UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIRURGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICO-CIRÚRGICAS

LUCIANA FUJIWARA AGUIAR RIBEIRO

PRÉ-CONDICIONAMENTO NUTRACÊUTICO COM MISTURAS DE ÓLEOS

ÔMEGA 3, 6 E 9 PARA ATENUAR AS CARACTERÍSTICAS

NEUROINFLAMATÓRIAS DO TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA

INDUZIDAS PELO ÁCIDO VALPRÓICO EM UM MODELO ANIMAL

FORTALEZA

2020

LUCIANA FUJIWARA AGUIAR RIBEIRO

PRÉ-CONDICIONAMENTO NUTRACÊUTICO COM MISTURAS DE ÓLEOS ÔMEGA

3, 6 E 9 PARA ATENUAR AS CARACTERÍSTICAS NEUROINFLAMATÓRIAS DO

TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA INDUZIDAS PELO ÁCIDO VALPRÓICO EM

UM MODELO ANIMAL

Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação Stricto Sensu em cirurgia do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Médico-Cirúrgicas. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão Vasconcelos Co-orientador: Prof.ª Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar

FORTALEZA

2020

LUCIANA FUJIWARA AGUIAR RIBEIRO

PRÉ-CONDICIONAMENTO NUTRACÊUTICO COM MISTURAS DE ÓLEOS ÔMEGA

3, 6 E 9 PARA ATENUAR AS CARACTERÍSTICAS NEUROINFLAMATÓRIAS DO

TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA INDUZIDAS PELO ÁCIDO VALPRÓICO EM

UM MODELO ANIMAL

Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação Stricto Sensu em cirurgia do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Médico-Cirúrgicas.

Aprovada em: ___/___/_____

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos

Universidade Federal do Ceará- UFC

_____________________________________________

Profa. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar

Universidade Federal do Ceará - UFC

_____________________________________________

Profa. Dra. Cristiana Libardi Miranda Furtado

Universidade Federal do Ceará - UFC

_____________________________________________

Prof. Dr. Gislei Frota Aragão

Universidade Estadual do Ceará - UECE

_____________________________________________

Prof. Dr. Fábio Miyajima

Fundação FIOCRUZ- CEARÁ

À Deus, por sempre me ajudar acreditar que

podemos ter um mundo melhor onde as pessoas

possam se respeitar e amar mutuamente e que a

fé na busca de uma viória torna o impossível

acontecer.

Aos meus pais ERNANI INÁCIO DE

AGUIAR (In memoriam) e HELENA

FUJIWARA AGUIAR pelos ensinamentos e

credibilidade a mim concebidos. O que sou

devo a vocês.

Ao meu marido e companheiro FABIANO

CARNEIRO RIBEIRO, pelo apoio, dedicação,

compreensão e amor por todos os momentos

quando precisei estar ausente você se fez

presente com nossos filhos.

A minha filha e amiga ÁGATHA FUJIWARA

AGUIAR RIBEIRO pelo amor, carinho e

compreensão, um dia quero ser igual a você.

E a você que foi o grande responsável na

idealização deste estudo – BERNARDO

FUJIWARA AGUIAR RIBEIRO, meu filho,

meu anjo, minha inspiração.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr PAULO ROBERTO LEITÃO DE VASCONCELOS, Coordenador do

Programa de Pós-Graduação Strictu Sensu do Departamento de Cirurgia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará, meu orientador, pela paciência, compreensão e

oportunidade de realizar este trabalho que abrilhantou meus olhos e minha vida acadêmica.

À Drª LISSIANA MAGNA VASCONCELOS AGUIAR, Professora e Vice-

coordenadora do Curso de Medicina da Universidade Federal do Ceará Campus Sobral, minha

co-orientadora, agradeço pelo carinho e oportunidade de abrir as portas do Laboratório de

Fisiologia e Neurociência mostrando o caminho para finalizar minha pesquisa.

À Drª CRISTINA LIBARDI MIRANDA FURTADO, Programa de Pós-Graduação

Strictu Sensu do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal

do Ceará, pela oportunidade de ter realizado parte das análises no Laboratório de Oncologia

Experimental (LOE) do NPDM, por toda atenção, carinho e dedicação à minha pesquisa.

À Drª MIRNA MARQUES BEZERRA BRAYNER, professora do Curso de

Medicina Campus Sobral, por todo apoio, incentivo, carinho, amizade e colaboração na

correção da minha tese.

Ao Dr GISLEI FROTA ARAGÃO, professor Adjunto do Curso de Medicina da

Universidade Estadual do Ceará, pelos esclarecimentos e ajuda no manejo das análises

comportamentais, pela compreensão estatística dos dados e todo apoio durante à pesquisa.

Ao aluno e amigo MATEUS ARAGÃO ESMERALDO do Curso de Medicina

Campus Sobral, pela árdua dedicação à esta pesquisa, pela disponibilidade diária de domingo a

domingo sem medir esforços do início ao fim, pela participação e coerência nas fases mais

turbulentas onde se tornava possível a realização das etapas, sem sua ajuda acho que não teria

conseguido chegar ao fim.

Aos meus irmãos Ernani Inácio de Aguiar Junior, Thiago Rodrigo de Aguiar e

Jefferson Felipe de Aguiar pelo apoio, incentivo, que desde à infância acreditavam e me faziam

ser uma pessoa melhor.

Às secretárias do programa de Pós-Graduação em Cirurgia, MARIA LUCIENE

VIEIRA DE OLIVEIRA e MAGDA GOMES FONTENELE, secretárias do Programa de Pós-

Graduação Strictu Sensu do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, por todo o apoio, atenção, estímulo que me foi concebido

durante todo este percurso.

Ao técnico do laboratório de Fisiologia e Neurociências FRANCISCO JOSÉ

GOMES, pela disponibilidade em ajudar em todas fases desta pesquisa, pelo apoio emocional

onde seu “vai dar certo” foi fundamental. Muito obrigada.

Aos alunos da Iniciação Científica, em especial a aluna SILVIA FLÁVIA ALVES

DE FREITAS e NICKOLAS SOUSA SILVA, pela dedicação, participação e amizade que

criamos durante toda a fase experimental e aos alunos que tiveram uma participação essencial:

Daniel Salmito Chaves, Kaio Júlio César de Sousa Nogueira, Mateus, Bárbara Barboza de

Alencar, Marília Rocha Silva,

A médica veterinária do Biotério da UFC/Sobral, ALANA GODINHO, por toda a

assistência prestada principalmente nos momentos de desespero, pelo carinho e incentivo que

tudo iria dar certo.

Ao técnico do Núcleo de Bioprospecção e Experimentação Molecular Aplicada

(UNINTA), ANTÔNIO MATEUS GOMES PEREIRA, pelo auxílio e paciência nas leituras

das análises neuroquímicas.

A pós-doutoranda CLEANE GOMES MOREIRA e doutoranda FRANCISCA

VALÉRIA BEZERRA SAMPAIO MARQUES que contribuíram nas atividades mais árduas

da pesquisa e através de suas lindas palavras acalentavam minhas aflições e horas de desespero.

A Universidade Federal do Ceará (UFC) pela oportunidade de estar afastada por 1

ano das atividades acadêmicas e tornar possível a realização de toda pesquisa em um curto

período de tempo.

Enfim, a todos que de alguma maneira estiveram presentes apoiando através de

ações, palavras ou atitudes.

“Do lado de fora, olhando para dentro, você

nunca poderá entendê-lo. Do lado de dentro,

olhando para fora, você jamais conseguirá

explicá-lo. Isso é autismo.” (Autism Topics)

RESUMO

Universidade Federal do Ceará. Pós-Graduação Stricto-Sensu do Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina, (Grau de Doutor em Ciências Médico-Cirúrgicas). Nutracêutico com misturas de óleos ômega 3, 6 e 9 atenua as características neuroinflamatórias e anti-oxidantes do transtorno do espectro autista induzidas pelo ácido valpróico em modelo experimental. Luciana Fujiwara Aguiar Ribeiro. Março 2020.

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é uma desordem do desenvolvimento neurológico, com

anormalidades no sistema imunológico, nas funções metabólicas e comportamentais. Nos últimos 15

anos, um grande interesse tem sido dado ao potencial papel dos ácidos graxos poliinsaturados ômega-3

na compreensão da patogênese e tratamento de distúrbios do neurodesenvolvimento e psiquiátricos. No

presente estudo misturas de óleos ômega 3, 6 e 9, com diferentes fontes de ômega-3 foram usadas

conforme suas características estruturais: Mix-1 (ácido graxo linolênico–ALA), Mix-2 (ALA (35%) +

ácido graxo eicosapentaenoico (EPA–39%) + ácido graxo docosahexaenóico (DHA–26%) e Mix-3

(ALA-84% + DHA-16%) com objetivo de avaliar seus efeitos neuroinflamatórios, anti-oxidantes e

comportamentais, bem como a expressão gênica em ratos wistar macho e fêmea submetidos a indução

de autismo com uma única dose de ácido valpróico (AVP), 400mg/kg, via sub cutânea, no 14ª dia após

nascimento. Os mixs de óleos foram administrados por gavagem durante 25 dias contínuo a partir do

15ª dia de nascidos. Durante este período foram realizados os testes comportamentais – campo aberto;

imersão em cauda; performance da natação e por último o teste do rota rod. No 55ª dia pós-nascimento

foram dissecadas quatro áreas cerebrais (hipocampo, córtex pré-frontal, amígdalas e cerebelo) para

determinar o grau de peroxidação lipídica, concentração de nitrito e glutationa redutase.

Adicionalmente, foi avaliada a expressão gênica do hipocampo no grupo tratado que apresentou

melhores resultados (Mix-3) utilizando os genes Dnmt3a e Achd2. Os resultados mostraram que tanto

em animais machos como fêmeas, o grupo AVP demonstrou um aumento significante no tempo de

latência a sensibilidade nociceptiva comparado com o salina. Os grupos Mix-1, Mix-2 e Mix-3 com

indução de TEA por AVP diminuiram esta resposta nociceptiva. Regressão nas habilidades motoras

foram avaliadas na performance da natação nos grupos AVP de ambos os sexos, mas não foi revertido

por nenhum tratamento administrado. Na atividade locomotora, apenas as fêmeas do grupo AVP

sofreram uma redução significante, onde mais uma vez os mix ricos em ômega-3 (Mix-1 e Mix-2)

melhoraram sua coordenação motora. Aumento expressivo do estresse oxidativo se deu nas áreas

hipocampo e córtex pré-frontal nos machos, sendo reduzido com ação dos Mix-2 e Mix-3 dos grupos

AVP. A alta produção de óxido nítrico (NO) foi presenciada na área cerebelar do grupo AVP dos animais

machos, podendo representar um tipo de processo inflamatório. O tratamento com AVP nos machos não

representou aumento significante da expressão gênica para área hipocampo dos genes Dnmt3a e Achd2.

Os achados deste estudo sugerem que a mistura dos óleos ricos em ômega-3 foi favorável à redução do

estresse oxidativo (Mix-2 e Mix-3) e efeitos na redução de sintomas do TEA.

Palavras-chave: Autismo. Ácidos graxos. Ômega-3. Expressão gênica.

ABSTRACT

Nutraceutical with mixtures of omega 3, 6 and 9 oils attenuate neuroinflammatory and anti-oxidant characteristics of autism spectrum disorder induced by valproic acid in an experimental model. Federal University of Ceará Stricto Sensu post-graduation. Department of Surgery, Medical School, (Degree of Doctor of in Medical-surgery Sciences). Luciana Fujiwara Aguiar Ribeiro. March 2020.

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder with abnormalities in the immune

system, metabolism and behavioral functions. Over the past 15 years, great interest has been given to

the potential role of Omega-3 polyunsaturated fatty acids to understand the pathogenesis of some

diseases and to treat neurodevelopmental and psychiatric disorders. In the present study, mixtures of

omega 3, 6, and 9 oils with different types of Omega-3 were used according to their structural

characteristics: Mix-1 (linolenic fatty acid – ALA), Mix-2 (ALA – 35%) + eicosapentaenoic fatty acid

(EPA – 39%) + fatty acid docosahexaenoic acid (DHA – 26%) and Mix-3 (ALA – 84%; DHA – 16%)

to evaluate their neuroinflammatory and antioxidant effects in the animals’ behavior, as well as the gene

expression in male and female Wistar rats submitted to ASD induction with a single dose of valproic

acid (VPA) sc 400mg/kg on the 14th day after birth. The oil mixes were administered by gavage for 25

days continuously starting on the 15th day of birth; water and ration were made available

ad libitum. Then, behavioral tests were performed - open field; tail immersion; swimming performance

and rotarod. On the 55th day after birth, four brain areas (hippocampus, prefrontal cortex, amygdalae

and cerebellum) were dissected to determine the degree of lipid peroxidation, nitrite concentration and

glutathione reductase levels. Additionally, the hippocampus gene expression of the control 0.9% saline,

VPA, Mix-3 and Mix-3 + VPA groups was evaluated using the Dnmt3a and Achd2 genes. Both in male

and female groups VPA showed a significant increase in latency compared to saline, improving their

pain response after treatment with Mix-1, Mix 2 and Mix-3 in the VPA groups. Deficit in motor skills

integration was noted in swimming performance in VPA groups of both sexes. In locomotor activity,

only the females of the VPA group suffered a significant reduction, where once again the mixes rich

in Omega-3 (Mix-1 and Mix-2) were able to restore their locomotor activity. A significant increase in

oxidative stress occurred in the hippocampus and prefrontal cortex in males, being reduced with the

action of Mix-2 and Mix -3 in the VPA groups. No antioxidant response from glutathione reductase was

observed in this study. A high production of NO nitric oxide was noted in the cerebellum of the VPA

group of male animals, which may represent a consequence of inflammatory process. Treatment with

VPA in males did not represent a significant increase in gene expression for the hippocampal area of

the Dnmt3a and Achd2 genes. Our findings suggest that the mixture of oils rich in omega-

3 was favorable to the reduction of oxidative stress (Mix-2 and Mix-3) and effects in reducing

behavioral alterations of ASD in rats.

Keywords: Autism. Fatty acids. Omega 3. Gene expression.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Manifestações comportamentais do TEA concomitantes ao neurodesenvolvimento ................................................................................................................................ 23

Figura 2 – Representação esquemática de como a estimulação de mastócitos e micróglia pode levar a vários efeitos que contribuem para a inflamação cerebral, a patogênese e os sintomas do autismo. .............................................................................................. 39

Figura 3 – A história da genética do TEA de 1975 a 2015. ..................................................... 44 Figura 4 – Estrutura dos ácidos graxos insaturados. ................................................................ 54 Figura 5 – Processos de dessaturação e elongação do ômega-3 e ômega-6 e consequente

geração de compostos bioativos. ............................................................................ 55 Figura 6 – Animal com filhotes no biotério. ............................................................................ 62 Figura 7 – Produção dos Mix-1, Mix-2 e Mix-3. ..................................................................... 63 Figura 8 – Esquema do delineamento experimental ................................................................ 64 Figura 9 – Soluções e composição com as respectivas fontes de w3 (MIX 1) ........................ 65 Figura 10 – Soluções e composição com as respectivas fontes de w3 (MIX 2) ...................... 65 Figura 11 – Soluções e composição com as respectivas fontes de w3 (MIX 3) ...................... 66 Figura 12 – Quantidade de solução lipídica infundida diariamente ......................................... 68 Figura 13 – Análise comportamental dos animais pelo Teste Campo Aberto. ........................ 70 Figura 14 – Análise comportamental dos animais pelo método Imersão em Cauda. .............. 71 Figura 15 – Análise comportamental dos animais pelo método performance da natação. ...... 72 Figura 16 – Representação esquemática do teste comportamental Rotarod. Dois dias antes do

teste, os animais foram adaptados ao aparato por meio da permanência neste por 300 segundos com baixa velocidade inicial, gradualmente crescente (4 a 15 RPM). No dia do teste, foi utilizada a velocidade crescente de 4 a 40 RPM com duração máxima de 300 segundos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: Tempo de Latência (tempo até a primeira queda) e Tempo ................................. 73

Figura 17 – Representação esquemática da determinação do estresse oxidativo por meio da obtenção de TBARS. ............................................................................................ 75

Figura 18 – Representação esquemática da determinação do estresse oxidativo por meio da obtenção de Nitrito. .............................................................................................. 76

Figura 19 – Representação esquemática da determinação do estresse oxidativo por meio da Concentração de Glutationa Reduzida ................................................................. 77

Figura 20 – Análise da atividade motora no Teste do Campo Aberto em ratos (machos) realizado no 24ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única dose de ácido valproico. .................................................... 82

Figura 21– Análise da atividade motora no Teste do Campo Aberto em ratos (fêmeas) realizado no 24ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única dose de Ácido Valproico. .................................................. 83

Figura 22 – Análise da imersão de cauda em ratos machos realizado no 30ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose ácido valproico. .................................................................................................... 84

Figura 23 – Análise da atividade motora no Teste de Imersão em Cauda em ratos fêmeas realizado no 30ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única dose de Ácido valproico. ................................................... 85

Figura 24 – Análise da imersão de cauda em ratos machos realizado no 32ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose ácido valproico ..................................................................................................... 86

Figura 25 – Análise da atividade motora no Teste de Imersão em Cauda em ratos fêmeas realizado no 32ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única dose de ácido valproico. .................................................... 87

Figura 26 – Análise da locomoção através do teste de RotaRod em ratos machos realizado no 50ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com Mix de óleos e única dose de ácido valproico. ............................................................................. 88

Figura 27 – Análise da atividade motora no Teste Rota Road em ratos fêmeas realizdo no 50ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única dose de ácido valpróico. ............................................................................. 89

Figura 28 – Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais de ratos machos realizados no 55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido Valproico. ........................................................................... 90

Figura 29 – Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais de ratos fêmeas realizados no 55ª dia post-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido valpróico. ............................................................................ 91

Figura 30 – Concentrações de Nitrito/Nitrato nas áreas cerebrais de ratos machos realizados no 55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido Valproico. ............................................................................................. 92

Figura 31 – Concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3) nas áreas cerebrais de ratos machos realizados no 55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido Valpróico. ................................................................. 93

Figura 32 – Concentrações de GSH (µ/g de tecido) nas áreas cerebrais de ratos machos realizados no 55ª pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido Valpróico. ..................................................................................... 94

Figura 33 – Níveis de GSH (µ/g de tecido) nas áreas cerebrais de ratos fêmeas realizados no 55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido Valpróico. .................................................................................................. 95

Figura 34 – Padronização dos genes alvo e referência. A - eficiência dos primers, B - curva de melting. ................................................................................................................. 96

Figura 35 – Avaliação da expressão relativa diferencial dos genes Dnmt3a e Chd2. .............. 96

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Classificação dos óleos ômega. ............................................................................. 54 Quadro 2 – Protocolo de Tratamento Experimental (FÊMAS - 96 animais) e MACHOS (121

animais), tipo de dosagens analisada. ................................................................... 67 Quadro 3 – Protocolo de Tratamento Experimental (Droga + Dieta) ...................................... 68

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Predição da expressão gênica por tecido, sequência de primers utilizados, alvos e tamanhos dos produtos amplificados esperados. ..................................................... 79

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-LOX 5-lipoxigenase

AA Ácido Graxo Araquidônico

ADDM Monitoramento de Autismo e Deficiências do Desenvolvimento

AG Ácidos graxos

AGE Ácidos Graxos Essenciais

AGPI Ácidos Graxos Poliinsaturados

AL Ácido Graxo Linoléico

ALA Ácido Graxo Linolênico

APA Associação Americana de Pediatria

AVA Ácido Valpróico Anticonvulsivante

AVP Ácido Valpróico

CDC Centro para Controle de Doenças

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

CID Classificação Internacional das Doenças

CNV Variação do Número de Cópias

COX Ciclo-oxigenase

CPF Cortex Pré-Frontal

DD Atraso no Desenvolvimento

DG Dia Gestacional

DHA Ácido Docosahexaenóico

DPN Dia Pós-Natal

DSM Manual do Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais

DZ Dizigóticos

EPA Ácido Eicosapentaenóico

GSH Glutationa

GWA Associação Genômica Ampla

HAC Acetilase de Histonas

HC Hipocampo

HDAC Desatilase de Histonas

ID Deficiência Intelectual

LC-PUFA Ácido Graxo Poliinsaturado de Cadeia Longa

LD Dificuldade de Aprendizagem

LOX Lisil Oxidase

MIA Ativação Imune Maternal

MZ Monozigóticos

NO Óxido Nítrico

OMS Organização Mundial da Saúde

PUFA Ácido Graxo Polinsaturado

ROS Espécie Reativa de Oxigênio

RPM Rotações Por Minuto

RT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa

SBCAL Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Short Tandem Repeats

TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

TDHA Transtorno do Déficit de Atenção com Hiperatividade

TEA Transtorno do Espectro Autista

TID Transtorno Invasivo do Desenvolvimento

VPA Ácido Valpróico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 19

1.1 Transtorno do Espectro Autista ................................................................................. 19

1.1.1 Conceito de TEA ................................................................................................ 21

1.1.2 Epidemiologia do TEA ...................................................................................... 24

1.1.3 Hipóteses Etiológicas ......................................................................................... 27

1.1.3.1 Teorias Psicogenéticas ................................................................................ 29

1.1.3.2 Mecanismos Epigenéticos ........................................................................... 31

1.1.4 Características/ Manifestações Clínicas ............................................................. 33

1.1.4.1 Déficit de Socialização ............................................................................... 33

1.1.4.2 Déficit de Comunicação/Linguagem .......................................................... 35

1.1.4.3 Padrões de Comportamentos ...................................................................... 36

1.1.4.3.1 Interesses Restritos e Estereotipados ....................................................... 36

1.1.5 Características Neuroquímicas ........................................................................... 37

1.1.5.1 Neuroinflamação ......................................................................................... 37

1.1.5.2 Mecanismos Moleculares e Genéticos ........................................................ 41

1.2 Ácido Valpróico ........................................................................................................ 46

1.2.1 Efeitos Teratogênicos ......................................................................................... 47

1.2.2 Mecanismo de Ação ........................................................................................... 48

1.2.3 Uso em Modelos Animais .................................................................................. 49

1.2.4 Áreas cerebrais estudadas ................................................................................... 52

1.3 Ácidos Graxos Poliinstaurados .................................................................................. 53

1.4 Testes Comportamentais em Modelo Animal versus Sinais do TEA ....................... 58

2 OBJETIVO ....................................................................................................................... 61

2.1 Objetivo Geral ........................................................................................................... 61

2.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 61

3 MÉTODO ......................................................................................................................... 62

3.1 Aspectos éticos e Animais ......................................................................................... 62

3.2 Drogas e soluções ...................................................................................................... 63

3.3 Delineamento Experimental ...................................................................................... 64

3.3.1 Distribuição dos Grupos de Estudo .................................................................... 64

3.3.2 Tratamentos dos grupos experimentais .............................................................. 65

3.3.3 Divisão dos Grupos de Estudo e Análises Experimentais .................................. 66

3.4 Testes Comportamentais ........................................................................................... 68

3.4.1 Atividade Locomotora (Campo Aberto) ............................................................ 69

3.4.2 Teste de imersão na cauda .................................................................................. 70

3.4.3 Teste de Performance de Natação ...................................................................... 71

3.4.4 Teste do rotarod .................................................................................................. 72

3.4.5 Dissecação das áreas cerebrais e descarte dos animais ...................................... 73

3.5 Avaliação Neuroquímica ........................................................................................... 74

3.5.1 Determinação da peroxidação lipídica por medição do conteúdo de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) ........................................................................ 74

3.5.2 Determinação da Concentração de Nitrito nas Áreas Cerebrais e no Sangue .... 75

3.5.3 Determinação da Concentração de Glutationa Reduzida GSH) ......................... 76

3.6 Análise de Expressão Gênica .................................................................................... 77

3.6.1 Desenho e análise dos primers ........................................................................... 77

3.6.2 Expressão Gênica do Hipocampo ...................................................................... 78

3.6.3 Extração de RNA total de hipocampo ................................................................ 78

3.6.4 Transcrição reversa obtenção de cDNA PCR quantitativo em Tempo Real (RT-qPCR) 79

3.7 Análises estatísticas (comportamentos, estresse oxidativo, GSH e Nitrito) .............. 80

3.7.1 Análise estatística (Expressão Gênica) .............................................................. 80

4 RESULTADOS ................................................................................................................. 81

4.1 Análises Comportamentais em MACHOS e FÊMEAS ............................................ 81

4.1.1 Avaliação da Atividade Locomotora - Teste do Campo Aberto ........................ 81

4.1.2 Avaliação da Atividade Locomotora - Teste de Imersão em Cauda .................. 83

4.1.3 Teste de Performance da Natação ...................................................................... 85

4.1.4 Avaliação da Atividade Locomotora -Teste de Rota-rod ................................... 87

4.2 Análises Neuroquímicas em MACHOS e FÊMEAS ................................................ 89

4.2.1 Determinação dos Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) ........................... 89

4.2.2 Determinação da Concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3) ..................... 91

4.2.3 Determinação das Concentrações de Glutationa Reduzida (GSH) .................... 93

4.3 Expressão Gênica por RT-qPCR ............................................................................... 95

5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 97

6 CONCLUSÃO ................................................................................................................ 110

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 111

APÊNDICE A - VALORES BRUTOS REFERENTES AOS RESULTADOS DOS TESTES COMPORTAMENTAIS E TESTES NEUROQUÍMICOS .................................................... 141

APÊNDICE B - VALORES BRUTOS REFERENTES AOS RESULTADOS DA ANÁLISE PCR ........................................................................................................................................ 169

ANEXO A- PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA ................................ 171

19

1 INTRODUÇÃO

1.1 Transtorno do Espectro Autista

O transtorno do espectro do autismo (TEA) é um distúrbio generalizado prototípico

do desenvolvimento resultante do desenvolvimento cerebral anormal. O TEA constitui dois

sintomas comportamentais principais, incluindo prejuízo nas interações sociais e na

comunicação, e comportamentos repetitivos restritos, diagnosticados em idade precoce no

desenvolvimento (American Psychiatric Association, 2013). O distúrbio é frequentemente

acompanhado por anormalidades no processamento sensorial (Rogers et al., 2003), problemas

de sono (SCHRECK et al., 2004), ansiedade e depressão (STRANG et al., 2012), hiperatividade

(AMAN e LANGWORTHY, 2000), agressões ou comportamentos autolesivos (SINGH et al.,

2006), convulsões (VOLKMAR e NELSON, 1990) e problemas alimentares ou digestivos

(Martins et al., 2008), deficiência intelectual (DI), epilepsia, dificuldade de controle motor,

transtorno de deficit de atenção e hiperatividade (TDHA), tiques (GILLBERG 2010;

MORENO-DE-LUCA et al., 2013).

O TEA é heterogêneo e é comumente comórbido com outros distúrbios e do

desenvolvimento neurológico (LEYFER et al., 2006). Como se pode esperar, essa condição

causa grandes dificuldades às famílias acometidas, pois pode levar a aflições sociais,

ocupacionais e outras funcionais (American Psychiatric Association, 2013).

Nas últimas décadas pesquisas identificaram vários fatores de risco que levam ao

TEA, que podem ser classificados em anormalidades genéticas, alterações epigenéticas e

agressões ambientais (GEPNER; FERON, 2009). Os fatores de risco genéticos assumem a

forma de mutações monogênicas, polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) e variantes de

número de cópias (CNVs). Não é de surpreender que muitos dos genes implicados tenham sido

associados à modulação do desenvolvimento cerebral e organização cortical, formação e função

de sinapses e neurotransmissão. Por outro lado, os insultos ambientais implicados no TEA

compreendem a exposição pré-natal a infecções ou produtos químicos virais, incluindo rubéola

(CHESS et al., 1978), citomegalovírus (YAMASHITA et al., 2003), timerosal (BERNARD et

al., 2002), talidomida (STROMLAND et al., 2002).

Com base nos fatores de risco identificados e na possível etiologia do TEA, foram

criados modelos animais para imitar e entender os mecanismos patológicos subjacentes às

anormalidades comportamentais desse distúrbio. Dois tipos principais de modelos animais, a

lesão e os modelos genéticos, tornaram-se muito usados. Os modelos de lesão incluem infecção

20

pré-natal (vírus da doença de Borna neonatal), lesão de amígdala neonatal e exposição pré-natal

ao ácido valpróico (AVP).

Uma alternativa para o tratamento adjuvante na tentativa de amenizar e/ou diminuir

os possíveis sintomas do TEA pode vir a ser a inclusão de alguns nutrientes isolados, ou

combinados, administrados em doses farmacológicas, classificados como nutracêuticos ou

fármaconutrientes. Estes nutrientes têm sido utilizados como modificadores da resposta

biológica exercendo ações antioxidantes (ácidos graxos monoinsaturados ω-9), ações anti-

inflamatórias (ácidos graxos poliinsaturados ω-3) e ações pró-inflamatórias (ácidos graxos

poliinsaturados ω-6). Quando a relação entre ω-9 e ω-6 é maior que 1 (ω-9/ω-6 > 1), ocorre

função anti-oxidante. Quando a relação entre ω-6 e ω-3 é menor que 4 (ω-6 /ω-3<4), uma função

anti-inflamatória é desencadeada (VASCONCELOS, 2013).

O termo nutracêutico, ou fármaconutriente, faz referência a um alimento, ou parte

de um alimento, capaz de proporcinar benefícios à saúde, incluindo prevenção e/ou tratamento

de doenças (ANDLAUER; FÜRST, 2002). Esses produtos podem incluir desde nutrientes

isolados, suplementos dietéticos na forma de suplementos orais e cápsulas, até produtos

beneficamente projetados, e alimentos processados tais como cereais, sopas e bebidas. Podem

ser classificados como nutracêuticos as fibras dietéticas, ácidos graxos poliinsaturados,

proteínas, peptídios, aminoácidos ou cetoácidos, minerais, vitaminas antioxidantes e outros

antioxidantes. Em suma, é uma substância de ocorrência natural, com evidente efeito benéfico

à saúde, que faz parte como ingrediente de alimentos específicos, alimentos funcionais ou

suplementos alimentares (MORAES; COLLA, 2006).

A busca de alternativas para o tratamento dos TEAs levantou a hipótese de que

anormalidades do metabolismo de ácidos graxos possam estar relacionadas a transtornos

mentais. Os ácidos graxos mais investigados são os w-3 por serem considerados componentes

essenciais das membranas das células nervosas e fundamentais para o desenvolvimento

neurológico (LEVANT et al., 2006).

Os ácidos graxos essenciais são ácidos graxos poliinsaturados que o ser humano

corpo não produz e é necessário para o desenvolvimento normal e funcionamento do cérebro e

do sistema imunológico (YEHUDA, 2005). Existem vários tipos principais de ácidos graxos

essenciais. Peixe e os frutos do mar são as principais fontes de ácido eicosapentaenóico (EPA)

e ácido docosahexaenóico (DHA), que são tipos de ácidos graxos ômega-3 de cadeia longa.

Linhaça, grãos e soja são fontes de ácidos alfa-linolênico (ALA), que são ácidos graxos ômega-

3 de cadeia curta. O ALA pode ser convertido no corpo em EPA e DHA, mas este é um processo

ineficiente; estima-se que menos de 5% do ALA em humanos seja convertido em EPA ou DHA

21

(BRENNA, 2002). Óleos vegetais são uma fonte de ácido linolênico (LA), que é um tipo de

ácido graxo ômega-6; gorduras animais também são uma fonte de ômega-6. O consumo ideal

de ômega-6 para ômega-3 deve ser de 1: 1 a 4: 1 (SIMOPOULOS, 2002). A maioria das dietas

modernas excede em muita essa proporção, que tem sido associado à vulnerabilidade a

deficiências e distúrbios de saúde mental (SIMOPOULOS, 2003).

A base de evidências da dose e tipo ideais de suplementação de ácidos graxos

ômega-3 para tratar TEA está atualmente ausente. Embora geralmente se acredite que a ingestão

diária de ômega-3 não deve exceder três gramas, são necessários estudos de dose (ranging) para

avaliar a ingestão ideal, o que pode diferir com base em características como peso, idade e

gravidade do distúrbio (RICHARDSON, 2006).

1.1.1 Conceito de TEA

A expressão “autismo” foi utilizada pela primeira vez por Eugene Bleuler em 1911,

para designar a perda de contato com a realidade com dificuldade ou impossibilidade de

comunicação, comportamento esse que foi, por ele, observado em pacientes diagnosticados

com quadro de esquizofrenia (AJURIAGUERRA et al., 1977). Durante as primeiras décadas

do século passado, autismo referia-se à tendência do esquizofrênico de se isolar do mundo

social e colocar-se em um mundo à parte (ABRAMOVITCH et al., 2001). Bleuler incluiu o

autismo dentro dos quatro critérios principais para a identificação desta afecção mental, que

ficaram conhecidos como os quatro ‘A(s)’ de Bleuler: alucinações, afeto incongruente,

ambivalência, autismo (BLEULER, 1991).

Somente entre os anos de 1950 e 1960 a causa biológica do autismo começou a ser

discutida. Até então, acreditava-se que a afecção era resultado da falta de proximidade dos pais

com seus filhos. Essa compreensão contribuiu para o surgimento do termo “mães-geladeira”,

que expressava a falta de afeto e a frieza dos pais (VERHOEFF et al., 2013).

O autismo começou a ser tratado de forma oficial em 1952, após a publicação da

primeira edição do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM- I)

(American Psychiatric Association, 1952), que reuniu a nomenclatura padrão e critérios para o

diagnóstico de transtornos mentais. Nas primeiras edições desse manual os sintomas

característicos do autismo foram classificados dentro da esquizofrenia infantil, sem o

diagnóstico diferenciado (American Psychiatric Association, 1952).

O autismo apareceu pela primeira vez somente na terceira edição do Manual

Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-III-R), revisado em 1989 (NADON et

22

al., 2011). No ano de 1994, com a atualização do DSM, em sua quarta edição (DSM-IV, 1994)

e com a Classificação Estatística de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde - 10a Revisão

(OMS, 1993) o autismo foi classificado como um Transtorno Invasivo do Desenvolvimento

(TID) cujo portador poderia atingir níveis mais graves no desempenho de atividades como:

redução do contato visual, restrição em mostrar, pegar ou utilizar objetos, atividades repetitivas

e comportamentos estereotipados, movimentação ou torção de mãos e dedos, agitação corporal

ou dificuldade/ausência de fala (DSM, 2000; NEMEROFF et al, 2013).

Na quinta edição do DSM, lançado em 2013, o autismo passou a ser definido como

um distúrbio neurocomportamental complexo, caracterizado por vários graus de deficiência

incluindo interação social, agilidade de pensamento, mudanças peculiares de linguagem e/ou

percepção atrasada, prejuízo na comunicação verbal e não verbal e inabilidade em responder a

certos estímulos apresentando um comportamento restrito e repetitivo (MCPARTLAND et al.,

2012). A partir desta atualização, o DSM-V substituiu o sistema multicategórico usado

anteriormente por uma única dimensão do diagnóstico – Transtorno do Espectro Autista (DSM,

2013; MCPARTLAND et al., 2012).

O diagnóstico no TEA ainda se concentra basicamente nas avaliações

comportamentais devido à ausência de marcadores biológicos para identificá-lo (ECKER;

ROCHA, 2010; WOLFERS, 2015; BUITELAAR, 2015). Mesmo com os avanços recentes na

capacidade de diagnosticar o transtorno precocemente, na maioria dos casos esse diagnóstico

acontece depois dos três anos de idade (CDCP, 2013). A Associação Americana de Pediatria

(APA) sugere realizar o acompanhamento do desenvolvimento de todas as crianças até 24

meses, pois é a partir do segundo ano de vida que os comportamentos característicos do TEA

surgem e esses são capazes de auxiliar no diagnóstico (SCHIEVE et al., 2012).

Estudos sobre a base neurológica do TEA antes dos três anos de idade é decisivo

para o tratamento, pois é nessa fase que ocorrem os cuidados primários da infância e é nesse

período que os resultados do tratamento podem ser melhores (SCHIEVE et al., 2012). As

manifestações comportamentais do autismo englobam uma ampla gama de alterações clínicas

e variabilidade na sintomatologia. A Figura 1 ilustra alguns dos sintomas que afetam indivíduos

com autismo. Com a falta de homogeneidade das manifestações comportamentais e a

consciência dos diferentes graus de acometimento e seguramente a interação entre múltiplos

fatores etiológicos, tornou-se justificável criar o termo “transtorno do espectro autista” (TEA)

(DSM-V, 2013).

É possível avaliar como critério de classificação o nível de gravidade e

comprometimento do TEA em diferentes estados (leve, moderado e grave) (LEE; THOMAS;

23

LEE, 2015). Para validar o diagnóstico, os indivíduos precisam apresentar no mínimo seis

características comportamentais (FRAZIER et al., 2012; TAHERI; PERRY, 2012), sendo pelo

menos dois sintomas na área de interação social, um na área de comunicação e um na área de

comportamentos estereotipados (SILVA; MULICK, 2009).

Figura 1 – Algumas das manifestações comportamentais do TEA concomitantes ao

neurodesenvolvimento

Fonte: https://autismo2.wordpress.com/caracteristicas-2/

Manifestações do TEA incluem prejuízos na comunicação e interação social,

anomalias sensoriais, comportamentos repetitivos e níveis variados de inteligência, invalidez

24

total. Juntamente com esses sintomas principais, distúrbios psiquiátricos ou neurológicos

concomitantes são comuns em pessoas com autismo, das quais hiperatividade distúrbios de

atenção (como déficit de atenção/ distúrbios de hiperatividade (TDHA), ansiedade, depressão

e epilepsia são bastantes prevalentes (LORD et al., 2020).

Várias formas de TEA foram descritas, como a síndrome de Asperger ou o autismo

do tipo Kanner (1949), revelando que o TEA é um distúrbio altamente heterogêneo,

provavelmente com várias causas subjacentes. Trabalho científico intenso foi realizado nos

últimos anos para entender a origem potencial do TEA, acreditando que esse distúrbio surge de

fatores genéticos e ambientais, especialmente aqueles que influenciam o desenvolvimento fetal

e o início da vida (LAI et al., 2013). Embora o TEA tenha se mostrado altamente herdável

(estimativas recentes de 38 a 54%), várias metanálises destacaram que existem causas pré-

natais não genéticas do TEA, abrindo a porta para novos estudos para investigar esses

mecanismos (HALLMAYER et al., 2011).

Aproximadamente 10% dos casos de TEA estão relacionados a distúrbios de

etiologia genética, como síndrome do X frágil, esclerose tuberosa e distúrbio de Rett. Apoiando

a idéia de heterogeneidade do TEA, as mutações genéticas únicas representam apenas 1-2%

dos casos de TEA (ABRAHAMS et al., 2008), com a maioria dos casos permanecendo

idiopáticos. Mutações identificadas por estudos genéticos revelaram que alguns genes afetados

estão envolvidos no desenvolvimento do cérebro desde o útero até a infância (WON et al.,

2013). Os genes envolvidos na formação de sinapses ou na conectividade cerebral (por

exemplo, fmr1, mecp2, shank3, tsc, neuroligin e cntnap2) têm sido repetidamente ligados ao

TEA (ODDI et al 2013; SHCHEGLOVITOV et al., 2013).

1.1.2 Epidemiologia do TEA

A prevalência de indivíduos com TEA sofreu um aumento substancial desde sua

descoberta. Por exemplo, nas décadas de 60 e 70 a frequência era de 4/10.000 indivíduos

diagnosticados com autismo em todo o mundo (FOMBONNE et al., 2005). Nas últimas duas

décadas está prevalência tem aumentado significativamente. Em 2000, a Rede de

Monitoramento de Autismo e Deficiências no Desenvolvimento (ADDM) do Centro de

Prevenção e Controle de Doenças (Center for Disease Control) estimou a incidência de TEA

em 1 em cada 150 crianças (SHARMA et al., 2018).

Em 2006, a incidência de TEA aumentou para 1 em 110 crianças e, em 2008,

aumentou novamente para 1 em 88 crianças. Em 2012, de acordo com o Centro de Prevenção

25

e Controle de Doenças, cerca de 1,5% (1/68 indivíduos) das crianças nos Estados Unidos

possuem diagnóstico de TEA (CHRISTENSEN et al., 2016), corroborando com Elsabbagh

(2012) onde cita a mesma incidência em uma proporção de 1:4 de homens e mulheres afetados.

Enquanto estudos realizados na Ásia e Europa identificaram uma prevalência populacional

média entre 1 e 2% de pessoas com o distúrbio (CHRISTENSEN et al., 2016).

O National Health Interview Survey (NHIS) nos EUA, divulgou sua mais recente

taxa de prevalência e relatou um novo recorde, citando que o TEA pode ser encontrado em até

1 em cada 36 crianças, em uma pesquisa que levantou dados de 2014 a 2016 (ZABLOTSKY;

BLACK; BLUMBERG, 2017). Pensa-se que esta proporção seja a mesma em todos os

contextos raciais, étnicos ou socioeconômicos, no entanto, existem variações de gênero.

Possivelmente o aumento no número de casos de autismo deva-se as melhores condições de

diagnóstico precoce, mudanças na prática de identificação da doença e incentivos financeiros

subsidiados pelo governo para realizar diagnósticos (BLUMBERG et al., 2013; LEE et al.,

2015).

Shriver (2005), relata que o autismo ocorre igualmente em diferentes grupos raciais,

étnicos e sociais, mas existem três grupos distintos que apresentam um risco mais elevado de

ocorrência de TEA: o sexo masculino, sendo cerca de quatro vezes mais afetado que o sexo

feminino, os irmãos de crianças com TEA, sendo que as famílias com uma criança autista

apresentam uma taxa recorrência 2 a 8%, e ainda as pessoas com outros distúrbios do

desenvolvimento como sejam o atraso mental, a Esclerose Tuberosa e o Síndrome do X Frágil.

Dados epidemiológicos e com base em estudos nas redes públicas, relatam que o

autismo é mais comum em homens do que nas mulheres, com taxas relatadas variando de 2:1 a

5:1, com uma estimativa de 4:1 no Global 2010 Estudo do ónus da doença (LOOMES et al.

2017; BRUGHA et al., 2016). Bedfor et al, (2016) também cita que o TEA é cerca de 4-5 vezes

mais comum em indivíduos do sexo masculino (1 em 42) do que no sexo feminino (1 em 89).

O gênero masculino indica um fator de risco poderoso e bem estabelecido para distúrbios do

espectro autista. Até o momento, definir a causa pela qual o autismo acomete mais indivíduos

do sexo masculino tem sido uma tarefa desafiadora (FRAZIER et al., 2014).

A Genética é um papel proeminente no desenvolvimento do TEA. Estudos que

avaliaram a prevalência de TEA descobriram que em gêmeos idênticos, se um gêmeo tiver

TEA, o outro terá 36% a 95% de chance de também ter TEA. Em gêmeos não idênticos, se uma

criança tem TEA, a chance de o outro gêmeo ter o mesmo distúrbio cai para 0 a 30%

(HALLMAYER et al., 2011; ROSENBERG et al., 2009). Os irmãos de crianças com TEA têm

um risco de 2 a 8% de desenvolver também o distúrbio, e isso aumenta para 12 a 20% se a

26

criança infligida apresentar déficits em um a dois dos três domínios prejudicados no autismo

(BOLTON et al., 1994).

TEA possui um grande componente herdável. Bebês nascidos de famílias com um

irmão mais velho afetado têm 20% de chance de desenvolver autismo (OZONOFF et al., 2011).

Concordância as taxas entre gêmeos monozigóticos, gêmeos dizigóticos e irmãos são de 30 a

99%, 0 a 65% e 3 a 30%, respectivamente, com uma herdabilidade global estimada de 0,7-0,8

(ROSENBERG et al., 2009; HALLMAYER et al., 2011; COLVERT et al., 2015). No entanto,

populações estudadas na Escandinávia mostraram uma herdabilidade estimada mais baixa de

0,5-0,6% (SANDIN et al., 2014).

Avaliando a literatura é possível observar que poucos estudos exploraram

alterações comportamentais nas fêmeas, em parte, por apresentarem sintomas e alterações

menos frequentes (comportamentais, neuroanatômicas e expressão molecular) evidentes do

autismo (KIRSTEN et al., 2012; LAI; LOMBARDO; BARON-COHEN et al., 2014;

SCHWARZ et al., 2011), ou ainda pelo fato de fêmeas possuírem manifestações clínicas e

comportamentais difícil de serem diagnosticados (MANDY; CHILVERS; COMORBIDITY,

2012). O comprometimento em pessoas do sexo feminino com autismo parece apresentar-se de

uma maneira muito menos grave do que o descrito no sexo masculino (MANDY; CHILVERS;

COMORBIDITY, 2012). Estudos têm mostrado que as fêmeas de várias espécies geralmente

apresentam aumento da resposta imune e da resistência à infecção em comparação aos machos

(SCHWARZ; BILBO, 2012). Estas diferenças têm sido atribuídas em grande parte, às ações

imunomoduladoras de hormônios esteróides sexuais.

Pesquisas que investigam a origem biológica da diferença entre os sexos no TEA

enfatizam os níveis circulantes de esteróides gonadais no útero (AUYEUNG et al., 2009,

BARON-COHEN et al., 2002) ou acúmulos de fatores de risco genéticos que tem valores

diferenciais em meninos versus meninas (JACQUEMONT et al., 2014; GOCKLEY et al.,

2015). A teoria do Cérebro Masculino Extremo postula que muitos traços autistas são a

masculinidade levada ao ponto de disfunção, ou seja, sistematização excessiva, baixa empatia,

falta de vínculo e falta de habilidades sociais (BARON-COHEN et al., 2002). Por outro lado,

vários estudos apoiam a afirmação de que as mulheres carregam uma carga maior de mutação

genética antes de sucumbir ao TEA, sugerindo que elas estão protegidas (JACQUEMONT et

al., 2014; ROBINSON et al., 2013; GOCKLEY et al., 2015; TURNER et al., 2015). Uma

terceira possibilidade atualmente não testada, é que as fêmeas são realmente mais sensíveis a

anomalias genéticas que afetam o desenvolvimento do cérebro e morrem desproporcionalmente

no útero (MARGARETH et al., 2016).

27

1.1.3 Hipóteses Etiológicas

A etiologia do TEA é bastante complexa e na maioria dos casos o processo

patológico é desconhecido. Estudos mostram que o TEA está diretamente ligado a fatores

genéticos, condições ambientais, neurobiológicas, neuroanatômicas, metabólicas e

imunológicas (SUPEKAR 2015; ONORE et al., 2014; KIM et al., 2015; KIRSTEN et al.,

2015).

O diagnóstico do TEA exige evidência de comunicação verbal e não verbal

prejudicada, compromete o interesse social, interação e comportamentos estreitos ou

repetitivos. Embora algumas citações possam definir as características desses distúrbios em

todo o espectro, existe muita diversidade entre os indivíduos diagnosticados. Essa variabilidade

é retratada na gravidade e variedade dos sintomas e na presença de outras características

adicionais, como comprometimento cognitivo, sintomas neuropsiquiátricos (emocionais e

comportamentais) e características físicas ou biomédicas (GABIS et al., 2014).

A taxa estimada da função cognitiva no TEA é de cerca de 50% subnormal. Ela é

medida como dois desvios padrão abaixo da média, que refletem uma pontuação <70 na maioria

das medidas de QI padronizadas (JOHNSON et al., 2007). Quanto às comorbidades comuns,

até 40% das crianças com autismo em contextos clínicos são diagnosticadas com epilepsia

(GAL et al., 2012), distúrbios neuropsiquiátricos como depressão, ansiedade, obsessões e

fobias (MATSON et al., 2007), transtorno de atenção / hiperatividade (GADOW, 2006) e

síndrome de Tourette (CANITANO et al., 2007). Além disso, características dismórficas estão

presentes em muitos indivíduos diagnosticados com TEA, algumas vezes indicando síndromes

genéticas conhecidas (KAPINOS-GORCZYCA; GORCZYCA; KAPINOS, et al., 2009;

MILES et al., 2000).

Segundo Gabi e colaboradores (2014) a apresentação clínica do TEA parece ter uma

heterogeneidade acentuada, o que sem dúvida obscureceu os esforços para identificar causas

simples ou específica dessa condição. Como resultado, a pesquisa etiológica atual está focada

em inúmeras e variadas vias patogenéticas que levam à manifestação do fenótipo TEA. Por

exemplo, características autísticas englobam uma série de característica fenotípica comum de

vários distúrbios do desenvolvimento neurológico determinados geneticamente, como

síndrome de Rett, síndrome do X frágil, síndrome de Angelman e esclerose tuberosa (MOSS et

al., 2009).

Observou-se que indivíduos diagnosticados com uma das síndromes acima

mencionadas, que também atendem aos critérios de diagnóstico para TEA, geralmente

28

apresentam habilidades cognitivas e adaptativas mais gravemente prejudicadas do que aqueles

que não apresentam TEA associado (CAPONE et al., 2005; JESTE et al., 2008; KAU et al.,

2004). Além disso, várias alterações fisiológicas tem sido associadas a uma incidência

significativamente maior de características autísticas incluindo baixo peso ao nascer

(INDREDAVIK et al., 2005), malformações congênitas (MAIMBURG et al., 2006),

sofrimento fetal (GLASSON et al., 2004), encefalopatia isquêmica hipóxica (BADAWI et al.,

2006), infecção por citomegalovírus congênito (YAMASHITA et al., 2003) fenilcetonúria

(BAIELI et al., 2003) e prematuridade (LIMPEROPOULOS et al., 2008). As evidências

sugerem que, às vezes, a sintomatologia autista pode resultar de insulto cerebral menos

específico, semelhante aos processos variados que causam comprometimento intelectual.

Assim, o perfil autístico pode se apresentar como uma característica primária com etiologia

desconhecida ou como secundária a uma síndrome específica ou distúrbio cerebral.

O TEA é amplamente considerado um distúrbio multifatorial resultante de fatores

de risco genéticos e não genéticos. Há evidências cumulativas para o envolvimento de fatores

genéticos na etiologia do TEA, uma vez que irmãos nascidos em famílias com TEA têm um

risco 35 a 40% maior de desenvolver TEA e com um aumento na taxa atual de

aproximadamente 1% a partir de uma taxa de 0,05% na década de 1970 (STUBBS et al., 2016).

Além disso, estudos genéticos revelaram que alterações nas vias de desenvolvimento de

estruturas neuronais e axonais fortemente envolvidas na sinaptogênese emergem de mutações

genéticas únicas (GESCHWIND et al., 2011; VOINEAGU et al., 2011; CHANG et al., 2015).

É provável que interações entre múltiplos genes e variabilidade na expressão de genes como

resultado de fatores epigenéticos e exposição a fatores ambientais sejam responsáveis por TEA

(MUHLE et al., 2004).

Em um estudo clínico envolvendo gêmeos, foi avaliado que o risco de desenvolver

TEA era de 35 a 40% devido à variabilidade genética, e os 60% restantes foram contribuídos

por fatores ambientais pré-natais, perinatais e pós-natais (HALLMAYER et al., 2011).

Consequentemente, fatores ambientais implicados no TEA incluem complicações pré-natais e

perinatais (GLASSON et al., 2004; MARAMARA et al., 2014), complicações de nascimento

e neonatais (GARDENER et al., 2011; GUINCHAT et al., 2012), infecção viral, doenças

autoimunes e exposição a teratógenos no pré-natal como o ácido valpróico (KERN; JONES,

2006; KOLEVZON et al., 2007). Portanto, uma maior compreensão da interface entre fatores

genéticos e ambientais na patogênese do TEA pode levar a uma estratégia terapêutica

otimizada.

29

A etiologia exata do TEA é desconhecida; é pensado em ter bases genéticas fortes

e complexas com modulação da expressão fenotípica por fatores ambientais (BAILEY et al.,

1996), as vacinas normais da infância foram falsamente implicado na causação do TEA, e uma

vasta pesquisa já comprova que não há nenhuma ligação entre a vacinação e TEA (SPENCER

et al., 2017).

1.1.3.1 Teorias Psicogenéticas

Kanner foi o primeiro a definir o termo Autismo e considerou-o uma perturbação

do desenvolvimento, surgindo a hipótese de uma componente genética. Defendia que, até ao

nascimento, as crianças apresentavam um desenvolvimento normal, mas que, devido aos fatores

familiares (frieza, pouca expressividade dos pais) era originado um déficit afetivo nas crianças,

surgindo desta forma o autismo. Nesta época, considerava-se o Autismo uma perturbação

emocional e não biológica. A criança autista apresentaria défices cognitivos e linguísticos

deficitários devido ao meio que a envolvia, o ambiente não carinhoso da mãe (KANNER et al.,

1943; ASSUMPÇÃO et al., 2007).

Teorias psicogenéticas no autismo fundamenta-se nas teorias psicanalíticas que

defendem que as crianças com autismo são normais no momento do nascimento, mas que,

devido a fatores familiares (pais frios e pouco expressivos), o desenvolvimento afetivo das

crianças fica afetado, provocando um quadro de autismo (BORGES et al., 2000; DUARTE et

al., 2001).

Surge assim, a teoria conhecida pelo termo “Mães Frigorifico” teoria desenvolvida

por Bettelheim em 1967, que assumiu grande importância na década de 70, dando origem a

novos estudos com crianças vítimas de maus-tratos, que desenvolviam autismo como uma

resposta negativa a um ambiente ameaçador e não carinhoso por parte da mãe (BORGES et al.,

2000). Esta teoria foi bastante criticada já que os investigadores se limitaram a observar as

relações da criança com os pais depois de a perturbação estar instalada, não apresentando

suporte empírico que tal justifique (MARQUES et al., 2000).

O estudo sobre o Autismo Infantil baseava-se sobretudo nas anomalias de interação

social, mas a partir da década de 60, a atenção recaiu nos défices cognitivos associados a esta

perturbação. Assim sendo, o déficit cognitivo começa a assumir um papel crucial na

determinação da gênese do autismo (ASSUMPÇÃO et al., 2007).

Alguns anos após a descrição do então denominado autismo, Kanner (1943) alega

ser esse quadro “[...] uma verdadeira psicose [...]”, quando relata que todos os exames clínicos

30

e laboratoriais (disponíveis à época) foram incapazes de fornecer dados consistentes no que se

refere à sua etiologia (EISENBERG; KANNER, 1956). Trinta anos após seu artigo inaugural,

o próprio Kanner questiona as discrepâncias na evolução das onze crianças por ele inicialmente

avaliadas e descritas, uma vez que algumas apresentaram franca deterioração, enquanto outras

evoluíram com discreto prejuízo no desempenho global, propondo que “[...] investigações

bioquímicas podem abrir novas perspectivas ao estudo do autismo infantil [...]” (KANNER et

al., 1971).

A partir dos primeiros relatos descartando a idéia de psicose e associando o autismo

à déficits cognitivos (RITVO et al., 1976), surge uma nova perspectiva para esse quadro,

considerando então um transtorno do desenvolvimento. Gillberg (1990) afirma ser “[...]

altamente improvável que existam casos de autismo não orgânico [...]” frisando que “[...] o

autismo é uma disfunção orgânica – e não um problema dos pais – isso não é matéria para

discussão. O novo modo de se ver o autismo é biológico [...]”

Difícil se torna sua diferenciação dos quadros de déficit cognitivo sobretudo em

função do comprometimento qualitativo no desenvolvimento das interações socias e nas

habilidades comunicacionais, o qual, ainda que passível de ser identificado, em geral não é

destaque no retardo mental (ASSUMPÇÃO et al., 2003).

Assim, passa-se a considerar o autismo uma síndrome comportamental com

etiologia ainda desconhecida, mas certamente orgânica (ASSUMPÇÃO et al., 2003). Pensando

desse modo, se nos dispomos a estudar esse campo extremamente complexo, temos que nos

lembrar dos muitos quadros de origem neurológica (e/ou genética) distintas, descritos em

associação ao autismo. Diante dessa perspectiva, as alterações cromossômicas são relatadas

com muita frequência, ainda que sejam de natureza inespecífica e variada (ASSUMPÇÃO et

al., 2007; KUCZYNSKI et al., 1996).

As manifestações do autismo incluem prejuízos na comunicação e interação sociais,

anomalias sensoriais, comportamentos repetitivos e níveis variáveis de incapacidade

intelectual. Juntamente com esses sintomas centrais, distúrbios psiquiátricos ou neurológicos

recorrentes são comuns em pessoas com autismo, dos quais distúrbios de hiperatividade e

atenção (como transtorno de déficit de atenção / hiperatividade (TDAH), ansiedade, depressão

e epilepsia são bastante prevalentes. Um diagnóstico de autismo é alcançado após a obtenção

de uma história detalhada do desenvolvimento, muitas vezes dos pais, e a observação do

indivíduo interagindo com os pais ou outros indivíduos (LORD et al., 2020).

31

1.1.3.2 Mecanismos Epigenéticos

Durante muito tempo, os cientistas tentaram descrever distúrbios associados às

doenças apenas por fatores genéticos ou ambientais. No entanto, o papel da epigenética nas

doenças humanas foi considerado desde meio século atrás. Na última década, esse assunto

atraiu muitos interesses, especialmente em distúrbios complicados, como plasticidade

comportamental, memória, câncer, doenças auto-imunes além de distúrbios neurodegenerativos

e psicológicos (MOOSAVI, 2016).

O termo epigenética significa “em adição à informação genética codificada no

DNA” (FEINBERG; TYCKO, 2004) e é genericamente utilizado para definir mudanças que

ocorrem na expressão gênica sem, no entanto, ocorrer nenhuma alteração na seqüência do

código genético (GIBBS, 2007; JIRTLE; SKINNER, 2007 WAGGONER, 2007). Assim, a

epigenética constitui uma camada “extra” de regulação da expressão gênica a nível

transcricional. Alguns mecanismos epigenéticos incluem a metilação do DNA, o imprinting,

mudanças na conformação da cromatina e o silenciamento mediado por RNA (MOSS;

WALLRATH, 2007; RODENHISER; MANN, 2006; SULEWSKA et al., 2007).

Nas últimas décadas, muitas investigações mostraram que os mecanismos

epigenéticos estão envolvidos na regulação de todo processo biológico no corpo, desde a

concepção até a morte. Esses mecanismos funcionais estão envolvidos na reorganização do

genoma, embriogênese e gametogênese precoces, bem como na diferenciação celular. A

interação entre a metilação do DNA e as alterações pós-traducionais das histonas, causadas por

proteínas reguladoras e RNAs não codificadores, são agentes epigenéticos essenciais para

reorganizar a cromatina em áreas como eucromatina, heterocromatina e compartimentação

nuclear. Os sinais epigenéticos podem ter impressões de longo prazo, por exemplo, na

aprendizagem e organização da memória ou predisposições para diferentes tipos de

câncer. Marcas epigenéticas incorretas podem resultar em defeitos congênitos, doenças da

infância, ou sintomas de doenças em outras áreas da vida. Por outro lado, algumas marcas

epigenéticas podem ser reversíveis, e esse fato incentivou muitos pesquisadores a se

concentrarem na terapia epigenética (BALI, 2011). Nos últimos anos, foi demonstrado que a

metilação do DNA, em alguns casos, pode ser irreversível (BALI, 2011; LU et al., 2006). Essa

característica pode ser útil em características complexas e doenças desafiadoras, como função

de memória, comportamentos e lesões psicológicas, dependência, câncer e outras doenças que

não poderiam ser explicadas apenas por fatores genéticos ou pelo ambiente.

32

O projeto do genoma humano (HGP) forneceu importantes informações sobre

estrutura, organização e previsão função de 2,85 bilhões de nucleotídeos na sequência de DNA,

que é a base da pesquisa biomédica, diagnóstico genético e genômica evolutiva (COLLINS,

2004). No entanto, a base genética de complexos distúrbios como diabetes, doenças

cardiovasculares, alzheimer, esquizofrenia, doenças auto-imunes e câncer, permanece incerto.

A natureza multifatorial dessas doenças envolve uma complexa rede de genes e influências

ambientais que reprogramam a genoma e dificulta o conhecimento dos mecanismos envolvidos

em sua fisiopatologia. O ambiente afeta a mecanismos epigenéticos que controlam a função do

gene, sem alterar a sequência do DNA, levando alteração da expressão gênica e à interrupção

de muitos processos biológicos. Ao contrário do genoma, o epigenoma pode ser reprogramado

e com grande plasticidade. Reprogramação epigenética é o principal evento durante a

diferenciação celular, conferindo diferenças funcionais e funcionais de um determinado tipo de

célula (fenótipo) herdável mitoticamente, garantindo uma expressão gênica específica de tecido

(FURTADO, 2019).

Os fenótipos comórbidos associados também incluem outras condições de

desenvolvimento neurológico, como distúrbios neurológicos como epilepsia, sinais de

alterações motoras neurológicos e condições clínicas não neurológicas, como problemas

gastrointestinais e cardíacos (GESCHWIND et al., 2009; ALDINGER et al., 2015).

Outro ponto de gatilho epigenético que vem sendo abordado é quanto a exposição

fetal à inseticidas como clorpirifós tem sido associada a uma redução no peso e comprimento

do corpo infantil, atraso no desenvolvimento psicomotor e um maior risco de TEA

(LANDRIGAN et al., 2010; RAUH et al., 2006). Além disso, estudos epidemiológicos recentes

fornecem evidências de que a exposição de mães grávidas, especialmente durante o 1º ou 2º

trimestre, a infecções virais ou bacterianas, promove a ativação imune materna (MIA) e

aumenta o risco de doenças neuropsiquiátricas, incluindo TEA em seus filhos (em 13%) em

comparação com filhos de mães grávidas não expostas (ESTES; MCALLISTER, 2016;

DEVERMAN, 2009). A MIA tem sido associada a aumentos de citocinas neuroinflamatórias,

bem como a anormalidades na expressão de proteínas sinápticas e a desenvolvimentos

aberrantes na conectividade sináptica, os quais podem estar subjacentes à fisiopatologia da TEA

(PENDYALA et al., 2017).

A exposição de gestantes a medicamentos psicotrópicos, principalmente durante o

primeiro trimestre, tem sido considerada um fator de risco para TEA (GARDENER;

SPIEGELMAN; BUKA, 2009). De fato, crianças expostas ao ácido valpróico no útero tem um

risco 8 vezes maior de desenvolver TEA (REVENDA et al., 2005). Estudos adicionais sugerem

33

que a prescrição de antidepressivos para gestantes aumenta consideravelmente o risco de TEA

(CROEN, et al., 2011; GIDAYA et al., 2014).

No entanto, ainda são necessários estudos clínicos adicionais para validar se existe

um aumento definitivo do risco de TEA em crianças nascidas de mulheres diagnosticadas com

depressão que não recebem tratamento ou tratamento antidepressivo durante a gravidez e

também para correlacionar esse risco com o efeito de medicamentos, tipos de antidepressivos

e dosagens durante a gravidez (SHARMA et al., 2018).

O papel significativo da epigenética no desenvolvimento e na doença cerebral é

devido aos seguintes fatores: 1) plasticidade da epigenética durante todos os períodos de

desenvolvimento e envelhecimento do cérebro, bem como regulação dinâmica nos neurônios,

2) organização desordenada da cromatina tanto na infância quanto na neurodegeneração adulta

e 3) aumento rápido dos fármacos modificadores da cromatina demonstrou ter potencial

terapêutico inesperado para distúrbios degenerativos e funcionais do sistema nervoso. Esses

fatores atraíram um grande interesse nos mecanismos associados a cromatina de doenças

neurológicas, e um novo campo de estudo chamado 'neuroepigenética (JAKOVCEVSKI, 2012)

foi estabelecido.

1.1.4 Manifestações Clínicas

1.1.4.1 Déficit de Socialização

Indivíduos com autismo exibem um amplo padrão de deficiências em situações de

interação social. Sob uma perspectiva de diagnóstico, estes déficits sociais são considerados

uma característica central do autismo (WHITMAN et al., 2015).

Embora crianças com autismo se apegue aos seus pais, utilizem ocasionalmente

habilidades não verbais como gestos para fazer solicitações; e possam mostrar habilidades de

revezamento durante as brincadeiras, elas, geralmente apresentam limitações acentuadas nessas

e em outras áreas da interação social, particularmente em situações que exigem atenção

conjunta, iniciação e reciprocidade dinâmica (WHITMAN et al., 2015).

As dificuldades na interação social em indivíduos com TEA podem manifestar- se

por um isolamento ou comportamento social impróprio, pobre contato visual, dificuldades em

participar de atividades em grupo, indiferença afetiva ou manifestações inapropriadas de afeto,

falta de empatia social ou emocional. À medida que crescem e entram na idade adulta, pode

haver uma melhoria quanto ao isolamento social, não obstante permanecer uma socialização

34

empobrecida, com dificuldade de estabelecer amizades persistentes (VOLKMAR,

MCPARTLAND, 2014).

De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM

- 5), as pessoas com TEA tem dificuldade de comunicação e interação com outras pessoas,

interesses restritos e comportamentos e sintomas repetitivos que prejudicam sua capacidade de

se comunicar e manter a rotina adequadamente na escola, no trabalho e em outras áreas da vida

(DSM-V, 2013).

A. Déficits persistentes na comunicação social e na interação social em vários

contextos, conforme manifestado pelo seguinte, atualmente ou pela história:

1. Déficits na reciprocidade socioemocional, variando, por exemplo, na abordagem social

anormal e falha na conversa normal como interagir; para compartilhamento reduzido de

interesses, emoções ou afetos; falha ao iniciar ou responder a interações sociais.

2. Déficits nos comportamentos comunicativos não verbais usados para interação social,

variando, por exemplo, entre comunicação verbal e não verbal mal integrada; a

anormalidades no contato visual e na linguagem corporal ou déficits na compreensão e

uso de gestos; total falta de expressões faciais e comunicação não verbal.

3. Déficits no desenvolvimento, manutenção e compreensão de relacionamentos, variando,

por exemplo, entre dificuldades em ajustar o comportamento para atender a vários

contextos sociais; a dificuldades em compartilhar brincadeiras imaginativas ou em fazer

amigos; à falta de interesse pelos pares

B. Padrões restritos e repetitivos de comportamento, interesses ou atividades, manifestados por

pelo menos dois dos seguintes, atualmente ou pelo histórico

1. Movimentos motores estereotipados ou repetitivos, uso de objetos ou fala (por exemplo,

estereótipos motores simples, alinhando brinquedos ou lançando objetos, ecolalia, frases

idiossincráticas).

2. Insistência na mesmice, aderência inflexível às rotinas ou padrões ritualizados de

comportamento verbal ou não verbal (por exemplo, angústia extrema com pequenas

mudanças, dificuldades com as transições, padrões rígidos de pensamento, rituais de

saudação, precisam seguir a mesma rota ou comer a mesma comida todos os dias).

35

3. Interesses altamente restritos e fixos que são anormais em intensidade ou foco (por

exemplo, forte apego ou preocupação com objetos incomuns, interesses excessivamente

circunscritos ou perseverantes).

4. Hiper ou hipo reatividade a estímulos sensoriais ou interesse incomum em aspectos

sensoriais do ambiente (por exemplo, indiferença aparente à dor / temperatura, resposta

adversa a sons ou texturas específicas, cheiro ou toque excessivo de objetos, fascínio

visual por luzes ou movimento).

C. Os sintomas devem estar presentes no desenvolvimento inicial, mas podem não se manifestar

completamente de forma tardia ou podem ser mascarados na vida por estratégias aprendidas

D. Os sintomas causam comprometimento clinicamente significativo nas áreas sociais,

ocupacionais ou outras áreas importantes do funcionamento atual.

E. Esses distúrbios são melhor explicados por deficiência intelectual (distúrbio do

desenvolvimento intelectual) ou atraso global do desenvolvimento. A incapacidade intelectual

e o distúrbio do espectro do autismo co-ocorrem frequentemente para fazer diagnósticos

comórbidos de desordem do espectro do autismo e deficiência intelectual, a comunicação social

deve estar abaixo do esperado para o nível geral de desenvolvimento.

1.1.4.2 Déficit de Comunicação/Linguagem

Existe um relacionamento dinâmico entre a linguagem das crianças e seu

funcionamento social e cognitivo. Através da linguagem, elas expressam suas necessidades,

pedem aquilo que precisam, regulam o comportamento próprio e dos outros, comunicam seus

sentimentos, exploram e respondem ao seu ambiente social, entendem melhor a si mesmas e

imaginam mundos diferentes daqueles em que vivem (WHITMAN et al., 2015).

A comunicação intencional desenvolve-se cedo (entre 9 e 13 meses), seguidas pelas

primeiras palavras (entre 13 e 18 meses), combinações de palavras (18 e 30 meses), frases (30

a cinco anos) e gramática do discurso (entre cinco e oito anos) (PRIZANT; WETHERBY,

1993).

Deficiência na linguagem é uma característica diagnóstica central do autismo.

Estimativas sugerem que aproximadamente 50% das crianças com autismo não adquirem a

linguagem como um modo principal de comunicação (PRIZANT et al., 1996).

36

O prejuízo relativo à comunicação ocorre de forma variada, indo desde o atraso ou

ausência total de desenvolvimento da linguagem verbal até a presença de linguagem. Nos

indivíduos com linguagem verbal, o prejuízo é notório, por não terem capacidade de iniciar

uma conversa ou mantê-la, registrando-se o uso estereotipado, repetitivo e idiossincrático da

linguagem. Existem alguns indivíduos que desenvolvem uma linguagem imatura, caracterizada

por ecolalia, reversão do pronome, prosódia anormal e entonação monótona. Os que possuem

capacidade expressiva adequada podem ter dificuldades em iniciar ou manter uma conversa.

As dificuldades de linguagem e de comunicação podem perdurar até a vida adulta (COSTA et

al., 2012).

Aqueles que possuem habilidades verbais podem apresentar déficits em

compreender sutilezas de linguagem, piadas, assim como dificuldades em compreender ou

interpretar a linguagem corporal e as expressões faciais (VOLKMAR; MCPARTLAND, 2014).

1.1.4.3 Padrões de Comportamentos

1.1.4.3.1 Interesses Restritos e Estereotipados

Condutas estereotipadas foram encontradas em animais e no homem. Seu

surgimento está frequentemente relacionado ao mau funcionamento do sistema de controle de

conduta, impulsos e motivações no desempenho de algum movimento ou vocalização.

Conforme a incidência, a qualidade dos episódios e a idade da criança, de uma forma ou de

outra, as estereotipias comprometem o desenvolvimento motor, linguístico e as atividades

físicas, sociais, emocionais, cognitivas e educativas (HOFFMANN et al., 2015).

A Classificação Internacional das Doenças, em sua décima edição (CID-10), traz

as estereotipias motoras como uma categoria nosográfica caracterizada por movimentos

intencionais, repetitivos, estereotipados, ritmados, desprovidos de finalidade e sem relação a

um transtorno psiquiátrico ou neurológico identificado. Esses movimentos caracterizam-se por

balançar o corpo e/ou a cabeça, arrancar e/ou torcer os cabelos, estalar os dedos e bater as mãos.

Porém, podem ter algum componente automutilador, sendo reconhecidos por bater a cabeça,

esbofetear a face, colocar o dedo nos olhos, morder as mãos, os lábios ou outras partes do corpo

(HOFFMANN et al., 2015).

Laznik (2004) informa que as estereotipias e automutilações surgem compondo o

quadro do autismo no segundo ano de vida. No entanto, afirmamos que é comum observarmos

em bebês condutas repetitivas que compõem o quadro do desenvolvimento psicomotor infantil,

37

entre elas, o balanceio da cabeça buscando o equilíbrio em decúbito ventral, o balanceio de

braços e pernas em decúbito dorsal, o balanceio do corpo ao se levantar quando sentada e o

hábito de sugar.

Os indivíduos caracterizados pela ausência de espontaneidade compatível com o

nível de desenvolvimento, relativo a jogos ou brincadeiras de imitação social, demonstram

resistência às mudanças, insistências em determinadas rotinas, apego excessivo a determinados

objetos, como rodas ou hélices, usando-os mais para representação simbólica, o que faz parecer

que estejam brincando. Estereotipias motoras e verbais, como balançar, bater palmas

repetitivamente, andar em círculos ou repetir de algumas palavras, frases ou canções são

algumas das manifestações frequentes em indivíduos com TEA. Quando adultos, os autistas

apresentam uma melhor adaptação às mudanças, porém os interesses restritos persistem e

aqueles que demonstram habilidades cognitivas adequadas tem a tendência a concentrar seus

interesses de forma limitada, tal como os horários de trens, aviões, mapas ou fatos históricos,

isto é, elementos que dominam suas vidas (FIRST.; FRANCE; PINCUS, 2004).

1.1.5 Características Neuroquímicas

1.1.5.1 Neuroinflamação

A inflamação é uma reação de defesa contra diversas lesões, o papel da inflamação

nos transtornos neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos tem, no entanto, uma explicação

muito mais complexa caracterizada pela ativação de vias de sinalização intracelulares

associadas à expressão de inúmeros mediadores inflamatórios (RIBEIRO et al., 2015).

A neuroinflamação é um componente-chave na indução e progressão de processos

degenerativos no SNC. Estudos demonstram que a neuroinflamação é um importante

mecanismo fisiopatológico das doenças neurodegenerativas no SNC, principalmente por meio

do do aumento da expressão de genes relacionados à produção de mediadores inflamatórios e

neurotóxicos, que contribuem para a cascata de eventos que levam a lesão e morte celular

(FRANK-CANNON et al., 2009; TAYLOR et al., 2013). O equilíbrio no sistema imune

consiste no reconhecimento padrão dos receptores, macrófagos e os sistemas em geral

desempenhando um papel fundamental na homeostase do SNC após a lesão e infecção. Os

componentes imunológicos inatos desequilibrados também podem contribuir para

neuroinflamação e neurodegeneração (SHASTRI; BONIFATI; KISHORE, 2013). Durante a

38

inflamação, ocorre a liberação de mediadores inflamatórios, como: a prostaglandina E2 (PGE2)

e citocinas, como a interleucina 1 beta (IL1β) e o fator de necrose tumoral alfa (TNFα).

Um dos principais indicadores de neuroinflamação no TEA é ativação das

microgliais - células imunes primárias da SNC e são muito semelhantes aos macrófagos

periféricos. Além disso, é relatado que a microglia defende o cérebro, limpando detritos

celulares e neurônios mortos do tecido nervoso através da fagocitose. No entanto, quando

ocorre ativação microglial de forma exagerada e sustentada, esse pode levar à danos colaterais

ou ao tecido saudável (RODRIGUEZ e KERN 2011). Por exemplo, ativação microglial em

excesso sustentada pode resultar na perda de conexões sinápticas saudáveis, por meio dos

desvios de suas funcionalidades normais, sendo consistentemente encontrada e explicada no

TEA (VARGAS et al., 2005). Inflamação em amostras cerebrais post-mortem de indivíduos

diagnosticados com TEA foram observados, especificamente, no cerebelo, giro cingular

anterior e as regiões médio-frontais do cérebro (VARGAS et al., 2005). Ativação neuroglial e

presença de concentrações aumentadas de citocinas inflamatórias como IFN-γ, IL-1β, IL-6,

TNF-α e quimiocinas CCL-2 foram encontradas no tecido cerebral de indivíduos

diagnosticados com TEA.

Anteriormente foi revelado que indivíduos diagnosticados com TEA em

comparação com os controles, apresentam uma resposta no efeito inflamatório elevada como

linfócitos e citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α e IFN-γ e em concentrações menores

a citocina anti-inflamatória IL-10 (TORRENTE et al., 2002, ASHWOOD et al., 2004,

NAKAGAWA e CHIBA, 2016), resultando entre os indivíduos diagnosticados com TEA,

inflamação crônica persistente.

Diversas linhas de pesquisa demonstram que tanto fatores genéticos como ambientais

influenciariam o desenvolvimento de anormalidades na circuitária neural que pode

desencadeiar as características do autismo. Os transtornos do espectro do autismo (TEA) são

condições ao longo da vida e muitas vezes devastadoras que afetam gravemente o

funcionamento social auto-suficiente, com um impacto muito negativo durante a vida inteira e

de toda família dos indivíduos afetados. Presumivelmente tem uma etiopatogenia multifatorial,

resultante de uma interação entre fatores genéticos e ambientais (LYALL, 2014; BÖLTE,

2014).

Em estudos realizados com roedores, a inflamação do cérebro e a ativação da

microglia foram prejudiciais para a sobrevivência dos neurônios do hipocampo mesmo após o

nascimento dos animais. Estímulos inflamatórios aplicados em culturas de tecido hipocampal,

tais como: interferon-α, fator de necrose tumoral , lipopolissacarídeo, vírus da imunodeficiência

39

humana-1 com revestimento proteico da glicoproteína 120, adenovírus e β-amiloide,

aumentaram a síntese de numerosas quimiocinas e citocinas do hipocampo, indicando que os

fatores secretados por sítios da neuroinflamação são atraentes para as células progenitoras

neuronais e sugerindo que as quimiocinas desempenham um papel importante neste processo

(BELMADANI et al., 2006; EKDAHL; KOKAIA; LIDVALL, 2009).

Todos os tipos de células neurais e não neurais que fazem parte do SNC em

desenvolvimento, como micróglia e células endoteliais, usam citocinas para sinalizações

parácrinas e autócrinas, e, pelo fato de muitas dessas mesmas citocinas também servirem como

moduladores imunes nos processos de desenvolvimento do SNC, podem estar susceptíveis à

distúrbios por desequilíbrio imunológico, como por exemplo, a partir de infecções maternas

(DEVERMAN et al., 2009).

Na Figura 2 pode ser observado um exemplo de lesão microglial após

neuroinflamação: em resposta à um desequilíbrio imunológico e dano neuronal, um estado de

neuroinflamação desenvolvido no interior do cérebro ativa principalmente a microglia. A

microglia ramificada é transformada em microglia ativada e libera várias moléculas

neuroinflamatórias que levam a danos na barreira hematoencefálica. Esse dano promove a

infiltração macrofágica que mais tarde exagera o influxo de citocinas inflamatórias, agravando

o estado neuroinflamatório existente no SNC, causando dano neuronal secundário e

subsequente ativação microglial.

Figura 2 – Representação esquemática de como a estimulação de mastócitos e micróglia pode

levar a vários efeitos que contribuem para a inflamação cerebral, a patogênese e os sintomas

do autismo.

40

Fonte: Adaptado: Theoharides (2013). Legenda: MCP= proteína quimiotática de monócitos

O papel da inflamação para a neurogênese tem, no entanto, uma explicação muito

mais complexa. Evidências experimentais indicam que a microglia, em determinadas

circunstâncias, pode ser benéfica e apoiar as diferentes etapas na neurogênese, desde a

proliferação de células progenitoras, sobrevivência, migração e até a diferenciação. Sua

ativação, como indicador de inflamação, pode ou não ser antineurogênico, mas o resultado final

é dependente do equilíbrio entre moléculas secretadas com ação anti e pró-inflamatória. A

inflamação é uma reação de defesa contra diversos insultos, destinada a eliminar os agentes

nocivos sendo capaz de inibir os seus efeitos prejudiciais. Ela consiste de uma deslumbrante

variedade de mecanismos moleculares e celulares e uma intrincada rede de trabalho para mantê-

los sob controle (EKDAHL; KOKAIA; LIDVAL, 2009; WYSS- CORAY; MUCKE et al.,

2002).

Até que ponto a inflamação é benéfica para o tecido cerebral lesionado, e como ele

contribui para os danos cerebrais secundários e perda neuronal progressiva? Existe uma dupla

evidência, tanto um efeito benéfico, como um papel deletério da neuroinflamação após lesão

cerebral traumática. A estimulação dos neurônios sensoriais produz vasodilatação,

extravasamento de plasma e hipersensibilidade. Progressos foram feitos na compreensão da

etiologia da inflamação neurogênica, estudos tem-se centrado em grande parte no papel do

péptido relacionado com o gene neuropeptídeo, a substância P e a calcitonina, que são liberados

na periferia por ativação de neurônios sensoriais de pequeno diâmetro (MORGANTI-

KOSSMANN et al., 2002; RICHARDSON; VASKO, 2002).

Além da imunidade sistêmica alterada (GOINES et al., 2010; MEAD et al., 2015),

neuroinflamação foi observada no cérebro de pacientes com TEA. A presença de microglia

ativada foi relatada no córtex pré-frontal dorsolateral de pacientes autistas (MORGAN et al.,

2010). Estudos post-mortem de indivíduos com TEA também demonstraram a ativação da

microglia, bem como um aumento na densidade (MORGAN et al., 2010; TETREAULT et al.,

2012; VARGAS et al., 2005). Reforçando a ideia de disfunção imunológica no TEA (CAO et

al., 2012; ASHWOOD et al., 2011; MOLLY et al., 2006), essa ativação da microglia é

acompanhada pelo aumento da expressão de fatores pró-inflamatórios, como citocinas e

quimiocinas, no cérebro e no líquido cefalorraquidiano de indivíduos com TEA (MORGAN

et al., 2010; VARGAS et al., 2005).

Apesar da falta de evidências em humanos de que a neuroinflamação desempenha

um papel direto na patogênese do autismo, pesquisas em modelos animais sugerem fortemente

41

que esse seja o caso. Demonstrou-se que os déficits na atividade microglial durante o

desenvolvimento do cérebro são prejudiciais à formação de sinapses maduras, levando a um

aumento de sinapses imaturas que podem ser responsáveis por déficits cognitivos e

comportamentais do tipo TEA (PAOLICELLI et al., 2011; ZHAN et al., 2014). Portanto, além

dos fatores de risco genéticos para inflamação, fatores ambientais que levam a eventos

neuroinflamatórios estão recebendo mais escrutínio na etiologia do autismo.

1.1.5.2 Mecanismos Moleculares e Genéticos

Atualmente, existem fortes evidências que apontam para um forte componente

genético na maioria das doenças psiquiátricas, entre elas o TEA (LEVY; MANDELL;

SCHULTZ; 2009). Desse modo, estudos buscam demonstrar a relação entre o quadro clínico

do TEA e a influência genética na expressão de alguns sintomas (TAMANAHA;

PERISSINOTO; CHIARI, 2008).

Da mesma forma, encontrados nas literaturas em estudo com roedores, o desafio

materno com AVP induz fenótipos do tipo autista em descendentes masculinos e femininos

(KATAOKA et al., 2013; HARA et al., 2017), não sendo diferente os resultados nas

anormalidades comportamentais e celulares observadas entre os sexos.

As expressões genéticas específicas dos alelos dos pais ao longo de domínios

impressos são produzidas por elementos de sequência especializados chamados 'regiões de

controle de impressão' (ICRs). Os ICRs estão localizados apenas em uma das cópias dos pais,

cuja função é regular as expressões gênicas por meio de um alelo específico. Embora a

metilação do DNA seja a alteração epigenética mais bem investigada nos ICRs, a metilação e

acetilação das histonas nos ICRs também foram relatadas (KANEDA, 2004). Para colocar

impressões de metilação nos ICRs, o Dnmt3a é essencial. Após a fertilização, através da

manutenção somática, as alterações de metilação alélica são conservadas durante o

desenvolvimento. Esse processo é complicado devido à sua ligação ao ciclo celular e requer

funções proporcionais de complexos multi-enzimáticos que podem ser afetados por agentes

intrínsecos e extrínsecos (DELAVAL, 2006). Outras importantes modificações de metilação

foram reconhecidas em genes envolvidos no desenvolvimento da doença de Alzheimer e

esquizofrenia. Além disso, foi confirmado um papel para modificações epigenéticas em

doenças psiquiátricas, como síndrome e dependência de Rubinstein-Taybi, doença de

Huntington e síndrome do X frágil. Atualmente, é amplamente aceito que, para a função normal

e as características do neurodesenvolvimento do cérebro, a constância da metilação do DNA e

42

das modificações das histonas é essencial, e sua desregulação pode resultar em doenças

fenótipas (PTAK, 2010).

O status de metilação do DNA tem alta estabilidade e serve como uma memória

epigenética especial de células específicas em todos os períodos do ciclo celular. Também pode

regular a expressão e a atividade dos códigos de histonas. A aceleração da metilação do DNA

nos locais CpG é mediada por enzimas DNA metiltransferase, como Dnmt1, Dnmt3a e

Dnmt3b. Dentro das células, a S-adenosilmetionina atua como um importante doador do grupo

metil. Nesse sentido, o ácido fólico e a vitamina B12 desempenham papéis determinantes na

re-metilação ou na atração da forma desmetilada da S-adenosilmetionina por meio de

mecanismos passivos e ativos (ABDOLMALEKY, 2008; KIM, 2005). Vários estudos

demonstraram que esses fatores efetivos podem alterar os padrões de metilação do DNA e

alterar os níveis de expressão gênica (COONEY, 2002; WATERLAND, 2006). Estudos

também confirmaram que o estado nutricional nos primeiros anos de vida pode afetar o padrão

de metilação do DNA e os níveis de expressão gênica na idade adulta (WEAVER, 2004). Além

disso, os padrões de metilação nas seqüências de CpG nos resíduos de citosina podem ser

herdados e atuar como características específicas de tecidos e espécies. É interessante que 70%

a 80% do DNA humano nas seqüências de CpG sejam geralmente metilados (LU, 2006;

TAYLOR, 2007). e foram relatadas correlações entre a metilação e os níveis de expressão

em cis e trans (VAN, 2014).

Cinco membros da família de proteínas de ligação o DNA helicase cromodomínio (Chd)

- (Chd1, Chd2, Chd5, Chd7 e Chd8) têm sido implicados no TEA e NDD (desordens do

desenvolvimento). No entanto, apenas Chd2, no cromossomo 15q26.1, e Chd8, no cromossomo

14q11.2, estão incluídos na lista de genes com fortes evidências estatísticas baseadas sobre os

estudos recentes de WES whole-genome sequencing (sequenciamento completo do genoma)

em grande escala no TEA e nas NDDs (STUDY, 2017; IOSSIFOV et al., 2014). Mesmo antes

dos estudos de WES em grande escala, havia evidências para o denvolvimento de Chd2 em

NDDs por meio de relatórios de microdeleções que afetam o 15q26.1 englobando o gene

(BHAKTA et al., 2005). Esses relatórios foram seguidos por uma descrição detalhada de seis

indivíduos com DNVs em Chd2 encontrados entre uma amostra de 500 (1,2%) com

encefalopatias epilépticas (CARVILL et al., 2013). Este estudo relatou que cinco dos seis

indivíduos (83%) com DNVs que afetam Chd2 apresentaram regressão e dois indivíduos

também foram diagnosticados com TEA. Atualmente, é conhecido que 32 indivíduos têm

NDDs relacionados a Chd2 e o fenótipo consiste em epilepsia de início precoce encefalopatia

43

seguida por desaceleração cognitiva ou regressão associada com a atividade epileptiforme

contínua (CARVILL et al., 2015).

Alguns pesquisadores vêm tentado desvendar os fatores genéticos associados a esse

transtorno. Causas como convulsões, deficiência mental, diminuição de neurônios e sinapses

na amígdala, sugerem um forte componente genético, bem como o tamanho aumentado do

encéfalo e concentração aumentada de serotonina circulante (LEVY; MANDELL; SCHULTZ;

2009).

Cerca de 15 anos atrás, estimava-se que aproximadamente 15 genes pudessem estar

envolvidos nesse transtorno. Não obstante, os estudos genéticos na atualidade veem sinalizando

que vários loci no genoma tem sido associado a esse transtorno, embora poucos genes

específicos tenham sido identificados (WILLSEY; STATE, 2013).

Interessa destacar que apesar de não existir um consenso, entre os pesquisadores na

identificação dos genes relacionados com o TEA, ocorre em contrapartida unanimidade na

comunidade cientifica o reconhecimento que na maioria dos indivíduos com TEA, os múltiplos

loci interagem entre si, contribuindo de forma significativa para expressão do transtorno

(TORDJMAN et al., 2014).

No que concerne aos estudos neurobiológicos algumas anomalias em estruturas

cerebrais, encontradas em pelo menos um subgrupo, vem sendo relacionadas as idiossincrasias

comportamentais do TEA (LEVY; MANDEL; SCHULTZ; 2009). Sob esse enfoque cabe

destacar, a presença de fatores de riscos pré-natais, perinatais e pós-natais tais como: a

prematuridade, a pós-maturidade, a hipóxia neonatal, rubéola, sífilis congênitas, toxoplasmose,

citomegalovírus e as infecções pelo vírus Herpes Simplex, os quais representam eventos

importantes para o desfecho do transtorno (TORDJMAN et al., 2014).

Os anos de 1960 e 1970 foram críticos para o papel dos fatores genéticos na gênese

do autismo (ASSUMPÇÃO et al., 2015). As evidências replicadas tanto em estudos com

gêmeos quanto em famílias durante as décadas de 1970 e 1980 reforçam a hipótese genética e

levantaram a probabilidade de que se tratava de um fenótipo autístico muito amplo do que a

categoria de diagnóstico mais convencional. Os achados clínicos e cromossômicos também

apontaram para a heterogeneidade genética dessa condição (RUTTER et al., 2000).

Satterstrom et al., (2020) apresentaram o maior estudo de sequenciamento de

exoma do TEA até o momento contemplando um número de 35.584 amostras no total, 11.986

com TEA. Usaram uma estrutura analítica aprimorada para integrar variação rara de novo e

controle de caso, identificando 102 genes de risco a uma taxa de descoberta falsa de 0,1 ou

menos. Desses genes, 49 mostraram frequências mais altas de variantes disruptivas de novo em

44

indivíduos que apresentaram um atraso grave no desenvolvimento, enquanto 53 mostraram

freqüências mais altas em indivíduos que tinham TEA; comparar casos de TEA com mutações

nesses grupos revela diferenças fenotípicas. Expressas precocemente no desenvolvimento do

cérebro, a maioria dos genes de risco tem papel na regulação da expressão gênica ou

comunicação neuronal (isto é, mutações afetam alterações neurodesenvolvimentais e

neurofisiológicas) e 13 caem em loci atingidos recorrentemente por variantes de número de

cópias (SATTERSTROM et al., 2020).

O aumento nos genes identificados associados ao TEA (SFARI, 2019) observados

na Figura 3 é representado juntamente com a prevalência de TEA (dados extraídos do Centro

de Controle e Prevenção de Doenças), as diferentes versões do Manual Estatístico de

Diagnóstico (do DSM II ao DSM 5.0) e o avanço da tecnologia genética (Adaptado de

HUGUET; BOURGERON, 2016).

Figura 3 – A história da genética do TEA de 1975 a 2015.

Fonte: Adaptado de Huguet e Bourgeron, 2016.

Com base em mais de 13 estudos com gêmeos publicados entre 1977 e 2015, os

pesquisadores estimaram a contribuição genética e ambiental para o TEA (HUGUET et al.,

2016). Em 1977, o primeiro estudo sobre autismo por Folstein e Rutter (1977) relatou uma

coorte de 11 gêmeos MZ e 10 gêmeos DZ. Este estudo mostrou que os gêmeos MZ eram mais

concordantes com o autismo - 36% (4/11) - em comparação com 0% (0/10) para os gêmeos DZ.

Quando um "fenótipo de autismo mais amplo" foi usado, a concordância aumentou para 92%

para os gêmeos MZ e para 10% dos gêmeos DZ (BAILEY et al. 1995). Desde este primeiro

estudo de pequena escala, estudos com gêmeos relataram constantemente uma maior

concordância para TEA em MZ em comparação com DZ (RITVO et al., 1985;

STEFFENBURG et al., 1989; BAILEY et al., 1996).

45

Entre 2005 e 2009, três estudos de gêmeos com grupos relativamente grandes de

gêmeos (285-3419) relataram altas concordâncias para TEA em gêmeos MZ (77-95%) em

comparação com gêmeos DZ (31%), (RONALD et al., 2005; TANIAI et al., 2008;

ROSENBERG et al., 2009). Notavelmente, as concordâncias MZ foram semelhantes às

relatadas nos estudos anteriores, mas as concordâncias DZ foram maiores. Lichtenstein et al.,

(2010) relataram uma concordância relativamente baixa para TEA em 39% dos gêmeos MZ em

comparação com outros estudos (a concordância para gêmeos DZ neste estudo foi de 15%). No

entanto, como indicado anteriormente por estudos usando o "fenótipo de autismo mais amplo",

todos os gêmeos MZ discordantes dessa coorte apresentavam sintomas de ESSENCE (por

exemplo, ID, TDAH, atraso no idioma etc.).

Uma proporção significativa da contribuição genética para o TEA mostrou-se

compartilhada com outros distúrbios do desenvolvimento neurológico, como TDAH (> 50%) e

dificuldade de aprendizagem (> 40%), (LICHTENSTEIN et al., 2010; RONALD et al., 2010;

LUNDSTROM et al., 2011; RONALD; HOEKSTRA, 2011). Em resumo, quando todos os

estudos com gêmeos são levados em consideração, a concordância para TEA é de

aproximadamente 45% para gêmeos MZ e 16% para gêmeos DZ (RITVO et al., 1985;

STEFFENBURG et al., 1989; BAILEY et al., 1995).

Além disso, cerca de 10% dos casos estão associados as doenças de herança

monogênica como esclerose tuberosa (relata em estudo na década de 1990) segundo Smalley

(1998), síndrome do X-frágil e neurofibromatose (FOLSTEIN; ROSEN-SHEIDLEY, 2001), e

em aproximadamente 3% dos casos, os indivíduos possuem alguma anomalia cromossômica

detectável por cariótipo (VORSTMAN et al., 2006).

Os primeiros estudos usando técnicas clássicas de mapeamento genético, tais como

ligação, triagem de genes candidatos e associação de variantes comuns, forneceram resultados

modestos, principalmente porque foram insuficientes para detectar variantes causais à luz da

alta heterogeneidade genética no TEA. Na última década, os avanços nas tecnologias de

sequenciamento de DNA, juntamente com a coleta de grandes grupos de pacientes e o amplo

compartilhamento de dados, permitiram um enorme progresso na identificação de genes

implicados no TEA (GESCHWIND; STATE, 2015).

Uma abordagem que tem se mostrado muito interessante para identificação de

genes e vias relacionados a doenças psiquiátricas são os estudos de expressão gênica,

especialmente após o desenvolvimento da técnica de microarranjos de DNA (ou em inglês,

DNA microarray). Esta técnica passou a permitir a avaliação da expressão de um grande

número de transcritos em um único experimento, possibilitando uma análise ampla em um

46

determinado tecido e momento particular e, portanto, abrindo perspectivas para a identificação

de vias importantes para os TEA (OLIVEIRA et al., 2011).

Houve um grande progresso na última década na compreensão da genética do TEA,

estabelecendo novas mutações, incluindo variantes de número de cópias (CNVs) e mutações

pontuais que provavelmente atacam os genes codificadores de proteínas, como causas

importantes do TEA (SANDERS et al., 2012; IOSSIFOV et al., 2014). No entanto, quando

combinados, todos os genes conhecidos associados ao TEA explicam apenas uma pequena

fração de novos casos e estima-se que, de maneira geral, novas mutações em genes que

codificam proteínas (incluindo CNVs) contribuam para não mais do que 30% de casos de TEA

(IOSSIFOV et al., 2014; YUEN et al., 2017). A grande maioria das novas mutações

identificadas está localizada em regiões intrônicas e intergênicas; no entanto, pouco se sabe

sobre sua contribuição para a arquitetura genética de TEA ou para qualquer outra doença

complexa (ZHOU et al., 2019).

1.2 Ácido Valpróico

O valproato é um medicamento antiepilético amplamente aceito que também é

utilizado para o gerenciamento do transtorno bipolar (NATASHA et al., 2008) e para a

profilaxia da dor de cabeça da enxaqueca (LAGACE et al., 2004).

O ácido valpróico (AVP) é comercializado e utilizado no mercado como

anticonvulsivante desde 1974 e é usado em muitos países devido à sua eficiência contra vários

tipos de epilepsias nos últimos 40 anos, se mostrando eficiente no controle de crises convulsivas

em adultos e especialmente na infância (NALIVAEVA et al., 2009), e como um estabilizador

do humor. Uma das suas principais ações é o aumento no nível do ácido gama aminobutírico

(GABA) no cérebro (ORNOY et al., 2009).

Do ponto de vista farmacológico, o AVP pertence à classe de inibidores da enzima

histona desacetilase (HDAC) com ação também sobre canais iônicos e transportadores de

GABA e pode atuar alterando expressão gênica através de controle epigenético. A regulação da

acetilação de lisinas na porção C-terminal das moléculas de histonas presentes nos

nucleossomos altera o estado de compactação e a estrutura da cromatina (ORNOY et al., 2009).

O aumento da acetilação de histonas produz descompactação do DNA, aumentando

o acesso da RNA polimerase II e proteínas acessórias necessárias à transcrição. O efeito é

observado através do aumento da expressão de genes comumente silenciados. Assim, o

equilíbrio entre as funções das enzimas HDAC e histona acetilase (HAC), além das DNA metil-

47

transferases, que controlam o grau reestruturação da cromatina e o nível de transcrição de

regiões cromosômicas específicas, fica comprometido (GÖTTLICHER et al, 2001).

A exposição de uma droga com alto poder de regulação da expressão gênica durante

o período de neurogênese pode levar então a uma modificação nos padrões de expressão de

genes relacionados ao neurodesenvolvimento. A inibição das proteínas histonas desacetilases

induzidas pelo AVP tem se mostrado importante na neuroproteção de cultura de neurônios

corticais do AVP, aumentando a viabilidade dessas células in vitro (JEONG et al, 2003).

1.2.1 Efeitos Teratogênicos

A exposição ambiental pré ou pós-natal a fatores pró-oxidantes, como ácido AVP,

mercúrio, chumbo, vírus, poluentes do ar, toxinas, talidomida e ácido retinóico pode servir

como fatores desencadeantes do estresse oxidativo no autismo (CHAUHAN; CHAUHAN,

2006; KERN; JONES, 2006; SWEETEN et al., 2004; TONG et al., 2003; ZOROGLU et al.,

2004).

Muitos relatos sugerem que o AVP pode produzir anormalidades comportamentais

(VOORHEES, 1987; YOCHUM et al., 2010), dificuldades no aprendizado e múltiplos defeitos

congênitos (SCHNEIDER; TURCZAK; PRZEWŁOCKI, 2005), devido aos quais foi

empregado para manifestar sintomas de autismo em animais. O AVP é capaz de induzir

anomalias nos neurodesenvolvimentos e isso tem sido atribuído ao seu status de "teratogênico"

(COLLINS et al., 1991; EHLERS et al., 1992). Acredita-se que o autismo induzido por AVP

ocorra devido a déficits no desenvolvimento neuronal no cerebelo, sistema límbico e tronco

cerebral, causando interrupções na conectividade sináptica (BAILEY et al., 1998; KEMPER;

BAUMAN, 1993; RINALDI et al., 2007).

Logo após o AVP ser introduzido no mercado para uso clínico como

anticonvulsivante surgiram casos de alterações no tubo neural, particularmente de espinha

bífida, entre os filhos expostos a esse medicamento no início de gestação (KOREN et al., 2006).

Estas alterações podem afetar o desenvolvimento da linguagem e habilidades de aprendizagem

(ORNOY et al., 2009). Além disso, alterações nos sistemas cardiovascular, genitourinário e

endócrino também foram associadas ao uso de AV (ALSDORF; WYSZYNSKI 2005).

Mulheres em idade fértil, tratadas com este fármaco, devem usar contraceptivos e

interromper a medicação antes de qualquer gravidez planejada. Se não houver nenhuma outra

alternativa para o tratamento com ácido valpróico, a gravidez deve ser considerada de alto risco

48

e deve ter o acompanhamento adequado incluindo o diagnóstico pré-natal (ORNOY et al.

2009).

1.2.2 Mecanismo de Ação

Foi relatado que a propensão teratogênica de drogas antiepilépticas ocorre devido

ao envolvimento do estresse oxidativo (DEFOORT et al., 2006). Achados experimentais

sugerem que o valproato e seus produtos metabólicos podem desencadear a liberação abundante

de espécies reativas de oxigênio, como peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila. Esses

radicais livres podem atuar em vários locais do corpo, resultando na formação de biomarcadores

de estresse oxidativo, que são substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e 15-F-isoprostano

(VERROTTI et al., 2008).

A geração de radicais livres constitui, por excelência, um processo contínuo e

fisiológico, cumprindo funções biológicas relevantes. Durante os processos metabólicos, esses

radicais atuam como mediadores para a transferência de elétrons nas várias reações

bioquímicas. Sua produção, em proporções adequadas, possibilita a geração de ATP (energia),

por meio da cadeia transportadora de elétrons; fertilização do óvulo; ativação de genes; e

participação de mecanismos de defesa durante o processo de infecção. Porém, a produção

excessiva pode conduzir a danos oxidativos (SHAMI 2004; FERREIRA, 1997).

A instalação do processo de estresse oxidativo decorre da existência de um

desequilíbrio entre compostos oxidantes e antioxidantes, em favor da geração excessiva de

radicais livres ou em detrimento da velocidade de remoção desses. Tal processo conduz à

oxidação de biomoléculas com consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio

homeostático, cuja manifestação é o dano oxidativo potencial contra células e tecidos

(HALLIWELL, 2004). A cronicidade do processo em questão tem relevantes implicações sobre

o processo etiológico de numerosas enfermidades crônicas não transmissíveis, entre elas a

aterosclerose, diabetes, obesidade, transtornos neurodegenerativos e câncer (GREEN, 2004).

Ferrari (2004), em estudo de revisão, ratifica que a geração de radicais livres desencadeia

eventos patológicos que, por sua vez, estão envolvidos nos processos cardiovasculares,

carcinogênicos e neurodegenerativos.

O AVP atravessa a placenta e está presente em uma concentração mais alta no feto

do que na mãe, embora não esteja claro se a concentração sérica fetal é maior durante

embriogênese (DICKINSON et al., 1997). Vários estudos sugeriram que a permanência dos

níveis total do ácido valpróico caem, mas essas frações livres aumentam durante a gravidez.

49

Achados sugerem que o metabolismo real do AVP não é alterado pela gravidez e que as

alterações da depuração plasmática se devem principalmente à diminuição da ligação às

proteínas (JOHANNESSEN et al., 1992).

A farmacocinética clínica e a farmacodinâmica do AVP foram revisadas

extensivamente (LOSCHER et al., 1999; GUGLER et al., 1980). A taxa de concentração sérica

terapêutica foi estimada em 50 - 100 mg/l (GIBALDI et al., 1991; BOURGEOIS et al., 1997)

ou 40-150 mg/l (DEAN et al., 1997). Recomenda-se evitar doses grandes e únicas em mulheres

grávidas, pois elas podem causar altos picos sérico com ação agressiva e irreversível, pondo em

risco o feto (DELGADO et al., 1992). É preferível tomar doses múltiplas/fracionadas de AVP

nos intervalos ao longo do dia para evitar picos séricos elevados durante a gestação (ASDORF

et al., 2005).

1.2.3 Uso em Modelos Animais

Os ratos têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre autismo por muitas

razões, principalmente por causa da tecnologia disponível para manipular o genoma do rato.

Isso permitiu o teste de muitas hipóteses sobre os genes que se pensa estarem envolvidos na

patogênese do TEA. Existem excelentes revisões com críticas sobre os modelos de

camundongos com mutações monogênicas (KAZDOBA et al., 2016). Esses modelos são

informativos para a biologia específica para mutações genéticas únicas, como síndrome do X

frágil, síndrome de Rett e esclerose tuberosa, da qual menos de 10% dos casos também são

diagnosticados com TEA (CHADMAN et al., 2017; ELLENBROEK et al., 2016).

Dos agentes ambientais, epigenéticos ligados ao TEA, o AVP é o que está sendo

estudado mais extensivamente. Um dos modelos baseia-se na exposição de ratas prenhas ao

ácido valpróico no nono dia gestacional (SCHNEIDER et al., 2006), afetando a migração de

neurônios como os serotoninérgicos, ou no 12,5º dia de gestação (RODIER et al., 1996),

podendo afetar a diferenciação neural. Essa exposição não produz anormalidades

neuroanatômicas, no entanto os filhotes apresentam distúrbios comportamentais, como o

aumento de tempo gasto em atividades estereotipadas semelhantes aos pacientes autistas

(SCHNEIDER et al., 2006). Esse período é equivalente ao dia 21 da gestação em humanos,

quando o tubo neural fecha, um passo importante no neurodesenvolvimento. Ratos expostos ao

AVP no pré-natal apresentam menor exploração social e aumento de estereotipias locomotoras

(STANTON et al., 2007).

50

No entanto, vários artigos citaram utilizar especificamente o AVP no período pós-

natal e apresentaram resultados semelhantes aos demais quando se referem às alterações

neuroquímicas e comportamentais observadas no TEA (YOCHUM et al., 2010; YAOCHUM

et al., 2008; YADAV et al., 2016), sendo um passo interessante nas pesquisas com autismo

regressivo, ou seja, perda das habilidades adquiridas desde o nascimento.

Modelos animais de autismo podem ser divididos em quatro grupos (BELZUNG et

al., 2005):

(i) animais com certas deficiências de receptores neuro-peptídeos, em particular

os de vasopressina (cepa de ratos e camundongos Brattleboro com uma mutação

zero dos subtipos de receptores de vasopressina (VAN et al., 1982), ocitocina

(camundongos knockout com a ausência de receptores de ocitocina) (POBBE et

al., 2012) e opióides (camundongos com uma exclusão direcionada de receptores

μ-opioides (WÖHR et al., 2011);

(ii) modelos com a reprodução de estados patológicos que aumentam o risco de

autismo nas pessoas; efeitos pré-natais de anticonvulsivantes, embriopatia

induzida por talidomida (NARITA et al., 2010) e distúrbios dos mecanismos de

síntese de serotonina no decorrer do desenvolvimento pré-natal (KAHNE et al.,

2002);

(iii) modelos com comprometimentos neonatais das zonas cerebrais, cujas

anomalias são conhecidas por estarem presentes em pessoas com autismo; as

estruturas estudadas são o cerebelo, o complexo amigdaliano ou o córtex pré-

frontal medial (TSAI et al., 2012);

(iv) modelos genéticos de doenças humanas associadas ao autismo, como a

síndrome de um frágil cromossomo X (MINES et al., 2010).

No entanto, há uma pergunta bastante natural: quão adequados são os modelos

acima? Nesses modelos, apenas certos aspectos da etiologia dos respectivos distúrbios são

reproduzidos; ao mesmo tempo, o autismo é um estado multifatorial. Em modelos animais,

observa-se manifestações associadas a distúrbios autistísticos "humanos", mas é difícil

identificar se essas manifestações são as razões desses distúrbios, suas consequências,

diferentes consequências de razões idênticas ou se essas manifestações estão interconectadas

por outras relações. Por exemplo, distúrbios no funcionamento do cerebelo se correlacionam

com a ocorrência de TEA, mas não há relação causal neste caso (MINSHEW et al., 1999). Além

disso, alguns fatores que induzem sintomas de autismo em animais estão ausentes em seres

humanos. Em particular, a exclusão do gene do receptor V1a proposto como um dos modelos

51

de autismo em roedores não foi encontrada em pessoas que sofrem de TEA (WASSINK et al.,

2004).

Belzung et al., (2005) mencionaram sete modelos nos quais se manifestam duas

características principais do TEA (distúrbios das inter-relações sociais e estereotipicidade /

rigidez cognitiva): modelos baseados nos efeitos pré-natais da 5-metoxitriptamina (5-MT)

(AZMITIA et al., 1999) e do ácido valpróico (FOLEY et al., 2012), três modelos de distúrbios

pós-natais iniciais, porquinhos-da-índia da linha GS e ratos infectados neonatalmente pelo vírus

Bourne (PLETNIKOV et al., 2002). Oito outros modelos foram qualificados na mesma

publicação que os válidos para modelar sintomas específicos do autismo. A terceira

característica da tríade autista (distúrbios da comunicação social) é difícil de modelar porque a

especificidade do fenômeno da fala, típico apenas dos seres humanos, cria dificuldades cruciais

definidas (CRAWLEY et al., 2000).

Modelos de lesões anatômicas são há muito utilizados para isolar regiões cerebrais

envolvidas nas vias patológicas de uma série de distúrbios neurológicos. No caso do autismo,

no entanto, danos cerebrais induzidos por uma lesão química ou eletrolítica grossa de regiões

específicas não foram capazes nem remotamente replicar TEA humano. A complexidade do

desenvolvimento humano e a heterogeneidade encontrada nos fenótipos do TEA poderia talvez

ser duas das principais razões que dificultam muito a recapitulação do TEA neste tipo de lesão

de modelos pós-natal. Além disso, as deficiências encontradas no TEA não são prováveis estar

enraizada apenas em um único circuito neural ou região cerebral (KIM et al., 2016).

Existem dois tipos de modelos animais produzidos pela exposição perinatal de

roedores ao ácido valpróico (AVP). Roedores expostos ao AV no dia embrionário (E) 12 têm

sido usados como modelo animal para o autismo, caracterizado por comportamento social

prejudicado, ansiedade aumentada e diminuição da sensibilidade à dor após a maturidade

(MARKRAM et al., 2008; SCHNEIDER et al., 2007, 2008). Por outro lado, roedores expostos

ao AVP no 14ª dia pós-nascimento têm sido usados como modelo animal para o autismo

regressivo, que mostra comportamentos sociais prejudicados, como modelos animais para o

autismo, mas acompanhados pela perda de algumas habilidades adquiridas (YOCHUM et al.,

2008, 2010; WAGNER et al., 2006). O modelo de autismo regressivo também mostrou

ansiedade aumentada em nosso estudo preliminar (ATSUKO et al., 2013).

Wang et al., (2016) citam em sua pesquisa que roedores que receberam AVP no 14ª

dia pós-natal mostraram comportamentos relacionados à ansiedade e menos interações sociais

(OGUCHI et al., 2013; YOCHUM et al., 2008). Foi relatado que os filhotes de ratos que

receberam injeções diárias de AVP no 6ª dia embrionário por um período máximo de 2 semanas

52

exibiram um comportamento social reduzido, juntamente com hipertrofia cortical e

propriedades eletrofisiológicas do tipo adulto em 40% dos neurônios localizados no córtex de

associação temporal (CHOMIAK et al., 2010). Dado que os déficits induzidos pela exposição

pré-natal ou pós-natal ao AVP em roedores são semelhantes aos sintomas observados em

crianças com exposição ao AVP no útero ou com autismo, a exposição de roedores ao AVP no

momento crítico do desenvolvimento do cérebro é considerada o modelo animal com o uso de

valproato fetal (WILLIAMS et al., 2001) e autismo regressivo (OGUCHI et al., 2013). No

entanto, pouca informação está disponível sobre a associação de alterações moleculares e

celulares no hipocampo e na amígdala com o desenvolvimento de distúrbios comportamentais,

quando experiências adversas de vida precoce ocorrem no momento do pico do crescimento

cerebral que pode ser encontrado ao nascimento em humanos e 7ª dia embrionário em ratos

(SEMPLE et al., 2013).

1.2.4 Áreas cerebrais estudadas

O cérebro de uma pessoa com autismo apresenta falha de comunicação entre os

neurônios, dificultando o processamento de informações. Apresenta alterações principalmente

no corpo caloso, que é responsável por facilitar a comunicação entre os dois hemisférios do

cérebro, a amígdala, responsável pelo comportamento social e emocional e o cerebelo, que está

envolvido com as atividades motoras, como o equilíbrio e a coordenação.

Moraes et al., (2014) descrevem as principais alterações no cérebro autista da

seguinte forma:

Hipocampo: é uma estrutura alinhada a formação da memória. É uma área de

armazenamento e formação de memórias de longo prazo (STEPHAN et al., 1983). Crianças

com autismo, com ou sem retardo mental, apresentam um maior volume do hipocampo direito

do que não autistas (NACEWICZ et al., 2006 apud MORAES et al., 2014).

Amígdala: é uma estrutura complexa adjacente ao hipocampo, envolvida no

processamento de emoções e do medo, coordena respostas fisiológicas com base nas

informações cognitivas, isso porque ela liga áreas do córtex com o sistema hipotalâmico e os

sistemas do tronco encefálico que coordenam respostas metabólicas (MAREN et al., 2005). A

amígdala em crianças com autismo é inicialmente maior, entretanto, não continua a crescer com

o desenvolvimento da idade, como é com os não autistas. Foi encontrado também correlação

entre o volume da amígdala e a gravidade do quadro clínico (NACEWICZ, et al 2006; POLŠEK

et al., 2011 apud MORAES, 2014).

53

Córtex pré-frontal: é uma área importante para diversas funções. É uma parte

crítica do sistema executivo que se refere à capacidade de planejar, raciocinar e julgar. Está

envolvido também no desenvolvimento da personalidade, nas emoções e na capacidade de

exercer avaliação e controle adequado dos comportamentos sociais (FUSTER et al., 2008). Os

padrões de maturação do córtex pré-frontal em crianças autistas é mais lento, o que é consistente

com o desempenho cognitivo dos mesmos (SIQUEIRA et al., 2016).

Cerebelo: Anormalidades anatômicas do cerebelo foram amplamente observados

em pacientes com autismo (BAUMAN; KEMPER, 1985). As anormalidades relatadas incluem

hipoplasia dos lóbulos verticais cerebelares VI e VII (COURCHESNE et al., 1994), que foram

negativamente correlacionados com o aumento de comportamentos repetitivos e

comportamento exploratório diminuído em crianças com autismo (PIERCE; COURCHESNE,

2001). Uma ampla revisão foi publicada explicando os fatores patológicos envolvimento do

cerebelo no desenvolvimento do autismo, onde foi destacado que em algumas pessoas com

TEA, existem anormalidades cerebelares que apresentam defeitos anatômicos, inflamação,

estresse oxidativo, anormal neurotransmissores e níveis de proteínas e relacionados ao cerebelo

comprometimentos motores e cognitivos (FATEMI et al., 2012).

1.3 Ácidos Graxos Poliinstaurados

Óleos: Ômega 9 (oléico), Ômega 6 (linoléico) e Ômega 3 (docosahexaenóico,

eicosapentaenóico e linolênico)

Esses óleos são ácidos graxos (AG) que são inicialmente isolados de fontes naturais,

principalmente de lipídios, e são ácidos carboxílicos monocarboxílicos que podem ser

representados pela forma RCOOH (na maioria das vezes o agrupamento R é uma cadeia

carbônica) e são classificados de acordo com: o tamanho da cadeia hidrocarbônica (curta – até

quatro átomos de carbono; média – de seis a dez átomos de carbono; e longa – mais de dez

átomos de carbono); presença de insaturações - ligações duplas entre átomos da cadeia R -

(saturados – não possuem insaturações na cadeia hidrocarbônica; insaturados – possuem

insaturações) e quantidade de insaturações (monoinsaturadas – apenas uma ligação dupla;

poliinsaturadas – duas ou mais ligações duplas) (DAHELE et al., 2006). Sendo assim os óleos

ômega em estudo estão classificados conforme o Quadro 1.

54

Classe Nome sistemático Nome comum Carbonos* Duplas ligações**

Ômega-3 Docosahexaenóico DHA 22 6

Ômega-3 Eicosapentaenóico EPA 20 5

Ômega-3 Octadecatrienóico Linolênico 18 3

Ômega-6 Octadecadienóico Linoleico 18 2

Ômega-9 Octadecenóico Oleico 18 1*

Quadro 1 – Classificação dos óleos ômega.

Fonte: Campelo (2018). Legenda: * Número de Carbonos, ** Número de Duplas ligações, # Monoinsaturado.

Os ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) são ácidos graxos categorizados em

vários grupos de acordo com a estrutura química e a posição da primeira dupla ligação contada

a partir do terminal metil; ômega-3 (n-3), n-6, n-7 e n-9 (BERG et al., 2007; GÓMEZ et al.,

2011; ANDERSON et al., 2009) (Figura 4). Os componentes mais importantes são os ácidos

graxos essenciais: ácido linoléico, ômega-6 (w-6 – LA) e ácido alfa-linolênico, ômega-3 (w-3

– ALA) que devem ser ingeridos obrigatoriamente por meio da dieta ou suplementação por não

poderem ser sintetizados pelo organismo (BERG et al., 2007; SURETTE et al., 2008; GÓMEZ

et al., 2011). Estes últimos compartilham das mesmas vias metabólicas e oxidativas; no entanto,

os seus produtos metabólicos finais têm efeitos fisiológicos antagônicos (COOK et al., 2004).

Figura 4 – Estrutura dos ácidos graxos insaturados.

Fonte: Gowdak, et al. 2015

Os ácidos graxos essenciais (AGEs) são obtidos de plantas ou outros organismos

que possuem vias enzimáticas para sua síntese. Os AGEs são, portanto, nutrientes dietéticos

essenciais para a sobrevivência de humanos e outros mamíferos devido à ausência das enzimas

55

dessaturase (∆) 12 e ∆ 15 necessárias para inserir uma ligação dupla na posição n ω-6 ou -3 de

uma cadeia de carbono de ácidos graxos (INNIS et al., 2003).

Após serem consumidos exogenamente (dieta ou suplementação), o LA e o ALA

são metabolizados no fígado pelas enzimas ∆6 e ∆5 dessaturases para gerar PUFAs de cadeia

longa (LCPUFAs) como ácido araquidônico (AA, 20:4, ω-6), ácido eicosapentaenóico (EPA,

20:5, ω-3) e ácido docosahexaenóico (DHA, 22:6, ω-3). Os produtos metabólicos enzimáticos

de 20 LCPUFAs de carbono são chamados eicosanóides e incluem as prostaglandinas,

tromboxanos e leucotrienos (Figura 5): em geral, os eicosanóides derivados do AA têm

principalmente propriedades pró-inflamatórias, enquanto os eicosanóides derivados do EPA

são anti-inflamatórios (KIECOLT et al., 2003).

Figura 5 – Processos de dessaturação e elongação do ômega-3 e ômega-6 e consequente geração de compostos bioativos. Fonte: Adaptado: Verma, O.P. Flaxseed - Miraculous Anti-ageing Divine Food M.B.B.S.,M.R.S.H. (London) President, Flax Awareness Society 7-B-43, Mahaveer Nagar III, Kota (Raj.) Published in Dr India April, 2013.

Além disso, outros autores identificaram um novo grupo de mediadores

denominados resolvinas das séries E e D, formados a partir de EPA e DHA, respectivamente.

Juntamente com a neuroprotectina D1 formada a partir de DHA por várias reações, esses

mediadores parecem exercer fortes efeitos de resolução da inflamação (KIECOLT et al., 2003).

Isso sugere que os LCPUFAs formam precursores de moléculas pró e anti-inflamatórias, e o

56

equilíbrio entre esses compostos mutuamente antagônicos pode determinar o resultado final do

processo da doença (DAS et al., 2006).

O ácido ômega-3 docosahexaenóico (DHA) e o ácido eicosapentaenóico (EPA),

além do ácido ômega-6 araquidônico (AA), são três LC-PUFAs de particular importância para

o desenvolvimento e funcionamento ideal do cérebro, com efeitos independentes e

compartilhados (DYALL et al., 2015), são incorporados aos fosfolipídios da membrana e a

incorporação do DHA ocorre em níveis excepcionalmente altos no sistema nervoso central

(LAURITZEN et al., 2016).

Esse aumento no cérebro inicia-se durante o surto de crescimento cerebral no

estágio intra-uterino, particularmente no último trimestre do desenvolvimento fetal e continua

até os dois anos de idade (CARVER et al., 2001), quando o cérebro da criança sofre um rápido

aumento no crescimento e proliferação celular, atingindo 80% do seu tamanho adulto

(CLAYOTN et al., 2001). Durante esse período, conhecido como "surto de crescimento

cerebral", há um aumento de aproximadamente 30 vezes no conteúdo de DHA (LAURITZEN

et al., 2001). Durante a infância, o DHA continua a se acumular no cérebro, em associação com

a maturação da substância cinzenta do córtex frontal (McNAMARA et al., 2015).

O suprimento intrauterino de PUFAs ocorre através de ácidos graxos polinsaturados

não esterificado, derivado principalmente da circulação materna através da placenta

(HERRERA et al., 2002). O aumento pós-natal de LCPUFAs nos tecidos infantis é suportado

pela transferência materna de LCPUFAs através do leite materno, e os níveis sanguíneos de

LCPUFAs em bebês amamentados permanecem mais elevados do que os níveis maternos por

algum tempo após o nascimento (IORGENSEN et al., 2006).

Comparado ao DHA, a concentração de EPA nos fosfolipídios cerebrais é

tipicamente 250 a 300 vezes menor (DYALL et al., 2015). No entanto, o EPA, mas não o DHA,

é um precursor dos eicosanóides das séries 3 e 5, que são mediadores lipídicos capazes de

promover efeitos benéficos, como anti-inflamação, vasodilatação e anti-agregação. A

biossíntese de eicosanóides derivados do EPA requer as enzimas ciclooxigenases (COX) e

lipoxigenases (LOX). Essas mesmas enzimas também estão envolvidas na formação dos

eicosanóides das séries 2 e 4 derivados do AA que tem principalmente efeitos pró-inflamatórios

e pró-agregadores (BAZINET et al., 2014; SCHUCHARDT et al., 2010). Consequentemente,

à medida que mais EPA está presente nas membranas celulares, menos quantidade de enzima

estará disponível para converter o AA em eicosanóides pró-inflamatórios. A razão AA / EPA

é, portanto, considerada um importante indicador de inflamação celular e a EPA pode atuar

como modulador da inflamação nos tecidos cerebrais (SONG et al., 2016). Por outro lado,

57

devido ao seu maior tamanho espacial, o DHA é um substrato pobre para as enzimas COX e

LOX (SONG et al., 2016). O DHA, no entanto, também pode exercer efeitos anti-inflamatórios

através da produção dos 'Mediadores Especializados em Pro-resolução', uma classe

recentemente identificada de mediadores lipídicos que evitam a inflamação excessiva e

promovem a resolução ativa das respostas inflamatórias (MOZAFFTARIAN et al., 2012).

Metabolizados pela ciclooxigenase (COX) e 5-lipoxigenase (5-LOX), os

eicosanoides NBR 6023:2018 (prostaglandinas, tromboxanas e leucotrienos) medeiam reações

inflamatórias (TASSONI et al., 2008). Os PUFAS disponibilizam precursores para a síntese de

prostaglandinas e modulam e expressão de enzimas fundamentais para o metabolismo destes

eicosanóides, bem como de esteróides (TRAN et al., 2016). De acordo com Xu et al., (2017),

uma razão DHA/EPA baixa na dieta, ocasiona efeitos inibitórios sobre a estereoidogênese

gonadal.

O DHA é o PUFA mais abundante nas membranas celulares fotorreceptoras da

retina e na substância cinzenta do cérebro, representando 15-20% da composição total de ácidos

graxos no córtex frontal (FLIESLER et al., 1983; MCNAMARA et al., 2015). Assim, o DHA

provavelmente está envolvido em funções executivas, como planejamento, atenção concentrada

e regulação comportamental, conhecidas por estarem localizadas principalmente no lobo frontal

(TESEI et al., 2016).

O AG ômega-9 (ácido oléico) confere proteção contra a peroxidação lipídica

diferente dos ácidos graxos polinsaturados como linolênico, EPA, DHA que contêm 4, 5 e 6

duplas ligações respectivamente são muito menos estáveis (CURI et al., 2002). O uso de

formulações ricas em lipídios na forma monoinsaturada, comparado ao uso de poliinsaturados

evidenciou menor resposta inflamatória e menor produção de radicais livres com fórmula rica

em monoinsaturados (CURI et al., 2002).

Sabe-se que existe uma comorbidade significativa dentre os que apresentam

Transtorno do espectro do autismo (TEA), distúrbio de déficit de atenção / hiperatividade

(TDAH), dificuldade de aprendizagem (LD) e deficiência intelectual (DI). Dentre os distúrbios

neurodesenvolvimentais mais comuns nestes indivíduos acometidos, e que todos eles têm um

componente herdável, foi levantada a hipótese de que distúrbios neurodesenvolvimentais e

psiquiátricos podem compartilhar fatores de risco no nível de predisposição biológica

(RICHARDSON et al., 2006).

Estudar alterações na composição dos PUFAs e a relação dos seus mediadores pode

ser uma estratégia importante para entender a fisiopatologia dos distúrbios do espectro do

autismo (TEA) (WONG et al., 2014). Especificamente, nos últimos 15 anos, foi dado

58

considerável interesse ao papel potencial das deficiências de ácidos graxos poliinsaturados

(PUFA) para a compreensão patogênica desses distúrbios e, posteriormente, ao possível papel

dos PUFAs como adjuvantes ao tratamento farmacológico (TESEI et al., 2017).

Devido aos seus efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios, o ômega-3 foi estudado

nessas doenças. Atua na formação da bainha de mielina, no desempenho cognitivo e na

comunicação entre células neurais. Também está presente na ação vasodilatadora e, portanto,

aumenta o suprimento de oxigênio e nutrientes ao sistema nervoso central (SNC) (MANKAD

et al., 2015; EL-ANSARY et al., 2014).

Considerando a semelhança entre epilepsia e TEA, a suplementação de PUFA

ômega-3 na dieta pode levar a uma melhora dos sintomas dessa síndrome (JAMES et al., 2011).

A suplementação com PUFA ômega-3 foi estudada no tratamento de distúrbios neurológicos

como o TEA, que não é considerado uma doença única, mas está associado a várias etiologias

e graus variados de gravidade. O TEA é caracterizado por alterações comportamentais, déficits

de linguagem e cognição, deficiências intelectuais em 70% dos casos e convulsões em 30%

(VALVO et al., 2013). O estudo em modelos animais de epilepsia com suplementação de EPA

e DHA permitiu que as doses de tratamento farmacológico fossem reduzidas na fase de

manutenção da doença, reduzindo as convulsões do hipotámo (MUSTO et al., 2011).

As membranas neuronais, constituídas principalente por AGPIs ômega-3, modulam

inúmeras vias e mecanismos biológicos, dentre os quais a fluidez de membrana da

neuroinflamação, apoptose e senescência, expressão gênica, função e plasticidade sináptica

(ABEDI; SAHARI, 2014).

1.4 Testes Comportamentais em Modelo Animal versus Sinais do TEA

A tentativa de modelar distúrbios neuropsiquiátricos, como o TEA, em roedores é

extremamente desafiadora, porque os comportamentos equivalentes aos dos roedores como

comunicação social e dos fenômenos mentais que caracterizam o TEA são muito limitados e

não existem biomarcadores validados para roedores com TEA. Por exemplo, fenômenos como

ecolalia, reversão de pronome, fala metafórica e comprometimentos pragmáticos não têm

equivalência com os roedores. Da mesma forma, deficiências na comunicação não verbal e

fenômenos mentais como reconhecimento de emoções e 'mentalização' não são passíveis de

modelagem. Além disso, embora modelos animais possam exibir vários fenômenos em testes

comportamentais que são pensados para se assemelhar aos recursos do autismo, eles não são

necessariamente equivalentes às deficiências relatadas em humanos (TAKUMI et al., 2019).

59

Para que modelos animais em doenças humanas sejam considerados precisos, deve

haver uma avaliação de três tipos de validade (BAKER et al., 2011; SILVERMAN et al., 2010).

Primeiro, a validade de construção exige que tudo o que causa sintomas no animal seja o mesmo

que caracterize a doença em humanos. Segundo, a validade da face requer que os sintomas em

um modelo animal espelhem os do paciente humano. Terceiro, a validade preditiva avalia se o

animal responde às drogas de uma maneira que corresponde às reações humanas; no entanto,

para o autismo, não existem drogas eficazes que sirvam como controle positivo.

Para estimativa de manifestações externas de distúrbios em modelos animais de

autismo, certas técnicas de teste de comportamento são utilizadas. Testes clássicos universais

(teste de campo aberto, morris labirinto de água, labirinto tipo T, labirinto radial, de Skinner

câmara) são métodos para a detecção de características dos distúrbios autistas. Frequentemente,

o comportamento do animal é observado em condições em que esses animais são mantidos em

ambientes que possam se adapatar, imediatamente nas gaiolas onde eles geralmente vivem.

Combinação e modificação de certas técnicas são convenientes; permitindo que os avaliadores

possam fornecer uma completa avaliação detalhada das manifestações fenotípicas nos

respectivos modelos (HRABOVSKA et al., 2016).

Em crianças, a exposição pré-natal ao ácido valpróico anticonvulsivante (AVP)

pode aumentar em até 10 vezes o risco de desenvolver TEA (RASALAM et al., 2005). Apoiada

por essa evidência clínica, a administração pré-natal de AVP no 12,5ª dia gestacional, e 14ª dia

pós-natal tem sido amplamente utilizada com um modelo de roedor de TEA (RIBEIRO et al.,

2020).

Os animais com modelo de autismo mostram uma redução na sociabilidade

(LUCCHINA; DEPINO, 2014) e comportamentos estereotipados aumentados (SCHNEIDER

et al., 2008), além disso, apresentam várias alterações celulares e moleculares também

observadas em indivíduos com TEA (LUCCHINA; DEPINDO, 2014). Curiosamente,

diminuição da sociabilidade, aumento de comportamentos repetitivos e comportamentos

relacionados à ansiedade foram observados em machos expostos ao AVP (KIM et al., 2013;

LUCCHINA; DEPINO, 2014; SCHNEIDER et al., 2008), mas não em fêmeas expostas no pré-

natal com AVP (KATAOKA et al., 2013; KIM et al., 2013; SCHNEIDER et al., 2008).

Pode ser observado que vários autores procuram demonstrar através de seus estudos

respostas que possam elucidar em modelos animais, em ratos ou camundongos machos e/ou

fêmeas, os parâmetros clínicos, sinais e sintomas comportamentais mais parecidos com as

possíveis características no indivíduo humano com TEA descritas no DSM V (2013), e desta

60

forma, encontrar meios de amenizar e/ou diminuir as respostas negativas que impossibilitam

estes indivíduos de terem uma independência familiar no futuro.

Tendo em vista a importância do uso de nutracêuticos, estudos que os utilizem

podem vir a ser realizados com o intuito de elucidar formas alternativas ao tratamento para

amenizar os possíveis efeitos da neuroinflamação, do estresse oxidativo, e alguns fatores

epigenéticos do TEA com dietas e/ou suplementos ricos em ácidos graxos poli-insaturados

(AGPI), (PINHEIRO et al., 2011) visando atenuar processos inflamatórios e pró já em curso

(CAMPELO, 2012).

No presente estudo foram utilizadas misturas de óleos em concentrações

nutracêuticas, com alta razão de w-9/w-6 com ação anti-oxidante e baixa razão de w-6/w-3 que

favorece uma ação anti-inflamatória, conforme estudos apresentados em outras situações

biológicas (ALLAYEE; ROTH; RODIS, 2009; SIMOPOULOS 2002, 2008). O uso destas

misturas, por via orogástrica, tem sido implementado após a instalação da lesão (CAMPELO,

2012) ou como pré-condicionante, ou seja, antes da geração do evento, seja ele trauma

(NAKAMURA et al., 2005), isquemia/reperfusão (PINHEIRO et al., 2011) ou indução de

inflamação crônica (VASCONCELOS, 2013).

61

2 OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

Analisar o efeito do nutracêutico de misturas de óleos ômega 3, 6 e 9 para atenuar

as características comportamentais e neuroquímicas do transtorno do espectro autista induzidas

pelo ácido valpróico em modelo experimental.

2.2 Objetivos Específicos

a) Avaliar o efeito dos Mix-1, Mix-2 e Mix-3 nas alterações comportamentais e

locomotoras por meio dos testes de Campo Aberto, Imersão de Cauda, Performance da Natação

e Rota Rod.

b) Analisar o efeito dos Mix-1, Mix-2 e Mix-3 sobre o estresse oxidativo (TBARS), da

relação nitrito/nitrato, e nas alterações da atividade enzimática dos sistemas antioxidantes

(GSH) no hipocampo, córtex pré-frontal, amígdalas e cerebelo de ratos.

c) Investigar o efeito do Mix-3 sobre a expressão dos genes Dnmt3 e Chd2 em amostras

do hipocampo de ratos, através da biologia molecular RT-qPCR.

62

3 MÉTODO

3.1 Aspectos éticos e Animais

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar machos (120 animais) e fêmeas (96

animais) pesando entre 160-260g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do

Ceará - UFC. Os animais acasalados foram mantidos em caixas de polipropileno condicionado

um casal por caixa, e após o nascimento os filhotes foram randomizados de diferentes ninhadas

para aumentar a variabilidade genética, permanecendo com as mães até o desmame com 21 dias

de nascidos (Figura 6). Nesta idade os animais foram separados por sexo e colocados em caixas

com no máximo 07 animais, à temperatura média de 24 ± 2°C em ciclos de alternância

claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão e água ad libitum. Durante todo o

experimento, os animais permaneceram em padrão sanitário controlado, onde foram mantidos

em caixas de polipropileno (50 x 50 cm) forradas com cama de maravalha. As caixas eram

trocadas todas as 2ª e 5ª feiras, bem como o recipiente de água e feito reposição de ração. O

protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da

Universidade Federal do Ceará (UFC) gerando o protocolo registrado com n°16/18. Cada um

dos grupos teve em média seis filhotes selecionados a partir da data do parto, os mesmos

passaram pelo processo de indução do TEA ainda filhotes no 14ª dia pós-nascimento, haja vista

a casuísta da enfermidade dar-se a partir da mais tenra infância.

Figura 6 – Animal com filhotes no biotério.

Fonte: Autora.

63

O protocolo experimental foi elaborado de acordo com o “Guia para Cuidados e

Uso de Animais de Laboratório” da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

(SBCAL) e previamente submetido ao Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFC

Campus Sobral. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número e o sofrimento dos

animais utilizados.

3.2 Drogas e soluções

A suplementação anti-inflamatória e antioxidante foi preparada e armazenada

dentro do laboratório de neurofisiologia da Faculdade de Medicina Campus de Sobral. Os óleos

para elaboração: Mix-1 (ácido graxo linolênico–ALA), Mix-2 (ALA (35%) + ácido graxo

eicosapentaenoico (EPA–39%) + ácido graxo docosahexaenóico (DHA–26%) e Mix-3 (ALA-

84% + DHA-16%). A mistura destes Mixs foi desenvolvida e patenteada a partir de uma junção

de gorduras com características antioxidantes e antinflamatória estudadas em pesquisas com

ratos e camundongos sob orientação do pesquisador (VASCONCELOS, 2013). Os óelos foram

adquiridos no mercado local “lojas de suplementação e nutrição”. Para preparação destes mixes,

os óleos foram pesados utilizando uma balança analítica da marca METTLER TOLEDO 10 mg

a 52g, d = 0,0001g com calibração automática, e adicionados em um vidro escuro de 25 ml com

tampa e imediatamente armazenados sob refrigeração 20 a 24 graus (Figura 7).

Gorduras insaturadas

Figura 7 – Produção dos Mix-1, Mix-2 e Mix-3.

Fonte: Autora.

Mix-1 Mix-2 Mix-3

Balanças

Mixs prepara

Beckerrrr

Armazenamento dos Mixs

64

3.3 Delineamento Experimental

3.3.1 Distribuição dos Grupos de Estudo

O modelo de autismo foi induzido por injeção s.c. de AVP no dia 14ª dia pós-

nascimento seguido de terapia de suplementação de gordura ricas em ácidos graxos insaturados

distribuídos em Mix-1 (óleo de canola, óleo de girassol, óleo de linhaça – ALA (ácido graxo

linolênico), Mix-2 (óleo de canola, óleo de girassol, óleo de peixe – ALA (35%) + EPA (ácido

graxo eixopentaenóico – 39%) e Mix-3 (óleo de canola, óleo de girassol, óleo puro de algas

(DHA – ácido graxo docosahexaenóico – 16%) e ALA (84%). Os filhotes foram avaliados e

acompanhados quanto ao risco e/ou aparecimento de enfermidades pós-natal e alterações

comportamentais até 50ª dia pós-nascimento (Figura 8). No 55ª dia pós-nascimento, os animais

foram eutanasiados e as áreas cerebrais (hipocampo, córtex pré-frontal, amígdalas e cerebelo)

extraídas sem danos. Os tecidos cerebrais coletados foram utilizados para as determinações de

alterações bioquímicas, marcadores de estresse oxidativo, marcadores inflamatórios e

expressão gênica.

A droga AVP (Valproato de Sódio 250 ml) “DEPAKENE” foi adquirida no

mercado local (farmácias) e armazenada sob refrigeração. Abaixo podemos analisar as etapas

do delineamento experimental em várias etapas.

Figura 8 – Esquema do delineamento experimental

Fonte: Autora. Legenda: DPN (dia pós-natal); VPA (ácido valpróico).

Nascimento

Dia 1

Indução do modelo com VPA

14 DPN 15 DPN 40 DPN

50 DPN

55 DPN

Suplementação com mix (durante 25 dias)

30 DPN

32 DPN

Teste da imersão da

calda

Teste da natação

Teste do rotarod

24 DPN

Teste do campo aberto

Coleta de sangue

65

3.3.2 Tratamentos dos grupos experimentais

Os Mix-1, Mix-2 e Mix-3 (Figura 09, 10 e 11 - respectivamente), foram

administrados no 15ª dia pós-nascimento por um período de 25 dias na dose de 1,2 ml /kg p.o

consecutivos (conforme cronograma experimental – Figura 8) - tendo em vista que essa é a

dosagem nutracêutica já estabelecida na literatura em pesquisas prévias (MELO et al., 2014;

MELO et al., 2017), sempre no mesmo horário 24/24h por via orogástrica com ajuda de uma

cânula de inox (Figura 12). Essas doses diárias de 1,2g /kg/dia estavam distribuídas nos mixs

na proporção de 1,4:1 de ω-6/ω-3 (efeito anti-inflamatório) e de 3,7:1 de ω-9/ω-6 (efeito

antioxidante). O que diferencia os grupos tratados são as distintas fontes de ω-3: ALA, EPA e

DHA, provenientes de óleo de linhaça, óleo de peixe e algas, conforme esquematizados abaixo:

Figura 9 – Soluções e composição com as respectivas fontes de w3 (MIX 1)

Fonte: Autora. Legenda: ALA = ácido α-linolênico;

Figura 10 – Soluções e composição com as respectivas fontes de w3 (MIX 2)

Fonte: Autora. Legenda: ALA = ácido α-linolênico; EPA = ácido eicosapentaenoico; DHA =

ácido docosahexaenóico.

Fonte de W-3

Proporção

Composição

Solução MIX 1

Óleo de canola

Óleo de girassol

w-6: w-3 = 1,4:1

w-9: w-6= 3,7:1

ALA

Óleo de linhaça

Fonte de W-3

Proporção

Composição

Solução MIX 2

Óleo de canola

Óleo de girassol

w-6: w-3 = 1,4:1

w-9: w-6 = 3,7:1

ALA (35%) EPA (39%) DHA (26%)

Óleo de peixe

66

Figura 11 – Soluções e composição com as respectivas fontes de w3 (MIX 3)

Fonte: Autora. Legenda: ALA = ácido α-linolênico; DHA = ácido docosahexaenóico.

3.3.3 Divisão dos Grupos de Estudo e Análises Experimentais

Os grupos serão separados e selecionadas da seguinte forma:

• Grupo I (Controle Sham 0,9% Salina normal p.o.)

• Grupo II (Controlo Positivo, VPA 400 mg / kg s.c)

• Grupo III (MIX-1, 1,2 ml / kg p.o.)

• Grupo IV (MIX-2, 1,2 ml / kg p.o.)

• Grupo V (MIX-3, 1,2 ml / kg p.o)

• Grupo VI (VPA + MIX-1 400 mg / kg + 1,2 ml / kg p.o.)

• Grupo VII (VPA + MIX-2 400 mg / kg + 1,2 ml / kg p.o.)

• Grupo VIII (VPA + MIX-3 400 mg/ kg + 1,2 ml/kg p.o.)

Abaixo encontra descriminado o protocolo do tratamento experimental para

compreender a distribuição do número de animais por sexo utilizado em cada etapa:

comportamental, parâmetros neuroquímicos e da expressão gênica utilizado neste estudo

(Quadro 2). Em seguida (Quadro 3), um esboço esquematizando a divisão dos grupos

experimentais, tipo de tratamento recebido durante 25 dias, bem como a via de administração

das gorduras antioxidantes e anti-inflamatórias por meio dos mixs e dose do “Ácido Valpróico

- AVP” no modelo do animal com autismo.

Fonte de W-3

Proporção

Composição

Solução MIX 3

Óleo de canola

Óleo de girassol

w-6: w-3 = 1,4:1

w-9: w-6 = 3,7:1

ALA (84%) DHA (16%)

DHA puro de algas

67

Sham VPA MIX-1 MIX-2 MIX-3 MIX-1 +VPA

MIX-2 +VPA

MIX-3 +VPA

Dosagens Total

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 Animais

TBARS NITRITO

48

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais

6 animais GSH

48

TOTAL DE MACHOS E FÊMEAS 192

7 animais

6 animais

- - 6

animais - -

6 animais

Chd2 Dnmt3a

25

TOTAL DE RATOS NO ESTUDO 217

Quadro 2 – Protocolo de Tratamento Experimental (FÊMAS - 96 animais) e MACHOS (121

animais), tipo de dosagens analisada.

Fonte: Autora.

GRUPOS EXPERIMENTAIS

M E F TRATAMENTO

DOSE (/KG)

VIA DE

ADM.

DURAÇÃO DO TRATAMENTO

(DIAS)

SHAM 0,9% Salina 0,9% 0 Oral 25 dias

AVP Ácido Valpróico (DEPAKENE)

400 mg s.c. 1 dia

MIX-1

Ω 9 + Ω 6 + Ω 3 Óleo de canola Óleo de girassol rico em oleico Óleo de linhaça

1,2 mg Oral 25 dias

MIX-2

Ω9 + Ω6 + Ω3 Óleo de canola Óleo de girassol rico em oleico Óleo de peixe

1,2 mg Oral 25 dias

MIX-3

Ω-9 + Ω-6 + Ω-3 Óleo de canola Óleo de girassol rico em oleico DHA puro de algas

1,2 mg Oral 25 dias

MIX-1 + AVP MIX-1 + Ácido Valpróico 1,2mg + 400mg

s.c oral

25 dias

Continua

Conclusão

68

GRUPOS EXPERIMENTAIS

M E F TRATAMENTO

DOSE (/KG)

VIA DE

ADM.

DURAÇÃO DO TRATAMENTO

(DIAS)

MIX-2 + AVP MIX-2 + Ácido Valpróico 1,2mg + 400mg

s.c oral 25 dias

MIX-3 + AVP MIX-3 + Ácido Valpróico 1,2mg + 400mg

s.c oral

25 dias

Quadro 3 – Protocolo de Tratamento Experimental (Droga + Dieta)

Fonte: Autora.

peso do animal

MIX 1/ MIX2 / MIX 3 X = P.1,2g / 968

volume administrado

Figura 12 – Quantidade de solução lipídica infundida diariamente

Fonte: Autora.

3.4 Testes Comportamentais

Os testes comportamentais foram realizados conforme esquema citado a seguir.

Antes de qualquer um dos procedimentos de avaliação comportamental, os animais eram

levados em suas caixas ao laboratório de fisiologia com 30 minutos de antecedência –

representando o período de habituação para que não houvesse interferências do ambiente. A

sala de comportamento ficava dentro dos acessos deste laboratório, onde antes de iniciar cada

teste, os animais eram deslocados individualemente. Todos os equipamentos e utensílios dos

testes comportamentais (Campo aberto e Rota road) foram limpos com álcool 70% após o teste

de cada animal, impedindo a permanência de odores.

Peso do Animal

Volume Administrado

69

• TESTE DE CAMPO ABERTO = 24ª dia pós-nascimento

• TESTE DE IMERSÃO EM CAUDA = 30ª dia pós-nascimento

• TESTE DE PERFORMANCE = 32ª dia pós-nascimento

• TESTE ROTA ROAD = 50ª dia pós-nascimento

3.4.1 Atividade Locomotora (Campo Aberto)

Este experimento foi realizado a fim de testar a atividade exploratória do animal

baseado na metodologia validada por Archer (1973) no 24ª dia pós-nascimento (Figura 13). Os

ratos foram colocados individualmente após o período de habituação, em um campo aberto com

área de 50 x 50 cm e em ambiente iluminado por uma luz vermelha. Este campo era

confeccionado em madeira com fundo preto, dividida em nove quadrantes iguais. Os animais

foram previamente habituados durante 1 minuto e, posteriormente, observados por 5 minutos

onde estava sendo observados e avaliado:

Locomoção: foram avaliados a frequência de cruzamentos (número de vezes eu o

animal cruzou as divisões marcadas no chão), uma medida de atividade exploratória.

Tempo parado nos quadrados: foi avaliado o tempo de permanência que o animal

ficou imóvel, um parâmetro de ansiedade.

Atividade de levantar (rearings): foi avaliada a frequência (número total de vezes

que o animal levantou sobre as patas dianteira e movimentou a cabeça numa postura típica de

orientação em um ambiente novo – Figura 13) (SILVEIRA et al., 2005).

Atividade de limpeza (grooming): é a atividade de esfregar o corpo com as patas ou

boca e esfregar a cabeça com as patas, num comportamento característico de limpeza (Figura

13). Foi contabilizado a quantidade de vezes que o animal ficou realizando esse comportamento

(HSIAO et al., 2012).

70

Figura 13 – Análise comportamental dos animais pelo Teste Campo Aberto.

Fonte: Autora. Figura criada na plataforma "Mind the Graph", disponível em: www.mindthegraph.com.

3.4.2 Teste de imersão na cauda

Neste modelo, um estímulo térmico entre 50º a 55ºC aplicado à cauda de ratos

desencadeia o reflexo da retirada da mesma por flexão predominantemente em direção rostral.

Etapa conhecida como efeito antinocicepção, sendo realizado no 30ª dia pós-nascimento

(Figura 14).

A avaliação das respostas é feita por meio da medida do lapso de tempo entre a

aplicação do estímulo térmico e o momento de afastamento da cauda da fonte de calor

(CARTENS et al., 1993). Esse modelo permite obter informações sobre o mecanismo e o local

da atividade antinociceptiva detectada, uma vez que o parâmetro avaliado, ou seja, o reflexo de

retirada da cauda, é de integração medular.

O teste foi realizado por meio da imersão do terço inferior da cauda dos animais em

água aquecida à 55°C, seguida da anotação do tempo de reação ao estímulo, através da

filmagem em câmera de celular. Este teste comportamental se baseia na premissa que a imersão

da cauda do animal na água provoca um movimento abrupto da cauda e, por vezes, o recuo de

todo o corpo; sendo o tempo de reação monitorado (SOUZA et al., 2014).

71

Figura 14 – Análise comportamental dos animais pelo método Imersão em Cauda.

Fonte: Autora. Figura criada na plataforma "Mind the Graph", disponível em: www.mindthegraph.com.

3.4.3 Teste de Performance de Natação

Em um recipiente cheio de água (28–29°C) os animais foram submetidos ao teste

de performance no 32ª dia pós-nascimento (Figura 15). Cada animal foi colocado no centro do

recipiente e avaliado por 10 segundos. A natação e o desempenho foram avaliados de acordo

com a posição do nariz e cabeça (ângulo) na superfície da água.

O ângulo da natação foi caracterizado da seguinte forma: 0 - cabeça e nariz abaixo

da superfície, 1- o nariz abaixo da superfície, 2- o nariz e topo da cabeça ou acima da superfície,

mas as orelhas ainda abaixo da superfície, 3- o mesmo que dois, exceto que a linha de água

esteja em nível do ouvido médio, e 4 o mesmo que três, exceto que a linha de água esteja no

fundo das orelhas. A natação avalia o desenvolvimento motor e consolidação de respostas de

reflexos coordenados (SCHAPIRO et al., 1970).

72

Figura 15 – Análise comportamental dos animais pelo método performance da natação. Fonte: Autora. Figura criada na plataforma "Mind the Graph", disponível em: www.mindthegraph.com.

3.4.4 Teste do rotarod

Este teste foi realizado no 50ª dia pós-nascimento para avaliar os aspectos de

coordenação e equilíbrio do desempenho motor em todos os grupos estudados. O aparelho

consiste em uma barra giratória com 3 cm de diâmetro presa a um motor com a velocidade

ajustada para 40 rpm, esquematizado na Figura 16. Os filhotes foram colocados

individualmente na barra giratória e observado o tempo gasto para permanecer sem cair bem

como a velocidade medida em RPM na barra giratória, tendo 300 segundos como o tempo de

corte (BHOSALE et al., 2011).

Para realização deste teste foi utilizado um período de adaptação (pré-teste) 48

horas antes do dia 50ª, seguindo o mesmo protocolo.

73

Figura 16 – Representação esquemática do teste comportamental Rotarod. Dois dias antes do

teste, os animais foram adaptados ao aparato por meio da permanência neste por 300 segundos

com baixa velocidade inicial, gradualmente crescente (4 a 15 RPM). No dia do teste, foi

utilizada a velocidade crescente de 4 a 40 RPM com duração máxima de 300 segundos. Foram

avaliados os seguintes parâmetros: Tempo de Latência (tempo até a primeira queda) e Tempo

Fonte: Autora. Figura criada na plataforma "Mind the Graph", disponível em: www.mindthegraph.com.

3.4.5 Dissecação das áreas cerebrais e descarte dos animais

Os animais após todas as determinações comportamentais no 55ª dia pós-

nascimento foram eutanasiados por guilhotina dentro do laboratório de

Fisiologia/Neurociência. Em seguida, os encéfalos foram rapidamente removidos e colocados

sobre papel alumínio em uma placa de Petri contendo gelo, seguido de dissecação das áreas

cerebrais a serem estudadas.

O hipocampo (HC), córtex pré-frontal (CPF), amígdalas e cerebelo, foram isolados

das demais áreas do encéfalo por divulsionamento com auxílio de uma pinça de

microdissecação. Cada área foi pesada, armazenada e identificadas em papel alumínio e

conservada a -80ºC até sua análise. As carcaças dos animais foram acondicionadas em sacos

plásticos, armazenadas em freezer e posteriormente o descarte ocorreu sob responsabilidade do

Biotério da Universidade Federal do Ceará/Campus Sobral.

74

3.5 Avaliação Neuroquímica

3.5.1 Determinação da peroxidação lipídica por medição do conteúdo de substâncias

reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS)

O grau de peroxidação lipídica foi determinado pelo método de Draper e Hadley

(1990). A determinação das concentrações de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico

(TBARS) foi avaliada nas áreas cerebrais (HC, CPF, amígdalas e cerebelo). Foram preparados

homogenatos das áreas cerebrais supracitadas a 10% em solução de tampão fosfato 150 mM.

Uma alíquota de 63 µL do homogeneizado foi retirado e precipitado com 100 µL de ácido

perclórico 35% dentro de um eppendorff, e posteriormente centrifugado à 5000 rpm por 10

minutos a 4 °C. Após centrifugação, foi separado 150 uL do sobrenadante e adicionado 50 µL

de ácido tiobarbitúrico 1,2 %. Posteriormente a mistura foi agitada e mantida em banho de

água fervente (95-100 ºC) por 30 minutos. Após isso, foi transferido 200 μL da amostra para os

poços de uma placa de poliestireno de 96 poços, a determinação do conteúdo de TBARS foi

realizada por espectrofotômetro a 535 nanômetros (nm) em leitor de microplacas

(MOLECULAR DEVICES –Spectra Max Paradigm Multi-Mode). Os resultados foram

expressos em micromol (μmol) de malonildialdeído (MDA) por miligrama de proteína. A curva

padrão de MDA foi preparada a partir de uma solução padrão nas concentrações 0,627; 1,247;

2,463; 4,8; 9,16 e 16,77 μmol/L e o branco foi feito com água destilada (Figura 17).

75

Figura 17 – Representação esquemática da determinação do estresse oxidativo por meio da

obtenção de TBARS.

Fonte: Autora.

3.5.2 Determinação da Concentração de Nitrito nas Áreas Cerebrais e no Sangue

Para a determinação da produção de nitrito, primeiramente foi preparado uma curva

padrão. Para isso, foram pesados 6,9 mg de NaNO2 e dissolvidos em 10 mL de água bidestilada

(estoque-10mM) e feitas as diluições em série (10 e 20 x), ficando 1 μM, 100 μM, 10 μM, 5

μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM, 0,312 μM. Foi realizada uma equação da reta para o cálculo

das concentrações do teste (GREEN et al.,1981). Para a determinação da concentração de nitrito

em cada tecido, foram preparados homogenatos das áreas cerebrais a 10% (p/v) em solução

tampão fosfato 150 mM. Após a centrifugação (11000 rpm/15 min A 4ºC) os sobrenadantes

foram coletados e a produção de óxido nítrico (NO) determinada através da reação de Griess.

Uma alíquota de 50 μL do sobrenadante foi incubada com 50 μL do reagente de Griess

[(sulfanilamida 1% em H3PO4/ naftiletilenodiamino-bicloridrato 0,1%/, H3PO4 1%/diluído

em água, na proporção de (1:1)] e foram distribuídos em uma placa de poliestireno de 96 poços

sob a temperatura ambiente por 10 minutos. Após 10 minutos de reação a absorbância foi

medida em espectrofotômetro a 570 nm em leitor de microplacas (MOLECULAR DEVICES –

Spectra Max Paradigm Multi-Mode). A concentração de nitrito (μM) foi determinada a partir

de uma curva padrão de NaNO2 e os resultados foram expressos em μM de nitrito-nitrato por

grama de tecido (Figura 18).

8 grupos de animais M e F

Hipocampo Cortex Pré-frontal

Amígdala Cerebelo

Peroxidação Lipídica (Tbars) mMol/g de tecido

Dissecados

Placa Elisa

Leitura Elisa Banho-maria

Homogenatos

76

Figura 18 – Representação esquemática da determinação do estresse oxidativo por meio da

obtenção de Nitrito.

Fonte: Autora.

3.5.3 Determinação da Concentração de Glutationa Reduzida GSH)

A atividade antioxidante foi determinada pela concentração de GSH, que se baseia

na reação do reagente de Ellman (5,5'-ditiobis-ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre

originando um dissulfeto misto mais ácido 2-nitro-5-tiobenzóico. Inicialmente foi preparado o

homogenato a 10% em EDTA 0,02M das áreas cerebrais em estudo, em seguida foi retirado 40

μL desse homogenato e adicionado 50 μL de água destilada e 10 μL de ácido tricloracético a

50%. O material foi agitado e centrifugado a 5000 rpm por 15 minutos a 4 ºC. Posteriormente,

foi recolhido 60 μL do sobrenadante e acrescido 102 μL de tampão Tris-HCL 0,4 M, pH 8,9 +

DTNB 0,01M e distribuídos na placa de poliestireno de 96 poços, após 1 minuto da reação foi

feito a leitura da coloração em 412 nm em leitor de microplacas (MOLECULAR DEVICES –

Spectra Max Paradigm Multi-Mode), (Figura 19). A concentração de glutationa reduzida foi

expressa em nanogramas de GSH/g de tecido, tendo por base uma curva padrão. A curva padrão

foi construída a partir da solução padrão de GSH (1mg/mL), a qual foi preparada em triplicata

de soluções a 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL. O branco foi feito com água destilada (4 mL) e

a cada tubo das soluções de GSH foi acrescentado de 4 mL de tampão Tris HCl 0,4M (pH 8,9).

Para a determinação da equação da curva padrão de GSH, foi adicionado ainda a cada tubo 0,1

mL de DTNB (SELDLAK; LINDSAY, 1988).

Dissecados

Hipocampo Cortex Pré-

frontal Amígdala Cerebelo

100 µL do reagente de Griess

(Sulfanilamida 0,1% em ac.

fosfórico 5% e Água destilada +

100 µL do homogenato

NITRITO mMol/g de tecido

Placa Elisa

Homogenatos

Leitura

Elisa

8 grupos de animais M e F

77

Figura 19 – Representação esquemática da determinação do estresse oxidativo por meio da

Concentração de Glutationa Reduzida

Fonte: Autora.

3.6 Análise de Expressão Gênica

3.6.1 Desenho e análise dos primers

O planejamento dos primers foi baseado nas sequências genéticas codificantes

identificadas tanto para genes de referência (Actb e Gapdh), quanto para genes alvos de

avaliação a resposta comportamental utilizando o banco de dados do NCBI -

https://www.ncbi.nlm.nih.gov). O desenho dos primers deu-se através do software Primer 3,

onde foram validadas in silico temperaturas de anelamento em torno de 60ºC, com tamanhos

de amplicons variáveis entre 84 pb e 147 pb para as sequencias-alvo estudadas. As sequências

dos primers selecionados encontram-se apresentadas na Tabela 1. Esse material foi analisado

quanto às probabilidades de formação de hairpins omodímeros e heterodímeros, estruturas que

podem prejudicar a eficiência de amplificação durante as reações de qPCR. Os níveis de

expressão dos genes foram avaliados a fim de escolher os melhores tecidos para desenho das

curvas-padrão.

Hipocampo

Cortex Pré-frontal Amígdala

Cerebelo

Centrifugar 5000 rpm por 15 min 4 °C

GSH mMol/g de

tecido

Dissecados

40 °µldohomogenato+50µldeáguadestilada+10µldeTCA50%

Tris EDTA + DTNB

Leitura Elisa

Homogenatos

8 grupos de animais M e F

78

3.6.2 Expressão Gênica do Hipocampo

Diversos trabalhos têm estudado os efeitos da administração de ácidos graxos w-3

sobre o hipocampo de ratos, desde experimentos in vitro, verificando sua atividade anti-

inflamatória em fatias de hipocampo (MOREIRA et al., 2010), até sua ação protetora in vivo

com inibição de atividade epileptiforme (YONG et al., 2000). Puskás et al., (2003)

demonstraram que a administração oral de óleo de peixe em ratos idosos acarreta um aumento

do DHA e uma drástica redução do AA na composição das membranas fosfolipídicas dos

neurônios do hipocampo. De forma similar, Lamaziere et al., (2011) evidenciaram que a

provisão exógena de ácidos graxos w-3, por meio da administração orogáastrica de óleo em

ratos, resulta em sua incorporação diferenciada nas membranas fosfolipídicas dos neurônios,

principalmente em determinadas regiões do cérebro, como o córtex e o hipocampo. Desta

forma, neste trabalho a área escolhida para o estudo da expressão gênica foi o hipocampo de

ratos em 4 grupos citados a seguir.

Em uma outra série de experimentos, grupos de animais tiveram o hipocampo

coletado após o tratamento para análise da expressão gênica. O material do hipocampo foi

coletado ao final de tratamento de quatro grupos experimentais: SHAM (n=7), AVP (n=6),

Mix-3 (n=6) e AVP + Mix-3 (n=6). O grupo do Mix-3 foi escolhido para realização da

expressão gênica na fase da pesquisa em a maioria dos resultados obtidos apresentavam-se

significativamente favoráveis aos achados esperados nesta pesquisa. Ao final da

experimentação os animais foram eutanasiados, conforme descrito na sessão “4.5.4 Dissecação

das áreas cerebrais e descarte dos animais”, o hipocampo foi dissecado, lavado duas vezes em

solução salina e transferido para tubo previamente identificado contendo solução de RNA later

(ThermoFisher Scientific), onde permaneceram submersos por 1h a temperatura ambiente, em

seguida esse material foi congelado a -30 ºC, transportado para unidade de realização

experimental e mantido a -30 ºC até o momento da extração de RNA.

3.6.3 Extração de RNA total de hipocampo

Todos os procedimentos que envolveram a manipulação de RNA foram realizados

utilizando materiais dedicados exclusivamente a esta finalidade. A superfície das bancadas, os

equipamentos e as micropipetas utilizadas foram higienizados e tratados com o spray “RNAse”

conforme recomendado pelo fabricante. Utilizando a extração do RNA total foi realizada o

reagente Trizol® (ThermoFisher Scientific) de acordo com as recomendações do fabricante. A

79

ressuspensão do RNA total foi realizada com 50 µL de água mili-Q DEPC nuclease free. O

RNA total foi avaliado e quantificado equipamento NanoDrop 1000 (Thermo scientific®) e as

amostras foram armazenadas em freezer -80ºC até sua utilização.

Rattus novergicus

Código NCBI Gene Primers Produto (pb)

NM_001107523.1 Chd2* F: GGAAAGGGGAGAGAGAATGG

R: ACTTTGGCAGGAAGGGATTT 104

NM_001003957.1 Dnmt3a* F: GAACGGCTCGTGTATGAGGT

R: TGAAGAGTGGGTGCTCCAG 101

NM_031144.3 Actb# F: CCTGAACCCTAAGGCCAACC

R: GCCATGTACGTAGCCATCCA 84

Tabela 1 - Predição da expressão gênica por tecido, sequência de primers utilizados, alvos e

tamanhos dos produtos amplificados esperados.

Fonte: Autora. Legenda: A = Alta; MB = Muito Baixa; B = Baixa; M = Média. *Primer3; **NCBI; #Primer Mus musculo com homologia previamente verificada in sílico

3.6.4 Transcrição reversa obtenção de cDNA PCR quantitativo em Tempo Real (RT-

qPCR)

Ensaios de RT-qPCR foram realizados para a quantificação relativa dos níveis

transcricionais dos genes Dnmt3a e Chd2. As etapas de transcrição reversa e de amplificação

foram realizadas separadamente (Método Two-Step). As amostras de RNA total extraídas foram

submetidas à reação de transcrição reversa com o uso do kit “High Capacity cDNA Master

Mix” ThermoFisher Scientific A estratégia obtenção cDNA a partir do RNA baseia-se no

anelamento de oligonucleotídeos de sequências aleatórias. A cada reação foram adicionados 10

µL de “RT Buffer 2X”, 1 µL de “RT Enzyme Mix”, cDNA, 5 µL de amostra de RNA total e

água mili-Q livre de RNases em um volume final de 20 µL. Para todos os grupos foram

utilizados 5 uL da solução de RNA total. As amostras foram incubadas à 37 ºC durante 60 min

e depois a 95 ºC por 5 min em termociclador “CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System

(Biorad). As amostras contendo o DNA complementar (cDNA) gerado foram quantificadas,

diluídas para concentração de 50 ng/uL e mantidas em freezer -20 ºC até sua utilização.

As reações de qPCR para os genes alvo foram realizadas em triplicata utilizando

como método de detecção o reagente intercalante de DNA Sybr Green utilizando o “PowerUp

SYBR® Green PCR Master Mix” de acordo com as recomendações do fabricante. A eficiência

80

dos primers foi avaliada através de uma curva de diluição seriada do cDNA, os quais

apresentaram eficiência entre 95 e 105%. A ciclagem de temperatura seguiu com um

aquecimento inicial a 95 ºC por 5 min e 60ºC durante 60 min, seguidas da curva de melting a

60oC por 1 minuto seguida de 95oC por 15 segundos (+0.3 oC). Os ensaios de qPCR foram

realizados replicata biológicas para confirmação dos resultados. Os resultados foram avaliados

utilizado o método de 2ˆddCq de acordo com Livak and Schmittgen (2001)

3.7 Análises estatísticas (comportamentos, estresse oxidativo, GSH e Nitrito)

O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para verificar se os dados de cada variável

analisada apresentam distribuição normal, de modo que os valores outliers foram retirados (p-

valor > 0,05). Para identificação dos valores atípicos (outliers) foi utilizado o método de ROUT

com Q-value de 10%. Os dados paramétricos foram analisados através do teste t de Student,

para a comparação da média entre dois grupos, e de ANOVA para a comparação das médias

em variáveis com mais de dois grupos. Em caso de homogeneidade de variâncias (p-valor ≥

0,05), foi definido como pós-teste para a ANOVA o teste de Tukey. Os dados não-paramétricos

foram expressos como mediana, seguida de seus valores extremos, e analisados pelo teste de

Kruskal-Wallis.

Para os dados paramétricos e não-paramétricos o nível de significância estatística

utilizado será de p<0,05 e as análises estatísticas serão realizadas utilizando os softwares SPSS

20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) e GraphPad PrismÒ versão 6.0 (La Jolla, CA, EUA).

3.7.1 Análise estatística (Expressão Gênica)

Os resultados de dois experimentos indepententes, realizados em triplicatas foram

expressos em Cq ± desvio padrão por animal. A estatística descritiva foi apresentada média ±

desvio padrão por grupo. O teste de normalidade KS foi realizado. As medianas dos grupos não

normais foram submetidas ao teste não paramétrico Mann-Whitney para a comparação pareada

entre os grupos experimentais, comparado ao controle SHAM.

As médias dos grupos foram submetidas ao teste t não pareado para a comparação

paramétrica entre a média dos grupos experimentais, comparados ao controle SHAM.

81

4 RESULTADOS

4.1 Análises Comportamentais em MACHOS e FÊMEAS

4.1.1 Avaliação da Atividade Locomotora - Teste do Campo Aberto

Esta tarefa foi utilizada como um parâmetro de avaliação do comportamento do tipo

ansioso e da atividade locomotora dos animais, assim como da memória de habituação para este

ambiente. Durante 5 minutos foram mensurados os seguintes parâmetros: número de

cruzamentos (crossings), respostas de orientação, ou atividade de levantar (rearings), tempo

parado nos quadrados (ansiedade), tempo de auto-limpeza (groomings).

No 24ª dia pós-nascimento foi realizado o primeiro teste de comportamento para

avaliar atividade locomotora. Não foram constatados nenhuma diferença estatisticamente

significativa entre os grupos AVP e grupo SHAM dos animais machos como podemos observar

na Figura 20.

82

Figura 20 – Análise da atividade motora no Teste do Campo Aberto em ratos (machos)

realizado no 24ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e

uma única dose de ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Número de cruzamentos; B: Tempo parado; C: Grooming; D: Rearing. Os valores representam a média ± SEM. (n= 13 – 23 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix3 + AVP. Valores significativos: aaaa=p<0,005, b=p<0,05, c=p<0,05 e d=p<0,05.

Para os grupos dos animais fêmeas, ao analisar o número de cruzamentos,

comparando os animais tratados com o SHAM (31,5±2,05; p<0,05), o grupo ácido valpróico se

mostrou diferente significativamente (46,44±2,69; p<0,05), com uma elevação exploratória

maior. Para variável tempo parado, os animais tratados com AVP (72,22±3,59; p<0,05) e Mix

3 (57,08±12,11; p<0,01) reduziram significativamente em relação ao grupo SHAM, podendo

caracterizar um comportamento de ansiedade (Figura 21).

Quando analisado os valores de autolimpeza (Grooming), nenhum grupo

experimental demonstrou diferença estatística quando comparado com o SHAM ou com o

grupo tratado somente com ácido valpróico. O último parâmetro analisado neste teste se refere

a atividade exploratória vertical (rearing). Somente apresentaram diferença significativa em

83

relação ao grupo SHAM, os animais tratados com AVP (18,2±1,88; p<0,05). Não foi constatado

nenhuma diferença significativa em relação ao grupo de Ácido valpróico.

Figura 21– Análise da atividade motora no Teste do Campo Aberto em ratos (fêmeas) realizado

no 24ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única

dose de Ácido Valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Número de cruzamentos; B: Tempo parado; C: Grooming; D: Rearing. Os valores representam a média ± SEM. (n= 10 – 18 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Mix1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Mix2+AVP; ‘e’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Mix3+AVP; Valores significativos: a=p<0,05; b=p<0,05; c=p<0,05; ee=p<0,01.

4.1.2 Avaliação da Atividade Locomotora - Teste de Imersão em Cauda

Para o teste de imersão em cauda, realizado no 30ª dia pós-nascimento, foi avaliado

o tempo em milissegundos no qual o animal realiza a total retirada da cauda quando imerso em

água.

Ao comparar os grupos controles do experimento nos animais machos, foi possível

constatar uma diferença significativa entre eles, onde o grupo AVP (565,7±13,87) aumentou o

tempo em relação ao grupo SHAM (369,6±8,84; p<0,0001). Ainda em relação ao grupo SHAM,

84

este se mostrou diferente do grupo Mix-1(462,1±18,55; p<0,01), onde o tratamento elevou o

tempo de retirada conforme a Figura 22.

Quando comparado com o Grupo AVP (565,7±13,87), todos os grupos

experimentais associados ao ácido valpróico se mostraram estatisticamente diferentes,

conseguindo reduzir o tempo de retirada da cauda [ (Mix1+AVP:377,5±19,66; p<0,0001);

(AVP + Mix-2: 349,1±10,27; p<0,0001) e (AVP + Mix-3: 429,3±12,77; p<0,0001) ].

O Mix-1 (462,1±18,55) se mostrou deferente significativamente em relação aos

grupos tratados com Mix-2 (383,8±16,52; p<0,01) e Mix-3 (390,5±16,52; p<0,01), bem como

com AVP + Mix-1 (377,5±19,66; p<0,01). Já o AVP + Mix-2 (349,1±10,27) se mostrou

diferente significativamente do AVP + Mix-3(429,3±12,77; p<0,001), aumentando o tempo de

retirada da cauda.

Figura 22 – Análise da imersão de cauda em ratos machos realizado no 30ª dia pós-natal,

induzidos ao autismo tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: AVP: Ácido valpróico. Os valores representam a média ± SEM. (n= 13 – 23 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix-1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix2+AVP. Valores significativos: aaaa=p<0,0001; bbbb=p<0,0001; cc=p<0,01, ddd=p<0,001.

Na Figura 23, ao ser comparado os grupos experimentais fêmeas, foi possível

constatar a diferença entre os grupos controle SHAM (379,7±12,59) e AVP (671,9±67,08;

p<0,005), onde os animais tratados com ácido valpróico necessitaram de maior tempo para

desempenhar a função. Os demais grupos experimentais não se mostraram significativamente

diferente do grupo SHAM.

Quando comparado com o Grupo AVP, todos os grupos experimentais se

mostraram estatisticamente diferentes, conseguindo reduzir o tempo de retirada da cauda.

85

(Mix1+AVP: 440,9±10,64; p<0,01); (Mix2+AVP: 397,8±11,19; p<0,0001) e (341±21,82;

p<0,0001)].

Figura 23 – Análise da atividade motora no Teste de Imersão em Cauda em ratos fêmeas

realizado no 30ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e

uma única dose de Ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: AVP: Ácido Valpróico. Os valores representam a média ± SEM. (n= 10 – 15 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo AVP. Valores significativos: aaa=p<0,005; bb=p<0,05 e ‘bbbb= p<0,0001.

4.1.3 Teste de Performance da Natação

Para o teste de natação realizado no 32ª dia pós-nascimento, foi avaliado os scores

de acordo com o ângulo de inclinação da cabeça dos animais na superfície da água de 1 a 4

(Figura 24).

Ao comparar os grupos controles machos, foi possível constatar a diferença

significativa entre o grupo SHAM (3,9±0,09) e o grupo AVP (3±0,17; p<0,005), onde houve

uma redução da média dos scores. Os demais grupos experimentais, foi possível observar

alterações significativas somente em relação aos grupos Mix-1 (3,92±0,07) e o Grupo AVP +

Mix-1 (3,167±0,16; p<0,01), onde foi possível observar a diminuição do desempenho motor.

86

Figura 24 – Análise da imersão de cauda em ratos machos realizado no 32ª dia pós-natal,

induzidos ao autismo tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose ácido valpróico

Fonte: Autora. Legenda: AVP: Ácido valpróico. Os valores representam a média ± SEM. (n= 12 – 20 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. Valores significativos: aaa=p<0,005 e cc=p<0,01.

Resultados parecidos foram encontrados nos grupos dos animais fêmeas como pode

ser observado na Figura 25. Para os grupos controles, foi possível constatar a diferença

significativa entre o grupo SHAM (3,84±0,10) e o grupo AVP (3,33±0,11; p<0,05), onde houve

uma redução da média dos scores. Entre os grupos tratados, foi possível observar alterações

significativas somente em relação aos grupos Mix 3 (4,0±0) e o Grupo Mix3+AVP (3,11±0,11;

p<0,005), apresentando uma redução do score no grupo associado ao Ácido Valpróico.

87

Figura 25 – Análise da atividade motora no Teste de Imersão em Cauda em ratos fêmeas

realizado no 32ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e

uma única dose de ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: AVP: Ácido valpróico. Os valores representam a média ± SEM. (n= 12 – 20 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘e’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 3. Valores significativos: a=p<0,05 e eee=p<0,005.

4.1.4 Avaliação da Atividade Locomotora -Teste de Rota-rod

Para o teste de Rota-rod, foram avaliadas quatro variáveis relacionadas a atividade

motora do animal, a saber: primeira queda e tempo final (coordenação motora e equilíbrio) e

RPM para a primeira queda e RPM final (equilíbrio e força muscular). Os parâmetros avaliados

no teste de Rotarod incluem: tempo de latência (ou de resistência para queda), distância total

percorrida (dependente da freguência de rotação e do tempo de latência).

Na Figura 26, ao ser analisado os parâmetros no teste rota rod para os grupos de

animais machos, não foi possível observar resultados significativos entre o grupo AVP em

comparação ao grupo salina (sham).

88

Figura 26 – Análise da locomoção através do teste de RotaRod em ratos machos realizado no

50ª dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com Mix de óleos e única dose de

ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Tempo final; B: RPM final; C: Primeira queda; D: RPM para a primeira queda. Os valores representam a média ± SEM. (n= 13 – 23 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix2. Valores significativos: b=p<0,05, cc=p<0,01, d=p<0,05 e dddd=p<0,0001.

Nos grupos dos animais fêmeas, a avaliação do tempo final representado na Figura

27, os grupos AVP (125±12,08; p<0,005) e Mix-3 (114±9,2; p<0,0001) reduziram

estatisticamente o tempo em relação ao SHAM (201,8±7,78). Quando comparado em relação

ao grupo tratado somente com Ácido Valpróico (125,0±12,08), Mix-1+AVP (208,8±12,9;

p<0,0001) e Mix-2+AVP (264,8±8,71; p<0,0001) apresentaram diferença significativa,

levando ao aumento do tempo.

Ao avaliar o tempo necessário para a ocorrência da primeira queda, os únicos

grupos que se mostraram diferentes do grupo SHAM foram o AVP (49,5±6,72; p<0,005) e Mix-

3 (48,77±5,93; p<0,01), diminuindo o tempo.

O último parâmetro avaliado foi o RPM necessário para que ocorresse a primeira

queda onde, em relação ao grupo SHAM (18,54±1,6), AVP (10,06±0,79; p<0,005) e Mix-3

(9,92±0,68; p<0,01) se mostraram diferentes.

89

Figura 27 – Análise da atividade motora no Teste Rota Road em ratos fêmeas realizdo no 50ª

dia pós-natal, induzidos ao autismo tratados por 25 dias com mix de óleos e uma única dose de

ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Tempo final; B: RPM final; C: Primeira queda; D: RPM para a primeira queda. AVP: Ácido valpróico. Os valores representam a média ± SEM. (n= 13 – 18 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix1+AVP. ‘e’ mostra diferença significativa em relação ao Mix2+AVP. ‘f’ mostra diferença significativa em relação ao Mix3+AVP Valores significativos: aa=p<0,01; aaa=p<0,005; aaaa=p<0,0001 b=p<0,05; bbb=p<0,005; bbbb=p<0,0001; cc=p<0,01; ccc=p<0,005; cccc=p<0,0001 e d=p<0,05; dd=p<0,01.; ddd=p<0,005; . ee=p<0,01; eee=p<0,005 e ffff.=p<0,0001.

4.2 Análises Neuroquímicas em MACHOS e FÊMEAS

4.2.1 Determinação dos Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS)

De acordo com os resultados obtidos (Figura 28), quando analisados os níveis de

Peroxidação Lipídicas no Hipocampo, os animais tratados com ácido valpróico (1488,0±433,1;

p<0,05) elevaram o grau de peroxidação lipídica em relação ao grupo SHAM (777,5±112,3),

sendo restaurado com o mix-3 no grupo mix-3 + AVP. Ao comparar os grupos experimentais

com o grupo tratado somente com Ácido Valpróico (AVP), AVP + Mix-2 (863,0±37,52;

p<0,05) e AVP + Mix-3 (737,6±40,88; p<0,01) demostraram diferença significativa,

conseguindo reduzir os níveis de TBARS das amostras.

No Córtex Pré-Frontal, foi possível constatar diferença significativa entre os grupos

controles, onde AVP (1358,0±311,0) aumentou significativamente os níveis de MDA em

90

relação ao SHAM (514,8±100,3 p<0,05). Também corroborando com o resultado do

hipocampo, restaurado com o mix-3 do grupo Mix-3+AVP (575,0±49,58).

Nas amígdalas, nenhuma dose testada dos mixs foi diferente significativamente do

grupo SHAM ou do ácido valpróico para os níveis de peroxidação lipídica. Por fim, no

Cerebelo, constatou-se diferença significativa entre os grupos controles AVP e SHAM, onde

apresentou uma redução dos níveis de TBARS em animais tratados com AVP (1097,0±176;

p<0,05) em relação ao grupo SHAM (1858,0±197,7), não sendo esperado neste estudo.

Figura 28 – Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais de ratos machos

realizados no 55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de

Ácido Valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Hipocampo; B: Córtex pré-frontal; C: Amigdalas; D: Cerebelo. Os valores representam a média ± SEM dos níveis de MDA (malondialdeído) medidos em µg/g de tecido. (n= 6 – 8 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix1+AVP. Valores significativos: a=p<0,05; b=p<0,05; bb=p<0,01; c=p<0,05; cc=p<0,01, d=p<0,05; dd=p<0,01 e dddd=p<0,0001.

De acordo com os resultados obtidos na Figura 29, para as áreas analisadas

hipocampo, córtex pré-frontal, amígdalas e cerebelo o estresse oxidativo não esteve presente

no grupo AVP quando comparado estatisticamente com o grupo controle salina para os animais

fêmeas.

91

Figura 29 – Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais de ratos fêmeas

realizados no 55ª dia post-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de

Ácido valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Hipocampo; B: Córtex pré-frontal; C: Amigdalas; D: Cerebelo. Os valores representam a média ± SEM dos níveis de MDA (malondialdeído) medidos em µg/g de tecido. (n= 6 – 8 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM; ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP); ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1; ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 2; ‘e’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 3. Valores significativos: a=p<0,05; b=p<0,05; bb=p<0,01; bbbb=p<0,0001; c=p<0,05; cccc=p<0,0001, d=p<0,05; dddd=p<0,0001 e eee=p<0,005.

4.2.2 Determinação da Concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3)

Avaliação da determinação de nitrito no estudo com o uso de ácido valpróico

espera-se expressar uma elevação dos níveis de Espécies Reativas de Nitrogênio (ROS)

caracterizando um tipo de processo inflamatório. Na Figura 30, para os animais machos, as

áreas hipocampo, córtex pré-frontal e amígdalas não foram observadas diferenças estatísticas

entre os grupos AVP e SHAM, no entanto, ao analisar o Cerebelo, os grupos AVP (5,32±1,03)

demonstrou diferença significativa em relação ao grupo SHAM (1,33±0,24; p<0,0001),

aumentando os níveis de nitrito/nitrato nas amostras cerebrais, sendo expressivamente

restaurada após o uso dos mix-1, mix-2 e mix-3 dos animais AVP, conseguindo diminuir os

níveis de NO2 e NO3 no tecido cerebral em estudo (Figura 30).

92

Figura 30 – Concentrações de Nitrito/Nitrato nas áreas cerebrais de ratos machos realizados no

55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido

Valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Hipocampo; B: Córtex pré-frontal; C: Amigdalas; D: Cerebelo. Os valores representam a média ± SEM dos níveis de Nitrito/nitrato (NO2/NO3), medidos em mMol/g de tecido. (n= 5 – 8 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix1+AVP. Valores significativos: a=p<0,05; aaa=p<0,001; aaaa=p<0,0001 b=p<0,05; bb=p<0,01; bbbb=p<0,0001; c=p<0,05; cc=p<0,01; cccc=p<0,0001 e dd=p<0,01.

Representando os resultados da determinação de Nitrito no grupo das fêmeas, é

possível constatar na Figura 31 que em nenhuma das áreas cerebrais analisadas houve um

aumento significativo de níveis de NO2 e NO3 no tecido cerebral.

93

Figura 31 – Concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3) nas áreas cerebrais de ratos machos

realizados no 55ª dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de

Ácido Valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Hipocampo; B: Córtex pré-frontal; C: Amigdalas; D: Cerebelo. Os valores representam a média ± SEM dos níveis de Nitrito/nitrato (NO2/NO3), medidos em mMol/g de tecido. (n= 5 – 8 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey ‘b’ mostra diferença significativa em relação ao grupo Ácido valpróico (AVP). ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix1+AVP. Valores significativos: b=p<0,05; bbbb=p<0,0001 cccc=p<0,0001; d=p<0,05; dd=p<0,01 e dddd=p<0,0001.

4.2.3 Determinação das Concentrações de Glutationa Reduzida (GSH)

A glutationa (GSH) faz parte de importante sistema enzimático de defesa contra

radicais livres, sendo um marcador da saúde celular e sua queda é indicativa de lesão oxidante.

Foi realizado nas áreas cerebrais: hipocampo, córtex pré-frontal, amígdalas e cerebelo a

dosagem dos níveis de glutationa reduzida onde esperava-se uma diminuição nos grupos com

ácido valpróico em comparação ao SHAM. Analisando as Figuras 32 e 33, para machos e

fêmeas respectivamente, não houve diferença estatística em nenhum dos grupos experimentais.

94

Figura 32 – Concentrações de GSH (µ/g de tecido) nas áreas cerebrais de ratos machos

realizados no 55ª pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido

Valpróico.

Fonte: Autora. Legenda: A: Hipocampo; B: Córtex pré-frontal; C: Amigdalas; D: Cerebelo. Os valores representam a média ± SEM dos níveis de Glutationa reduzida (GSH), medidos em uMol/g de tecido. (n= 6 – 11 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao Mix 1. ‘d’ mostra diferença significativa em relação ao Mix2+AVP. Valores significativos:c=p<0,05; cc=p<0,01 e dd=p<0,01.

Abaixo podem ser analisados os resultados para GSH em animais fêmeas e sua

respectivas áreas cerebrais avaliadas.

95

Figura 33 – Níveis de GSH (µ/g de tecido) nas áreas cerebrais de ratos fêmeas realizados no 55ª

dia pós-mortem, tratados por 25 dias com Mix de óleos e uma única dose de Ácido Valpróico.

Fonte: Autor. Legenda: A: Hipocampo; B: Córtex pré-frontal; C: Amigdalas; D: Cerebelo. Os valores representam a média ± SEM dos níveis de Glutationa reduzida (GSH), medidos em uMol/g de tecido. (n= 6 – 9 animais por grupo experimental). Para análises estatísticas foram utilizados o teste One-way ANOVA seguido por Tukey. ‘a’ mostra diferença significativa em relação ao grupo SHAM. ‘c’ mostra diferença significativa em relação ao grupo MIX 1.‘d’ mostra diferença significativa em relação ao grupo MIX 2. ‘e’ mostra diferença significativa em relação ao grupo MIX 1+AVP. ‘f’ mostra diferença significativa em relação ao grupo MIX 3+AVP. ‘g’ mostra diferença significativa em relação ao grupo MIX 2+AVP. ‘h’ mostra diferença significativa em relação ao grupo MIX 3. Valores significativos: a=p<0,05, cc=p<0,01; dd= p<0,01; e=p<0,05; f=<0,05; gg=<0,01; h=p<0,05

4.3 Expressão Gênica por RT-qPCR

Os resultados do Figura 34 mostram as curvas-padrão realizadas para os genes alvos

(Dnmt3a e Chd2) e o gene referência (Actb). Todas as curvas apresentadas apresentam

eficiência similar (Figura 34A a 34C) (Actb, 1,11; Dnmt3a, 1,08 e Chd2 1,19 respectivamente).

A similaridade das eficiências permite a análise de quantificação da expressão relativa realizada

pelo médoto 2-ddCt. Observa-se que após curva de melting, todas as amplificações foram

específicas de acordo com as curvas de melting apresentadas a baico (Figura 34D a 34F).

96

Figura 34 – Padronização dos genes alvo e referência. A - eficiência dos primers, B - curva de

melting.

Fonte: Autora. Legenda: Curvas padrão dos genes Bactin (A/D), Dnmt3a (B/E) e Chd2 (C/F) e suas respectivas curvas de melting.

Figura 35 – Avaliação da expressão relativa diferencial dos genes Dnmt3a e Chd2.

Fonte: Autora. Legenda: A: Hipocampo. O teste de normalidade KS foi realizado.

1As medianas dos grupos não normais foram submetidas ao teste não paramétrico Mann-Whitney para a

comparação pareada entre os grupos AVP, Mix-3, AVP + Mix-3 comparado ao controle SHAM.

2As médias dos grupos foram submetidas ao teste t não pareado para a comparação paramétrica entre a média dos

grupos experimentais, comparados ao controle SHAM.

A B C

D E F

97

5 DISCUSSÃO

Foi avaliado o estresse oxidativo em 4 áreas cerebrais mais investigadas e

acometidas pelo TEA: hipocampo, córtex pré-frontal, amígdalas e cerebelo, segunda a

literatura.

Estudos em modelos animais fornecem grandes possibilidades de investigações que

não são possíveis em humanos, incluindo análises imunológicas e do desenvolvimento,

plasticidade e sinalização neural. O autismo é uma condição particularmente difícil de ser

mimetizada em animais. A empatia e a capacidade de intuir os sentimentos e intenções de

terceiros parecem ser impossíveis de ser medidas em ratos ou camundongos (MILLER et al.,

2006). Por outro lado, os roedores são, em geral, espécies que têm altos índices de interação e

comunicação social (CRAWLEY et al., 2003). Essa característica faz com que mudanças no

comportamento social dos roedores sejam relacionadas a fatores ambientais ou genéticos

(CRAWLEY et al., 2007; INGRAM et al.,2000).

A vantagem de utilizar ratos nesses estudos é baseado no relatório de que o AVP

atingiria a mesma concentração no cérebro em seres humanos do que em camundongos,

extrapolando assim os dados mais relevantes para o homem (JOHANNESSEN;

JOHANNESSEN, 2003). Exposição no 14ª dia pós-nascimento é selecionada como janela

crítica, na migração e diferenciação de células granulares cerebelares e hipocampais. Devido às

anomalias cerebrais produzidas pelo VPA, há perda de atividade motora, cognição,

comportamentos intrusivos, sensibilidade alterada a estímulos dolorosos e déficit pertinente

interação social (MARKRAM et al., 2008).

O AVP induz regressões comportamentais em camundongos na exposição pós-natal

idêntica àquele visto em indivíduos com autismo (MING et al., 2008).

O teste de campo aberto é comumente usado para avaliar a atividade locomotora

geral, explorar o comportamento, e comportamento relacionado à ansiedade. A distância total

percorrida e o tempo gasto no centro do campo são medidos para avaliar a atividade dos

animais. Além disso, a duração total da auto-limpeza e a atividade de levantar as patas dianteiras

são medidas para o comportamento (SEGAL-GAVISH et al., 2015; SEIBENHENER et al.,

2015; BASSO et al., 1995; KUNIISHI et al.,2017).

A exploração restrita é uma das principais características dos casos clínicos e pré-

clínicos de autismo (OLEXOVÁ et al.,2013). Esta leitura muitas vezes pode ser realizada pelo

teste do campo aberto através do número de cruzamentos e rearing. A diminuição da atividade

exploratória e locomotora neste estudo não foi percebida para os animais machos como

98

mencionado por Wagner et al., (2006) onde demonstraram que comportamentos críticos

mediados pelo cerebelo aparecem pela primeira vez no 14ª dia pós-natal. E que, uma única

exposição no 14ª dia pós-natal de 400 mg/kg de ácido valpróico foi eficaz na produção de

deficits cognitivos e motores induzidos por VPA que imitavam a regressão autística resultando

em deficits sociais nos camundongos em desenvolvimento.

No entanto, as fêmeas apresentaram resultados antagônicos a estes bem como no

esperado de efeito teratogênico com ácido valpróico. Um aumento significante da atividade

locomotora e exploratória podem ser observadas estatisticamente no grupo com autismo AVP

em relação ao Sham (Figura 21). O parâmetro “número de cruzamentos” é considerado uma

medida simultânea de comportamento ansioso e de atividade locomotora. Um alto valor deste

parâmetro sugere exploração e locomoção aumentadas e, consequentemente, menor nível de

ansiedade (ZIMCIKOVA et al., 2017). É possível verificar estes resultados também entre os

grupos, onde Mix-3 + AVP e Mix-1 + AVP, apresentaram valores significantemente maiores

em relação ao neurotípicos do mesmo grupo. Quanto à análise dos rearings, o grupo AVP

fêmeas apresentou uma quantidade significativamente maior deste comportamento em relação

ao grupo Salina. O rearing é interpretado tanto como um índice de medição de comportamento

exploratório como de comportamento que expressa ansiedade, apesar de haver controvérsias na

literatura acerca do tema (SEIBENHENER et al., 2015). O resultado obtido no presente estudo

foi um aumento significante na quantidade de rearings no grupo AVP em relação ao Salina,

sem diferenças significantes entre os demais grupos, o que pode ser interpretado como um

aumento da atividade exploratória que se deve ao AVP, relacionando-se negativamente com

estados ansiosos e de medo (SESTAKOVAL et al., 2013), observado na atividade de “tempo

parado” onde as fêmeas do grupo Salina, estiveram significativamente menos interesse em se

locomover quando comparados com o grupo AVP e o grupo Mix-3. Mais estudos devem ser

encorajados para explicar o aumento desta exploração com uso do ácido graxo DHA no animal

AVP, “seus efeitos neuroprotetores” como podemos encontrar na Figura 21 para o grupo Mix-

3 + AVP em relação ao grupo Mix-2 + AVP, bem como para os grupos neurotípicos tratados

dos animais machos, onde Mix-1 teve um aumento significante quando comparados aos grupos

SHAM e Mix-3.

Um estudo clínico recente relatou que a relação entre os PUFA ômega-3 e o AA é

antagônica à manutenção da homeostase em altas concentrações de EPA e DHA. A

incorporação de PUFAs ômega-3 reduz a concentração de AA (JANSSEN et al., 2014;

MORBTATEN et al., 2013), regulando a síntese de eicosanóides, mediadores da sinalização de

AA na membrana celular (MORBTATEN et al., 2013). Os PUFAs ômega-3 na dieta podem

99

atenuar os níveis de AA do tecido e a formação de eicosanóides (WHELAN et al., 1996). O

antagonismo da sinalização de AA pode ter efeitos importantes na sinalização celular no

sistema nervoso central (OBAJIMA et al., 2005; MORI 2004) modificando os efeitos

biomédicos e comportamentais (OBAJIMA et al., 2005). Essa interação competitiva entre os

PUFA ômega-3 e o AA reflete um aumento nas proporções ômega-3 / AA no plasma

(SCHMITZ et al., 2008; LUXWOLDA et al., 2011; JANSSEN et al., 2014). Podendo ser uma

luz nas interpretações destes dados acima neste estudo.

Modelos de animais de ansiedade que utilizam diversos comportamentos de defesa,

investigam comportamentos que não precisam ser aprendidos, são preferências de grande parte

da comunidade cientifica, na medida em que não envolvem situações de treino, apresentam

baixo custo e têm sessões de curta duração. O grooming de roedores, apesar de negligenciado

pela maioria da comunidade científica, se enquadra nesta categoria de comportamentos e vem

sendo investigado por alguns pesquisadores (VELOSO et al., 2012; ESTANISLAU et al., 2012;

KALUEFF; TOUHIMMA 2005a; KALUEFF; TOUHIMMA, 2005b), como um possível

marcador de ansiedade. Nosso estudo englobou ambos os sexos no 24ª dia pós-natal, período

da ontogenia destes animais, já tendo sido investigado por (YADAV et al., 2016) aplicando o

mesmo protocolo, porém com óleos de ácidos graxos diferentes (ALA e GLA). Embora o AVP

possa induzir anormalidades cerebrais em ratos semelhantes aos de indivíduos com autismo

(BAUMAN et al., 1985; BAUMAN et al., 2005; CZYŻ et al., 2001), como a ansiedade, neste

estudo não foi possível observar estas mudanças em ambos os sexos.

O teste de imersão de cauda é um teste largamente utilizado em modelos animais

para aferir a nocicepção, i.e., a recepção de estímulos aversivos, transmissão, modulação

e percepção de tais estímulos. Em relação ao TEA, a literatura é conflitante acerca das

alterações na sensibilidade dolorosa nos indivíduos afetados, entretanto é consenso que crianças

com TEA reagem de forma diferente à dor (BARONIO et al, 2015). Em geral, nos modelos

animais de TEA induzidos por AVP, há uma redução da nocicepção supraespinhal e espinhal,

segundo revisão de Schneider, Przewłocki, similar aos resultados encontrados no presente

estudo na avaliação da nocicepção espinhal, visto que tanto os animais machos quanto fêmeas,

quando induzidos ao modelo de TEA pelo AVP, demonstraram um aumento significativo e

quantitativamente expressivo no tempo de latência no teste de imersão de cauda (SCHNEIDER;

PRZEWŁOCKI, 2005). Tal achado sugere o sucesso na indução do TEA pelo modelo de

indução no 14ª dia pós-natal por AVP no quesito de sensibilidade à dor, que encontra-se

diminuída ou abolida em casos humanos, sendo este um paralelo fisiológico entre o atraso para

100

a retirada da cauda pelo animal mediante estímulo doloroso e a hipossensibilidade nociceptiva

observada em humanos com TEA (MILITERNI et al, 2000).

Quanto às gorduras ricas em ômega testadas, Mix-1, Mix-2 e Mix-3, todas foram

capazes de normalizar os tempos de latências nos animais induzidos ao modelo de TEA,

levando o tempo de reação em geral para valores semelhantes ao grupo SHAM em ambos os

sexos. Tal resultado corrobora com achados de outros estudos, como no de YADAV et al, 2016,

que também obteve uma normalização do tempo de reação de retirada de cauda à estímulo

doloroso nos grupos tratados com os ácidos graxos poli-insaturados ácido alfa-

linolênico (ALA) e ácido gama-linolênico (GLA) em um modelo de TEA induzido por AVP.

Resultados semelhantes também foram obtidos com o uso de outras substâncias como

tratamento, como no caso de Huang et al em que a Betaína também foi capaz de fazer com que

o tempo de latência dos animais tratados no modelo de TEA induzido por AV retornasse a

valores semelhantes ao grupo controle. No caso da Betaína, o mecanismo sugerido para tal

melhora foi o aumento do metabolismo da homocisteína e consequente redução em sua

concentração (HUANG et al., 2019). Já no caso dos ácidos graxos poli-insaturados, o

mecanismo ainda não se encontra bem estabelecido no caso da melhora de reflexos medulares

como no caso do teste de imersão em cauda, mas postula-se que haja relação com a prevenção

de uma mielinização inadequada de regiões centrais e periféricas do sistema nervoso

(WYSOCZAŃSKI et al., 2016).

O teste de performance de natação foi criado por Schapiro et al, em 1970, com o

objetivo de desenvolver um teste para avaliar o desenvolvimento motor geral do rato e seus

possíveis atrasos em diferentes modelos através do padrão de nado, desde o menos

desenvolvido (0) ao mais completo (4), presente no animal adulto (SCHAPIRO et al, 1970).

Este teste foi validado para o uso em modelo animal de TEA induzido pelo AVP, no qual os

ratos induzidos ao modelo tendem a apresentar um atraso em tal desenvolvimento

(SCHNEIDER et al., 2005). Por mais que o teste tenha sido idealizado em 1970 para ser

realizado em torno dos dias pós-nascimento 6 a 16, há estudos mais recentes que utilizam o

teste em períodos mais tardios, como Yadav et al que utilizou no dia pós-nascimento 32, e que

têm obtido resultados úteis para a avaliação de repercussões mais tardias no desenvolvimento

motor em modelo de TEA induzido por AVP e para testar o efeito de substâncias sobre tais

repercussões.

No presente estudo, foi possível perceber que, em ambos os sexos, o grupo AVP

apresentou em média um padrão de nado significantemente mais atrasado do que o grupo

SHAM no dia 32ª dia pós-nascimento, o que sugere um prejuízo no desenvolvimento motor

101

causado pelo AVP com repercussões duradouras, classificando a maioria dos animais de tal

grupo no padrão 3 de nado (água a nível da orelha na maior parte do teste). No grupo dos

machos, os grupos Mix-2+AVP e Mix-3+AVP apresentaram uma média de escore de natação

maior do que o grupo AVP e não apresentaram diferença significante em relação aos respectivos

grupos Mix-2 e Mix-3. No grupo de animais fêmeas, os grupos Mix-1+AVP e Mix-2+AVP

obtiveram escores em média maiores que o do grupo AVP, sem diferença significante em

relação aos grupos Mix-1 e Mix-2, respectivamente. Tais resultados em conjunto sugerem que

a melhora do desempenho motor está relacionada ao tratamento com os ácidos graxos poli-

insaturados administrados, visto que estão implicados na regulação do bom funcionamento da

membrana celular neuronal e na mielinização adequada de axônios, essencial à formação e

integração de circuitos motores complexos no animal, recrutados durante o nado (VAN ELST

et al., 2014). Importante observar que o Mix-2 foi o único capaz de mitigar significativamente

a repercussão negativa causada pela administração do AVP ao desenvolvimento motor do rato

em ambos os sexos. Tal efeito positivo pode ocorrer devido ao fato de que as fontes de ω-3 do

Mix2 são mais variadas (ALA, EPA e DHA), o que pode levar a uma melhor distribuição no

sistema nervoso central e periférico ao longo do período de tratamento, haja vista que o teste

avalia desde funções motoras periféricas até sua integração, regulação e modulação central em

uma atividade motora integrada única, o nado (SCHAPIRO et al., 1970).

O teste de Rotarod é um teste comportamental que atualmente tem ganho grande

importância na avaliação de modelos animais de TEA por ser um dos mais clássicos testes para

avaliação da coordenação motora em ratos, função primordial do cerebelo, estrutura cada vez

mais implicada no TEA segundo a literatura, visto que há evidência crescente de que alterações

cerebelares como depleção de células de Purkinje, elevação do estresse oxidativo e disfunção

gabaérgica geram repercussões motoras, mnésicas e linguísticas observáveis nos indivíduos

com TEA (MORAKOTSRIWAN et al., 2016).

No presente estudo, o grupo AVP de fêmeas sofreu uma redução significante em

relação ao grupo SHAM, tanto no tempo de latência até a primeira queda quanto no tempo final,

o que condiz com os resultados da maioria dos estudos que avaliam a coordenação motora de

modelos animais de TEA no teste de Rotarod, pois é esperada uma piora da coordenação motora

nos testes que avaliam tal função neural nos modelos de TEA (MAIN; KULESZA, 2017).

Ainda em relação aos ratos fêmeas, o valor de tempo final significantemente mais alto dos

grupos Mix-1+AVP e Mix-2+AVP em relação ao grupo AVP demonstra que possivelmente a

administração dos Mix-1 e Mix-2 estão implicados no melhor desempenho motor no teste. Em

um paralelo com humanos, tal resultado condiz com conclusões da metanálise de estudos

102

clínicos controlados e randomizados realizada por Cheng et al, que conclui que a suplementação

com ácidos graxos da família ω-3 pode estar implicada na melhora de escores relacionados à

atividade locomotora (hiperatividade, estereotipias e letargia) em indivíduos com TEA

(CHENG et al., 2017).

Na análise dos resultados dos ratos machos, com exceção da discrepância entre o

grupo Mix-2+AVP em relação ao grupo Mix-2, não houve diferença significante nas variáveis

avaliadas em relação ao grupo SHAM e ao grupo AVP, limitando assim a interpretação dos

resultados, não sendo encontrada melhora significante estatisticamente no desempenho motor

que possa ser atribuída às substâncias testadas. Há várias hipóteses para explicar essa diferença

expressiva dos resultados entre sexos. Evidências recentes mostram alterações diferentes nos

circuitos neurais de ratos machos em relação a ratos fêmeas quando induzidos ao TEA por AVP,

como redução de conexões entre córtex visual e cerebelo, reduzidas de forma bem mais nítida

em machos, além de circuitos que envolvem a medula e o córtex motor, que encontram-se

aumentados nos machos em relação às fêmeas (CHO et al., 2017). Ademais, as concentrações

de corticoesterona nos ratos machos induzidos ao modelo de TEA por AVP são mais elevados

do que os das fêmeas, além de diferença expressiva na maturação do sistema nervoso central

nos vastos aspectos que possuem envolvimento com hormônios sexuais, fatos que podem levar

à uma grande variância em testes de desempenho motor (ASHWOOD et al., 2006).

O estresse oxidativo pode ser caraterizado por um desequilíbrio metabólico entre

espécies pró-oxidantes e antioxidantes. Os agentes pró-oxidantes podem ser representados por

espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS), já os anti-oxidantes são sistemas de

defesa constituídos por enzimas como, por exemplo: catalase (CAT), superóxido dismutase

(SOD) e glutationa peroxidase (GSH) (PISOCHI et al., 2015).

Ao serem analisados os resultados na Figura 28 no animal macho, os valores para

o hipocampo contemplado no grupo tratado com AVP em comparação ao grupo controle

SHAM, apresentou um aumento significante quando considerados aos marcadores de

peroxidação lipídica para TBARS; não sendo representado igualmente na Figura 29 para as

fêmeas na mesma área.

Quanto à análise inter-grupos, (Mix-2 + AVP e Mix-3 + AVP), tiveram uma

redução significante dos valores do estresse oxidativo ao serem comparados com o grupo Mix1,

ou seja, os mixes ricos em EPA e DHA sendo caracterizados com alto poder anti-inflamatório

e antioxidante, foram capazes de atenuar a concentração dos valores da peroxidação lipídica,

validando uma proteção notável nos filhotes tratados e com autismo. Estes resultados refletem

claramente a exacerbação do estresse oxidativo pelo AVP e demonstração na eficácia destas

103

gorduras EPA/DHA em proteger contra o estresse oxidativo quando comparados aos demais

grupos.

Corroborando com o presente estudo (YADAV et al., 2016) ao serem analisados os

efeitos do ALA e o GLA nas características comportamentais e neuroquímicas em um modelo

animal com autismo no 14ª dia pós-nascimento, comprovou-se que administração de AVP

proporcionou aumento nos níveis de TBARs, e que foi significantemente restaurado por ômega

3 rico em ALA e GLA.

Córtex pré-frontal é uma parte crítica do sistema executivo que se refere à

capacidade de planejar, desempenho cognitivo e raciocínio. Nesta pesquisa foi possível

observar na Figura 28, diferença estatística no grupo ácido valpróico elevando a peroxidação

lipídica no córtex pré-frontal de animais machos, comprometendo não somente as funções do

hipocampo “mencionado anteriormente” como também do córtex pré-frontal. Uma avaliação

entre os grupos AVP tratados, a suplementação de ômega 3 à base de algas (Mix-3 + AVP =

ALA + DHA), foi capaz de impedir estatisticamente quando comparada ao grupo Mix-1 + AVP

rico em ALA, a geração de TBARs, constituindo uma defesa enzimática para combater a

perioxidação lipídica (AL-GADANI et al., 2009; ZOROGLU et al., 2004), e melhorar o

desempenho cognitivo destes animais ocasionado pelo ácido valpróico. Al-Amin et al estudou

o efeito da astaxantina, um poderoso antioxidante, no modelo animal de AVP, encontrando uma

correlação sólida entre o aumento dos níveis de TBARS no córtex pré-frontal no grupo AVP e

o pior desempenho em testes comportamentais de funções sociais (teste de interação social).

Tal déficit comportamental foi normalizado após o tratamento anti-oxidante com a astaxantina,

que reduziu significativamente os níveis de TBARS no córtex dos animais tratados (AL-AMIN

et al, 2015). Este e inúmeros outros resultados presentes na literatura corroboram com estudos

em humanos que demonstram que alterações estruturais e o aumento do estresse oxidativo em

áreas como o córtex pré-frontal orbitofrontal e dorsolateral são centrais na fisiopatologia da

doença, e a redução do estresse oxidativo nestas áreas, especialmente em testes em ratos, tem

se mostrado constantemente ligada a um melhor desempenho nos testes comportamentais

sociais e executivos (SAJDEL-SULKOWSKA et al, 2011).

Estes resultados podem consolidar os valores apresentados neste estudo para

aumento significativo de TBARS nas amígdalas dos animais machos do grupo Mix-1 + AVP

quando comparados ao grupo Mix-3 + AVP e Mix-1 onde foram capazes de expressar valores

inferiores, e que ao correlacionar com os valores inversos para NO nas amígdalas na Figura 31,

o Mix-1 apresentou valores superiores comparado com Mix-1 + AVP.

104

A mistura de óleos do Mix-1 é caracterizada por ter baixa relação w-6/w-3, devendo

apresentar efeitos anti-inflamatórios a nível de membrana celular. Sabemos que o ácido graxo

ômega 6 (LA) - 18: 2, ω-6) é convertido em ácido gama-linolênico (GLA) (18:3, ω-6) no corpo,

que é posteriormente decomposto em AA (20: 4, ω-6). Em divergência com o fato de o GLA

ser uma das moléculas intermediárias para a síntese de AA (20: 4, ω-6), a literatura sugere que

o GLA desempenha um papel importante na alocação de inflamação em todo o corpo. Assim,

mesmo o grupo Mix-1 + AV recebendo uma única dose elevada de ácido valpróico, não justifica

ser diferente estatisticamente dos outros grupos autistas tratados, até porque o grupo Mix3 +

AV apresentou um poder de proteção na peroxidação lipídica maior quando comparado a estes

resultados. Portanto, existe um dilema científico para definir o potencial / mecanismo anti-

inflamatório do ácido graxo ω-3 e / ou ω-6 (RUSSO et al., 2009; KAPOOR et al., 2006).

Resultado antagônico foi observado para os machos na área cerebelar neste estudo,

onde o grupo Sham gerou um estresse oxidativo quando comparado com o grupo autista, não

sendo desta forma consistente com os artigos científicos mencionados na literatura acadêmica

descritos abaixo.

O malonyldialdeído (MDA) é gerado pela peroxidação de ácidos graxos

poliinsaturados e ésteres relacionados e é usado como marcador de LPO (ESSA et al. 2012).

Um estudo mostrou que o conteúdo de MDA no plasma era maior em 13 de 15 (87%) dos

indivíduos autistas, em comparação com indivíduos normais. Zoroglu e cols. (2004) relataram

níveis aumentados de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico no soro de pacientes

autistas. Analisando os tecidos cerebrais (amígdalas e cerebelo) neste estudo e em ambos os

sexos, não foi possível comprovar o aumento de MDA nestas áreas no grupo AV, porém o

grupo Mix 1 elevou significativamente o estresse oxidativo em comparação ao Mix-1 + AV.

Para os animais fêmeas, o grupo Mix2 nos tecidos amígdalas e cerebelo Vários estudos clínicos

realizados, sugerem que suplementar lactentes com AA, EPA e DHA melhorou

significativamente seu desenvolvimento cognitivo e memória (LUXWOLDA et al., 2011;

VRABLIK, 2013). Este benefício poderia se estender sendo iniciado a partir do estágio da

gravidez até o crescimento cerebral onde o desenvolvimento está completo (DAS, 2013). Além

disso, os PUFAs inibiram produção de citocinas neurotóxicas TNF-alfa IL-1 e IL-6; e aumentou

a síntese do óxido nítrico (NO), evento que impedem a apopotose neuronal e facilitam melhoria

e consolidação de memória (RUSSO, 2006; AL-GADANI, 2009; CROEN, 2002; LYALL,

2013).

No teste do Rotarod, no qual se observou um déficit sensório-motor nos ratos

fêmeas do grupo AVP e desempenho normal nos grupos tratados com Mix 1 e Mix 2, é possível

105

postular que tal desempenho esteja associado à redução dos níveis de TBARS nos grupos AVP

fêmeas tratados com Mix 1 e Mix 2, visto que Morakotsriwan et al demonstrou que o aumento

do estresse oxidativo e de alterações histopatológicas como rarefação de células de Purkinje no

cerebelo estão provavelmente ligadas ao pior desempenho motor dos animais do grupo AVP

no teste de Rotarod e, por raciocínio análogo, a melhora de tal desempenho estaria associada à

redução dos níveis de radicais livres e ao mantimento da histopatologia normal do cerebelo,

efeito promovido por certas substâncias com poder antioxidante e neuroprotetor, como os

componentes dos Mixes utilizados no presente estudo (MORAKOTSRIWAN, et al., 2016). O

melhor desempenho no teste de performance de natação, observado nos animais dos grupos

AVP tratados com Mix 2 e Mix 3, pode também ser explicado parcialmente pelo mesmo

mecanismo cerebelar, visto que o cerebelo está implicado na integração motora e na ontogênese

da motricidade coordenada (FATEMI, S. H. et al, 2012).

A glutationa (GSH) é o antioxidante primário responsável por manter o

microambiente intracelular redutor, essencial para a função e viabilidade celular normal. É um

indicador confiável na redução do status celular, e na sua redução crônica o GSH / GSSG reflete

uma capacidade antioxidante reduzida e maior vulnerabilidade a danos oxidativos (JONES et

al., 2006). Recentemente, um aumento na proteína oxidativa e no dano ao DNA foi associado

à diminuição do GSH / GSSG plasmático e intracelular em crianças com autismo, sugerindo

que a capacidade reduzida de defesa antioxidante nessas crianças pode ter consequências

funcionais manifestadas em termos de dano oxidativo (MELNYK et al., 2012).

Com o intuito de avaliar possíveis mecanismos associados aos efeitos preventivos

dos diferentes tipos de ômega-3, buscou-se avaliar parâmetros neuro-oxidativos. Neste

contexto, a glutationa reduzida (GSH) é considerada um antioxidante não enzimático que regula

o equilíbrio redox e o estresse oxidativo (LU et al., 2013; PASTORE et al., 2001), estando

fortemente implicada no TEA, dada sua interação com neurotransmissão glutamatérgica. Os

resultados do presente estudo revelaram que os níveis de GSH não diferiram significativamente

entre o grupo AVP e o Salina em ambos os sexos e nem com os demais grupos estudados.

Yadav et al (2016), relata efeitos positivos no aumento de glutationa ao realizar um

protocolo equivalente ao que foi utilizado pela nossa equipe: indução com AVP no 14ª dia pós-

natal com uma dose de 400mg/kg/p, e tratamento com administração dos PUFAs por 25 dias

de ácido α linoléico (ALA) ou γ ácido linoléico (GLA), sendo esta a diferença do nosso estudo,

onde os grupos autistas e neurotípicos receberam apenas 1 tipo de ácido graxo insaturado.

Os PUFAs e seus produtos metabólicos têm sido implicados no TEA através de

seus papéis na estrutura e função cerebral, neurotransmissão, estrutura da membrana celular e

106

organização dos microdomínios, inflamação, imunidade e estresse oxidativo (MCNAMARA et

al., 2010; WITTE et al., 2013; PU et al., 2013; TANG et al., 2016).

As concentrações de ácidos graxos poliinsaturados no sangue (plasma, soro,

glóbulos vermelhos e sangue total) são consideradas biomarcadores confiáveis (SERRA-

MAJEM et al., 2012). Foi relatada níveis anormais sanguíneos de n -3 LCPUFA em distúrbios

psiquiátricos, incluindo, entre outros, transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH)

e TEA (SPAHIS et al., 2008; KHAN et al., 2002; BRIGANDI et al., 2015). Sugeriu-se que as

explicações para tais anormalidades sejam uma menor ingestão alimentar de n -3 LCPUFAs, e

distúrbios no metabolismo e na incorporação destes ácidos graxos nas membranas celulares de

populações autistas em comparação com controles saudáveis (KHAN et al.2002; BRIGANDI

et al., 2015). Um grande número de relatórios indica diferenças nas proporções de n -3

PUFAs, n -6 PUFAs e / ou n -6 para n -3 PUFA entre populações com autismo e controles

saudáveis (MOSTAFA et al., 2015), mas alguns também não mostraram diferenças (BELL et

al., 2010). O motivo de tais discrepâncias não é bem examinado e não houve tentativas de

comparar sistematicamente esses estudos.

A evidência inicial de óxidos de nitrogênio no metabolismo veio de experimentos

que demonstraram produção de nitratos em camundongos germ-free no início da década de 80

(GREEN et al., 1981). Em 1985 demonstrou-se que macrófagos ativados por lipopossacárides

bacterianos eram capazes de levar à produção de nitritos e nitratos (STUEHR 1985). Na

seqüência evidenciou-se que a L-arginina era o substrato e a L-citrulina era formada como co-

produto (HIBBS et al., 1987). Em 1988, Marletta identificou o óxido nítrico como o produto

da reação de oxi-redução da L-arginina (MARLETTA et al., 1988). Quase que

simultaneamente, Furchgott investigava um fator vasodilatador associado ao endotélio vascular

(endothelium-derived relaxing fator) – EDRF (FURCHGOTT et al., 1984) e poucos anos mais

tarde concluiu-se ser o NO responsável pela atividade biológica do EDRF (IGNARRO et al.,

1987). Durante o final da década de 80 e início de 90, a comunidade científica aprofundou

pesquisas nesta direção, adicionando importantes conhecimentos sobre o NO como mensageiro

(ou sinalizador inter e intracelular) e como toxina, atuando em inúmeros processos patológicos.

O óxido nítrico (NO), produzido a partir de L-arginina pela família de enzimas

óxido nítrico sintetase (NOS), é uma importante molécula de segundo mensageiro que regula

várias funções fisiológicas. Nas células endoteliais, relaxa o músculo liso, o que diminui a

pressão sanguínea. As células de macrófagos produzem NO como um sistema de defesa

imunológica para destruir patógenos e microorganismos. Nas células neuronais, o NO controla

a liberação de neurotransmissores e está envolvido na sinaptogênese, plasticidade sináptica,

107

função de memória e secreção neuroendócrina. Acredita-se que o NO seja um radical livre que

geralmente contribui para o dano oxidativo e a destruição de moléculas e tecidos e, portanto, é

um tanto surpreendente que ele tenha tantos efeitos fisiológicos benéficos significativos.

Óxido nítrico sintase (NOS) é uma família de síntase catalítica, incluindo a NOS

neuronal (nNOS ou NOS1), NOS endotelial (eNOS ou NOS3) e NOS indutível (iNOS ou

NOS2), que sintetizam a produção de NO, uma molécula de sinalização de gás (ALDERTON

et al., 2001). A isoforma endotelial, eNOS, é constitutivamente expressa nas células endoteliais,

enquanto a isoforma do macrófago, iNOS, não é expressa constitutivamente como mencionado

anteriormente, mas é induzida por citocinAS (HEVEL et al., 1991), como corroborando pelo

nosso estudo no grupo AVP na área cerebelar dos animais machos.

A alta produção de NO nos distúrbios do autismo é um fenômeno bem relatado e o

mesmo foi evidente nos achados de YADAV et al., (2016) após a administração do AVP. A

administração concomitante de GLA (ácido graxo gama-linolênico) foi credenciada com menor

produção de NO, fundamentais para os seres humanos devido à sua ampla participação nos

papéis do sistema fisiológico, incluindo cérebro em desenvolvimento.

Investigações realizadas com doenças neurodegenerativas (OZYURT et al., 2014),

cita que mediante as alterações oxidativas na esquizofrenia, aponta-se que níveis elevados de

metabólitos do óxido nítrico e associados a outros radicais livres, provavelmente contribuem

para a neurobiologia do transtorno.

Outro estudo com modelo animal de esquizofrenia realizado com camundongos

machos e fêmeas, apresentaram níveis elevados de nitrito no CPF e HC nas fêmeas, sendo

amenizado com uso de ômega-3 no 30ª dia no pós-nascimento por 20 dias ininterruptos nas

áreas do CPF, HC e CE.

Como já abordado, o NO esteve alterado em todos os estudos onde houve

estimulação através de metabólitos tóxicos responsáveis pelos processos patológicos (iNOS),

não sendo obtido a mesma resposta áreas cerebrais dos grupos AVP de animais machos e

fêmeas utilizados neste estudo.

Como mencionado anteriormente, o ácido ômega-3 docosahexaenóico (DHA) e o

ácido eicosapentaenóico (EPA), além do ácido ômega-6 araquidônico (AA), são três LC-

PUFAs de particular importância para o desenvolvimento e funcionamento ideal do cérebro,

com efeitos independentes e compartilhados (DYALL et al., 2015), são incorporados aos

fosfolipídios da membrana e a incorporação do DHA ocorre em níveis excepcionalmente altos

no sistema nervoso central (LAURITZEN et al., 2016).

108

Os avanços recentes no campo da genética como triagem e investigações do genoma

de indivíduos e parentes afetados pelos TEA, promoveram uma explosão de informações sobre

a fisiopatologia desses transtornos (LISIK et al., 2014).

Apesar de anomalias de quase todos os cromossomos já terem sido associadas ao

autismo (COUTINHO et al., 2015) esses avanços permitiram detectar bases genéticas

heterogêneas e complexas de deficiência e, parcialmente, a compreensão de processos que

resultam diferentes fenótipos (LISIK et al., 2014).

O Gene Chd2 pertence a uma família de proteínas de remodelação da cromatina

dependente de ATP (LAMAR; CARVILL, 2018) tem demonstrado mutações em membros

dessa família que tem sido associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento, como transtorno

do espectro do autismo, deficiência intelectual e epilepsia (CARVILL et al., 2013, Allen et al.,

2013). Mutações encontradas no gene Chd2 incluem deleção parcial ou completa do gene,

todas são descritas como de novo e um alelo mutante é suficiente para causar a doença

(CARVILL et al., 2013, ALLEN et al., 2013) Apesar dessa correlação entre mutações

no Chd2 e doenças neurológicas, pouco se sabe sobre o papel desse gene no desenvolvimento

do cérebro.

Estudos em camundongos demonstraram que as deleções homozigóticas

de Chd2 produzem um atraso geral no crescimento e letalidade perinatal, enquanto as deleções

afetam a viabilidade neonatal e lesões não neoplásicas na maioria dos órgãos primários

(MARFELLA et al., 2006), mais recentemente, foi descrito por knockdown que

Chd2 promove uma diferenciação neuronal prematura durante o desenvolvimento cortical do

camundongos embrionários devido a uma diminuição nas células progenitoras neurais Pax6 + e

um aumento nas células progenitoras intermediárias Tbr2 + (SHEN et al., 2015).

Para identificar novas causas de crescimento humano, foi realizado um

sequenciamento do exoma em dez trios probandos-pais e detectado duas mutações Dnmt3a de

novo. Neste estudo foi possível detectar 11 mutações de novo adicionais sequenciados pelo gene

Dnmt3a em mais 142 indivíduos com crescimento excessivo. Estas mutações alteram resíduos

nos domínios funcionais do Dnmt3a e a modelagem de proteínas sugere que elas interferem nas

interações domínio-domínio e na ligação de histonas. Assim, o Dnmt3a se une a um grupo

emergente de genes epigenéticos modificadores de DNA e histona associados a distúrbios do

crescimento do desenvolvimento e doenças malignas hematológicas (TATTON-BROWN et

al., 2014).

Estudo realizado na identificação de novas mutações utilizando exoma completo do

gene Dnmt3a que causam a síndrome de West observou que certos genes de alta confiança para

109

epilepsia foram compartilhados entre as redes de co-expressão e interação genética

de Dnmt3a, Cdkl5 e Kmt2a. Além disso, todos os genes candidatos à epilepsia na rede de co-

expressão do Dnmt3a foram significativamente enriquecidos nos estágios iniciais de

desenvolvimento do cérebro, em particular, relataram que os DNMs do Dnmt3a foram

compartilhados entre epilepsia, transtorno do espectro autista (TEA) e deficiência intelectual

(DI) e ocorreram principalmente no domínio funcional do Dnmt3a (LIU et al., 2018).

Além das variáveis do estresse oxidativo, nitrito e ação antioxidante proveniente do

GSH, no presente estudo, os grupos controles da área HC do sexo macho: SHAM, AVP e os

grupos que no momento da coleta de material expressaram melhor desempenho nos resultados

comportamentais: grupos Mix-3 e Mix-3 + AVP a análise da expressão gênica dos gens Chd2

e Dnmt3a como possíveis mediadores genéticos expressivos como responsáveis pelo

desenvolvimento do TEA. No entanto, a expressão dos genes neste estudo não apresentou

resultados significantes nos grupos e áreas analisadas.

O principal achado do presente estudo foram as respostas e alterações

comportamentais em períodos diferentes, nos animais machos e fêmeas a longo prazo induzidos

pelo desafio do TEA com uso de Ácido Valpróico no 14ª dia pós-nascimento e sua mimetização

com a infusão de ácidos graxos ômega-3, ômega-6 e ômega-9.

Futuramente, novos experimentos poderão ser realizados em animais ratos machos

e fêmeas induzidos ao TEA com ácido valpróico, acrescentando outros testes comportamentais

tais como: interação social, reconhecimento de objetos. Estudos futuros para elucidar possíveis

ações e mecanismos das misturas de óleos, em outros tempos distintos tais como fase

considerada adolescência e adulta em ratos. Estuda outra vari’veis tais como atividade

enzimática COX e LOX para medir ação inflamatória. Avaliar outros fatores epigenéticos como

algumas citocinas estudadas no autismo (IL-1, IL-6, Il-8 e TNF- alfa) e correlacionar aos

resultados e morfologia neuronal pelo método Golgi Cox.

110

6 CONCLUSÃO

1. O modelo experimental induzido por Ácido Valpróico no 14ª dia pós-nascimento

desencadeia alterações comportamentais e neurobioquímicas semelhantes às que ocorrrem

em portadores de transtorno do especto autista.

2. Os mixes de óleos estudados promovem melhora nas alterações comportamentais dos

animais submetidos à indução de modelo de autismo pelo ácido valpróico.

3. Os mixes de óleos reduzem a perioxidação lipídica mas não conferem proteção anti-

oxidante pela GSH.

4. Neste modelo a relação nitrito/nitrato no tecido cerebelar nos animais machos aumenta

significantemente. Os mixes estudados reduzem esta relação para as mesmas apresentadas

pelo grupo controle.

5. Não há impacto sobre a expressão dos genes Dmnt3a e Chd2 na área cerebral hipocampo

com o uso dos mixes de óleos.

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REFERÊNCIAS

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141

APÊNDICE A - VALORES BRUTOS REFERENTES AOS RESULTADOS DOS TESTES COMPORTAMENTAIS E TESTES

NEUROQUÍMICOS

GSH - FÊMEAS Hipocampo

SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 104,881* 64,28793* 156,6* 191,4207 97,24655 83,51379* 147,2431 68,29138 87,19138 108,1397 81,13966 107,069 104,0897 112,2362 77,27586* 71,92241 80,48793 81,51207 54,74483 71,6431 133,0914 95,47759 158,7879 81,83793

85,05 92,68448 84,07241 85,28276 109,0707 105,6724 103,2052 77,0431 73,55172 154,4586 97,38621 42,45517* 100,6914 114,2845 93,80172 200,4983 93,84828 98,78276 96,54828 126,6207 104,5086 95,43103 97,99138 66,56897 77,41552 110,8397 149,8034 118,381 97,99138

92,59138 77,0431

Córtex pré-frontal SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

105,3466 68,52414 79,27759 52,13793 109,1172 95,61724 98,22414 76,15862 90,21724 94,77931 63,63621 76,01897 88,30862 79,37069 115,9138 72,24828 100,7379 97,71207 101,9017 66,61552 99,29483 109,2569 109,6293 68,01207 86,91207 97,01379 113,9586 67,4069 95,66379 99,24828 164,5138 68,33793 87,33103 92,12586 116,0069 74,06379 115,1224 110,9328 57,07241* 65,26552 88,40172 70,01379 92,77759 101,4828 105,1138 69,50172 72,29483 99,57414 74,57586 114,3776 107,6276 78,06724 94,82586

91,75345 85,00345

142

Amigdalas SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

80,76724 118,1483 79,88276* 87,37759 99,66724 115,7741 90,68276 97,61897 75,22759 99,52759 109,8155 80,72069 106,7431 112,2828 83,51379 73,78448 74,62241 87,42414 112,8879 77,83448 112,2362 124,8052 68,98966 104,9741 92,73103 119,4052 106,9293 55,53621 94,22069 91,33448 112,3293 88,58793 75,5069 88,40172 100,9707 65,73103 94,03448 103,0655 94,73276 102,0414

113,4931* 86,21379 113,2603 115,6345 117,869 95,43103 84,81724 101,2966 82,35* 72,85345* 117,45 97,71207 92,87069

97,94483 82,86207*

Cerebelo SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

77,1362 184,6707 166,3293 98,2707 116,1 188,3948* 109,4431 89,9845 105,3 111,3052 121,5 97,3397 122,0121 113,9121 118,3345 104,881

99,3879 109,8155 125,5034 93,6621 116,1 131,7879 92,8241 87,7034 112,4224 116,2397 125,4569 103,1586 127,7845 108,6983 96,4086 106,7431

147,4293* 105,0672 128,7621 92,8707 113,6793 105,6724 106,65 114,8431 88,2155 87,9362 35,4724* 111,2586 116,9845 95,6172 115,3552

175,7328 102,1345 118,2414 117,1707 97,9914 125,131 93,0103 32,1672*

GSH - MACHOS Hipocampo

SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

143

83,6069 66,28966 66,84828 28,35 63,26379 58,98103 58,00345 56,00172 69,36207 73,64483 97,15345* 33,42414 73,78448 59,21379 68,9431 60,6569 70,1069 77,22931 76,99655 27,32586 183,4138* 60,93621 89,05345* 54,0931

115,4017* 138,5379* 66,33621 33,05172 30,44483 68,05862 87,19138 82,02414 86,26034* 54,88448 60,6569 28,95517 45,48103 72,52759* 66,66207 46,73793 79,23103 66,10345 66,42931 27,88448 29,7 65,12586 41,52414 42,96724 34,54138 34,30862 34,58793 43,15345 29,04828 30,77069 97,57241* 35,0069 32,53966 43,24655

33,98276 34,68103 29,00172

Córtex pré-frontal SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

58,93448 48,92586* 68,10517 32,4931 84,58448 48,18103 78,34655 55,58276 61,58793 55,62931 76,67069 70,61897* 46,22586 54,32586 87,19138 67,36034 53,9069 60,70345 66,38276 29,93276 87,00517 56,00172 72,10862 69,59483

65,82414* 59,07414 66,52241 29,00172 50,97414 51,62586 61,40172 51,53276 63,96207 59,07414 59,95862 34,16897 28,07069 49,90345 70,24655 72,52759 58,93448 140,4466 74,06379 33,47069 30,77069 47,66897 41,38448 52,09138 28,67586 33,19138 28,81552 44,50345 31,56207 29,65345 85,79483 30,53793 27,69828 43,33966 28,81552 35,47241

37,52069

Amigdalas SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

64,10172 56,7 64,42759 47,25 87,6569* 58,51552 64,93966 39,15 68,66379 59,86552 76,71724 30,58448 73,08621 66,28966 58,79483 38,31207

144

58,84138 65,54483 43,15345 56,00172* 64,8 49,90345 70,2 98,68966* 91,28793 66,56897 69,03621 31,37586 29,6069 77,78793* 86,67931* 51,25345 68,38448 67,12759 86,63276* 42,22241 28,90862 60,37759 72,94655 29,23448 64,19483 67,63966 58,42241 47,80862 36,12414 50,88103 37,66034 57,07241 31,42241 41,85 41,98966 84,35172 32,86552 31,84138 67,54655

29,7* 37,8931 123,5483* 34,02931 36,26379

30,49138

Cerebelo SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

73,59828 63,3569 58,93448 63,3103 81,65172 91,00862 56,7931 56,04828 69,40862 22,8569* 100,0397* 249,0052* 76,62414 74,66897 67,08103 51,11379

139,2828* 51,53276 85,32931 62,4259 66,56897 94,91897 53,25517 71,22414 90,3569 65,31207 51,85862 32,5397 31,6086* 69,36207 81,0931* 51,2069

75,55345 69,78103 61,35517 30,3983 77,1828 62,61207 63,72931 56,65345 62,56552 89,75172 65,21897 33,7966 36,5431 68,9431 31,4224 57,9569 44,7362 32,7724 30,9569 50,92759

31,1431* 28,769 70,85172 32,5862 41,7569 63,68276 47,6224 26,9069

27,7914

NITRITO - FÊMEAS Hipocampo

SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 1,049382716 2,329218107 1,374485597 20,7037037* 1,728395062 1,255144033 6,716049383 1,057613169

5,238683128* 2,069958848 1,732510288 0,679012346 1,456790123 1,913580247 19,20164609* 0,888888889

145

1,037037037 2,617283951 2,020576132 0,757201646 1,530864198 1,950617284 1,053497942 2,201646091 1,345679012 1,872427984 2,563786008 0,716049383 1,082304527 2,24691358 1,016460905 5,24691358 1,164609053 1,440329218 0,810699588 1,049382716 1,325102881 3,9218107 8,37037037 1,728395062 0,761316872 2,218106996 1,041152263 1,197530864 1,938271605 7,024691358 3,604938272 6,613168724

0,711934156 5,917695473 11,85185185* 0,790123457 10,6090535*

córtex pré-frontal SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

1,473251029* 1,843621399 0,888888889 0,839506173 1,349794239 8,172839506 4,316872428 1,913580247 0,971193416 2,687242798 0,95473251 0,724279835 1,839506173 12,2345679 5,975308642 0,880658436 0,757201646 2,057613169 3,300411523* 0,695473251 6 11,40740741 9,522633745 1,316872428 0,769547325 0,975308642 0,823045267 0,769547325 6,580246914 8,823045267 5,827160494 0,991769547 0,773662551 1,156378601 0,888888889 0,765432099 5,555555556 11,83539095 4,802469136 1,395061728 0,909465021 1,288065844 0,864197531 0,773662551 13,16872428 4,349794239 0,794238683* 0,930041152

1,152263374 1,090534979* 0,884773663 1,222222222 4,382716049*

Amigdalas SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

0,765432099 0,806584362 3,024271845 2,87654321 2,736625514 0,868312757 2,230452675 1,16872428 0,823045267 5,082304527 3,742718447 2,600823045 16,10699588 1,358024691 1,432098765 0,917695473 1,456790123 0,720164609 1,757281553 4,469135802 1,131687243 1,366255144 1,065843621 0,827160494 0,757201646 3,888888889 2,689320388 4,160493827 0,9218107 4,259259259 2,588477366 1,604938272 0,83127572 2,699588477 2,640776699 3,720164609 6,382716049 3,823045267 10,43621399* 1,304526749

1,106995885 0,810699588 2,019417476 6,209876543 14,70781893 4,70781893 1,465020576 2,950617284 2,181069959 1,127572016 10,4526749* 1,205761317 2,823045267

Cerebelo

146

SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 2,362139918 2,905349794 5,325242718 4,650205761 6,386831276 11,8436214 3,020576132 4,127572016

4,691358025* 3,378600823 2,033980583 5,699588477 8,732510288 8,04526749 0,868312757 4,62962963 2,106995885 1,226337449 5,655339806 6,50617284 10,45679012 9,288065844 3,181069959 5,152263374 1,469135802 4,131687243 2,029126214 9,847736626* 19,13168724 14,55144033 1,827160494 4,201646091 2,279835391 1,283950617 2,281553398 6,037037037 14,10288066 16,30452675 1,695473251 4,205761317 1,670781893 1,0781893 1,839805825 5,534979424 9,670781893 8,024691358 2,732510288 2,481481481

1,930041152 1,78600823 1,131687243 1,654320988

NITRITO - MACHOS Hipocampo

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 0,880658436 1,251028807 2,057613169 3,004115226 1,304526749 1,004115226 2,205761317 2,325102881 0,798353909 1,16872428 2,913580247 2,979423868 1,683127572 0,757201646 1,884773663 2,452674897 1,127572016 0,757201646* 1,329218107 1,893004115 6,160493827* 1,29218107 2,094650206 2,547325103 1,29218107 0,880658436* 2,004115226 2,893004115 3,555555556 1,04526749 2,481481481 2,666666667

9,893004115* 1,004115226 1,156378601 2,724279835 3,58436214 1,004115226 2,230452675 4,0781893 1,625514403 2,703703704 4,851851852

córtex pré-frontal SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

0,757201646 1,78600823 3,502057613 4,518518519 5,181069959 0,880658436 2,144032922 1,983539095 1,004115226 1,251028807 6,995884774* 4,205761317 2,967078189 0,633744856 3,279835391 1,473251029 0,880658436 1,333333333 1,641975309 6,530864198* 2,967078189 0,9218107 2,942386831 2,238683128 1,127572016 1,456790123 2,827160494 3,222222222 3,78600823 0,839506173 1,444444444 3,625514403 1,16872428 0,757201646* 8,917695473* 1,341563786 2,814814815 0,757201646 1,316872428 1,740740741

147

1,04526749 2,279835391 2,518518519 1,275720165 0,716049383 2,732510288 0,333333333 4,094650206*

Amigdalas SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

1,127572016 1,16872428 5,097087379 3,333333333 3,201646091 0,880658436 2,255144033 4,329218107 1,04526749 0,757201646 3,990291262 1,950617284 4,95473251 2,979423868 1,362139918 1,279835391

1,004115226 1,086419753 5,004854369 4,395061728 2,864197531 1,04526749 1,164609053 3,004115226 0,757201646 0,962962963 2,218446602 3,333333333 2,703703704 0,839506173 1,839506173 11,19341564* 1,16872428 1,04526749 9,86407767* 1,275720165 4,193415638 1,04526749 1,555555556 1,238683128

2,358024691 2,316872428 2,650205761

Cerebelo SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

19,02880658* 5,489711934 5,019417476 3,296296296 3,086419753 6,271604938* 1,724279835 5,481481481* -1,028806584* 8,12345679 5,427184466 2,950617284 4,58436214 0,962962963 1,950617284 3,395061728

1,580246914 3,308641975 4,54368932 9,156378601* 3,028806584 0,9218107 3,880658436 3,650205761 1,086419753 0,839506173* 4,009708738 2,855967078 3,127572016 0,9218107 6,70781893* 1,991769547 0,798353909 1,04526749* 4,640776699 3,736625514 2,139917695 0,962962963 2,724279835 2,50617284 1,868312757 4,378600823 3,485436893 3,106995885 1,41563786 4,407407407*

1,958847737 2,115226337

TBARS - FÊMEAS Hipocampo

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

148

1056 792 1571 839 790 1096 998 1085 1047 1237 1180 1005 3034* 681 1589 1125 1053 808 1666 933 748 729 805 885 1122 1424 1540 1272 888 727 1845 1100 802 1008 1396 844 717 778 1117 1180

1501 1335 1565 1372 893 790 923 888 1649 843 979 1049

Córtex pré-frontal SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

992 1179 1326 844 1164 874 680 1601 1677 1731 1454 1372 892 787 656 844 1161 1397 1301 900 957 801 768 880 1001 1059 2007 892 913 770 614 1161 1539 1047 1796 1221 1032 788 717 1018 1751 1414 1911 754 856 727 867 1116

1477 1094 620 1221

Amigdalas SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

992 1179 1326 1846 790 1167 1256 1271 1677 1731 1454 2108 753 889 1021 1031 1161 1397 1301 1552 926 626 673 1301 1001 1059 2007 1911 1028 724 696 915 1539 1047 1796 1744 1069 713 214 825 1751 1414 1911 2283 791 645 647 1036

1477 -256 582 911 912

149

Cerebelo

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 1770 1455 1310 1310 1014 634 469 114 1486 1173 1696 1696 713 574 465 127 1451 1281 1578 1578 842 633 679 117 1227 1316 873 873 526 607 789 110 986 1413 1466 1466 1044 1670 1266 116

1340 1092 1441 1441 764 786 1210 126 1227 1079 143 1267 150

TBARS - MACHOS Hipocampo

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 831 1196 1042 836 951 1811 881 671 840 -135* 850 856 1090 1446 824 738

2541* 510* 1075 814 1002 1802 1002 875 982 795 796 956 1058 368* 808 637

-125* 2755 778 877 1124 386* 800 956 457 1205 778 968 1846 664

694 666

Córtex pré-frontal SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

2354* 875 988 988 1443 1846 846 647 403 795 1245 1245 1292 742 930 392 573 973 956 956 1086 288* 872 549

150

769 1748 1038 1038 964 261* 835 658 1499* 2399 524* 524* 976 1650 427 629

314 4340* 1124 1124 1490

Amigdalas SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

1143 911 1445* 742 823 831 1185* 1020 2176* 1303 704 821 712 1597 640 343

466 519* 802 835 899 920 833 626 920 1214 427 812 612 2140 818 1213*

1784 1757 2129* 455 605 2906* 862 581 608 795* 645 283* 1909 371

Cerebelo

SHAM AVP MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX1 MIX2 MIX3 350* 778 1087 1001 1347 546 1155 824

2532* 1232 1345 1592 1407 573 754 814 2042 822 1551* 1159 1517 1063 1154 857 1463 261* 1035 1250 1136 1276 909 954 2069 3948* 1092 1605 1109 973 1226 889 546* 1517 1433 1141 1757 1014

TESTE CAMPO ABERTO - FÊMEAS Tempo parado

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 107 66 84 139 20 82 132 32 131 71 113 72 8 125 152 15 128 48 111 85 12 128 188 21 137 67 91 79 15 80 107 5

151

152 74 86 92 12 68 85 6 152 53 90 77 14 139 65 6 77 58 76 53 78 53 70 48 80 58 83 33 78 41 34 71 77 107 92 45 97 50 51 44 80 85 48 106 45 142 58 47 65 121 80 55 34 40

125 70 98 101 55 33 56 144 72 158 121 46 32

91 131 74 99 74 68

Cruzamentos SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

37 39 27 29 38 59 23 54 22 33 28 45 38 39 22 72 23 46 50 47 31 38 19 64 34 38 34 42 45 59 46 63 26 36 35 35 45 65 67 44 26 30 19 44 56 44 74 63

45* 37 37 56 31 44 52 54 41 41 25 51 39 43 67 54 39 46 28 57 35 48 49 60 25 67 52 20 46 6* 30 42 74 42 28 44 45 37 31 52 40 24 54 55 40 32 44 39 16 50 62

51 38

152

58 48 44 52

Rearing SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

7 23 8 8 21 26 16 20 13 15 9 14 15 15 14 9* 13 36 30 14 15 14 3 21 11 7 8 28 27 24 3 29 13 7 18 7 29 16 5 23 12 22 9 13 24 17 5 34

22* 16 14 11 10 23 21 26 11 17 8 16 13 14 17 18 5 3* 8 31 5 13 15 26 4 5* 28 4 15 5 33

20* 5* 7 17 13 19 22 6 21 13 7 2* 26 8* 8 22 5 9 12 10 20 4 18 12 24 13

Grooming SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

3 5 4 2 4 6 2 1 2 3 3 3 3 5 2 3

153

2 1 2 4 6 5 1 6 2 2 6 1 2 6 6 3 1 4 5 10* 4 6 2 7 0 2 5 3 4 1 4 4 3 2 4 1 5 3 5 5 4 4 4 4 2 4 3 2 2 6 9 0 2 3 3 3 7 2 3 0 1 2 1 3 4 5 3 2 2 1 1 5 7 1 2 0 2 3 3 2 5 3 4 4 3 3 1 2 3

TESTE CAMPO ABERTO - MACHOS Cruzamentos

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 25 39 40 36 27 22 67 46 40 50 41 35 33 30 71 33 64 50 48 43 44 13 81 56 58 24 48 42 48 50 62 62 37 58 31 51 42 74 29 59 54 46 28 42 36 81 46 32 30 43 20 46 27 49 31 29 34 35 40 44 25 41 28 48 33 34 36 73 28 36 24 57

154

33 24 46 34 46 18 32 46 35 41 51 34 21 33 16 52 33 28 50 31 30 18 22 48 53 30 27 24 32 29 41 56 34 24 30 98 61 51 33 36 35 27 45 33 18 30 29 35 37 29 27 33 34 51 47 31 32 28 36 61 27 50 48

Tempo parado

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 146* 70 100 118 143 171 51* 92

72 126 116 103 113 124 28* 109 86 113 142 69 135 118 23* 91 84 161 106 69 105 89 90 94 72 107 116 77 140 53* 10* 88

109 99 85 108 94 116 6* 109 68 92 103 51* 135 45* 134 131 42 105 74 82 90 76* 131 112 58 142 82 85 88* 102 129 109 68 115 85 126 77 140 119 105 89 80 87 118 111 90 176 106

118* 68 62 126 101 154 106 90 100 42* 84 145 97 108 107 77*

155

95 58 140 93 90 74 68 142 117 97 98 89 125 104 84 118 102 90

105 106 98 122* 101 100 100 105 46 64 50

Rearing

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 7 17 26 6 11 29 23 7*

13 14 28 15 5* 15 44 10 14 32 32 28 13 22 30 42 14 10 16 23 15 18 30 10 5 10 25 24 13 35 13 9 5 15 15 16 10 22 33 33 4 9 20 20 11 10 8* 9

13 12 19 3* 9 6* 6* 10 11 5* 12 13 9 3* 19 2* 11 10 25 12 7* 18 10 8 23 27 9 14 9* 7* 8 10 25 17 9 0 8

15* 4* 8* 5* 21 9 7* 11 13 10 12 10 9* 12

19* 11 29 7 11 0 12 11 8 9 15 8 8* 20 13

156

7 8* 4* 8* 7 12 13 6 12

11 3* 17*

5

Grooming SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

0 3 2 4 4 6 10 3 1 3 3 4 0 4 3 3 1 2 6 3 5 10 3 3 2 4 5 6 2 6 3 2 0 2 3 4 2 11 11 4 1 1 3 3 1 7 8 2 4 1 3 1 2 6 3 1 2 3 1 3 1 0 2 2 1 2 2 0 5 1 2 1 1 3 1 2 7 3 3 2 2 1 5 1 5 3 4 2 5 3 2 4 3 0 1 2 2 4 4 1 2 2 2 2 0 2 6 5 1 1 0 1 2 5 8 2 1 4 5 4 2 2 4 4 5 5 6

9* 3 5 4 7 2

157

3 3

TESTE DE IMERSÃO DE CAUDA - FÊMEAS Imersão de Cauda

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 364 602 502 410 364 482 434 2,37* 370 486 420 416 386 486 400 2,75* 408 592 484 448 404 386 380 2,6* 372 520 360 420 402 454 440 362 440 455 392 460 396 444 438 282 364 812 400 452 414 486 440 304 340 452 364 404 402 424 444 312

1212 410 566 462 440 362 280 440 442 512 398 438 360 320 438 612* 460 436 372 260 440 462 482 366 354 364 444 384 414 408 350 382 674 404 440 482 422 1084 444 524 280

TESTE DE IMERSÃO DE CAUDA - MACHOS Imersão de Cauda

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 326 514 422 362 362 4,69* 1* 1212* 332 612 492 400 422 1,33* 1,07* 422 364 634 428 368 368 1,34* 1,41* 464

158

400 552 414 446 364 0,72* 1,37* 392 844* 564 410 346 348 1,25* 282 402 330 652 540 428 410 1,41* 374 1288* 340 530 520 304 408 1,78* 368 380 364 540 345 448 370 316 410 484 352 552 348 458 412 376 382 542 342 546 470 1212* 404 326 372 660* 414 496 560 422 424 416 360 420 440 596 494 314 402 528 322 830* 430 482 310 382 666* 416 424 362 544 364 400 680* 374 382 316 460 360 408 308 400 384 284 330 432

344 316 476 408 310 532 320 358 396 350 394

TESTE DE NATAÇÃO - FÊMEAS Natação

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 4 4 4 4 4 3 3 3 4 3 4 4 4 3 4 3 4 3 4 4 4 3 3 4 4 3 4 4 4 3 4 3 4 3 4 4 4 3 3 3

159

4 4 4 4 4 4 3 3 4 3 4 4 4 4 3 3 4 3 4 3 4 4 4 3 3 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 4 4 4 3 3 4 4 4 4 3 4 4 4 4 3 4 3 3 3 4 3 3

TESTE DE NATAÇÃO - MACHOS Natação

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 4 4 4 4 4 3 3 4 4 3 4 4 4 4 4 4 3 4 4 4 3 4 3 4 3 4 3 4 3 4 3 3 3 3 4 4 3 4 3 4 3 4 4 4 3 4 3 4 3 4 4 4 4 3 4 4 3 4 4 4 4 4 4 4 2 4 4 3 3 3 4 4 3 4 4 4 2 4 3 4 4 4 4 3 3 2 4 4 3 4

160

4 3 3 2 3 4 4 3 3 4 4 3 3 4 2

TESTE ROTAROD - FÊMEAS Tempo 1° Queda

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 140 21 174 102 34 54 118 40 89 49 56 47 67 41 145 10

108 117 145 124 30 68 31 46 153 16 120 42 35 117 57 152 39 44 107 60 38 27 28 139

187 50 108 44 51 138 30 43 37 114 116 161 103 87 32 43

149 12 88 64 66 54 103 133 57 87 158 40 84 128 143 139 28 177 126 67 172 54 60 163 30 115 114 42 46 172 105

161

76 32 58 48 37 86 223 47 150 70 102 26 154 40

56 106 47 46 86 54 52 43

RPM 1° Queda SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

21 7 25 16 8 11 13 9 15 10 11 10 12 9 17 6 17 18 21 19 8 13 8 10 22 6 19 9 9 19 11 22 9 9 17 12 9 7 7 21

27 10 17 9 10 21 8 9 8 18 18 24 16 15 8 9

22 6 15 12 12 11 16 20 11 15 23 9 14 19 21 21 7 25 19 12 25 11 11 24 8 18 18 9 10 25 17 13 8 11 10 8 14 31 10 22 12 16 7 22 9

11 17 10 10 14 11 10 9

162

Tempo Final SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

167 108 185 150 100 180 247 110 119* 80 220 160 107 180 324 96 174 133 164 155 97 117 206 89 202 117 182 136 105 172 263 177 158 163 156 150 89 197 248 158 220 103 156 104 75 168 256 103 218 125 240 214 162 266 262 114 215 35 266 191 264 241 180 180 263* 224 221 144 260 276 188 199 248 234 173 92 257 298 172 212 256* 227 256 110 190 289 249 234 262* 247 239 123 222 267 111 243 114 228 87 241 118

160 245 129 97 120 154 116 122

RPM Final SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

24 17 26 22 16 27 24 17 18 14 30 23 17 27 28 16 25 20 24 23 16 19 19 15 28 18 26 20 17 25 36 25 23 24 23 22 15 28 34 23 30 16 23 17 13 24 35 16 30 19 33 30 24 36 36 18

163

30 8* 36 27 36 33 26 26 36 31 31 21 35 37 27 27 34 32 25 16 35 40 25 30 35 31 35 17 27 39 34 32 36 34* 33 19 31 35 17 33 18 31 15 33 18

23 33 19 16 19 22 18 19

Bolos fecais SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

6 0 1 0 0 0 2 0 6 3 3 0 0 6 0 0 6 4 11 0 0 0 0 0 4 0 0 2 4 0 6 5 5 1 6 0 0 0 4 6 3 2 4 0 3 10 5 3 3 4 4 0 3 3 3 4 3 2 3 2 0 7 1 3 6 2 2 3 4 0 0 0 4 5 0 1 7 5 0 0 5 4 0 2 5 3 0 1 3 0 6 1 0 4 1 4 0 0 2 0 3 4 0 1 4 0 3

164

0 0

TESTE ROTAROD - MACHOS Tempo 1° Queda

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 12* 93* 70 30 55 265* 101 77 9* 72 59 38 52 74 92 25* 56 45 77 30 65 62 38 150

103 65 67 47 54 150* 73 52 49 36 88 44 52 40 34 46*

10* 120* 58 50 117 104 65 163 39 80 8* 9* 34 40 29 45*

35* 93* 9* 10* 84 26 10* 158 45 86 8* 10* 112 29 45 28

24* 40 15 76 49 27 23* 10 54 150* 8 34 29* 27 90 96 56 96* 12 49 153 77 100 101

158 40 115 64 20* 99 110 114 86 20 98 35 27 17* 44

123 32 57 42 152 61 74 40 86 60 195 48 90 16 82 141 53

96* 47 65 175 50 65 46 36 43 43

165

RPM 1° Queda

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 5* 9 13 8 11 15 8 13 5* 8 11 9 10 7 7 7* 11 7 13 9 12 6 5* 22 17 7 12 10 10 10 7 10 10 6 15 10 10 9 9 10 5* 12 11 10 18 16 12 24 8 14 5 6 8 9 7 9 8 15 5 6 14 6 5* 23

10 14 5 6 17 9 9 7* 7 9 6 13 10 7 7 5*

10 22* 5 8 7 7 15 16 11 16* 6 10 23 13 16 16 23 9 17 12 7 16 17 18 14 7 16 8 7 6* 9 19 8 11 9 23 11 13 9 14 11 27 10 15 6 14 21 10

16* 10 12 25 10 12 10 8 9 9

Tempo Final SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

45 225 113 90 146 300 300 105

166

43 241 113 90 143 277 300 70* 90 229 112 97 126 300 300 290

115 230 103 108 100 300 300 100 95 242 121 88 95 90 155 80 44 230 76 108 155 119 133 180

125 140 37 63 132 65 156 71* 97 147 38 35 146 97 211 180 93 142 40 47 188 97 135 95

100 136 40 108 170 88 202 142 89 180 54 127 82 90 316 146

186 135 97 127 174 214 137 180 259 120 189 171 50 165 155 249 101 140 191 227 132 188 220 115 148 190 47* 103 268 164 188 256 201 95 220 168 234 230 110

135 256 122 239 116 242 102 278 91 90 90

RPM Final SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP

10 19 18 15 22 15 15 17 9 28 18 15 21 14 15 13

15 26 18 16 19 15 15 27* 18 27 16 17 16 15 15 16 15 28 19 15 16 15 23 14

167

9 27 13 17 23 18 20 26* 20 9 12 20 12 18 13 22 9 8 22 16 20 26* 20 9 10 25 16 15 15 19 9 17 25 15 19 21 26 10 19 14 15 28 22 20 16 19 25 30 21 26*

19 19 27 25 10 24 23 16 16 21 27 31 20 27* 15 18 22 27 10 16 16 24 27 35 28 16 15 24 32 32 17 26 20 35 19 35 33 18 34 33 16 31 37 16 36 15 31 15

Bolos fecais

SHAM AVP Mix 1 Mix 2 Mix 3 MIX1 + AVP MIX2 + AVP MIX3 + AVP 0 7 7 0 0 3 0 0 4 4 0 0 0 4 6 0 2 3 6 1 0 4 0 8 2 6 2 0 0 1 0 0 6 8 6 0 0 0 6 0 1 6 4 1 0 1 0 0 2 3 0 0 3 2 8 4 3 4 0 0 3 0 6 5 0 2 3 0 4 0 6 6

168

1 3 2 6 5 3 7 4 3 1 1 6 5 0 5 5 5 2 0 3 5 6 6 8 1 4 5 8* 3 4 2 3 2 0 9* 5 3 4 1 4 4 7 2 0 4 7 1 2 3 1 8 2 5 2 2 5 7 0 3 0 6 0 5 0 0 0

169

APÊNDICE B - VALORES BRUTOS REFERENTES AOS RESULTADOS DA

ANÁLISE PCR quantitativa (RT-qPCR)

Valores de Cq por grupo

Cq Dnmt3a Chd2

Média Desvio padrão Média Desvio padrão SHAM 1 2,21 0,25 2,06 0,96 SHAM 2 2,44 0,34 2,11 1,23 SHAM 3 0,25 0,04 0,39 0,01 SHAM 4 0,33 0,01 0,41 0,06 SHAM 5 0,63 0,06 0,51 0,08 SHAM 6 0,22 0,16 0,38 0,04 SHAM 7 0,34 0,06 0,55 0,08

Cq Dnmt3a Chd2

Média Desvio padrão Média Desvio padrão AV 1 1,00 0,06 1,23 0,71 AV 2 0,93 0,02 1,34 0,90 AV 3 0,27 0,06 0,29 0,01 AV 4 0,32 0,01 0,46 0,03 AV 5 0,29 0,04 0,37 0,00

Cq Dnmt3a Chd2

Média Desvio padrão Média Desvio padrão MIX 3_1 1,05 0,06 1,39 1,05 MIX 3_2 1,24 0,02 1,55 0,89 MIX 3_3 0,25 0,00 0,43 0,07 MIX 3_4 0,19 0,02 0,31 0,07 MIX 3_5 0,20 0,01 0,16 0,08 MIX 3_6 0,24 0,06 0,26 0,08

170

Cq

Dnmt3a Chd2 Média Desvio padrão Média Desvio padrão

AV+MIX 3_1 1,25 0,47 1,89 1,58 AV+MIX 3_2 0,92 0,03 1,22 0,66 AV+MIX 3_3 0,17 0,01 0,11 0,13 AV+MIX 3_4 0,21 0,00 0,31 0,04 AV+MIX 3_5 0,16 0,01 0,29 0,08 AV+MIX 3_6 0,39 0,49 0,15 0,18

Médias

Cq Dnmt3a Chd2

Média Desvio padrão Média Desvio padrão SHAM 0,92 0,97 0,91 0,80 AV 0,56 0,37 0,74 0,50 MIX 3 0,53 0,48 0,68 0,62 AV+MIX 3 0,52 0,46 0,66 0,73

171

ANEXO A- PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA