksin Penyakit mastitis pada Sapi Perah. Jurnal Sains Dan Teknologi Nuklir Indonesia, Volume IV, Edisi Khusus 2
Thamrin M.T. dan Akhadi, M. 1997. Dosimetri gamma dosis tinggi dalam kegiatan industri. Buletin ALARA 1 (2), 27-33. Pusat Standarisasi dan Penelitian Keselamatan Radiasi – BATAN
Trampuz, A, et. al. 2006. Effect Of Gamma Irradiation On Viability And DNA Of Staphylococcus Epidermimidis And Escherichia coli. Jurnal of medical microbiology. 55, 1271 – 1275.
Uchan U.S, et. al. 2005. Plasmid and Petterns of Escherichia coli Isolated From Bovine Mastitis in Konya, Turkey. Turk J Vet Anim Sci 29. pp 475-480. TUBITAK
Ummubalqis. 2000. Karakterisasi Protease dari Ekskretori/Sekretori Stadium L3 Ascaridia galli. Jurnal Hal 28- 40. IPB
Vuckovic M, et. al. 2005. Gamma-Radiation Induced Damage of Proteins In The Thick Fraction of Egg White. JSCS-3365. UDC 54-78:637.413:577.112.Vinca Institute of Nuclear Sciences Serbia and Montenegro
Wahyudi P., et. al. 2005. Pengaruh pemaparan sinar gamma isotop cobalt-60 Dosis 0,25–1 kGy terhadap daya antagonistik trichoderma Harzianum pada fusarium oxysporum. Berk. Penel. Hayati: 10 (143–151). Pusat Aplikasi Isotop & Radiasi-BATAN, Pasar Jumat. Jakarta. Fakultas Biologi – UNSOED, Purwokerto
Winarno F.G. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Cetakan ke-7. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama
Yatim, W. 1999. Biologi Sel. Bandung. Tarsito
Yudi. 2008. Interaksi Radiasi Nuklir. Infonuklir.com News. Pusat Diseminasi IPTEK Nuklir (PDIN). Jakarta
Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga
Young, B.A. 1981. Nuclear techniques in animal agruculture, IAEA Bul. 23. 47
Lampiran 1
KOMPOSISI BUFFER SAMPEL
1. Komposisi buffer sampel untuk protein yang tidak terdenaturasi
- Bromphenol Blue 0,5 % 0,5 ml
- Gliserol 10 % 1 ml
- Tris HCl, pH 6,8 0,06 mM 10 ml
- Water 4,8 ml
2. Komposisi buffer sampel untuk protein yang terdenaturasi
- β – Mercaptoethanol 50 µl
- Leammli sample buffer 950 µl
KOMPOSISI LARUTAN LOWRY
1. Lowry I
45 ml Larutan A + 0,05 ml Larutan B + 0,05 ml Larutan C
2. Lowry II
Folin : phenol reagent → 1 : 1
Keterangan:
Larutan A = 2% Na2CO3 dalam NaOH 0,1N
Larutan B = 27% K.Na tartat
Larutan C = 1% CuSO4
Lampiran 2 SKEMA KERJA
Lampiran 3
Kultur E. coli
Kurva Tumbuh
0Gy 50Gy 200Gy 500Gy 600Gy 700Gy 800Gy 900Gy 1000Gy
Spektrofotometri
Protein Ektraselular Total Protein (Ektra + Intra)
Protein Intraselular
SDS-PAGE
Inkubasi 24 jam, suhu 370C
Iradiasi sinar gamma (laju dosis 1089,59 Gy/jam)
Kultur E. coli S1, fase mid log
Kultur Iradiasi
Diukur kadar proteinnya dengan metoda Lowry, pada panjang gelombang 700 nm
Analisis LabImage 1D 2006 dan SPSS 11.5
Penentuan fase mid log
Karakteristik Profil Protein E. coli
Kurva Standar Protein
Kurva standar dibuat untuk mengetahui kadar protein berdasarkan nilai
absorbansi. Kurva ini dibuat untuk menentukan kandungan protein intraselular
dan ekstraselular kultur bakteri. Hasil yang diperoleh adalah berupa persamaan
garis yaitu sebagai berikut: y = 529,08x + 61,872 dan nilai R2 = 0,9971, dengan
nilai y adalah absorbansi dan x adalah kadar protein (mg/ml).
Absorbansi Konsentrasi (mg/ml) 0.187 40 0.228 60 0.279 80 0.492 200
Kurva Standar Protein
y = 529.08x - 61.872R2 = 0.9971
0
100
200
300
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Absorbansi
Kon
sent
rasi
(m
g/m
l)
Lampiran 4
Kurva Standar Pertumbuhan Bakteri E. coli S1
y = 1E+08x - 2E+07R2 = 0.9752
-2.00E+07
0.00E+002.00E+07
4.00E+076.00E+078.00E+07
1.00E+08
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Absorbansi
Jum
lah
Bak
teri
cfu/
ml
Absorbansi Jumlah Bakteri E. coli (cfu/ml) 0.139 3 x 1006 0.442 3,5 x 1007 0.687 8 x 1007
Lampiran 5
1 x 108
8 x 107
6 x 107
4 x 107
2 x 107
0
-2 x 107
Y = 1 x 108X – 2 x 107 R2 = 0,9752
Hasil Analisis LabImage 1D 2006
1. Kurva Standar (marker) Leammli
2. Kurva dosis 0 Gy
3. Kurva dosis 50 Gy
4. Kurva dosis 200 Gy
5. Kurva dosis 500 Gy
6. Kurva dosis 600 Gy
7. Kurva dosis 700 Gy
8. Kurva dosis 800 Gy
9. Kurva dosis 900 Gy
10. Kurva dosis 1000 Gy
Lampiran 6
HASIL ANALISIS STATISTIK SPSS 11.5
ANOVA
Nilai RF
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups .059 8 .007 .153 .996Within Groups 13.073 270 .048 Total 13.133 278
Hipotesis yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut:
H0 = Ada pengaruh yang signifikan antara dosis iradiasi terhadap profil
protein yang dihasilkan.
H1 = Tidak ada pengaruh yang signifikan antara dosis iradiasi terhadap
profil protein yang dihasilkan.
Dari tabel anova (analysis of variance) diperoleh nilai signifikan sebesar
0,996 atau 99,6% yang berarti lebih dari 5% dan H0 ditolak. Jadi hipotesis awal
diterima, artinya tidak ada pengaruh yang singnifikan antara dosis iradiasi
terhadap profil protein yang dihasilkan.
Lampiran 7
Pembesaran 1000 kali
Gambar Bakteri Escherichia coli S1
Sheker Inkubator Lampiran 8
Gambar LabImage 1D 2006 Lampiran 9
Gamma Chamber 4000 A
Bahan-bahan SDS-PAGE Lampiran 10
Mini-Protein Gel Electrophoresis, Atto
Cara Memasukkan Gel ke dalam Mini-Protein Gel Electroforesis, Atto
Top Related