I1MSTYTUT FIZYKI JĄDROWEJ

INSTITUTE OF NUCLEAR PHYSICS

ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ СРИ31/1КИ

RAPORT No1511/B

CZY CHEMIZACJA ROLNICTWA ZAGRAŻA ŚRODOWISKU BARDZIEJ

NIŻ PROMIENIOWANIE ?

KRAKOW 1990

CZY CHEMIZACJA ROLNICTWA ZAGRAŻA ŚRODOWISKU BARDZIEJ NIZ

PROMIENIOWANIE ?

/MATERIAŁY Z BADA»? NAD MUTAGENNOŚCIĄ ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN/

POD REDAKCJA ANTONINY CEBULSKIEJ-WASILEWSKIEJ

KRAKÓW 1990

WYDANO NAKŁADEM INSTYTUTU FIZYK/JĄDROWEJ

IM. HENRYKA NIEWODNICZANSKIEGO KRAKÓW. UL RADZI KOWSKIEGO 152

Kopię kserograficzną, druk i oprawę wykonano w IFJ Kraków

Wydanie! Zam. 131/90 Nakład 80 egz.

Praca wykonana w problemie B4-02 s "Badania nad mutagennym

oddziaływaniem stosowanych w rolnictwie środków chemicznych",

w ramach programu CPSR 1O.13 "Metody radiacvjne w rolnictwie"

SPIS TREŚCI

1. BADANIA NAD MUTAGENNYM DZIAŁANIEM ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN A.Cebulska-Wasilewska, S.MacugoMSki, H.Płuciennik, R.Smolinski..7

2. ZASTOSOWANIE MUTACJI BARWNIKOWYCH CHLQRELLA V. I MUTACJI MITOCHONDRIALNYCH SACCHAROHYCES CER. DO OCENY . MUTAGENNEJ AKTYWNOŚCI ŚRODKÓW' OCHRONY ROŚLIN H.Płuciennik, S.Smoliński. 29

3. SYNERGIZM W INDUKOWANIU MUTACJI U TRAVESCAHT1A PRZEZ ŚRODKI

OCHRONY ROŚLIN WSPÓŁDZIAŁAJĄCE Z PROMIENIOWANIEM JONIZUJĄCYM

A.Cebulska-Wasilewaka, J. Smagała... S3

4. BADANIA WPŁYWU MUTAGENNEGO DECISU I DELTAMETKYNY NA TRADESCAHTIA

AUTOMATYZACJA ZBIERANIA DANYCH W.Wajda, A. Cebulska-Waeilewska 63

5. ZASTOSOWANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH I WYMIUN SIOSTRZANYCH

CHROMATYD W LIMFOCYTACH KRWI LUDZKIEJ W OCENIE EFEKTYWNOŚCI

ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN

A.Wierzewska , E.Kasper, B.Krzykwa. .....81

6.OCENA MUTAGENNYCH SKUTKÓW BADANYCH ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN

A.Cebulska-Wasilewska, J.Huczkowski , H. Płuciennik 93

WSTĘP

Właściwe oszacowania ryzyka wynikającego istniejących zagrożeA stanowi zagadnienie dość skomplikowane. Odczucie opinii publicznej nie zawsze jest oparte na racjonalnych przesłankach. Jest ona najbardziej wyczulona na zagrożenie związane z promienio¬ waniem jonizujący*. Na przykład ryzyko, jakie jest związane z prześwietlaniem klatki piersiowej odpowiada liczbowo ryzyku związanemu z przejechaniem samochodem odległości 1OO kilometrów. Ale, odczucie opinii publicznej historycznie uwrażliwionej na promieniowanie przypisuje na pewno większą wage pierwszemu. Tymczasem rosnące stale chemiczne zanieczyszczenie środowiska naturalnego staje sie poważnym problemem.

- W Polsce jak i na całym świecie stale zwiększa sie liczba produkowaynch związków należących do grupy środków ochrony roślin. Niezależnie od niewątpliwych korzyści płynących dla społeczeństw z podniesienia poziomu upraw, cześć tych związków stanowi równocześnie potencjalne zagrożenie dla środowiska i zdrowia człowieka. Ujemne skutki ich pojawienia si» w środowisku mogą sie objawić w postaci zwiększonej częstości indukowania rozwoju komórek rakowych, dziedzicznych uszkodzeń genetycznych, czy też nawet mogą być przyczyną tzw. dryftu genetycznego. Z tego powodu, szczególnej wagi nabierają badania, w wyniku których uzyskuje si» nowe informacje odnośnie kancerogenności lub mutagenności popular— nie stosowanych związków lub preparatów. Mamy nadzieje że przedstawione w niniejszej pracy rezultaty badań nad mutagennością niektórych stosowanych powszechnie środków roślin, stanowią ważne uzupełnienie tak potrzebnych informacji, odnośnie genotoksycznvch skutków tych środków . Z drugiej strony mamy również nadzieje że porównanie skutków biologicznych tych preparatów ze skutkami

biologicznymi promieniowania jonizującego, ułatwi właściwe

zrozu«ienie ryzyka wynikającego dla człowieka i Środowiska ze

stosowania tych środków, a w związku z ty« przyczyni si« do

rozważenia zysków i strat wynikających z ich. stosowania i być może

do lepszego sterowania ich użytkowaniem.

Antonina Cebulska-Uasilewska

BADANIA NAD MUTAGENNYM DZIAŁANIEM ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN

A. Cebulska-Wasilewska, S.Macugowski , H.Płuciennik, R.SmoliAski

USTĘP Wprowadzenie i stosowanie dużej ilaści nowych środków ochrony

roślin w rolnictwie spowodowało, że oprócz badań toksykologicznych coraz częściej pojawiają sie prac» dotyczące takich właśnie efektów wywołanych działanie*) tych związków u roślin i zwierząt. Najlepiej pad tym względem są zbadane związki z grupy insektycydów. Mniej uwagi do tej pory przywiązywano do badań nad herbicydami. Celem badań, kti5rych rezultaty częściowo prezentowane są w niniejszej pracy było zbadanie preparatów będących w aktual¬ nym zastosowaniu w rolnictwie obszarów Polski Płd, pod kątem ich mutagennej aktywności. W doborze preparartów do badań kierowano sie sugestiami Stacji Ochrony Roślin w Krakowie.

Ocenę mutagennej aktywności preparatów badanych przeprowa¬ dzono z zastosowaniem następujących metod badawczych: mutacji barwnikowych u Chlordl* vulgar is <1>, somatycznych u 7>a«tesca»tia (2) i mitochondrialnych u Smccharomyces cmr. <1). Postanowiono również przynajmniej dla niektórych 2 badanych związków przeprowa¬ dzić test idukowania aberracji chromosomowych i wymian chromaty-dowych w komórkach limfocytów (3>. Badania prowadzono na prepara¬ tach użytkowych, oraz wybranych substancjach aktywnych wchodzących w skład tych preparatów, takich jak: Aminopieijk oraz kwas 2,4— dwuchlorofenoksyoctowy, Afalon, Ambusz, Ripkord, Oecis 2,5 EC oraz deltametryna, Bi-5a, Prometen a także Tiuram. Ponadto przeprowa¬ dzono badania porównawcze stosując znane mutageny chemiczne takie jak np. akrydyna i EMS t metyl osułf oni an etylowy) oraz mutia -fizyczny tzn. promieniowanie jonizujące gammi i X.

ZWIĄZKI BADANE Aminopielik g

Najważniejsze ze związków chwastobójczych stosownych w Polsce można zaliczyć do dwóch grup : kwasów aryloksyalkanokarboksylowych oraz pochodnych mocznika. Jednym z tych preparatów jest Aminopie¬ lik, stosowany w uprawach zbóż ozimych. Składnikami aktywnymi w tym preparacie sat 2,4D / kwas 2,4-dwuchloro—fenoksyoctowy, w ilo&ci 36% / i dikamba / kwas 3,6—dwuchloro-2—metoksybenzoesowy -2,8% / *t formie soli dwumetyloaminowych. Struktura tych związków przedstawiona jest na Rys.1. Kwas 2,4 D przenika da tkanek -roślin głownie przez li&cie

r o - r ci o"- -vO)~0 -CH-C <° Y i Cl "vO)~0 -CH_-C <°> - С Y 4 7 "ч Y 4o i 7 ч ч CI u Cl OCH, O

kwas 2,40 dike (4,S> i działa podobnie do hormonów ro£linnych-auksyn (6) powodując nadmierny rozwój tkanek, skręcanie, więdniecie i usychanie roślin. Afalon Afalon należy do stołowanych często w Polsce herbicydów z grupy pochodnych mocznika. Jest to preparat produkcji Faebwerke Hoechst A6 / NRF /. Składnikiem czynnym tego preparatu jest linuron /N-/5 , 4-dwuchl or of <anyl o-N-metoxy-N • metyl -amoczni к -5ОЙ /. Wzór tego związku przedstawiony jest na Rys.lAr

O CH, Cl - <P> - NH - С - N ч

Rys.IB: monuron zwalczania chwastów jednorocznycł)

Cl - <O> -

Cl Rys.1A Stosowany

NH

on

0 II /

linuron jest

осн3

do

dwuliściennych w Marchwi, pietruszkach, ««larach, parach, kminku, zimnniakach, kukurydzy i słoneczniku. Herbicyd ten wnika przez korzenie i liście powodując zaburzenia w procesie fotosyntezy (4). Pod tya aspektem był dobrze przebadany w układach in vitro (6). Herbicyd ten odznacza sie znaczną stabilnością w glebie. И zależności od wilgotności i temperatury rozkłada sie w czasie 1-3 eiesiecy (4). Ambusz 25 EŁ, Riocord 4£

Kolejny* ZMUzkiM poddany* badanie* był Ambusz 25 ЕС. Należy on do grupy pyretroidów syntetycznych. Pyretroidy są substancjaMi wykazujący* działanie kontaktowe lub żałądkowe, ulegają silnej absorbcji na cząstkach gleby i w niskich temperaturach są bardzo toksyczne (7). Wy«ienione środki posiadają silne właściwości owadobójcze, działają na szkodniki już w dawkach dziesięciokrotnie mniejszych niż związki fosforoorganiczne lub karbaminiany. Aktywną rMbstancją Ambuszu jest permetryna o następującym wzorze chemicznymi

° Л / * Cl С

)c = CH -си - си - с - o - (5) - o - сн2 " Ф) Ci 0

Ambusz 2S ЕС zawiera 25Х tej substancji aktywnej i zalicza si» do IV klasy toksyczności. Zakres jego działania w uprawach roślin użytkowych jest rozszerzony aktualnie do zwalczania szkodników magazynowych.

Do tej samej grupy związków co Ambusz, wywodzących sie z' naturalnych pyretroidów będących pochodnymi kwasu pyretrynowego względnie estrów kwasu chryzantemowego, należy następny badany związek Ripcord, z tym że jego substancją aktywną nim jest permetryna lecz cypermetryna.

Decis 2.5 E£

Następnym badanym środkiem ochrony roślin był preparat Decis

2,5 EC i jego substancja aktywna deltametryna. Decis 2y5 EC jest

nazwą handlowa preparatu owadobójczego również o działaniu kontak¬

towym. Służy do zwalczania owadów gryzących i ssących w uprawach

rolniczych. Jego substancja aktywna biologicznie, deltametryna ma

następujący wzór strukturalny:

c ч o

C - C H - C H - C - C - C H 2 - ( o ) / CN \

Br °

<3-c»-cyjano-3~f enokeybenzylo-lRcie-3-2.2-dwubromowinylic-2.2-

dwumety1o-karboksylan)

Bi 58 EC. Prometen. Tturan

Preparatami należącymi także do grupy związków owadobójczych

były Bi-58 EC i Prometen, Bi-5S to preparat należący do U klasy

toksyczności zawierający 373Ł substancji aktywnej (dimetoat) tzn.

dwutiołosłoranu S—/N— netylokarbamyłometylo/-0,0 dwu<netylowego.

Prometen płynny to preparat owadobójczy o działaniu kontaktowym i

żołądkowym. Składniki aktywne w tym preparacie to: metoksychior

(127.), propoksur <77.) i eudosuHan <£>'/.>.

Ostatnim związkiem badanym był dwusiarczek—bis—N.N—

dwumetylotiokarbamidu o nazwie handlowej Tiuram i nastepulącym

wzorze strukturalnym ••

. СМзч S S /CH 3

N - C - S - S - C - N с нз ^ з

1O

Wchodzi on w skład preparatów użytkowych Sadoplon /5 oraz kaprawa nasienna T. Jest to środek grzybobójczy stosowany do zaprawiania nasion zbóż, warzyw oraz do ochrony papieru i skór. Uznawany jest za mało toksyczny dla ludzi. REZULTATY

W tabeli 1 przedstawiono zestawienie odpowiedzi zastosowanych testów mutagenności na badane preparaty i związki. Tabela 1

Odpowiedzi testów na Mutagenność dla rożnych badanych preparatów

handlowych oraz ich substancji aktywnych

Test Chlor*!1л v.-S»cch*romyces c*r.-Ггadcscantia-Abcrracj*.

Preparat chromom.

Aminopiel ik

2 , 4 D

Afalon

Atnbusz

Ripkord

Oecis

Deltametryna

Bi-58

Prometen

Tiuram

+• •

-

nb

*

nb

-

-

nb

nb

m ~

* wynik pozytywny zależny od

• * test wymian chrontatydowych

nb nie badano

-

-

nb

+

nb

-

nb

nb

-

roku produkcji

+•

nb

*/-

*

-

•

nb

4- »

nb

-

nb

nb

+ • *

nb

nb

nb

nb

Wpływ ekspozycji na preparat użytkowy A«inopi«lik na orzeżywalność oraz częstość mutacji indukowanych u Chlor tli» vulg. przedstawiono na rysunku 2. Linia. ciągła. przedstawiono

11

przeżywa!ność kolonii po traktowaniu różnymi stężeni aMi preparatu Ann пора eJ i к 88 i 89, natomiast linia, przerywana, efwkt Mutagenny zaobserwowany tylko u preparatu Aminopielik 88.

Zależność częstości zdarzeń letalnych oraz Mutacji somatycznych indukowanych w komórkach włosków pręcików 7 radescautia różnymi ekspozycja» na AMinopielik przedstawiono na rysunku 3. Zarówno w przypadku Chlortll* vulg. jak i w przypadku Tradescantia obserwowane zależności efektu Mutagennego od ekspozycji na mutagen Maja. charakter zbliżony do liniowej zależności.

-QS

«O

-i

-15

X

'• f 1

1

J AP№) /EFEKT LETALN

\ J -x-EFEKT , \ MUTAGENNY

2

t

i

0.5

&

O.0S OdO

RVS.2. uetalne i Mutagenne działanie preparatów aminopieliku roczni» 1Ч8в i 1989 na komórki Chlortll* vulg.

12

1 os 1 L as i I-о о

i a,

T-4430

Л skrócenie o różo** rvtoeje

30

1 Objętość mjtkowonego .roztworu tjjl)

RYS.3. Zal«±no£ć cz«Kta£ci «utacji różowych oraz tetalnych

(skróceń) ad wielkości ekspozycji na Aainopielik wyrałoncj

iloczyn** st«±ania i obj^toici injafcattanago roztworu.

T-4430 AFALON

. ЬоОопЫЖ

П 12 13 К 15 1$ Л » D K B » Овеп'ро troktoHWiru

RYS.4. Kształtowani» si« czvstoici autacji roiOMych i latalnych и komórkach włosków pręcików Tradcscaittia po traktowaniu roślin roztMoraai afalonu (&wi«zya i dwuletnia)

Badając mutagenny wpływ kwasu 2,4 D na Chlorella vulg, oraz na S»cch»romyces cer*v, nie stwierdzone istotnego statystycznie wzrostu częstości mutacji <1>. A+alon, Ambusz,

Przykłady mutagennego wpływu traktowania roślin Tradescantia

roztworami preparatu A-falon różniącymi się czasem ich sporządzenia przedstawiono na Rys.4. Preparat starszy cechuje się wyraźnie niższą toksycznością (wyraźne obniżenie częstości indukowanych mutacji letalnych) natomiast wykazuje on podwyższoną aktywność

«о О) - 1 •

-2

•Ъ :

-к

N.

\

\

> /

/х

А

7 / /

\

\ .

\ Q005

ч -F5

- 5

aoio o/e v/v

RYS.5. i_etalne i mutagenne działanie preparatu Ambusz 25 ЕС т

komórki Chlorella vulg.

0,40 0.20 %

RYS.6. Letalne i mutagenne działanie preparatu Ambusz 25 EC na

komórki Saccharomyce cer.

mutagenną. Na rysunku 5 przedstawiona wyniki przeżywałności i mutagenności uzyskane po traktowaniu Chlor ej la vulg. różnymi stężeniami preparatu Ambuss 25 EC, natomiast dane na rysunku 6 prezentują efektywność toksyczną i mutagenną tego preparatu stwierdzoną pD traktowaniu Saccharomyces cerev. Rezultaty badaiS e-tektywnoćci mutagennej Ambusz u w indukowaniu mutacji somatycznych u Tradescantia przedstawiono na rysunku 7. Dane wykazują, że we wszystkich trzech zastosowanych testach na mutagenność tego preparatu uzyskano wynik pozytywny.

Г-4430 AMBUSZ (gazowy)

. 0 mutacje różom» я -•- letolnt

fft5

I

i 11 12 » 1* /5 76 Dzień po traktowaniu

B.0

5,0 \

RYS.7. Hutaganny ««pływ preparatu Asbusz na rośliny Trmdmscmnttm

T-4430 RPCORD

(JOfjl Q0005V*)

i i

I i

• mutacje różowe v —- letalne

11 12 13 1< 15 Dzień po troktowaniu

6.0

5.0

RYS.8. Kształtowani* się częstości Mutacji u Tr*desc*ntia w

różnych dniach od traktowania roślin preparat** Ripcord

16

Ri pcord

Badania nad MutagennościĄ preparatu Rapcordu prowadzonych z

zastosowani** układu Modelowego Trmdmscmnti* były bardzo utrud¬

nione ze względu na silne obniżenie intensywności kwitnienia pod

wpływea działania tego preparatu. PO M I M O tego, stwierdzono jednak

wyraźny wpływ tego preparatu podwyższający cz«sto£ć Mutacji soMa-

tycznych u Tr»desc*nti* Rys.8.

Decis i deltaeetryna

Mutagenna, efektywność preparatu użytkowego Oecis 2.S EC

badano zarówno na Mikrobiologicznych Modelach Mutacyjnych

Chlormlla yulc. i Smcch*rowycms ctrtv. jak również na Modelu

Tradcscantia.. Preparat wywołuje silny efekt letalny u

S*cch*ro*yc*s cer«к. natoMiast nie zwiększa częstości występowania

mutantów barwnikowych u Chlorell*. Działanie tego preparatu na

МЛС/

100 •о. во.

60' so. 4О so to. 10.

aott 0.0ц o.*»* 04» o.(

RVS.9. Mutagenne działanie preparatu DEC1S na SaccAaroeyces.cer*v.

17

Saccharomyces cer cv. również wywołuje silny efekt letalny. W zakresie stężeń do O,07 um/ml nie zaobserwowano powstawania mutacji ffiitochondrialnych u Saccharomyces cerev., r. atorni ast wyższe stężenia wywołały gwałtowny wzrost częstości pojawiania się mi ni kolonu. Zjawisko ta jest najprawdopodobniej skutkiem toksycznego działania tego preparatu na mitochondria <Rys.9.>. Traktowanie ChlorelJa vulg. i Saccharomyces cerev, alkoholowy* roztworem deltametryny nie wykazało mutagennego działania tej substancji. Odmienne rezultaty uzyskano badając ten preparat na roślinach Tradescantim. Wprawdzie .zaobserwowane podwyższenie częstości mutacji u Tradescanti* na skutek traktowania roślin preparatem Decis 25 EC jest niewielkie i brak powtarzalności we wszystkich eksperymentach, ale za to wyraźny efekt występuje dla deltametryny. W przypadku deltaaetryny rozpuszczonej w DMSO, którą potraktowano kwiatostany, obserwowany efekt Mutagenny jest statys¬ tycznie istotnie różny od poziomu mutacji występującego w grupie kontrolnej (Rys.10).

T-4430 * * J.0-

i

§05

I

Ipgdeltametryna 2jjg •»• Decis

5.0

V 12 13 li В 16 П 12 13 U 15 16 Dzień po traktowaniu

RYS.10. Kształtowanie się częstości mutacji różowych i 1eta1nych u Tradesc*ntia w różnych dniach od traktowania roślin preparatem Decis oraz deltametryną

18

Bi-58, Pr ometen Po traktowaniu roślin preparatem Bi-58 o stężeniu zalecany»

do stosowania w rolnictwie, nie stwierdzono wpływu na podwyższenie częstości mutacji u Trad*sc»ntia. Traktowaniu poddano grup* ^100 roślin i nie stwierdzano statystycznie istotnego wzrostu częstości mutacji różowych u Tradtscantia. Podobnie, duż* grupę ClOO) roślin potraktowano roztworem Prometenu o stężeniu zalecanym do zastosowania w praktyce ^0,3X. U railin tych stwierdzono podwyższenie poziomu mutacji <O,34mut/lOO), w zitiązu z powyższym w miarę możliwości będą. kontynuowane badania nad tym związkiem. Tiuram

W badaniach nad wpływem traktowania kultur Chlor el la vulg.

oraz Saccharomycas c*r*v. roztworem alkoholowym Tiuramu м t poziom mutacji indukowanych u tych kultur, nie stwierdzono mutagennego efektu tego traktowania <1>. BADANIA PORÓWNAWCZE

Prowadząc badania nad mutagennością, preparatów użytkowych oraz ich substancji biologicznie czynnych stwierdzono, że aby podJĄĆ próbę oszacowania stopnia ewentualnego zagrożenia środowiska wynikającego ze stosowania badanych preparatów konieczne jest porównanie skutków biologicznych badanych prepa¬ ratów z efektami wywołanymi przez znane mutageny . Do tego celu wybrano akrydynę, EHS, i promieniowanie jonizuja.ee.

Akrydyna

Akrydynę wybrana do badań mutagenności w przypadku Smccharo-

eyces c*r*v. ze względu na «akt, że ЕИБ nie wywołuje mutacji mitochondrialnych u drożdży. Zależność efektów mutagennych i letalnych u Saccharoeyces c*r»v. od stężenia oraz objętości zasto¬ sowanej do badań akrydyny przedstawiono na Rys.11.

19

• z

CpZ/jMOUML

RYS. 11. Letalne i mutagetjne działanie akrydyny na i:o«órki

Smcch*romycms cmrmv.

it M

RYS. 12. Lwtalnc i mutagenne działanie EMS Chlormlla rulcans.

20

я ••*

• • !

KKSFOZTCJA HA

•к К M 41 M M

- Gbjatośó iajakotmaa x rtaiaaia

RYS. 13- Wpływ %tmtmni* EMS na cz*sto*<± Mutacji u 7r«d*scai»ti»

-*-EFEKT LETALNY ) - х - EFEKT I

MUTAGENNY j

100 200 KRAD

RYS.14. Letalny i autaqanny ирЗум proMianicwania na CAiorciia

-Q8

50 iOO ISO KRAD

RYS.IS Letalne i mutagenne działanie promieniowania gamma na

komórki Smcch*romyc*s c*rmv.

EMS

Częstość mutacji barwnikowych oraz letalnych u Chlorella

vulg. oraz różowych u Trmdmscmnti* wywołanych działaniem roztworów o różnych stężeniach EHS-u przedstawiono odpowiednio na rysunkach 12°i 13. Promieniowanie jonizujące.

Wpływ wielkości dawki pochłoniętej promieniowania gamma na częstość zdarzeń mutacyjnych i letaJtuych indukowanych u Chlorella

vulg. przedstawiono na Rys 14, natomiast u Sacc/iaro»yc*s certf. na

22

Rys. 15. Zależność od dawki promieniowania X efektów obserwowanych u Tradescantia przedstawiono пл Rys. 16 12). DYSKUSJA

W przypadku preparatu Aminopieliк stwierdzono u Traóescantia

aktywność mutagenna, wszystkich badanych preparatów , natomiast u Chlorella vulg. агат: Saccharomyces cer mv. tylko preparat z roku 1988 wykazywał cechy mutagenna. Nie stwierdzono natomiast aktywności Mutagennej preparatu Aminopielik 89 ani też -formy aktywnej tego preparatu tzn kwasu 2,4 O. Ponieważ 2,4 D Jest składnikiem wielu herbicydów, badano jego genotoksyczna. aktywność przy użyciu rożnych testów na bakteriach (8>, komórkach roił innych (9) i komórkach zwierzęcych (10) И przypadku użycia czystego chemicznie związku z sześciu stosowanych testów w czterech nie stwierdzono w ogóle jego wpływu na wzrost poziomi mutacji. Dodatnie wyniki genotoksyczności uzyskano tylko na bakteriach Bacillus subtil is szczepów rec* i rec~ (8) i koeorkach merystemu korzeniowego Allium cepa (10). Drugi składnik Aminoprelika D -dika*ba był aktywny w dwóch z czterech stosowanych testów, oba były przeprowadzane na bakteriach (8). Należy jednak podkreślić, że preparaty stosowane w rolnictwie w zależności od tecłmologii ich uzyskiwania zawierają, r^tnm iloSci zanieczyszczeń, wśród których »ożna wyliczyć kwas 2,4,5-trichlorcrfenoksyoctowy, 2,4,5-trichloro-fenol, 2,4-dichlorofenol i inne. Również w literaturze występują doniesienia, że takie komercyjne preparaty 2,4 O różni* sie od czystego 2,4 O genotoksyczno&cia. <1O>.

Preparat Afalon w badaniach prezentowanych w niniejszy* opracowaniubadano tylko z zastosowanie» testu na Tra<tmscaatim.

Wykazał on mutagenny wpływ na rośliny, poza tvwstwaerdzono, śe mutagenność tego preparatu wzrasta w czasie jego "starzenia

obniżania jego toksycznych właściwości 2 grupy związków pochodnych mocznika i zbliżonych bard*w

budową do Afalonu genatoksyczne właściwości badano dla monuronu (Rys.IB). Z pięciu stosowanych testów tylko « jednym teście мука* zуwal on własności mutagenne (8).

Wydaje się również, że interesująco wygląda porównanie rezul¬ tatów uzyskanych dla preparatów Ambusz i Decis. Posiadają, om» zbliżone cheaiczn^ budowa, substancje aktywne. W trzech zastosowa¬ nych testach nie stwierdzono aktywności Mutagennej preparatu Decis-58 natomiast wszystkie zastosowane testy wykazały mutagenność Ambuszu, w którym permetryna jest substancja, aktywna.. Tylko test oparty o mutacje somatyczne u Tradmscanti* wykazał aktywność mutagenna.,roztworu substancji biologicznie aktywnej preparatu Decis, w uznawanym za biologicznie obojętnym rozpusz¬ czalniku, tzn DMSO. Fakt ten może zarówno Świadczyć o wyjątkowej wrażliwości 7r*desc*ntią, ewentualnie może być efektem współdziałania pomiędzy rozpuszczalnikiem a substancją aktywna, i byłaby właściwe sprawdzenie na Tr*d*sc*ntia mutagenności tej substancji rozpuszczonej np w alkoholu.

Ostatni z badanych insektycydów nie wykazał aktywności muta-ge nnej ani w odniesieniu do Chlormlla v. ani do S*cch*rowycms с W tabeli 2 przedstawiona częstości mutacji indukowanych przez badane związki i obsaerwowanyeh nm poziomie 5ОХ przeżywałności komórek poddanych traktowaniu. Pozwala to na porównanie ich efek¬ tywności mutagennej z aktywnością, mutagenna, znanych mutagenów chemicznych a także promieniowania jonizującego. Pozwala również na próbę klasyfikacji tych związków w zależności od ich efektywności w wywoływaniu skutków pożądanych tzn toksycznych oraz niepożądanych czyli mutagennych.

Tabela 2 Częstość mutacji <2> indukowana przez badane preparaty i związki, w różnych testach n* poziomie SOX przezywałnoici komórek testowanych

Chlorell* v., S*ccharowyc9s c*r*v., Tradmscantim

2.63 " 45.О O no

0,91 11,71 O 2,O2

no. 2.S

nb 29.46 3,3 2,74

O 0,55 O 12,O3

nb O

nb ? O nb

nb 17,85

o,32 nb

Pro«i eni owani e Kwas 2,4 D

Aminopielite 88 Aminopielite 89

Afalon

Afalon (dwuletni) A M O U S Z

Decis Deltametryna

Bi-58

Proneten Tiura«

EMS Akrydyni=

0.13 0

0,0075 О

nb

nb 0,0018

0 0

nb

nb О

0,12

nb

Oceniając przab»dmnm preparaty z tego punktu widzenia, w świetle przedstawionych w tabeli 2 zdolności outagennych tych preparatów wydaje sie, że najmniej korzystne - w praktyce jest stosowanie preparatów Ambuszu i Aminopielika.

25

LITERATURA CYTOWANA 1. Płuclennik к., Sroolinski S., Zastosowanie mutacji barwnikowych

ChlifreMa v. i mutacji mi tochondriainych Saccharomyce-s cer. do oceny mutagennej aktywności Środków ochrony roślin.

Raport IFJ w druku. 2. Cebul ska-Wasi lewska A., Działanie mutagenne promieniowani.-; jonizującego oraz czynników chemicznych i środowiskowych u 1r adeseantia

3. Wierzewska A., Kasper E., Krzykwa В., Aberracje chromosomowe i wymiany chromatyd siostrzanych w lim-focytach krwi ludzkiej w ocenie efektywności środków ochrony roślin. Raport IFJ w druku

4. Byrdy S., Borecki K., Łaszcz E.: Pestycydy. PWRiL 1976.

5. Zimmermann N.H., Milburn J.A. <cds> Transport in Plants. Phloem Transport, Encyklopedia of Plant Physiology New Series, vol. 1. Springei—Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1975.

6. Corbett J.R.: The Biochemical Mode of Action of Pesticides. Academic Press, London-New York 1974.

7. E.Markiewicz—Jodko, Perspektywy stosowania w ochronie roślin nowych insektycydów z grupy syntetycznych perytryn., Ochrona Roślin, 6,6-7, 1978.

8. Klopman 6., Contreras R., Rosenkrans H.S., Waters II.D.: Structure Qenetoxic Activity Relationships o* Pesticides. Comparison of the Results from Seweral Short-Term Assays. Mutation Res. 147 <19B5) 343-356.

9. Fiskesje G., Lessen C., Renbarg L.: Clorjnated Phenoksyacetic Acid and Chlorophenols in the Modified Allium Test. Cheat. -Biol. Interact. 34 <1981) 333-344.

10. Mustonen R., Kanges J., Vuojolahti P., Linnainmaa K.s Effects of Phenoxyacetic Acid on the Induction of Chromosome Abberations

2b

in Vitro and in Vivo.

11. Carresnogenicity and pesticides Jssnes and Relationships Am.

Cheat. Soc. Sympasiua. Series. No 414. 1990.

27

ШХАСЛ ЗАШЛКОШХСН Chlorella vuig&ris I «JIACJI

H SaccharomjceE cerevis iae 20 QCMX i.J2AGJŁuiSJ

AŁIIMOŚCI ŚRODKÓW ОСНБШХ ВО&П;

H. Płuciennik i 8 . Smoliifeki

Uniwersytet Warszawski, wydział Chemii

I. W p r o w a d z e n i . * Chemizacji rolnictwa towarzyszy zanieczyszczanie środowis-

Ica różnymi substancjami chemicznymi. Hiektóre.s olch acgą bjft mutsgenami. Substancje te bezpośrednio lub pośrednio mogą prse-nikać do organizmu człowieka i wywoływać mutaoje. Istniej* doeć ścisły związek pomiędzy mutagenną i kancerogenną aktywnością / 1-10 /. Dlatego każda substancja mutagenna może okazać mif kancerogenem. Z tych względów wydaje sif weJne oznaczanie auta» gennea aktywności wprowadzanych do środowisk* substancji chemi¬ cznych. Temu problemowi dotychczas nie poiwięcono dostatecznej uwagi. Ola przykładu, w jednym z nowszych opracowań, dotjczą-cych biologicznej aktywności biocydów i regulatorów wzrombu / 11 /, o mutagennej aktywności wogóle sit ai« wspomina., cho¬ ciaż od dość dawna wiadomo, że niektóre biocydy są silnymi mu-tagenami / 12,1? /.

W tej pracy opisano stosunkowo proste metodyki oznaczania mutagennej aktywności środków chemizacji rolnistwa, w których wykorzystuje się dwa różne modele mutacyjne: model mutacji bar¬ wnikowych jednokomórkowego glonu fotosyntezującego Chlcrella vulgaris, oraz model mutacji mitochondrialaych /oddechomych/ drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae. Opisane metodyki

mośaa traktować jako próbę rozszerzenia baterii już opracowa¬ nych metod oznaczania mutagenności» t.zw. testów skróconych, opartych na wykorzystaniu różnych mikroorganizmów, takich jak bakteriofagi /14,15/, bakterie Bacillus subtilis /16,17/, Sal¬ monella typhimurium /18-25/ i iacherichia coli /24-26/, oraz drożdże /27-30/. Jedna z opisanych w tej pracy metodyk stanowi rozwinięcie sygnalizowanej wcześniej możliwości wykorzystania do tego celu mutacji barwnikowych glonu Chlorella /31»32/.

Przesłanki wyboru modelu mutacji barwnikowych Chlorella v. były następujące: 1. Prosta i ogólnie dostępna mikrobiologiczna technika pracy z tym mikroorganizmem na agaryzowanym podłożu z glukozą jako źró¬ dłem węgla, umożliwia niezawodną i ilościową rejestrację zaró¬ wno wszystkich żywych komórek /zielone kolonie/, jak i mutantów barwnikowych /kolonie białe, sałatkowe, żółte, szeroka gama żółto-zielonych, ceglasto-czerwone/. 2. Aparat genetycznej kontroli złożonych szlaków biosyntezy bar¬ wników fotosyntetycznych, oraz genów regulujących funkcjonowa¬ nie tego aparatu, jest również bardzo złożony i fizycznie duży /szacunkowo kilkaset genów - kilkaset tysięcy nukleotydów/. Po¬ szczególne geny tego kompleksu są zlokalizowane zarówno w DNA jądra, jak i chloroplastu / 33 /. Dzięki temu mutacje barwniko¬ we powstają z względnie wysoką częstotliwością /spontanicznie około 6 z 10~v> Umożliwia to ilościowe oznaczenie częstotliwo¬ ści powstawania mutacji nawet dla mało aktywnych mutagenów. 3* Mutacje barwnikowe są mutacjami prostymi /w odróżnieniu od wykorzystywanych w wielu testach mikrobiologicznych mutacji wstecznych od stanu zmutowanego do dzikiego fenotypu/.

30

Dlatego w przypadku autami barwnikowych ur.ika sie, zjawiska specyficzności mutagenezy, mogącej mieć istotne znaczenie w przypadku mutacji wstecznych. 4-. Dzięki stosunkowo wysokiej częstotliwości powstawania muta¬ cji barwnikowych można je ilościowo oznaczyć, wykorzystując dziki szczep - z normalnym systemem naprawy uszkodzeń ОДА. Szczepy o podwyższonej wrażliwości na działanie mutagenów /z uszkodzonym systemem naprawy DiłA/, często wykorzystywane w te- . stach. mikrobiologicznych, mogą cechować.się zróżnicowaniem wra¬ żliwości na różne czynniki mutagenne.

Przesłanki wyboru modelu mutacji mitochondrialnych /odde¬ chowych/ drożdży Saccharomyces cer. były następujące: 1. Mutanty mitochoadrialne /oddechowe/, odkryte' przez Ephrussie-go przed około 40-tu laty, powstają z dużą częstotliwością /spontanicznie 0.5 - 3 x 1 0 /. Sugeruje to, że test opart; sa tym modelu mutacyjnym może być znacznie bardziej czuły, niż oparty na modelu mutacji barwnikowych Chlorella. 2. Mutanty te mogą być niezawodnie i ilościowo oznaczone na po¬ dłożu różnicującym, zawierającym jako główne źródło węgla foray nie ulegające fermentacji /np. glicerol/t oraz glukozę /force ulegająca fermentacji/jako marginalne źródło węgla. 3. Molekularna istota tych mutacji jest dość dobrze poznana / 54, 35/i zawsze przyczyną mutacji jest albo duża delecja w mitochondrialnym Ш Л /mutanty rho*~/, albo jest to związane z całkowitą utratą zego ША, prowadzącą do pełnego zaniku aito-cnondriów w komórce /mutanty rho°/« Z tego względu zarówno mu¬ tanty гдсГ jak i rno° są mutantami nierewertującymi. Powstające równolegle inae rodzaje mutantów mitochondrialnych /syn" i mit"/

są wynikieb mutacji punktowych, mogą ulegać rewersji, w związ¬ ku z azym w warunkach doświadczenia ulegają mutacjom wstecznym do dzikiego fenotypu rho+ i nie są wykrywane.

Jak wynika z powyższych przesłanek» wybrane dwa modele mu¬ tacyjne zasadniczo różnią się między sobą: mutacje barwnikowe są rezultatem .. szerokiej gamy zmian zarówno w DNA jądra, jak i chloroplastu, lecz nie w DNA mitochondriówj mutan¬ ty mitochondrialne rho~ i rho° są rezultatem dużych delecji lub całkowitej utraty mitDłłA. W związku z tym można oczekiwać, że wyniki testowania tej samej substancji chemicznej przy pomocy tak różnych modeli mutacyjnych będą się różniły. Dla przykładu można oczekiwać, że mutagen wywołujący głównie mutacje punktowe będzie mało efektywny w odniesieniu do modelu mutacji mitochon-drialnych, natomiast może być efektywny w wywoływaniu mutacji barwnikowych. Doświadczalne potwierdzenie tych oczekiwań może umocnić ogólnie* akceptowaną tezę o potrzebie testowania substa¬ ncji na ich mutagenną aktywność przy pomocy wielu różnych tes¬ tów /36/. II. M £ 1 O D X E Л T E S T O W A N I A II. 1. M o d e l m u t a c j i b a r w n i k o w y c h

Do hodowli komórek Chlorella vulgaris służy podłoże płynne lub agaryzowane, o następującym składzie: Podłoże płynne: Makroelementy i makroskładniki /g/dcnr/ Ki«>5 1.09 CaCl2 x H20 0.025 Ł-:2K>4 0.90 ?eS04 x 7 HpO ...0.0069

0.26 N x. 7 E20 0.25 Glukoza ..20.С

Mikroelementy /mg/dcnr/ aaflO4 0.169 CuSO4 x 5H20 ...C.0025 HjBO^ 0.061 /ЙН4/2ИоО4 0.124 7.пЯ04 I 7 H20 0.287 So nannażania pojedynczych, komórek i uzyskiwania kolonii sto¬ sowano płytki agaryzowane w szalkach. Petriego z podłożem sta¬ łym o następującym składzie / w g/dcnr/ t Podłoże płynne ....... 1 den' Pepton ................ 1 Agar 20

Hodowlę komórek zarówno w podłożu płynnym, jak i na płyt» kach agarowych, prowadzono sterylnief w temp. +30°c, bez sta¬ łego oświetlenia i wymuszonej aeracji. W takich warunkach czas podwojenia liczebności populacji komórek w podłożu płynnym wy¬ nosi około 6 godzin, natomiast na płytce agarowej każda żywa komórka po upływie 8 - 1 0 dni wytwarza makrokolonię o średnicy do 4 mm.

Testowanie substancji chemicznej na jej ewentualną muta¬ genną aktywność przeprowadzano według następującej procedury. Do serii próbek hodowli płynnej o gęstości około 10 8 komórek w mililitrze wprowadzano sterylnie badaną substancję /np w postaci roztworu alkoholowego/ w takich ilościach, aby uzyskać określone jej stężenia. Jedna z próbek /kontrola/ nie zawiera badanej substancji, a jedynie alkohol w takiej ilości, jak próbki z badaną substancją. Następnie prowadzono inkub&cję próbek w temp. +50°C przez okres czasu, wystarczający dc zre¬ alizowania przez komórki 2 - 5 podziałów komórkowych /stosowa¬ no inkubację przez 12 godzin/. Po zakończeniu inkubacji supo-

33

więdnie rozcieńczenia każdej próbki wysiewano posiewes niuraw-kowyc aa pływki z podłożet stałym. Płycki iiusibowano w temp. +30°C przez S - 10 dni. Po tya czasie każda żywa komórka wycwa-rza aa płytce makrokolonię. Komórki niezmutowane wytwarzają zielone kolonie, natomiast te, w których pod wpływem badanej substancji nastąpiło uszkodzenie jednego z genów, determinują­cych biosyntezę barwników, wytwarzają kolonie o barwie innej, niż zielona /białe, żółte, żółto-zielone itd/. Oznaczanie prze-żywalaości "S" sprowadza się do zliczenia kolonii na płytkach kontrolnych / N /, oraz na płytkach o danym stężeniu badanego czynnika mutagennego / #„/• Przeżywałaość wyliczano ze stosun-toi! N„

8 =1 "o

Oznaczanie częstości powstawania mutacji barwnikowych sprowadza się do zliczenia na tych samych płytkach tylko liczby kolonii barwnych / n c/. Wskaźnik częstości mutacji wyliczano ze stosun­ku: n c

Wyniki, otrzymywane w rezultacie przeprowadzenia opisanej pro¬ cedury badawczej, umożliwiają wyznaczenie podstawowych zależ¬ ności, niezbędnych do wytestowania badanej substancji pod ką¬ tem jej aktywności mutagennej} przeżywalność "S", oraz czę¬ stość powstawania mutacji "m" jako funkcje wielkości ekspozycji na dany czynnik mutagenny. Dla ilustracji możliwości opisanej metodyki można przytoczyć wybrane przykłady oznaczeń testowych, wykonanych dla kilku biocydów, oraz dla promieniowania gamn& i klasycznego mutagenu chemicznego /metylosulfonian etyiewy

34

-Ii.'iI3 /, wyKcrzystanysh w charaiuerse mutagenćw odniesienia, j'a wykresach., przecsTuivionych na lig* 1 i 2, pouano wyniki canacceń. efeireow istŁlaego i outugs.nnego, wywcływanycu przez dwie substancje pochodna trćjazyny - desoetrynę i terbutrynę -będące składnikami оаулаутх niektórych preparatów użytkowych. i!a wykresach., przedstawionych na Pig. 5 podano tylko wielkości efektu letalnego, wywoływanego przez trzy substancje, należące do tei samej grupy biocydów; kwas 2,4-dwuchiorofenoksyoctowy /2,4-D/, sól aooaiową kwasu / ~ /-2-/4-chloro-2-metylofenoksy/-propionowego /ŁIEGOPROP - WFP /, oraa 5-/5»4-dwuchlorofeaylo/ /1*, 1'-dwumetyiomocznik /DIURON/. Wszystkie trzy substancje wywołują silny efekt letalny, natomiast praktycznie nie wywołu¬ ją mutacji barwnikowych* -tfa wykresach, przedstawionych na Pig. 4 i 5 pokazano te same efekty /letalny i mutagenny/, wywoły¬ wane przez metylosulfonian etylowy / SUS /, oraz przez promie¬ niowanie gamma kobaltu-60. Jak wynika z przytoczonych danych» model mutacji barwnikowych Chlorella vulgaris poprawnie testuje substancje chemiczne na ich mutagenną aktywność. Świadczy o tym wywoływanie jak efektu letalnego, tak i mutagennego przez EMS /Pig. 4/, oraz przez promieniowanie gamma /Fig. 5/» Są to od dawna znane czynniki mutagenne i na ich działanie powinien po¬ zytywnie reagować każdy model mutacyjny, rekomendowany w cha¬ rakterze układu testującpgo.

Interesującą możliwość stwarza odniesienie efektów nnrca» свпатси, wywoływanych przez różne czynniki, do "cej samej wiel¬ kości efekvu legalnego, rakie noraowaoie względem efektu letal¬ nego dla 7.'sz?stkich omawianych w tej pracy biocydów zostało zaprezentowane ла «ykrssach, prseastawionych na lig. 6.

Oprócz odpowiedzi na pytanie» czy badana substancja wykazuje właściwości mutagenne, zestawienie takie umożliwia ilościowe porównanie mutagennej efektywności różnych biocydów, o niezna¬ nym mechanizmie działania na Ш . Rzeczywiście* na podstawie danych, zilustrowanych na Fig. 6 można ułożyć następujący sze¬ reg mutagennej efektywności: PROU.GAlffluN SUS/ ТНШиЗВШкЛ DBSHMRYNA.) MCEP=DIUR0N=2,4-D Ponadto, porównując wielkości tangensów kątów nachylenia pro¬ stych, przedstawionych na Pig. 6 , można i l o ś c i o w o oszacować mutagenną efektywność porównywanych czynników w fc*eł» liczbowych indeksów efektywności. Przyjmując wielkość tangen.su kąta nachylenia prostej dla promieniowania gamma jako jednostkę takiego indeksu, wprost z wykresów Pig. 6 można odczytać na¬ stępujące wielkości względnej mutagennej aktywności dla poszcze¬ gólnych biocydów: raołi.GAmu sus тжзиазша DSSMBIRYNA MCPP DIURON 2,4-D

1 0.3 0.2 0,05 0 0 0 Na tej podstawie można uważać, że np Terbutryna jest mutagenea czterokrotnie bardziej efektywnym, niż desmetryna. Informacje tego rodzaju, dostarczane przez opisaną technikę testowania, mo¬ gą być przydatne w praktyce rolniczej i w ochronie środowiska, kiedy występuje możliwość dokonania wyboru pomiędzy różnymi biocydaai o podobny* działaniu. Dane tego rodzaju pozwoliłyby dokonać wyboru stanowiącego mniejsze zagrożenie mutagenne dla środowiska naturalnego. II.2. M o d e l m u t a c j i m i t o c h o n d r i a l n y c h .

Drożdże piekarskie Saccharooyoes cerevieiae są jednokomór¬ kowymi organizmami eukariotycznymi, należącymi do grupy tlenow-

36

ców fakultatywny cii. Głowią ?&c;.~, oarożaiająccj ^e oa "-enowcow, jest zdolność do realizowania w atmcsierŁ& oe-w^e^owej procesów giikolizy i fermentacji, stanowiących su^err.utywne względem spalania tlenowego źródło ATP. Procesy te są determinowane przez geny, zlokalizowane w M A jądra komórkowego» Natomiast procesy oddychania tlenowego są realizowane w mitochondriach i są determinowane przez geny zlokalizowane w mitochondrialmym DNA /mitDNA/. Gdyby w komórce, należącej do grupy tlenowców, .::i.z„i nastąpiła dezaktywacja, lub eliminacja mitochondriów, zostałaby ona pozbawiona źródła ATP i musiałaby zginąć. Natomiast w przy¬ padku drożdży inaktywacja czy utrata mitochondriów nie musi prowadzić do śmierci komórki, jeżeli tylko w podłożu będą obec¬ ne formy węgla, ulegające fermentacji /np glukoza/* W propono¬ wanej technice testowania biooydów na ioh mutagenną aktywność, wspomnianą wyżej właściwość drożdży wykorzystuje się do detek¬ cji mutantów oddechowych, /mitochondrialnych/, u którycn wskutek mutacji w mitDNA następuje utrata biologicznej aktywności mito¬ chondriów. Technika wykorzystania tej możliwości jest następu¬ jąca. Jeżeli skonstruujemy skład podłoża dla drożdży w taki sposób, że głównym źródłem węgla w nim będzie forma nie ulega¬ jąca fermentacji /taką formą jest glicerol/, natomiast źródłem marginalnym będzie forma ulegająca fermentacji /np glukoza/, to na takim podłożu mogą się rozmnażać zarówno komórki wyposa¬ żone w sprawne mitochondria, jak i mutanty z uszkodzonym apara¬ tem genetycznym tych organelli. Z tą jednakże różnicą, że w takim samym czasie na w/w podłożu utwardzonym agareo iomorki niezmutowane wytworzą makrokolcnie, gdyż w pcaic-u -na^cu^e się duża ilość przyswajalnej dla nich formy -vegia, .lazc^asr kemor-

ki, в których została wywołana ausacja w nitL«At isytworzą si-aikolonie, &ayż dla nicn przyswajalną na drodze feraantasji formą węgla będzie glukoza, obecna w podłożu w marginalnej ilo¬ ści. "Wychodząc z przedstawionej możliwości morfologicznego róż¬ nicowania kolonii komórek nieznutowanych i mitociicn^riainycii mutantów oddechowych drożdży, dla ilościowej detekcji tyол mu¬ tantów stosuje się agaryzowane podłoże różnicujące /YEPóif/ o następującym składzie: ekstrakt drożdżowy 10 g pepton 10 g glicerol 20 g glukoza ......* 5 g agar 20 g bufor fosforanowy pH 6.6 do 1 dcm'' Natomiast do namnażania komórek drożdży stosuje się podłoże płynne lEPglu o składzie: ekstrakt drożdżowy ..... 10 g glukoza ....*.... 20 g pepton 10 g bufor fosf. pH 6.2 do 1 dear

Metodyka testowania substancji cnemiczaych pod kątem możli¬ wości wywoływania przez nie mutacji mitocńoadrialnycii jest na¬ stępująca. Do serii próbek nodowli komórek drożdży na podłożu płynnym wprowadza się badaną substancję w ściśle określonyca stężeniach, następnie próbki inkubuje się w temp. + 28°C przez okres czterech godzin. W tym czasie w nodowli kontrolnej zacno-

. dzi kilka /2 do 3/ podziałów komórkowycn. Po inkubacji odpowied¬ nie rozcieńczenia każdej próbki zostają wysiane posiewea muravs-kowym na płytki z podłożem różnicujаоуь IBrdif. Płytki inćubuje się w temp. +28°C przez 3-4 ani. Po гут czasie każda żywa kosor-

&.£. ero za ay wye war2a so^onif. лоьог^ . ^.iss^ux

aaKrckolo-iie о irsd^-^y ас - за, aatCEiasT; Eutaaty orcecaowe

/aitocncndrialae/ wycwarzają mlrtśkolonie o sreemicy około pię¬

ciokrotnie mniejszej. Przeżywainość "S" można wyznaczyć ze sto¬

sunku: 3 e

S = ^ —

w którym If - liczba kolonii na płytkach kontrolnych if - liczba ko-onii na płytkach z próbkami, poddanyai

działaniu badanej substancji» Częstość powstawania mutacji mitochondrialnych "т с" dla danego stężenia mutagenu można wyznaczyć ze stosunku:

Ш

« którym: o. - liczba miaikolonii, N - liczba wszyskich kolonii. Dla zilustrowania funkcjonowania tego modelu mutacyjnego jako testu na mutagenność, na Fig. 7 przedstawiono w formie graficz¬ nej wyniki oznaczeu efektu letalnego i mutagennego, wywoływa¬ ny ел przez promieniowanie gamma, a na fig* в - efekt letalny i mutagenny wywoływane przez preparat użytkowy AMBUSZ 25 ЕС, substancją czynną którego jest permetryna.

Jak wynika z prezentowanych na w/w Figurach zależności, model mutacji aitocnondrialnych drożdży Saccharooycee cerevisiae również udziela poprawnej odpowiedzi na pytanie, czy testowana suostancja wykazuje mutagenną aktywność.

:,Ta zakończenie należy zaznaczyć, że w ostatnim okresie można zauważyć znaczny wzrost zainteresowania problematyką

;; i kancerogecŁe^ aktywności biocyców, szczególnie es 'oegc aośa być sorjranizowanie po raz

39

pierwszy рггег Amerykańskie towarzystwo Ciiemlczne specjalnego , poświęconego wyłącznie tej tematyce / 37 /•

I I I . L i t e r a t u r a c y t o w a n a

1. f i l l e r E.C., iśi l ler J . I . , Jbe «utagenicity of ciiemical

carcinogens, problems and in terpre ta t ions . Ins CHEMICAL

ШТЛЗДОЗ, ERINCIELBS AMD MBffiODS FOR THEIR SBEBCHOH.

Sd. A.Hollaender, 1971»

2. Miller J .A., Miller E.C., Chenical carcinogens, mecnanisms

and approaches to i t s control . J.NA3GL.CANCSR ШВЕ*

42, 7-Х7 /1971/ .

3* Baxtscb. S., Srover P«Ł*t Caeeical .carcinogenesie and nata-genesis. In: SCIENTIFIC FOUNDATIONS OP OHCOLOGY. Sd. Sy¬ mington T. and Carter R.L., London 1976.

4. Bridges B*A.» Short-term screening tests for cercinogens. SATORE / L /» 261, 195 - 200 / 1976 /.

5* McCann J., lees B.N.t Detection of carcinogens and autagens In tne Salaonella /microsome test: Assay of 300 chemicals: Discussion. fROCKAXL.ACAD.SCI., ££, 950 - 954 /1976/.

e.Purcnase J.P.H., Łongstaff В., Ashby J., Styles J»A.t Anderson D., Lefevre P. A., festwood У .В., Evaluation of six snort--term tests for detecting organic cneaioel carcinogens and recomendations for tneir use. NATURE /I/» 264, 624-7/1976/.

7. Stoltz D.R., Pcirier Ł.A., Irring C.C., Sticn H.P., Veis-burger J.S., Grice B.C., Evaluation of snort-term test for carcinogenicity. SOCSICaL.APPL.PHAH]UCOL., 2g, 157-60/19?V-

8. Sugioura I., Sato S., Hagao II., Tagahi Т., Matsushi&a Т., Saino Т., Takeueni K., EawacM Т., Overlapping of carcino¬ gens and autagens. In:FOSDAMEOTAL Ilf CANCIE PHEVSNTIOU.

40

Ed.Masse Р.Я. et e l . , Tokyo 1976.

9 . SBORT-XERM TEST SYfiEEMS FOR DMSECTIiłG CARCINOGENS. Ed.

Norpoth K.H., and Garner R.C., Springer Verlag Ber l in -

-Heidelberg-New York, 1980.

10 . MOTAGENICIKT ESSEDJG: A PRACTICAL APIROACH. Sd. S.Venitt

and Parry J.M., IrLPressLtd, Oxford, England 1984.

1 1 . P f i s t e r K., Urbach W., Effects of b ioc ides and growth

regulators: Physiological b a s i s . In: ESCYCLOPEDIA OF PLANT

PHYSIOLOGY. Vol. 12D, p.329 • I d . Lange O.L. et a l . ,

apringer-Verlage, Berlin-Heidelberg, 1963.

1 2 . He Mahan R.E. e t . a l . , Assay of 855 t e s t cbenicals in ten

t e s t e r s tra ins a new modification of the Ames t e s t for

bacter ia l mutageas. CANCER RES., £9., 682 / 1 9 7 9 / .

13» Abbondaudolo A»t Col lect ion and evaluation of data outage-

nic e f f ec t s of environmental cnea ica l s . С0Ш. EUR. С010Ш-

HIKES, EKE., 1970, p.670.

14 . Corbett Т.Н., Heidelberg C , Dove W.F., Determination of

the autagenic a c t i v i t y t o bacteriopnage S4 of carcinogenic

and nan—carcinogenic compounds. MOL. PHARMACOL.,

6 /6 / ,667-6?9 / 1 9 7 0 / . 15. Drake J.W., Uutagens screening with virulent bacteriopha-

ges . In: CHEMICAL MUTAUENB, PRINCIPLES AMD MS3S00S KE

OKEIR DKCECTION. Vol. I , pp 219-234. £d.Hollaend«?,197I.

16 . Herriott R.H., Effects on Mki Sransfoxaixig pr inc ip le .

In: CHBUICAL MUTAGENS, PRUłCIPLKS AHD 1B3BDBS fQR 1ЖПВС-

TION. Vol .1 , pp 173-218. Sd. Hol lander A., 1971. .

17. Maher V.M., Curren R.D., Cuel lette L.M., McCoxmidt J . J . ,

Effect of Ш repair on the frequency ot Mutations indw»«<i 41

in human ce l l s by ultraviolet irradiation and by chemical

carcinogens. In: ИИГОАИЗЯТАЬ Iff CANCER PREVENTION. Ed.

teases P.N., Tokyo, 1976.

13. Ames В.Л., The detection of chemical autagans with enteric

bacteria. In: CHEMICAL MJTAGEHS, HłINCIPŁBS А1Ш METHODS FOR

THEIR DETECTION. Vol.I, pp 26?-282. Sd. Hollaeoder A., 1971.

19. Ames B.H., Sims P. , Grover P.L., Bpoxides of carcinogenic

polycyclic aydrocarboae are fraaeshift autageas.

SCIENCE, Д2§» ^7 " *9 /1972/.

20. Ames £«N«, Gurney E.G., Millar J.A., Bartsch H.( Carcino¬

gens and frajoeenift mucagens: Metabolites and derivatives

of 2-acetylaminofluorene and ohter aromatic anine carcino¬

gens. ffiOCNAlL.ACAD.SCI., 6$, 3128-3152 /1972/ .

21. Ames B.N., Lee P.D., Durston W.S., An improved bacterial

tes t system -for the detection and classif ication of auta-

gens and carcinogens. PROC.MAIL.ACAD.eCI., 22» 7Ь2 /1973/ .

22. Ames B.K., Durston W.E., Yamasaki E . , Lee F.D., Carcinogens

are mutagens: a simple tes t systee combining l iver homoge-

nates for ectivation and bacteria for detection.

ER0C.MACL.ACAD.SC1., ,70, 2281-2285 /1973/ .

23. Ames B.N., Me Cann J . , Yaaasalci Б. , Methods for detecting

carcinogens and mutagens with the Salmonella /uamaalian

microsome mutagenicity t e s t / . MUTATION RBS . , ,^1.3^7/1975/.

24. Bridges Б.А., Short-term screening te s t for carcinogens.

HATURB / L / , 261, 195-200 /1976/.

25. Mohn G«, Revertants of an Sscherichia col i £12 strain with

high sensit ivity to radiations and chemicals.

MOTEAIIOIf RES., 12» 349-355 /1973/ .

42

26. Moreau P., Bailone Д., Devoret к., Propcage lamoda indue-.. tion in Escherictiia coli K-12 env A uvr Bs A hignly sen¬ sitive test for potential carcinogens. PROC. NAIL. AC AD. SCI.,

22, 3700-3704 Л976/. 2?. Loprieno ił., et.al., Induction of gene mutations and gene

convertions by vinyl chloride metabolites in yeast. CANCER .RES.*, 2£, 253-257/1976/.

26. Marquardt H., Mutation and recombination experiments with yeast as prescreeniag tests for carcinogenic effects. Z. EREBSFCRQCH., 81, 333-346/197V.

29. Mortimer R.E., Manney T.R., Mutation induction in yeast. In: CHEMICAL MUIAGENS, PRINCIPLES AND METHODS РОК THEIR EB1BCTI0N. Vol.1, pp 289-ЗЮ. Ed. Sollaender A., 1971.

30. Zismerman F.K., Detection of genetically active chemicals using various yeast system. In: CHEMICAL MUTAGENS, PRINCI¬ PLES AND ME3H0DS В Ж THEIR DEiEBCTIO^. Vol.Ill, pp.209-240. Ed. Hollaender A., 1971.

31 * FLuciennik H., Die mutagene wirkung des zerf alls von inkor-poriertem radioaktivem phosphoi>>32auf Cnlorella vulgaris-zellen. MAT.SrMP.ttALGEN ALS IMDIKATQREH", £0tnen, 19B4, pp 65-69.

32. Pluciennik H., Ispolzovanije pigmentnych mutacji Cnlorella

dlja kolicestveonoj ocenki mutagennoj aktivsoeti sredstv

chimizacji selskogo chozjajstva. MAI.XVII Konf.probl.

RWPG-1.16.3. 2ЙЕВ0Ы, 1985. 33. Sager R., Genetic analysis of cnloroplast DNA in Cnlamydo-

monas. АВЧ.GW&T., 12, 287-340/1977/. 34. Lloyd D., The mitochondria of microorganisms. AP,Load.1974.

43

35- Bytlcs. J.i Putrsmeax A., Kruszewska A., Baranowsiia H., Kotyiai. Z., GeaetyLt. i biogeaeza mitocaoadriow w drożdżaełi SaooaaroĘyoes cerevisiae. POSTĘPY MIKROBIOLOGII,

22r 2-59 /197S/. 50. ^JVISCiasiITAL HEALTH CRITERIA. Vol, VI. PRINCIPLES AND

iSTHODS JOE 3VALUATI9B THE TOXICITY OF CHEMICALS. ISHC, Geaeva'1$?S.

37. CARCINOGENICITY AND PESTICIDES. PRINCIPLES.ISSUES AND RELATIONSHIPS. Amex.Cnem.Soc.Symp. Series N- 414, 1990.

a 85

0.1

SRZEZTułJJiOŚĆ "ST i

CZĘSTOŚĆ MUTACJI / % / I

I

0.15

0.10

0.05

1 2 Stężenie DESUSTRTOT, mikromol/mi

FIGURA 1. Letalite i mutagenae działanie DESMETRYUY aa komórki CMorella vulgaris

45

ь

aoi

- PRZBŻYWALMOŚd "S" - CZĘSTOŚĆ MUTACJI / % /

а

0.2

fO 20 Stężenie ИЕВШШ, ю1кгово1/ш1

FIGTJRA г. Łetalne i autageime działanie TERBUIRXKy aa komórki Chlorella vulgaria

_ • — - KWAS 2,4-D / I / О MECOPROP / II /

—ft DIUROH / III /

10 Stfżenle eutegeaów, mlkxoaol/al

?IGUR1 3. Letala» działanl* KWASU 2,4-0, UBCOPROPU i DIUkONU na komórki CblontUa vulgazis. Matae«oa*eo działania w/w biocydów oi« wykryto.

*• CZSSTO&J MUTACJI

EMS, mikroeol/ml PIGURi. 4. Lttalne i mutagenne działanie EMS na komórki

Cnlorella vulgaris.

0.1 со s

w ш

0.001

&00О1

- HłZEŹYWALNOŚĆ " S "

9|f— CZĘSTOŚĆ MUTACJI

* / /

H

100 200 Dawka promieniowania gasea, KRAD

FIGURA 5* Letaln* i mutagenne działanie proaicoiowaaia gamma kotoaltu-60 na konórki Cnlorella vulgarie.

49

s 9 ш о

. 0 _ - promień. GAMMA

• 4 — - b'MS

.X - TERBUTRYNA

.» DESMETRYNA

0.1 0.01 0-001 PRZEŻYWALNOŚĆ " S "

FIGURA 6. Porównanie mutagennej aktywności testowanych mutagenów

CO s

IS] Й

0.1

CZĘSTOŚĆ MUTACJI.

Dawka promieniowania gamma, ERAS

FIGURA 7. Letalne i mutagenne działanie promieniowania gamma kobaltu-60 na komórki Saccoaromyces cerevisiae.

Si

^+ * — -loo

CZEST06C MUTACJI

Л1 0.2 Stężenie preparatu AMBUSZ 25 ЕС / v/v % /

FIGTffiA 8. Letalne i mutageone działanie preparatu AMBUSZ 25 EC na komórki Saccharomyces cerevisiae.

SYNERGIZM W INDUKOWANIU MUTACJI U TRADESCAH11A PRZEZ ŚRODKI OCHRONY ROŚLIN WSPÓŁDZIAŁAJĄCE Z PROMIENIOWANIEM JONIZUJĄCYM

Antonina Cebulska-Masilewska, Janusz Smagała

WSTĘP

Efekt synergi styczny aa miejsce wtedy gdy e-fekt równoczesnego działania dwóch czynników przewyższa sumę ich indywidualnych oddziaływań. Synergistyczne współdziałanie było stwierdzone dotąd dla przeżywalności komórek dla wielu ró*nych czynników. Udowodnie¬ nie występowania efektu synergi stycznego Ил eutacji przy współdziałaniu promieniowania jonizującego i chemicznych mutagenów ma ogromne znaczenie dla mutagenezy roślin użytkowych, a także dla ochrany radiologicznej i ochrony środowiska. Badania przepro¬ wadzone na Tradesca»tia, nad współdziałanie» proaieniowania joni¬ zującego ze znanymi mutagenami chemicznymi taki«i jak EMS oraz DBE dały rezultaty potwierdzające istnienie synergizeu dla eutacji. Badania te stanowią właściwie pierwsze światowe udokumentowane doświadczalnie i uzasadnione teoretycznie doniesienie na temat występowania synergistycznego efektu dla mutacji, przy zastoso¬ waniu niskich dawek współdziałających razemi promieniowania X, oraz chemicznego mutagenu <1,2,3>. Maga i znaczenie problemu potencjalnego synergizmu, ogromną jego role dla ważnej proble¬ matyki rakotwórczo*сi, oraz oszacowania zagrożeń dla człowieka wynikających z obecności w środowisku czynników mutagennych., wyznaczają pilną potrzeb» badań nad współdziałaniem różnych muta-genów środowiskowych. Ponieważ w środowisku naturalnym człowieka jest zawsze obecne promieniowanie jonizujące, z tego wzgledu w prezentowanych w niniejszym opracowaniu, badaniach nad

mutagennośćiA stosowanych w rolnictwie środków ochrony roślin

uwzględniono badania nad współdziałaniem z proeienionanien jonizu¬

jącym tych г badanych środków ochrony roślin, które wykazały м

testach mutagenny charakter.

MATERIAŁ I METODY

Do badaiS nad współdziałanie» ?. promieniowaniem joniżującym

wybrano : Aminopielik, Ambusz, Afalon, Ripcord, Decis i deltame-

try nę. Działanie tych preparatów na rośliny Iradescantia

powodowało podwyższenie poziomu Mutacji. Przycięte kwiatostany

klonu Traóescmntia 4430, traktowano poprzez injekcję do kwiatos¬

tanu, lO-ciu ul roztworu o odpowiednim stężeniu, a następnie po

upływie określonego czasu napromieniano je promieniowaniem X, przy

pomocy aparatu rentgenowskiego. Metodyki? eksperymentów, trakto¬

wania 3 napromieniania oraz prowadzenia hodowli Tradescantia, jak

również metodę pomiaru mutacji przedstawiono szczegółowo w poprze¬

dnich opracowaniach (3).

W badaniach nad współdziałaniem Aminopielika z promienio¬

waniem ustalono, że wydłużenie powyżej dwóch godzin (RYS.l),

przerwy pomiędzy injekcja. roztworu a napromienianiem, nie wpływa

już w sposób istotny na efekt współdziałania. W związku z tym w

doświadczeniach mających zbadać efekt skojarzonego działania

badanych czynników przestrzegano, żeby przerwa pomiędzy trakto¬

waniem a napromienianiem wynosiła conajmn.rej 2 godziny.

REZULTATY

Na rysunku 2 przedstawiono wyniki uzyskane w badaniach, w

których zastosowano skojarzone traktowanie roślin Aminopielikiem

отэг promieniowaniem X o różnych dawkach. Wartość częstości mutacji

dla dawki równej zero, jest efektem indywidualnego działania

roztworu, którym traktowano wszystkie grupy roślin,

Ig 6,0

Ё к-к e

TKAOESCAHTIA c l o n e - 4430

АИ1М0Р1Е11К , O.OO4X) * PROHIKHIOWANIK X

L 4 I 3

DŁ0GOŚĆ ПШВаПГ POMIĘDZY ТЕАКТОИАМ1АН1

RYS.1. Zależność efektu kortcowego skojarzonego traktowania

Aminopielikiem i promieniowaniem, od długości przerwy

pomiędzy traktowaniem chemicznym i napromieniowaniem.

! i l

•I 1

T'4430 АМН0Р1ЕЦК-0

o anunaciettk * promieniowane . promżeniowantr llt/lsynercfzm

20 <0 60 SOlcOy) Dawko promieniowana

RYS.2. Zależność efektu synergi stycznego od dawki promieniowania.

55

Dolna krzywa przedstawi* zależność czystości mutacji u Tradescarttia od dawki promieniowania X - и przypadku indywidualnego działania promieniowania, natomiast górna krzywa, przedstawia efekt skojarzonego działania roztworu i promieniowania. Widać że dla niższych dawek efekt końcowy różni sie niewiele od sumy indywidualnych efektów, ale dla dawek wyższych daje się zauważyć synergistyczne wzmocnienie. Podobnie jest w przypadkach skojarzonych traktowan roztworami Afalonu i Ripcordu, oraz różnymi dawkami promieniowania X. Rezultaty tych badań przedstawiono na rysunku 3 i rysunku 4. Podobnie jak dla A«inopielika, górne krzywe przedstawiają. wyniki skojarzonych traktowani Afalonem i różnymi dawkami promieniowania X (Rys.3.> i Ripcordem i różnymi dawkami promieniowania X (Rys.4.). Również dla wyższych dawek wartość synergistycznego efektu współdziałania (przestrzeń zakres-kowana) wzrasta, z tym że dła Ripcordu synergizm jest wyraźnie widoczny dla całego zakresu dawek promieniowania. Należy tutaj również zwrócić uwagę ne fakt, że od pewnego zakresu wartość efektu synergistycznego, czyli wartość zwiększenia częstości mutacji wynikająca ze współdziałania tych dwóch czynników przewyższa wartość efektu indywidualnego działania tego preparatu. Efekt ten jest wyraźny również w przypadku skojarzonego traktowania roślin Trad*sc*ntia roztworem preparatu Ambusz oraz promieniowaniem X o dawce 6O cGy. Częstość mutacji różowych indukowanych w komórkach włosków pręcików Trmdescanti* przez injekcje lOul 0,005% roztworu Ambuszu wynosi 0,4 mut/ 1OO włosków, częstość mutacji indukowanych przez promieniowanie wynosi 3,3 mut/ 100 włosków, natomiast częstość mutacji indukowanych w wyniku skojarzonego traktowania tym samym roztworem Ambuszu i napromie¬ niowanych tą samą dawką promieniowania, wynosi 7,O mut / 1OO

56

J2.0

T-4430 AFALON

• of alon •• promieniowani?x • promitniowacitX

20 40 SO SO lOOCcGyl Dowko pramieniowonioX

RYS.3. Zależność e-fektu synergistycznego od dawki promieniowania.

о I» Г- 44 30

RIPCORD 40 PC o ripcord*promieni(wo-• promienowanitX

20 tO 60 80 lOOkG Dawko ргстепаатгпаХ

RYS.4. 2al»żno*e efektu synergistycznego od dawki promieniowania.

57

6.0

7.0

I 5.0 •c

• poóteże standardowe £ 2 podtoże г dodatkiem dolomitu

2.0

10

П

i i . L -PZ7a . 1

prorn.X 'Ambusz' 'AmtxtSz'-prcmX

RYS.5- Częstość mutacji mukowana u Tradescantia niezależnym i

skojarzonym działaniem Ambuszu i promieniowania włosków (Rys.5). Widać więc, że wartoić synergistycznego wzmocnienia przewyższa wielokrotnie wartość efektu od czynnika chemicznego działającego w sposób niezależny.

Na rysunku 5 przedstawiono również rezultaty takich samych traktowan, ale wykonanych na roślinach rosnących na wzbogacanym w domieszkę dolomitowa, podłożu. We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że takie wzbogacenie podłoża wpływa na wzrost radioodpornoćci roślin fi^prawdopodobnie powodowany stymulacją procesu naprawy - subuszkodzen DNA. Dlatego też sprawdzono jak w takim ikładzie wygląda współdziałanie badanego środka ochrany roślin z promieniowaniem. Jak widać, rośliny rosnące na podłożu z domieszką dolomitową wykazują większą odporność i na promieniowanie i na mutagen, a także efekt

se

t

i

о S ч -с

I

Т-4430 AMBUSZMp/UOO52V.)'pnmieniamnieX

г й -.ambusz'-'prom.X fpodtoże z dodatkiem dolomitu} • о - promieniowanieX (podłoże stondardowe)

Ю1 Ю* Dawko promieniowaniaX

RYS.6.Zależność dawka-e+ekt dla roślin z różnych podłoży, oraz

traktowanych i nie traktowanych wstępnie Aeibuszem. synergistyczny Jest bardzo wyraźnie mniejszy. Spostrzeżenie to potwierdzają rezultaty przedstawione na rysunku 6, na którym częstości mutacji indukowane skojarzonym traktowaniem Ambuszem i promieniowaniem, u roślin z podłoża dolomitowego nie wykazują, synergistycznego wzmocnienia w stosunku do standardowej krzywej dawka-e-fekt.

Nie stwierdzono natomiast synergistycznego współdziałania w . przypadku skojarzonego działania deltametryny i promieniowania (Rys.7.). Wydaje sie> wręcz, że wstępne traktowanie roślin przez injekcję roztworu, powoduje wyraźne zmniejszenie wrażliwości roślin na promieniowanie.

59

DYSKUSJA I WNIOSKI Synergizm stwierdzone po skojarzonym z promieniowanie*

X traktowaniu roślin roztworami preparatów: Aminopielik, Ambusz, Afalon, i Ripcord.

Jedną z prób wyjaśnienia mechanizmu współdziałania synergis tveznego jest teoria współdziałania na poziomic ONA, pomiędzy promieniowaniem Jonizującym i Jakimkolwiek innym mutagenem lub czynnikiem działającym na DNA opracowań* przez H.P.Leenhouts'a i K.H.Chadwick'a, W teorii tej , autorzy przyjmują, że zarówno mutagen chemiczny działający na DNA Jak i promieniowanie poza uszkodzeniami, których skutki obserwujemy w postaci mutacji, aberracji chromosomowych czy też Śmierci komórki, wywołują, również subuszkodzenia spirali DNA, które to mogą być eliminowane w proce¬ sach naprawy. W przypadku, gdy mutagen chemiczny i promieniowanie działają łącznie, wtedy w wyniku koincydencji wywołanych przez nie subuszkodzen powstaje dodatkowa pewna i łoić trwałych uszkodzeń DNA. Liczba uszkodzeń powstających dodatkowo Jest proporcjnalna do całkowitej ekspozycji na promieniowanie i mutagen tzn. N = rj • X • D Przy czym w T) jest zawarte określone prawdopodobieństwo, że subuszkodzenie,wywołane promieniowaniem o dawce D oraz wywołane ekspozycją X mutagenu chemicznego dadzą w efekcie trwałe uszko¬ dzenie DNA. Według autorów teorii w zakresie niskich dawek i mocy dawek przy których duża cześć subuszkodzen ulega naprawie efekt synergistyczny odgrywa role dominującą zwiększając liczbę efektywnych uszkodzeń DNA. Jest to wniosek bardzo ważny z punktu widzenia ochrony środowiska, gdyż zarówno niskie dawki, jak i moce dawek są charakterystyczne dla słaba jonizującego promieniowania, występującego w środowisku naturalnym.

Silne powiązanie pomiędzy indukcją mutacji somatycznych a

f I ,2.0

I

O promieniowanie XOOcGy/ • deltometryno Ш promieniowcnieX *deltametryno

0 1 2 3 * 5 6 7 9 9 0 Ifigl ZoHortość dettamtttyty

RYS. 7. Częstość mutacji różowych indukowana różnymi traktowani ami

deltametryną i promieniowaniem X

czynnika chemicznego działającego niezależnie, potęguje rolę

zagrożeń wynikających z wprowadzania do środowiska naturalnego

tych środków ochrony roślin, które działają również mutagennie.

Niezwykle korzystnym natomiast zjawiskiem wydaje s ię być zaobser¬

wowany ochronny wpływ na rośliny domieszek dolomitowych da

podłoża. Jako środek dość często stosowany in rolnictwie mógłby

odgrywać dodatkową rolę czynnika ochronnego. Dlatego wydaje s ię ,

że byłoby bardzo wskazane kontynuowanie badań w rym kierunku.

Także odmienne niż innych środków współdziałanie aeitametryny :

promieniowaniem mogłoby sugerować obiecujące kombinacje traKtawań,.

ale ten efekt zdecydowanie wymaga głębszych badań.

:. Сег.:1 5» a-wa = i lews* a A., Chadwic^ ,К« Н. , . <_eenhouts H. Р., (1981) rvns-c:sm.Cetwesn EMS and X rays + or the induction ot somatic ,'iutations in Trad&scantis, Int. J. Rad i at. Biol. 40, 2, 163-173 Z. Leenh.3.:t= H.F., Chacwic^ К. . , (1978) Analysis o-f synergistic ss"5itisati on. B". J. Cancer, 3~, supp.III, 19B. T. leDLiI =i -э-Wasi lewstf-a A., Mutacje somatyczne u Tratiescantia jako •.ilia: madelowv do badania skutków czynników środowiskowych, IFJ, K-aków, Raport 1335/Б, 1986.

A. Cebul ska— Wasi łewska A., Smagała J., Influence o-f tne soil composition on the radiation induced mutation -frequency in

. Nukleonika, 33, 4-6. 127-137, 1986.

BADANIA WPŁYWU MUTAGENNEGO DECISU I DELTAMETRYNY NA TRAOEiCAUT1A

- AUTOMATYZACJA ZBIERANIA DANYCH W. Wajda, A. Cebulska-Wesilewska

WSTĘP Test op*rty na pomierz» częstości mutacji somatycznych w

komórkach włosków pręcikom kwiatowych niektórych odmian Tr adescanti a jest najczulszym spośród monitorów promieniowania jonizującego, wykorzystujących mutacje u roślin. Wprowadzany do kolekcji około 1958 roku przez pro-f . W. V. Browne z Uniwersytetu w Austin heterozygotyczny ze wzglądu na barw<? kwiatów klon T-02 juz w 1960 roku został zaproponowany przez S. Ichikawe- jako biologiczny monitor promieniowania do zastosowania w otoczeniu elektrowni jądrowych. Wykorzystanie tej metody w badaniach radiobiologicznych okazano siЩ niezwykle cenne i zaowocowano uzyskaniem licznych wyników. Zbadano np. ti metodч skuteczność biologiczna rożnych rodzajów promieniowania, zbadano zależność e-fektu promieniowania od parametrów biologicznych takich jak stopień ploidalnosci, zawartość DNA w komórce czy wielkość _Hdra i chromosomów. Sprawdzono wpływ mocy dawki i -fra-fc-cjormwania dawki na wielkość e-fektu, zbadano takie zalelnoso dawke-e-f-ekt w zakresie niskich dawek i «nocy dawek. Stosując klon T-02 badano także efekt promieniowania kosmicznego. Test ten okazał sie rownie£ wrażliwy na mutageny chemiczne. Niektóre z klonów znalazły zastosowanie w badaniach laboratoryjnych wielu rolnych mutagenow chemicznych, a takie w monitorowaniu środowiska. Do najczęściej wykorzystywanych możliwości metody nale:» oomiar cz&stosci mutacji rojowych i letalnych w «omorkach włosków pricikow Jradescant т. Sczego iowy opis nodowli rośliny jak i

metodyki porriarowej przedstawiono we wcześniejszej pracy (i>. Biorąc jednak pod uwag? fakt, Je metod* ta nie jest bardzo rozpowszechniona w Polsce, warto podkreślić jeszcze гаг jej szczególnie u'ytecsne cechy.

Tradescantta jest rośliną długiego dnia i daje sie łatwo prowadzić w zwykłej szklarni lub komorze wzrostowej. Zapewnienie plantacji 18-godzinnego cyklu świetlnego prowokuje ją do ciągłego kwitnienia. Oprócz niezaprzeczalnych zalet tego systemu do których naleJy zaliczyć prostotę, dostępność, ekonomicznosc i szybkość jest jeszcze kilk* innych cech które czynią ten' model szczególnie cennym narzędziem badawczym: - wiosek pręcika poprzez swej rozwój może być porównywany z układem hodowli komórkowych,

- metoda daje możliwość badania dużej populacji komórek,

- w relatywnie krótkim czasie pozwala uzyska-: informacje o indukowanych częstościach mutacji tprzeciętnie po 2-3 tygodniach od ekspozycji)

- lilesnosc czystości mutacji od dawki promieniowania przebiega zgodnie z dobrze opisanym modelem mutacji z supresją w populacji traktowanej

- znajomość modelu opisującego zależność efektu od dawki pozwala na głębszą i bardziej jednoznaczną analizę wpływu środowiskowych czynników modyfikujących efekt promieniowani*,

wrażliwość Tradescantim na promieniowanie jest bardzo wysoka, zbliżona do wrażliwości komórek ssaków (dawki rzędu 0.025 Gy wywołują juz łatwo mierzalne efekty)

kwiatostan zawierający upakowane paczki niewielkich rozmiarów znakomici* nadaj* się do napromieniowania nawet małymi wiązkami promieniowania,

64

- duża i lose klonów Traćescantia pozwala аоыегас je do oadar. w zależności od ich cech genotypowych i specy-fiKi nada*, - zarówno prowadzenie' plantacji, jak i metoda pomiarów nie sprawiaj* żadnych trudności <do mierzenia mutacji wystarczy zwykła lupa binokularna), - rośliny rosnł dobrze w zwykłej szklarni, a warunki hodowli i -fizjologia rośliny są szczegółowo poznane i opisane,

- rozmnażanie wegetatywne roślin zapewnia minimalni zmienność genetyczną.

Stosowanie metody nie wymaga żadnych skomplikowanych procedur, takich jakie n» przykład są niezbędne w metodach opartych na

sterylnych hodowlach kultur tkankowych. Do zalet metody należy również zaliczyć fakt, że znajomość szczegółowa zależności dawka— efekt dla promieniowania jonizującego, pozwala porównać e+ektywnosc mutagenną innych czynników środowiskowych i poprzez zastosowanie Rad—ekwiwalentu stworzyć wspólną bazę porównawczą dla rożnych mutagenow. Mając na uwadге powyższe zalety metoda ta jest od wielu lat wykorzystywana w badaniach и Zakładzie Radiobiologii IFJ, a także w ramach prac prezentowanych w niniejszym opracowaniu do określenia mutagenności stosowanych w rolnictwie środków ochrony roślin. Niniejsza praca, пя

przykładzie badań nad mutagenności* preparatu Dęcie i jego substancją aktywną deltametryną, prezentuje wyniki prac nad przyspieszeniem i automatyzacją zbierania oraz interpretacji danych.

ó5

System zbierania i analizy danych składa się z dwóch programów:

- programu TRADIN służącego do wczytywania danych - programu TRAOOUT służącego do analizy danych

Obydwa programy zostały napisane w dialekcie SFA Basic dla komputerów Atari ST.

Program TRADIN letniej* w dwóch wersjach - uproszczonej,

przyjmującej dane z klawiatury, oraz podstawowej przyjmującej dane

bezpośrednio ze stanowisk przy mikroskopach. Zliczane mutacje s4

wprowadzane bezpośrednio do komputera przez przyciśnięcie pedału

i rejestrowane oddzielnie dla każdego rodzaju Mutacji.

Rejestrowane są trzy rodzaje mutacji więc stanowisko pracy

wyposażone jeet w cztery pedały - po jednym dla każdego rodzaju

mutacji) różowych, pojedynczych i skróceń, oraz czwarty pedał

wysyłający sygnały sterujące systemem.

System zbierania danych jest dostosowany do obsługi dwóch

stanowisk pomiarowych z możliwości* rozszerzenia maksymalnie do

trzech. Każdy zestaw pedałów dołączony jest do

jednego г gniazd manipulatora (joysticka) komputera Atari 520 ST.

Wykorzystanie gniazd joysticków do wprowadzania sygnałów ze

zliczania mutacji bardzo uprościło rozwiązania sprzętowe. Zbędne

stało się wykorzystywanie specjalnych interfejsów i rozbudowanych

układów elektronicznych w stanowiskach pomiarowych, co byłoby

niezbędne przy stosowaniu gniazd transmisji szeregowej lub

równoległej.

Obsługiwanie jednocześnie dwóch stanowisk pomiarowych

stworzyło problemy związane z koniecznością synronizacji działań

obu osób liczących mutacje. Wstępne dane dla kaidego punktu

66

pomiarowego s-3 wprowadzane z klawiatury, po czym zliczane S3 mutacje przy wykorzystaniu stanowisk z pedałami. Po zakończeniu oglądania danego punktu pomiarowego musi bye wprowadzona z

klawiatury całkowita liczba oglądanych pr^cikc-w, która jest nieznana z gory. Dlatego niemożliwe jest rozpoczęcie w jednym stanowisku zliczania mutacji dla następnego kodu gdy nie zostało jeszcze zakończone zliczanie poprzedniego kodu w drugim stanowisku. Z powyższych względów zaistniała konieczność sygnalizacji osobom liczącym przez system pewnych sytuacji, takich jaki potwierdzenie przyjęcia impulsu zliczanego, zakończenie zliczania w jednym stanowisku, przejście systemu w tryb korekty danych, zezwolenie na wprowadzanie następnego kodu - bez odrywania ich od okularów mikroskopu. Z tego powodu wykorzystanie ekranu monitora do przekazywania informacji osobom liczącym musiało zostać powainie ograniczone i postanowiono wykorzystać do tego celu sygnały dźwiękowe. Ze wzglądu na powyższe uwarunkowania komputer Atari 520 ST okazał się bardzo przydatny do tych celów gdyż posiada gniazda manipulatorów oraz rozbudowane możliwości generowania dźwięków. Użycie tego komputera do realizacji omawianego systemu pozwoliło zrealizować go znacznie mniejszym kosztem ni i przy użyciu np. komputera klasy IBM PC.

Podstawowa wersja programu TRADIN przyjmuje dane г dwóch stanowisk pomiarowych wyposażonych w pedały. Po wprowadzeniu wstępnych danych z klawiatury, osoby mierzące przez przyciśnięcie pedałc-w wprowadzaj3 zaobserwowane mutacje które M zliczane przez komputer. Przyjęcie każdego impulsu przez komputer je«t potwierdzane krótkim sygnałem dźwiękowym który umożliwia kontrole poprawności wprowadzenia. Każdy z trzech pedałów odpowiada Jednemu rodzajowi mutacji - odpowiednio! rć-sowe, pojedyncze i

67

skrócenia. Obydwa stanowiska mogą Jednocześnie wprowadzać mutacje dla tego samego kodu odpowiadającego jednemu punktowi pomiarowemu w eksperymencie. Zakończenie wprowadzania dla danego kodu sygnalizowane jest przyciśnięciem czwartego pedału - sterującego. Po zakończeniu wprowadzania danych dla danego kodu przez obydwa stanowiska komputer przechodzi w tryb korekty/akceptacji danych, co jest równie* sygnalizowane odpowiednim sygnałem dźwiękowym. MoJna wtedy skorygować omyłkowo wprowadzone dane po czym po akceptacji danych dokonanej niezależnie z obu stanowisk komputer

oblicza częstości mutacji na 100 włosków i zapisuje na dyskietkę, wras z ilością włosków i zliczoną liczbą mutacji. Taki system

pracy zapewnia ze w przypadku nagłego zaniku zasilania powtórzenia wymaga wyłącznie wprowadzenie danych dla jednego, aktualnie obserwowanego kodu. Jest to istotne, gdy? pręciki Tradescantia po zliczeniu mutacji dla jednego kodu są usuwane ze szkiełka podstawowego, a przechowywanie ich do końca dnia jest praktycznie niemożliwe.

Wyniki pomiarów są zapisywane na dyskietce równolegle w trzech zbiorach, osobno dla każdego rodzaju mutacji. Postać zbiorów jest następująca»

68

- i lose kodów (punktów pomiarowych); - oznaczenie kodu) - oznaczenie kodu;

itd...

- znacznik dnia} - numer dnia pomiarowego;

- znacznik kodu; - oznaczenie koduj - częstość mutacji na 100 włosków;

- ilość zliczonych mutacji; - ilość: włosków|

- znacznik koduj . • - oznaczenie koduj - dane dla następnego kodu;

itd. az do końca dnia pomiarowego - znacznik dnia; - numer dnia pomiarowego}

- znacznik kodu; itd. dla następnych kodów

- znacznik dnia; - numer następnego dnia pomiarowego;

itd...

Taka organizacja zbiorów daje dwie korzyści!

kolejne dni pomiarowe mogą być swobodnie dopisywane do końca istniejącego zbioru,

program interpretujący wyniki może kontrolować poprawność zbiorów i dokonywać analiz wykorzystując np. tylko niektóre dni lub kody.

69

Sekwencyjn-э organizacje zbiort<w zastosowano aby zapewnić uniwersalność i wymiennose zbiorc-w w przysz łosci dla ronnych programów interpretujących a nawet dla róinych typów komputerów. Zastosowanie zbiorów o berpo-rednim dostępie utrudniioby t -wymi enno-v. gdy? procedury obsługi takich zbiorów roinii si6 istotnie dla roinych języków programowania i dla rożnych typów sprz«tu komputerowego.

Oprócz omówionej pełnej wersji programu TRADIN istniej* tet

dwie inne wersje:

- obsiugujqca tylko jedno stanowisko pomiarowe, poza tym nie rołniaca si= od wersji omówionej,

- wersja uproszczona obsługująca wprowadzanie danych z

klawiatury( stosowana gdy konieczne jest wprowadzenie danych gbieranych w sytuacjach wykluczających <no?liwosc zastosowania komputera, lub całego starego eksperymentu gdzie ilości zliczonych mutacji S3 zapisane w dokumentacji.

Program TRftDOUT jest programem analizującym dane z

eksperymentu i prezentującym wyniki. Wczytuje on jeden ze zbiorów utworzonych programem TRADIN i kontroluje jego poprawność. Po stwierdzeniu poprawności zbioru £3da podania informacji czy ma analizować cały zbifrr, czy tylko wyszczególnione dni. Program mofe wyliczać średnie częstości mutacji używając średniej zwykłej lub ważonej. Program oblicza średnie czysto?.i mutacji na 100 włosków dla poszczególnych kodów (punktów pomiarowych) sumując dane po dnićch oraz wylicza odchylenie standardowe. Program prezentuje wyniki w dwóch podstawowych formach: wydruku w postaci tabeli, oraz wykresu na ekranie - przy czym wykres może byc przesłany na drukarka w celu sporządzenia trwałej kopii.

70

W pierwszym przypadku tabele pre2«ntuje dan» dla wszystkich analizowanych punktów pomiarowych <patrz Tabela l i 2). W tym trybie możliwe jest także przeprowadzenie testu Studenta istotności rótnic dla wybranych par średnich. Przykłady dla Deci«u przedstawiane pod tabelkami 1 i 2 prezentuJ4 zastosowanie tej -funkcji programu. W trybie prezentowania wykresu pokazywany jest przebieg w czasie (dla poszczególnych dni) częstości mutacji dla wybranego kodu. Na zadanie wykres może być skopiowany graficznie na drukarce. Obejrzenie przebiegu w czasie częstości mutacji może być przydatne szczególnie w' przypadku traktowania roślin mutagenami chemicznymi, dla których przebieg częstości mutacji w funkcji czasu jest odmienny niz w - przypadku promieniowania, a także w celu analizy synergizutu działania mutagenu chemicznego i promieniowania jonizującego.

Poniżej przedstawiono wydruki wyników działania programu TRADOUT dla Decisu i Deltametryny, oraz kopie wykresów rysowanych przez program na ekranie. W tabelkach kody oznaczają msmwrr

punktów pomiarowych, wartości dla poszczególnych dni sa częstościami mutacji na 100 włosków, średnia' i odchylenie standardowe nie wymagają komentarza.

Znaczenia poszczególnych kodów sa nastepujacet 1 — Decis 0.17., iniekcja 10 ul

2 — Decis 0.03'/., iniekcja 10 ul 3 — Decis 0.Ob'/., iniekcja 20 ul

4 — Decis О.О17., iniekcja 10 ul

5 — Deltametryna, iniekcja 5 ug 6 — Deltametryna, iniekcja 1 ug

7 — Deltametryna, iniekcja 2 ug 6 — Kontrola

71

Kody

U

Dec IB i Del tcimetryna mutacje rozowe dzień pa naświetleniu

12 13 14 2 5 średnia! s.dev. 1 — > 2 > 3 > 4 > 5 > 6 > 7 > В >

0.3i o.i; 0.1! 0.3! 0.3! 0. li 0.0! 0.3!

0.1 0.3 0.4 0.5 1.6 0.2 0.5 0.0

i 0. 1 ! ! 0.2! i i ! 0.2! ! 0.3! ! 0.3! ! 0.41 | — — >

0. 0. 0. 0. 0. o. 0. 0.

3! 1! 1! 4! Z i li S! 1!

_ _ _ , _ Г I I 1 0.1 i !

_ 1 1 ł 1 0.0! i 0.3! ! 0.3! i 0.8! i 0.4! 1

0.206!: 0.184!! 0.211!! 0.274!! 0. 551! ! 0.215!t 0.457!! 0.202!!

0.0362 0.0344 0.0364 0.0392 0.0625 0.0436 0.0966 0.0327

•*••##•*•#•*•****«-»•#••##•#••••#•#*##••••••••#•###•••**•**•*•«•## Kontrola ictotnoeci rożnie «rednicn testem Studenta

Kody 2 i в Średnie rosnia sie z prawdopodobieństwami 53.37 % Wartość funkcji t Studenta» 0.7703 Stopnie swobodyi 7

*•«•#•*«•*•

Kontrole istotności rożnie średnich testem Studenta Kody 4 i 8

Średnie roznia sie z prawdopodobieństwem: 97.83 '/. Wartość -Funkcji t Studenta» 2.94О1 Stopnie swobodyt 7

Kontrola istotności rożnie średnich testem Studenta Kody 5 i 8

Średnie rosnia sie z prawdopodobieństwem: 100,00 "/. Wartość funkcji t Studenta: 10.0319 Stopnie swobodyi 7 «-«"•i-**************»*»***************»»******'»'»***************** ««««"ii"»*********************»*»»**************************'»****

Kontrola istotności rożnie średnich testem Studenta Kody 6 i 8

Średnie roznia sie z prawdopodobienstwemi 37.73 V. Wartość funkcji t Studenta: 0.5146 Stopnie swobodyi 7

Kontrola istotności rożnie średnich testem Studenta Kody 7 i 8

Średnie roznia sie z prawdopodobieństwem! 99.84 % Wartość -funkcji t Studenta: 4.9994 Stopnie swobody» 7

72

•««•••W*****»**************»***»*'!»********»****'»*****'»*********»* I iXpoqoMS

C686'8T «»}uapn}S ł tf3>iun+ f. 00"001 i«Mm^>u«TqopodopM*^d z axe «IUZCM axupajs

8 ? А Арох • • * • » * gstupajs SIUZOJ issou^o^et

^ lApoqoM* Stt8'Z i»łuepnłs Я хГэ^ип*

X 6£*/.6 twsM^su*iqopodopM*Jd z at* V^UZOJ 8 T 9

I tXpoqoMa 8 t £ f £ i»*uapn*s ł i f ^ u " *

X fr£'86 iwaM^suaxqopodopMVjd z атв « IUZOJ 8 ? fr Apo>|

a^sa^ gsiupaj* SIUZOJ tsaou^o^st «{Oji uo>4 *#*********#••*•»•#**»»•#•*•***#•****»«*•****#*#•••****•*•*•#•*•• **••*•••*#••*•#•»•***••*•#•••••••*»*•#*»#•*#•»•••#?••#»»••»•••••»••

S |Лроцомв 8OfiO'£ iw^uapn^s ł tf3>iun*

% 9T*£fe iwaM^suaxqopodopMVJd z ait VX U Z O J 8 T £ Apo*

цэгира^м atuzoj хэяои^о^ях

SSZZ'T 00'fr/l «шам^виаtqopodopMPjd z B I S VTUZOJ

8 T г Ароя цэхира^я этигоа тэяаи^о^вх «towi uo»

9SZ0 ton 06£O £S90 S9Z0 £££O 66Z0 9£S0

•о •о •о *0 •o •o '0 •o

II6fO 1 !££S"t ISSS'O

!!80fr * T !9£x»*0

!l£Zfr'O !89*'О Sfr8£"T

) i 1 1 1

i 1 1

I

; * тире-is

1 1 1

t 1 I 1 1

i {

l£ if

:z 18 it i-!S 1-

•I

•z •o •x "T

•o

ST

IT 18 ! I

:z IT \l

\z

•o

•o •T •o •o •o •o •z (•I

i-!0 IT !T !9 t ""•

iO \L

___ *£ •o '£ •o •T •T £T

•!Z

ia !8 i9 f£ •1Z !Z \L

•o •o "0 •x •o •o '0 •o ZJ

)£* 18' IS* l£* !0* it»" (£• !£" I

0 0 0 0 0 0 0 I I

< В < L < 9 < S < f < £ < Z < 1

пхиат?агмя«и od uatzp t soag

Лро»

« 3

ь • V ł и t

1 1

Kod i

f \

\

12 13 14 IS dni on nasuiłtlwiiu

Kod 2

/ \

12 13 14 15 4

74

Kod 6

l i 12 13 14 15 <in i DO nasu tet 1 >n i u

Kod 7

11 12 13 14 15 dni na msMnt ł»niu

75

Poru tej zaiacione s« wydruki fragment:** programów. ««.* ***»»*•*•••••#•##*#••#•#••*•«** *•»•***##*##*•«•»#*••*•*••••*#•••*

Procedure Pedały *## nbŁłuąe p#4eiew «• wproweOmm» i popr*w* ilości mutacji ««• ftrocedur* ob«lugi joystickow z Atari GFA Basic »••*

Wr-'.«Tab'/.+60

W2'/.-Tab'/.+61

Bb*«Chr#(i<H15) Cc*»Chr*<«<H8)

X-Xbios<*H19,3,LiVarptr(Aa»)>

Do Joył%-P»«k<Wl'/.) Joy2-/.»Pe*k (W2"/.> I-f JoylV.-8 Then

For Syg»l To 4 Sound 1,15,2,2,4 Sound 1,15,2,3,4 Sound 1,0,0,0,0

N»xt Syg End if If Joy2X-8 Th*n

For Syg-1 To 4

Sound 1,15,2,2,4 Sound 1,15,2,3,4 Sound 1,0,0,0,0

Next Syg Endi-f Exit If FiniX-i And Fin2X«l It Ooyl'/.-l Or Joy2'/.-l Than

Sound 1,15,2,7,5 Sound 1,0,1,1,10

p«P+Krocz»k Print At<10,4)|" " Print At(10,4>|P

Endif If Joy 17.=2 Or Joy27.-2 Than

Sound 1,15,2,6,5 Sound 1,0,1,1,10 Sp«Sp+Kroczek

Print At(10,4)|" H

Print At (20,4.) ł" " Print At(10,4)jP Print At(20,4);Sp

End if If Joy 17.-4 Or Joy2'/."A Then Sound 1,15,2,5,5

Sound 1,0,1,1,10 SteSt+Krocaet--Prxnt At(30,4);" " Print At(30,4);St

Encii f

Loop

X=Xbioe<&H19,3fi_[Varptr (Bb*> )

X=Xt>.ios<StHl9,3,Lj Varptr <Cc*> )

Poke WIV.,0

Poke W2"/.,C)

Return

~ »*•**••«••••••••*»»***•*•**••*••••••••*•»••*••»

78

LITERATURA CYTOWANA 1. Cebul вка-ttasilewska A., Mutacje somatyczne u i r adescarit ta jako ukiad modelowy do badanie skutkd-w ciynnikcw środowiskowych. IFJ, Krakow, Rap. 1335/B.,19B6. 2. Nawrocki• S., GFA-Baeic. Stołeczny Ośrodek Techniki Obliczeniowej., WarŁzawa 1968.

79

ZASTOSOWANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH I WYMIWN SIOSTRZANYCH CHROMATYD W LIMFOCYTACH KRWI LUDZKIEJ W OCENIE EFEKTYWNOŚCI ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN A.Wierzewska , E.Kasper, B.Krzykwa

WSTĘP. Znane jest zjawisko uszkadzania nici DMA chromosomów poprzez

działanie na żywe komórki promieniowania, jonizującego. Efekt tego uszkodzenia można zaobserwować stopując do do&wiadczen Modelową hodowlę limfocytów krwi obwodowej człowieka, która. poddano działaniu takiego promieniowania. Wówczas po zakończonej hodowli w preparatach cytogenetycznych widoczne są charakterystyczne aberracje chromosomowe. Są to chromosomy dicentryczne i koliste (ringi). Chromosomy dicentryczne powstają na skutek pęknięć dwóch chromosomów i ponownego wzajemnego połączenia się ich oraz chromosomy koliste powstają г jednego chromosomu o połączonych końcach. Te same aberracje chromosomowe nogą wystąpić w hodowlach limfocytów, do których dodano badanych substancji chemicznych podejrzanych o uszkadzające działanie nici DNA.

Jednak czulszą i lepszą metodą dla substancji chemicznych, które działałyby mutagenni» na materiał genetyczny jest analiza wymian chrornatyd siostrzanych (SCE). Są to wzajemne wymiany odcinków chromatyd w obrębie tego samego chromosomu; występujące w każdej żywej komórce. Pod wpływem działania środka chemicznego można zastać zwiększoną ilość tych wymian, co wykorzystana da badań nad oceną mutagenności różnych związków. Wymiany chromatytf siostrzanych można obserwować wówczas, gdy każda z chromatyd jednego chromosomu jest inaczej zabarwiona tj. jedna jest jasna, druga ciemna. Efekt taki uzyskuj* się gdy do hodowli limfocytów

doda się 5-bromodeoxyurydynę <5-BrdU) , która jako analog tymidyny jest Mbudowywana do nici DNA. Chromatydy mające wbudowaną 5-&rdU w obie nici ONA wiążą, mniej barwnika Siemsy i są jasne, w przeciwieństwie do chromatyd, które wbudowywują w jedną nić 5-BrdL» są ciemne. Wzajemne wymiany między tymi chromatydami powodują przemienne wystąpienie odcinków jasnych i ciennycn na ich di ugości.

W niniejszej pracy przedstawiono rezultaty badań nad skutecznością indukowania aberracji chromosomowych i siostrzanych wymian chrornatydowych, przez roztwory niektórych środków ochrony roślin. Biologiczne efekty działania tych preparatów porównano również z efektywnoźią indukownia tych samych zmian chromosomowych przez różne rodzaje promieniowania jonizującego.

MATERIAŁ I METODYKA. Do wszystkich przeprowadzonych eksperymentów materialni

wziętym do badań była krew od dawców krwi w średnim wieku. Pełną krew pobierano do heparynizowanych naczyń szklanych i niezwłocznie napromieniowano w temperaturze pokojowej. Następnie zakładano hodowlę limfocytów, przenosząc napromienioną krew do nowych sterylnych naczyń z pożywką o składzie: 30'/. podłoża Eagle a z antybiotykami, 20JŁ surowicy cielęcej płodowej. Podziały limfocytów stymulowano preparatem LF-7 w ciągu 46 godzin.

Tak krótki czas hodowli wybrano w celu wzięcia do obserwacji wyłącznie komórek będących w pierwszym podziale mitotycznym. Po dodaniu do hodowli colcemidu w ilości 0,03 ug/ml kończono ją w sposób rutynowy.Preparaty barwiono roztworem Giemsy w buforze Sorensena i obserwowano aberrację chromosomowe w figurach mitotycznych pod imersją. Do obliczeń wzięto pod uwagę.

82

występowanie chromosomów dicentrycznych i kolistnycn.

Traktowanie chemiczne.

Traktowanie limfocytów krwi ludzkiej środkami ochrony roślin

(Aminopielik i Decis) polegało na dodaniu do hodowli odpowiednich

stężeń tych związków. H badaniach nad Aminopielikie* dodawano

lul-3.ul na lOmł hodowli natomiast w przypadku Decisu O,O2-

-O,O4ul/lOml hodowli. Do odczytów SCE, hodowla prowadzona była

przy obecności 5-BrdU, w ilości 5ug/«»i przez 72 god?., w

ciemności. Po sporządzeniu preparatów м sposób rutynowy, barwiono

je f1uorochrone* Hoecnst 33258 i naświetlano promieniowanie» UV.

Następnie poddano działaniu wysokiej temperatury w rpztworze

bu-forowym i ostatecznie i ostatecznie barwiono beewnilkiem Siemsy.

Działanie to «a służyć do wzmocnienia zróżnicowanego barwienia

сhrornatyd przy analizowaniu wymian chronatyc siostrzanych.

Napr они eni owaM e

Próbki ferwi naoronieniowywano w sterylnych, heparynizowanycn

naczyńkach szklanych, w temperaturze pokojowej, na aparaturze

rentgenowskiej zlokalizowanej w pomieszczeniu cyklotronu U-12O w

następujących warunkach: napięcie 250 fcv, - f i l t r 0,5 м Си, яюс

dawki 110 R/ein.

Próbki krwi zostały napromienione pięcioea dawka«ii IO, 20,

SO, 75, łOO radów.

Do odczytów częstości aberracji chraaosaMwych 1 imłocytów

krwi dla promieniowania neutronowego, napromieniowana również pięi

próbek krwi następującymi dawkami: *O, 3Ot 120, ibO, 20O rado*», na

cyklotronie U-120, będa.cym źródłem prędkich neutronów o średniej

energii S.6 ileV.

REZULTATY. W trakcie badań nad preparatem Aminopielik 2.4 D -

stwierdzono w jednej z uzyskanych trzydniowych hodowli limfocytów /po dodaniu do niej 2 ul preparatu o stężeniu handlowym/ na 216 dzielących sie komórek - cztery aberracje chromosomowe limfocytów krwi.

Ponieważ u człowieka pojedyncze aberracje pojawiają, sie po zbadaniu od 3OOO do 6OOO komórek - wynik ten wydawał sie wskazywać na mutagenność preparatu.

Na Ь hodowli, w których zastosowano Aminopielik 2.4 0 - we wszystkich obserwowane były fragmentacje chromosomów, w czterech natomiast /2,4,5 i 6/ obserwowane były aberracje przyjęte jako kryterium mutagenności, tj. dicentriki i ringi. W jednej hodowli /dawca B.J./, w której udało sie przeprowadzić obserwacje Stosunkowo du^ej, bo przekraczającej 2000 liczby komórek, zaobserwowano 24 komórki z aberracjami, w których pojawiło si» ogółem 42 aberracje. Na rysunkach l i 2 przedstawiono zależno&ć

12-10'

hU)'2

RYS. 1 i ' JL

0.00 7.00 2.00 XX Stężenie amlnopieliku pl/ml hodowli

8 4

210'-

••*.

,1 0.00 JJJO 200 3.00 *.00

St&enie ominopietiku j*/ml hodowli RYS. 2

występowania aberracji w tej hodowli и układzie* efekt - steienie roztworu. Widać г nich, że istnieje istotna zależność eiettzy występującą w populacji ilością, komórek z aberracja*! lub częstości aberracji a stężeniem,.

Rezultaty badań <my*iana chroeatyd siostrzanych), nad genotoksyc2nyi* wpływea preparatu Aeinopiełik 2.4 O i Decis przedstawiono na wykresach 1 i 2.

Ola porównania efektów uzyskanych po traktoteaniu li«focytoM środkami ochrony roil an z efekta*i biolooicznyKi innego znanego mutagenu przeprowadzono badania wpływu proaieniowania jonizującego na indukcję aberracji w komórkach lie/focytow.

Rezultaty tych badań przedstawiono na rysunkach 3 - 5 . Rysunek 3 przedstawia krzywą zależności y/x/ ilo&ci aberracji na 1 komórkę w zależności od dawki dla promieniowania neutronowego, rysunek A krzywą zależności y/x/ ilości aberracji пл t koaorke w zależności od dawki dla proeieniowania rentgenowskiego. Nat omast rysunek S przedstawia porównanie krzywych zależności y/x/ _ilości

WYKRES 1

WYKRES 2

14.00

1100

£ j j 10.00

ш ало-о

400:

ooooo QDBPP II 44*4* III

100 -1Е-0Ю 2ЕЧ>1в 1Е-0И 2E-002 3E-002

Dawka X (aminopielik}

НЛО i

u g

I

200 Tiini.nwiimiiiiliuiiiiiuiiiiiiiiuiiiHiimiiin -1E-00S1E-003 S-003 SE4XU 7E-003 К-0Ю

Dawka я (decis)

8 6

•D -' -si :

Rys.3. Zależność miedzy wielkością dawki a częstością, chronosoaów

dicentrycznych i kolistych м komórce dla promieniowania neutronowego. aberracji na 1 komórkę od dawki dla promieniowania neutronowego i

rentgenowskiego w układzie linoiwym. Błąd a częstości aberracji obliczony jest przy założeniu, że

rozkład aberracji chromosomowych podlega rozkładowi Poisson*. Odczytana 2 tabeli dawka jest maksymalnie prawdopodobną dawką równoważną na całe ciało. Jej przedział ufności określany jest przez -fakt, iż rozkład aberracji jest wspomnianym wyżej rożkiadee Poi ssana. Przedział ufności ustalono w tym przypadku na 95%.

* Dane o częstości chromosomów dicentrycznych i chroAosoMów

kolistych poddano dopasowaniu metodą najmniejszych kwadratów do równania;

gdzie t i ; у - częstość chromosomów dicentrycznych jr ; a. - parametr składowej liniowej

' О з /

I PROMIENIOWANI; S: / i MOC DAWKI » no гая/mir. /

1 1

N u

,.4. te • c ! 1С '

Rys.4. ZsłłżnoSć miedzy Mielkością, dawki a częstością chromosomów dicentrycznych i kolistych м komórce dla promieniowania t

O.00 ::-з.оо

Rys.Sp Wpływ promieniowania neutronowego i rentgenowskiego n*

liczb» aberracji dicentrycznych i kolistych w limfocytach krwi ludzkiej.

8 8

ft. — parametr składowej kwadratowej 0 - dawka

Obliczenie dokonano na komputerze IBM PC Xl przy użyciu programu MINUIT, służącego do minimalizacji funkcji wielu zmiennych.

W efekcie uzyskano nastepuja.ee wartości parametrów a i ft dla promieniowania neutronowego /cyklotron U-120 o średniej energii 5.6 MeV/

a - 3.6 N 10"* rad "* ft = 9.3 x 1<Гв rad"a

Dla promieniowania rentgenowskiego o mocy dawki 110 rad/min, a * S.3 x iO"* rad"1

ft =1.2 x 10"" rad "*

Porównując dawki promieniowania rentgenowskiego z dawkami neutronowymi dla arbitralnie przyjętego poziomu aberracji, eożna określić względną skuteczność biologiczna. /HS8/ prędkich neutronów o średniej energii S.6 MeV w stosunku do promieniowania rentgenowskiego. Na podstawie przeprowadzonego opracowani*, oszacowano wartość WSB, przyjmując go równym stosunkowi dawek promieniowania rentgenowskiego i neutronowego dla częstości 1 aberracji na I komórkę:

0 / 1 aberracji na 1 komórk»/ WSB = *

0 / 1 aberracji na 1 komórkę/

Otrzymana wartość wynosi 3.8.

DYSKUSJA. Porównując uzyskane zależności dla Aninopielika oraz Oecisu z

zależnością dla aberracji chromosomowych limfocytów krwi występujących pc napromienianiu promieniowaniem X, można stwierdzić, że uzyskane dla stężenia 3 ul Aminopieliku 2,4 D na 1

99

mi nodowi i ilo^i dicentrikón i ringów /22 na 103* fcoinórefc / oraz

iloiii коякуек z aoerracjaffi! ,'15 na 1036/ odpowiada dawce promieniowams ot?, & redów /1/.

Naieży stwierdzili, że czynnikiem różnicującym częstotliwość aberracji ocserwowanych po mutaoeme jest dawce krwi. Podatność na działanie mutagenu jest różna u różnych dawców.

Komentarza wymaga też sprawa partii związku /rok produkcji/, który był używany do badań. Największa, ilość aberracji chromosomowych uzyskano stosując Aminopielik 2.4 D wyprodukowany w roku 1988, ca zdecydowanie potwierdziły testy mikrobiologiczne, w których Aminopielik 2.4 - 1999 m e powodował mutacji. Nie powodował też mutacji czysty kwas 2.4 D.

Według niektórych autorów /2/, którzy zajmowali się mutagennością tego związku, czynnikiem powodującym mutacje jest jakaś domieszka, która dostaje się do preparatu w trakcie procesu technologicznego jego produkcji, lub powstaje w wyniku rozpadu elementów składowych preparatu. Tłumaczyłoby to różna, mutagenność różną mutagenność różnych partii produkcyjnych Ami порlei i ku 2.4 U.

90

t_ I THTł A TUR A. 1. t'eiuctiinger M. , Koester L. , Schmidt E. , Dresp J., itręnc Chromosome Aberrations in Human lymphocytes induced by ti rteutrons. Int. J. ftadiat. Siół., N o . 5 , 449-457, 19Э4.

2. Schwarzacher H.G., Wolf U.s Methods in human cytogenetics, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New Vork 1974. 3. Sharma A.K., Sharma A.,: Chromosome techniques, Butterwertns, London, Boston, Sydney, Welington, Durban, Toronto 1980. 4. Ziemba-S6ł tawska 8., Bocian E. , Rosiek 0. , and SabliiSski 0. , Chromo&oitis aberrations induced by low doses of X—rays in human

1 уrriohocytes in vitro. Int. J. Radiat. Biol. vol.37, No 2, 231-236, 1980.

5. Turfela Т.Е., and Jalal S.H., Increased rates of sister cliromatid exchanges induced by the herbicide 2.4—0. The Journal of Heredity 76, 213-214, 1985. 6. Best R.G. and McKenzie W.H., Variable sister—chroeatid exchange response in human lymphocytes exposed in vitro to gossypol acetic acid. Mutation Research, 2О6, 227-233, 1988.

7. kohn P.H., Sister Chromatid Exchange in Cancer, Annals o*

Clinical and Lab. Science, Vol. 13, No 4, 1983.

OCENA MUTASENNVCH SKUTKÓW BADANYCH ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN A.Cebulska-Wasilewaka, J.Huczkowski, H. Płuciennik

WSTĘP

W Polsce, jak i na cai y/n świecie stale zwiększa się liczba produkowaynch związków należących do grupy środków ochrony roślin. Niezależnie od niewątpliwych korzyści płynących dla spoieczeństw z podniesienia poziomu upraw, część tych związków etanowi równocześnie potencjalne zagrożenie dla środowiska i zdrowia człowieka. Niektóre z nich, bezpośrednio lub też ich pozostałości a także produkty ich siotransfогяасл, dostają się do wódy, gleby i pasz, stanowiąc nieprzewidziane i niekontrolowane zagrożenie dla zwierząt i dla ludności. Ujemne skutki ich pojawienia się w środowisku mogą się objawić w postaci zwiększonej częstości indukowania rozwoju koaórek rakowycn, dziedzicznych uszkodzeń genetycznych, czy też nawet mogą oyć przyczyna, tzw. dry-ftu genetycznego. Z tego powodu, szczególnej wagi. nabierają, badania, w wyniku których uzyskuje się поме in*or»acje- odnośni* kancerogenności lub mutagenności popularni* stosowanych związków lub preparatów. W poszczególnych rozdziałach mniejszego opracowania przedstawiono rezultaty z wykonanych na rożnych testach biologicznych badań nad Mutagennością. niektórych popularnie stosowanych w rolnictwie preparatów. Cele» niniejszej pracy oraz podkreśleni* paru нпюском istotnych die ochroney środowiska czy też dalszych badaA. EFEKTYWNOŚĆ MUTAGENNA

Aktywność mutagenną stwierdzono dła preparatów;

- Afalon, i deltawetryna w oparciu o pojedynczy t*st - Decis w oparciu o dwa testy

- Anunopielik, Ainbusz , w oparciu o trzy testy Normowanie wielkości е-fektu mutagennego na poziomie SO'/. przeżywalności dla modelu mutacjj barwnikowych Chloral la vulgar is

pozwala ułożyć następujący szereg mutagennej aktywności badanych czynni kt*-- Promieniowanie > EMS > Aminopielik 88 > Ambusz >> pozostałe ""O Analogiczne normowanie na modelu mutacji mitochondrialnych u Saccharomyces ccrevisiae pozwala z kolei ułożyć następujący szereg tych samych czynników: Ambusz or orni eni owani e > Ami napięli к > Akrydyna >> pozostałe ""O Jeszcze bardziej szczegółowy szereg mutagennej aktywności uzyskuje się w oparciu o rezultaty uzyskane dla mutacji somatycznych u

Tradescantia:

Promieniowanie X > fiipcord > A-falon (przestarzalv) > EMS .-•

deltametryna > Amnopielik 88 > Ambusz > - Afalon (świeży) > Ammopielik 89 > Decis Wprawdzie tak przedstawione aktywności pozwalają tylko na jakościowe oszacowanie uzyskanych rezultatów, niemniej jednak niepokojącymi w tych rezultatach są dwa -fakty: - w pewnych układach biologicznych środki będące w powszechnym użyciu mogą być bardziej mutagenne niż znane silne mutageny (zależności podkreślone w przedstawionych powyżej szeregach),

- niektóre ze stosowanych środków wykazują bardzo silną zmienność w aktywności mutagennej w zależności od daty produkcji czyli od technologii < w przypadku Aminopielika taką niestabilność potwier¬ dziły wszystkie zastosowane testy włączjąc w to aberracje chromo¬ somów» indukowane w limfocytach krwii ludzkiej), względnie wykazują niestabilność roztworów stosowanych preparatów <Afalon), a zat** wskazując na możliwość zagrożenia wynikającego

94

Tabela 1

Wartości Rad - ekwiwalentów uzyskanych dla preparatów badanych na test indukowania mutacji somatycznych u Tradescantia Preparat

Promieniowanie

EMS

Ammopielik S8

Aminopielik 89

Afalon (2)

Afalon (0)

Ambusz

Decis

Deltametryna

Ekspozycja

X lcGy

2oul-C,045X

lOuł-O,OO4%

10и1-0,004Я

10ul-0,003Z.

łOul-O,OO3X

10u 1-0,005"/.

Юц1-0,1Х

2ug w lOul DMSO

Częstość

fflut/ЮО Hł

O,O45

0,60

0,30

0,24

0,27

0,33

0,30

0,01

0,26

Raa-efcw.

c G y

l.O (rad)

13,3

6 , 7

5 , 3

7 , 3

6 , O

6 , 7

0 , 2

5 , 8

z degradacji stosowanego preparatu w środowisku naturalny*. Jeszcze bardziej niepokojące wydają się oyi wnioski

wynikające z próby przybliżonego szacowania ilościowego ryzyka wynikającego z mutagewnnoSci tych preparatów. Takie przybliżane szacowanie opiera sie na porównaniu skutków biologicznych obserwowanych pod wpływem działania tych preparatów, ze sfcutkaati wywołanymi w tym samym układzie przez promieniowania jonizujące. W tabeli 1 przedstawiono wartości Rad- ekwiwalentu uzyskane w opraciu o dane prezentowane dla Tradescantia. Jeżeli weż*ie»y pod uwagę, że w przypadku promieniowania jonfeującego dopuszczalna granica rocznego naraź enia ludności na proeieniowawanie wynosi 0,5 ren, co odpowiada efektowi biologicznemu proaipniowama o dawce pochłoniętej 0,5 cGy < rad), to wyniki te wskazują na rzeczywiste zagrożenie środowiska. Za§rożenię wynikające z

95

wprowaazanió lut» ooecncśti tych preparatów w środowisku jest niepn ówr.ywaine w żadnej яиегге z zagrozemeci jakie wynika dla :::c»ieto г jego nieununionecio kontaktu z promieniowaniem jajrujĄcyai. Dramatyzm tycn cyfr jeszcze bardziej podkreśla fakt, że jał- wykazano w pracy na temat współdziałania tych czynników z promieniawanieu jonizującym w środowisku «ozna się równie: spodziewać synerąistycznego wzmocnienia, Mutagennej aktywności tych preoaratiw. WNIOSKI

Uzyskane rezultaty wykazują po pierwsze przydatność wypranych metod do oceny efektywności mutagennej preparatów badanych. po drugie celowość zastosowania kilku testów zamiast jednego, którego np negatywna odpowiedź nie wyklucza caikowicie mutagennej aktywności tego preparatu w innym teście

Badania wykazały, że preparaty zarówno typu chwaetooójczeoe takie jak Aminopielik jak i owadobójczego jak Amousz mogą być efektywnymi mutagenami i to w zakresie stężeiS zbliżonych do etęzer. stosowanych м praktyce rolniczej. Aktywność Mutagenną tych preparatów stwierdzono zarówno пл prostych układacn roślinnych jak Chlor ell* vulg. jak również u roślin wyższych jak Tradescantza.

W oparciu o uzyskane rezultaty wydaje się, ze powinno sie zalecać stosowani» w praktyce rolniczej, jeżeli te jest aożliwe preparatów typu becis 2,5 EC zamiast preparatu Ambusz 25 EC.

Należy podkreślić fakt, że w przypadku badanych środków ochrony roślin w układach opartych na Chlor mila vulg. oraz Saccharowyces cmrev. efekty sa. obserwowane już przy zastosowaniu środków o stężeniach zbliżonych do stosowanych w praktyce natomiast efekty mutagennego działania promieniowania obserwowane

są tylko po oardro wysokich dawkach < lo trad ^a

'. 20kr ad Chiorclla vuig.). » zasadzie ekspozycja cat ego па dawki promieniowania przekraczające 100 radów grozi

śmiercią, natomiast, dawki promieniowania wynikające z eKSPOzycji na występujące w środowisku źródła promieniowania są rzędu null radów na rok. Czyli nawet tysiąckrotnie wyższe dawki promieniowania niż dawki występujące w środowisku nie mogłyby wywołać obserwowałnego efektu mutagennego u Chlorella vulq. oraz u Sacctiaromyces cerev.. Można zatem przypuszczać, że mutagenne właściwości środków ochrony roślin mogą. stanowić istotne zagrożenie genotoksyczne dla środowiska naturalnego nieporównywalnie większe niż ryzyko wynikaja.ce z nieuchronnego kontaktu człowieka г obecnym w środowisku promieniowaniem jaru z u ja. cvn.. Przypuszczenie takie wyraźnie popierają rezultaty aonośme mutagenności oaoanych preparatów uzyskane dla Tradescantia. Test ten яа wrażliwość na promieniowanie zbliżona, do wrażliwości limfocytów ludzkich. W konsekwencji wydaje sie że byłoby wskazane kontynuowanie dalszych badań z uwzględnieniem następujących kierunków;

- poszerzenia możliwości korzystania г całej baterii testów we wszystkich przypadkach badanych preparatów, albo przynajmniej tych, dla których zostanie uzysk*"* odpowiedź pozytywna dla najczulszego testu tzn Tradescantta

- badanie preparatów oraz ich czystych substancji biologicznie aktywnych jeszcze przed wprowadzanie* preparatów użytkowych na rynek. - opracowanie modelu matematycznego opisującego zależność dawka efekt u Chlorella vulq. oraz Saccharomyces cmrmv., pozwalającego na ekstrapolacje danych z zakresu dawek wysokich do niskich. Taka

ekstrapolacja w konsekwencji dałaby możliwość zastosowania koncepcji szacowania ryzyka genot oi'sycz nego na podstawie Rad ekwiwalentu w oparciu o dane eksperymentalne z wszystkich stosowanych model i.

98

PODZIĘKOWANIE W imieniu wszystkich współautorów niniejszego opracowania pragnę gorąco podziękować naszym koleżankom i kolegom z Działu Elektroniki oraz z Zakładu XI, a szczególnie Jołi Adamczyk za pomoc w naszych badaniach i rzetelność w pomiarach, które w ogrcinym stopniu przyczyniły się do osiągnięcia naszego celu.

A. Cebulska-Wasi1ewska

99

AUTORZY TEKSTÓW: ANTON I NA CEBULSKA-WAS ILEWSKA Zakład Radiobiologii, Instytut Fizyki Jądrowej, ul. RadzikowskieQO 152, 31-342 KRAKOM JERZY HUCZKOWSKI Zakład Radiotuologi i ,

Inst/tut Fizyki Jądrowej, ul . Radźikowskiego 152, 31-342 KRAKÓW

EWA KASPER

Zakład Radiobiologii, Instytut Fizyki Jądrowej, ul. ftadzikowskiego 152, 31-342 KRAKOM BOGUSŁAWA KRZYKWA Laboratorium Cytologii, Instytut Pediatrii, ui.Wielicka, KKAKOW STANISŁAW MACUBOWSKI Krakowska Stacja Kwarantanny i Ochrony Roślin,ul.Kołowa 3, KRAKÓW HENRYK PŁUCIENNIK #

Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski, ul. Pasteura 1, WARSZAWA JANUSZ SMAGAŁA Zakład Radiobiologii, Instytut Fizyki Jądrowej, ul. Radźikowskiego 152, 31-342 KRAKÓW STANISŁAW SIWLINSKI Wydział Chenii, Uniwersytet Warszawski,ul. Pasteura 1, WARSZAWA WITOLD WAJDA Zakład Radiobiologii,

Instytut Fizyki Jądrowej, ul. Radzikowskiego 152, 31-342 KRAKÓW ANNA WIERZEWSKA

Zakład Radiobiologii, Instytut Fiiyki Jądrowej, ul. Radzikowskiego 152, 31-342 KRAKÓW

1OO