PANDUAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER

DISUSUN OLEH:

Valentina Yurina, M.Si

Dra. Diana Lyrawati, M.Si. Ph D. Apt.

Ferri Widodo, M.Biomed., Apt.

Rudy Salam, M.Biomed., Apt.

Oktavia Rahayu, M.Biomed.

dr. Dewi Santosaningsih, M.Kes

dr. Dwi Yuni Nurhidayati, M.Kes

Oktavia Rahayu Adianingsih, M.Biomed.

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

2019

0

1

KATA PENGANTAR

Panduan praktikum Biologi Molekuler ini disusun bagi mahasiswa Program

Studi Sarjana Farmasi, FKUB yang melaksanakan praktikum Biologi Molekuler

sebagai penunjang dari mata kuliah Biologi Molekuler.

Praktikum Biologi Molekuler diharapkan dapat menambah wawasan dan

ketrampilan mahasiswa dalam teknik-teknik dasar biologi molekuler yang umum

digunakan.

Sebelum memulai praktikum, mahasiswa diharapkan mempelajari panduan

praktikum ini, termasuk tata tertib praktikum sehingga tujuan praktikum dapat tercapai

dan praktikum berlangsung dengan benar dan memenuhi persyaratan keamanan

laboratorium. Penggunaan sampel biologis dalam praktikum ini menuntut kehatia-

hatian dan perhatian penuh dari setiap mahasiswa karena dapat mengakibatkan resiko

kontaminasi yang serius jika tidak diantisipasi sebelumnya.

Semoga buku panduan praktikum ini dapat berguna bagi mahasiswa dan

pengguna lain.

Malang, Agustus 2017

Tim Penyusun Panduan

Praktikum

Biologi Molekuler

2

3

TATA TERTIB PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

Mahasiswa yang mengikuti praktikum Biologi Molekuler diwajibkan mematuhi Tata

Tertib sebagai berikut:

1. Diwajibkan hadir tepat waktu sesuai jadwal praktikum yang telah ditentukan.

2. Mengenakan pakaian sopan dan sepatu tertutup.

3. Mengenakan jas praktikum.

4. Membawa perlengkapan yang tidak tersedia di laboratorium, seperti: tissue, sarung

tangan lateks sekali pakai, dll.

5. Berada dalam laboratorium selama praktikum, kecuali mendapatkan izin dari

dosen yang bertugas.

6. Menjaga kebersihan dan keutuhan alat laboratorium. Bagi mahasiswa yang

merusak atau menghilangkan alat laboratorium diwajibkan mengganti sesuai

dengan spesifikasi alat tersebut maksimum 1 hari sebelum praktikum selanjutnya.

Apabila hingga praktikum berikut belum mengganti alat tersebut maka sanksinya

adalah tidak diperbolehkan mengikuti ujian praktikum.

7. Bekerja dengan jujur dan tertib.

8. Berbicara seperlunya dan tidak gaduh.

9. Maksimum ketidakhadiran mahasiswa dalam praktikum adalah 1 kali pertemuan,

apabila mahasiswa tidak hadir lebih dari 1 kali praktikum sanksinya adalah

dianggap tidak lulus dalam praktikum Biologi Molekuler dan harus mengulang

praktikum ini pada tahun berikutnya. Izin yang diterima adalah izin yang tertulis

dan dengan alasan yang dapat dipertanggungjawabkan.

10. Mengembalikan alat laboratorium dalam keadaan bersih dan lengkap.

11. Membuat dan mengumpulkan laporan praktikum sesuai dengan draft yang telah

ditentukan.

12. Meninggalkan ruang praktikum dalam keadaan bersih dan rapi.

Tempat praktikum: Laboratorium Mikrobiologi FKUB

4

JADWAL PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

TAHUN AKADEMIK 2019/2020

MINGGU TANGGAL MATERI KELAS TEMPAT PRAKTIKUM

DOSEN PENGAMPU

123-08-2019 Teknik Pipetting A & B Laboratorium

Farmasi Klinis

Dra. Diana Lyrawati, M.S., P.hD., Apt.

Dr. Valentina Yurina, M.Si.

Oktavia Rahayu A, S.Farm., M.Biomed

2 30-08-2019 Isolasi & Kuantifikasi

DNA

A

Laboratorium Mikrobiologi

3 06-09-2019 B

413-09-2019

Amplifikasi DNA dengan metode PCR

A & B

520-09-2019

Karakterisasi DNA dengan elektroforesis

agarosa

A & B

627-09-2019

Kloning DNA dengan metode

heat shockA & B Laboratorium

Mikrobiologi dan Biomedik7 04-10-2019 Karakterisasi

hasil kloningA & B

8 25-10-2019 Isolasi dan kuantifikasi

protein dengan metode bradford

ALaboratorium Mikrobiologi

Dra. Diana Lyrawati, M.S., P.hD., Apt.

Oktavia Rahayu A, S.Farm., M.Biomed

9 1-11-2019 B

1008-11-2019

Karakterisasi protein dengan

SDS-PAGE

A & B

11 15-11-2019Presentasi hasil

A

Laboratorium Farmasi Klinis

12 22-11-2019 B

13 29-11-2019Ujian akhir praktikum

A

14 06-12-2019 B

Persentase penilaian: Diskusi : 10% Pengerjaan : 50% penilaian dari proses dan produk (hasil) Post test : 10% Laporan : 10% Ujian akhir : 20%

5

BAB I

TEKNIK PIPETTING

Tujuan:

Memahami tujuan penggunaan mikropipet

Memahami penggunaan mikropipet dengan baik dan benar

Memahami sistem metrik dalam penghitungan volume kecil

Alat:

Mikropipet dengan berbagai ukuran

Bahan:

1 mL larutan berwarna merah

1 mL larutan berwarna hijau

1 mL larutan berwarna kuning

1 mL larutan berwarna biru

Beaker glass

Aqua bidestilata

Tip

Microtube

Prinsip Dasar:

Penelitian Biologi Molekuler pada umumnya berkaitan dengan volume yang

sangat kecil, yaitu dalam skala mikroliter. Untuk mendukung penelitian tersebut

dibutuhkan suatu peralatan khusus untuk mengukur dan mengambil sejumlah tertentu

larutan, yaitu mikropipet. Penggunaan mikropipet yang baik dan benar akan

meningkatkan keberhasilan suatu penelitian. Mikropipet yang tersedia saat ini dapat

mengambil suatu volume larutan mulai dari 0,25 µL hingga 1000 µL. Ada dua macam

mikropipet yang umum digunakan, yaitu single channel dan multi channel (Gambar

1.1)

6

Gambar 1.1. Variasi mikropipet (A) Manual single channel micropipette (B) Manual multi channel micropipette (C) Electronic multi channel micropipette

Mikropipet terdiri dari beberapa bagian utama, yaitu: plunger (tombol

untuk menarik/mengeluarkan cairan), ejector button (tombol untuk melepaskan

disposable tip), volume indicator (menunjukkan jumlah cairan yang dipipet),

volume adjustment (bagian pengaturan jumlah cairan yang dipipet), tip

attachment (bagian penempelan disposable tip). (Gambar 1.2).

Gambar 1.2. Bagian-bagian pipet

7

Prosedur:

A. Penggunaan mikropipet dengan berbagai variasi rentang volume

Mikropipet tersedia dalam berbagai rentang volume yang berbeda, yaitu 0,5-10

μL (P-10), 2-20 μL (P-20), 20-200 μL (P-200), 200-1000 μL (P-1000).

Penggunaan pipet harus tepat sesuai dengan volume cairan yang hendak

dipipet.

1. Pilih pipet seusai dengan volume yang dimaksudkan, misalnya:

P-20 P-200 P-1000

0 0 0

4 4 4

7 7 7

4.7 μL 47 μL 470 μL

Isilah bagian yang kosong pada tabel berikut:

A) P-1000 B) P-200 C) P-____

0 1

8 9

8 8

_____ μL _____ μL 940 μL

D) P-____ E) P-20 F) P-____

1

5

0

50 μL _____ μL 19,5 μL

8

9

2. Tentukan volume yang hendak dipipet dengan mengatur tombol adjusment.

Jangan memutar tombol adjusment lebih besar daripada volume yang tertera di

bagian atas pipet!!

3. Tekan pipet pada kotak tip. Penekanan harus cukup kuat untuk mendapatkan

suatu kondisi kedap udara tetapi jangan menggunakan kekuatan berlebihan.

4. Tekan bagian plunger hingga pemberhentian pertama, masukkan ujung tip hingga

kurang lebih 2 mm dari permukaan cairan dalam keadaan pipet vertikal. Lepaskan

plunger secara perlahan, tarik ujung tip dari permukaan cairan. Jangan pernah

memegang pipet dalam kondisi horizontal saat tip berisi cairan !!

5. Sentuhkan ujung tip pada bagian sisi dalam mikrotube kosong, tekan plunger

hingga pemberhentian kedua. Upayakan semua cairan keluar keluar dari tip

6. Buang tip dengan menekan tombol ejector

B. Penggunaan mikropipet dengan akurat dan presisi

1. Beri label pada 3 mikrotube kosong (A.B.C)

2. Pipet sejumlah larutan berwarna sebagai berikut pada ketiga tabung:

Tabung Cairan

merah (μL)

Cairan

kuning (μL)

Cairan

biru (μL)

Cairan

hijau (μL)

Total

volume (μL)

A 220 25 5 0

B 33 7 0 210

C 3 0 215 32

3. Ketukkan tabung pada meja hingga semua cairan terkumpul.

4. Jumlahkan volume total pada masing-masing tabung

5. Set volume pipet sesuai jumlah volume total

6. Pipet cairan sejumlah volume total masing-masing tabung, cek apakah tersisa

7. cairan di dasar tabung atau terdapat udara di ujung pipet.

10

BAB IIISOLASI DNA TOTAL

Tujuan:

1. Memahami konsep isolasi DNA total dari sel manusia.

2. Melakukan isolasi DNA total dari sel manusia.

Prinsip:

DNA total dapat diperoleh dari sel tanaman, bakteri, atau dari organismen lain yang

hendak dipelajari. Secara garis besar, proses isolasi DNA total terdiri dari empat tahap, yaitu:

Lisis sel, baik dengan metode fisik (secara mekanik) atau kimiawi (menggunakan

senyawa tertentu yang menyebabkan sel lisis, misalnya lisosim dan EDTA).

Ekstraksi DNA sehingga terpisah dari komponen sel lain, dapat digunakan menggunakan

pelarut organik (misalnya fenol dan kloroform) atau dengan metode kromatografi.

Pemekatan DNA total, pada umumnya menggunakan presipitasi etanol.

Bahan:

Rambut manusia (5 helai yang dicabut beserta bagian akarnya)

Apusan bukal manusia

Larutan saline (larutkan 20 gram garam dalam 200 mL air)

Proteinase K

Tip

Microtube

TE buffer (harus dibuat segar, maksimal 1 jam sebelum penggunaan):

o 1 ml 1 M Tris HCl

o 0.2 ml 0.5 M Na2EDTA

o Tambahkan aquadest sehingga volume akhir 100 ml

o Adjust dengan larutan buffer hingga mencapai pH 8.0

Alat:

Sentrifuga

Water bath

11

Mikropipet

Wadah penampung

Prosedur isolasi DNA dari sel bukal manusia:

1. Peserta praktikum yang hendak diambil sampelnya berkumur dengan cairan saline 10 mL

selama 60 detik. Keluarkan cairan saline dan tampung dalam wadah yang disediakan.

2. Putar wadah perlahan untuk meresuspensi sel kemudian ambil sampel sebanyak 1,5 mL

dan masukkan ke dalam mikrotube

3. Sentrifuga cairan sampel selama 2 min pada kecepatan maksimal.

4. Buang supernatannya kemudian ulangi prosedur 2 dan 3 sebanyak 2 kali.

5. Resuspensi sel bukal dengan 140 uL buffer lisis kemudian homogenasikan dengan

vorteks, tambahkan 10 uL proteinase K 20mg/mL

6. Inkubasi sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C

7. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik

8. Inkubasikan sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 99⁰C

9. Sentrifuga sel lisat selama 2 menit pada kecepatan 6000 rpm

10. Pindahkan supernatan pada tabung mikrosentrifuga

11. DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (simpan di suhu - 20⁰C)

Gambar 2.1. Prosedur isolasi DNA total dari sel bukal manusia (Sumber: VNTR Human DNA typing Using PCR (Edvotek))

12

Prosedur isolasi DNA dari rambut manusia:

1. Ambil 5 helai rambut, termasuk bagian akarnya (lihat gambar).

2. Potong rambut sepanjang 1cm dari bagian akar rambut.

3. Gunting menjadi bagian yang lebih kecil.

4. Sentrifuga dengan kecepatan maksimal selama 10 detik untuk mengumpulkan potongan

rambut pada bagian bawah tube.

5. Resuspensi potongan rambut dengan 140 uL buffer lisis (pastikan semua potongan

rambut terendam buffer lisis), tambahkan 10ul Proteinase K 20mg/mL.

6. Inkubasi sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C.

7. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik.

8. Sentrifuga sampel pada kecepatan maksimal selama 10 detik.

9. Inkubasikan sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C.

10. Pindahkan pada waterbath bersuhu 99 ⁰C kemudian inkubasikan selama 10 menit

11. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik.

12. Sentrifuga sel lisat selama 2 menit pada kecepatan 6000rpm.

13. Pindahkan supernatan pada tabung mikrosentrifuga.

14. DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (simpan di suhu - 20⁰C)

Gambar 2.2. Prosedur isolasi DNA total dari rambut manusia (Sumber: VNTR Human DNA typing Using PCR (Edvotek))

13

BAB IIIKUANTIFIKASI DNA

Tujuan:

1. Mempelajari prinsip dan metode penghitungan konsentrasi DNA dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis.

2. Melakukan kuantifikasi DNA menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

Prinsip:

DNA murni memiliki kemampuan untuk menyerap absorbansi pada panjang gelombang

260 nm karena adanya basa-basa purin dan pirimidin yang menyusun DNA. Untuk menghitung

konsentrasi DNA dalam suatu sampel dapat digunakan penilaian berikut ini:

1 O.D. pada 260 nm untuk double-stranded DNA = 50 ng/ul of dsDNA

1 O.D. pada 260 nm untuk single-stranded DNA = 20-33 ng/ul of ssDNA

1 O.D. pada 260 nm untuk RNA molecules = 40 ng/ul of RNA

Maka untuk menghitung konsentrasi DNA digunakan persamaan berikut ini:

Konsentrasi DNA = A260 nm x 50 x faktor pengenceran

Di lain pihak, senyawa fenol dan protein dapat menyerap absorbansi pada panjang gelombang

280 nm. Dengan demikian adanya kontaminan protein/fenol pada sampel DNA/RNA dapat

dihitung dengan menggunakan persamaan:

Nilai kemurnian DNA/RNA =

DNA atau RNA yang murni memiliki nilai kemurnian antara 1,8-2,0. Adanya kontaminasi

menyebabkan nilai yang diperoleh akan lebih kecil dari 1,8 sehingga mengurangi nilai

kepercayaan dalam penghitungan konsentrasi DNA atau RNA yang sebenarnya.

Bahan dan Pereaksi:

DNA rambut dan bukal yang akan dihitung konsentrasinya

Aquabidestilata

Microtube

Tip

14

Alat:

Mikropipet

Spektrofotometer UV-Vis

Prosedur:

1. Pipet 50 µL sampel DNA yang akan ditentukan konsentrasinya

2. Masukkan ke dalam mikrotube baru yang telah berisi 50 µL aquadest, homogenkan.

3. Ukur absorbansi sampel pada λ 260 nm dan λ 280 nm.

4. Hitung konsentrasi dan kemurnian sampel DNA dengan mempertimbangkan faktor

pengenceran.

15

BAB IVAMPLIFIKASI DNA DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION

Tujuan:

Memahami dan melakukan proses amplifikasi DNA menggunakan metode Polymerase

Chain Reaction

Prinsip:

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu metode amplifikasi atau perbanyakan

DNA pada suatu daerah terget tertentu yang dibatasi oleh sepasang primer (primer forward dan

primer reverse). Pada umumnya proses amplifikasi dilakukan oleh DNA polymerase yang

berasal dari Thermus aquaticus. Proses amplifikasi dilakukan dalam 3 tahap, yaitu denaturasi

(pemisahan untai ganda DNA), anneling (penempelan primer), dan elongasi (perpanjangan untai

DNA). Masing-masing tahapan dilakukan pada suhu yang berbeda-beda.

Aplikasi metode polimerase chain reaction di bidang kesehatan sangat luas, misalnya

sebagai metode pendeteksi patogen atau cemaran dalam produk kesehatan, untuk identifikasi

hubungan kekerabatan, dan untuk deteksi forensik dan deteksi penyakit genetik. Salah satu

penggunaan PCR yang telah lama dikenal adalah identifikasi variable number of tandem repeats

(VNTR), yaitu suatu region pada genome manusia yang sangat bervariasi antar individu. VNTR

pada segmen pYNZ22 (HGM locus Dl 7S30) adalah salah satu segmen dengan tingkat

polimorfisme yang tinggi dan telah banyak digunakan dalam deteksi hubungan kekerabatan dan

penyakit genetik.

16

Gambar 4.1. Proses amplifikasi DNA dengan metode PCR (Sumber:VNTR Human DNA typing Using PCR (Edvotek))

Bahan:

DNA template (DNA kromosom total hasil isolasi)

Primer forward dan reverse (5'-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3' dan 5'-

CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3') masing-masing dengan konsentrasi 0,5 uM

dNTP

Taq DNA Polimerase dan buffer yang sesuai

ddH2O

17

Tip

Microtube untuk PCR (200 µL)

Alat:

Sentrifuga mikro

Microtube 200 µL steril

Thermal cycler

Prosedur:

Komposisi reaksi PCR:

Master mix solution 12,5 L

Primer forward 10pmol/uL 1 L

Primer reverse 10pmol/uL 1 L

DNA template 1 g/uL 1 L

ddH2O 9,5 L

Total 25 L

Prosedur kerja :

1. Selalu gunakan wadah es saat bekerja.

2. Masing-masing komponen PCR dimasukkan ke dalam tabung, gunakan tip yang berbeda

untuk setiap komponen

3. Sampel DNA di kocok/vortex dan kemudian di-spin sebelum digunakan.

4. Tabung dispin sebentar agar semua larutan turun dan bercampur.

5. Tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR.

Kondisi reaksi PCR :

Pre-denaturasi : 94 oC selama 5 menit

Denaturasi : 94 oC selama 1 menit

Annealing : 55 oC selama 1 menit

Elongasi : 72 oC selama 1 menit

Post-elongasi : 72 oC selama 10 menit

Penyimpanan : 4 oC

6. Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis dan diamati di bawah sinar UV.

18

28 siklus

BAB V

KARAKTERISASI DNA DENGAN ELEKTROFORESIS AGAROSA

Tujuan khusus:

Mempelajari dan melakukan karakterisasi DNA dengan menggunakan elektroforesis

Agarosa

Menentukan ukuran DNA hasil elektroforesis dengan menggunakan metode logaritmik

Prinsip:

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan DNA berdasarkan ukurannya di bawah

medan elektrik. Molekul DNA bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke kutub positif saat

diletakkan di dalam suatu medan elektrik. Jarak migrasi masing-masing molekul DNA pada

suatu media akan berbeda-beda tergantung pada ukurannya. Media yang dapat dipakai adalah gel

agarose, poliakrilamid, atau campuran keduanya. Media tersebut berupa suatu polimer berpori di

mana besar pori ditentukan oleh konsentrasinya. Semakin tinggi konsentrasi polimer maka pori

yang terbentuk semakin kecil. Dengan demikian DNA yang berukuran besar akan memiliki jarak

migrasi yang lebih pendek dibandingkan DNA berukuran kecil pada suatu media dengan

konsentrasi yang sama. DNA yang telah bermigrasi divisualisasi dengan metode tertentu, di

antaranya dengan staining Etidium bromide atau cyber green di bawah iradiasi ultraviolet.

Bahan:

Agarosa

DNA yang akan dikarakterisasi

DNA marker/ DNA ladder

Etibium bromida (EtBr)

Buffer elektroforesis (Tris Acetate EDTA/ TAE buffer)

Loading dye

Alat:

Heater with magnetic strirer

Electrophoresis horisontal system

Transluminator UV

19

Penggaris

Prosedur:

1. Timbang 0,4 g agarose dengan neraca

2. Encerkan TAE 10x hingga diperoleh buffer TAE 1x

3. Larutkan agarose yang telah ditimbang dalam 40 mL buffer TAE 1x, kemudian panaskan

hingga mendidih. Pastikan semua agarose telah larut dalam buffer.

4. Setelah larutan agarose agak dingin (±60⁰C), tambahkan 1µL EtBr, aduk hingga

homogen

5. Tuangkan larutan agarose+EtBr ke dalam cetakan yang telah disiapkan sebelumnya,

pastikan sisir telah terpasang dengan baik dan cetakan terletak pada permukaan yang

datar.

6. Tunggu hingga larutan agarose memadat

7. Setelah larutan agarose menjadi gel padat, masukkan ke dalam chamber elektroforesis.

8. Tuangkan buffer TAE 1x hingga seluruh permukaan gel terendam.

9. Load DNA yang akan dikarakterisasi yang telah ditambah dengan loading dye.

10. Hubungkan elektroda dengan power suply (jangan terbalik antara elektroda positif dan

negatif) dan atur voltase dan waktunya.

11. Setelah elektroforesis selesai, matikan alat dan ambil gel; pindahkan ke transluminator

UV dan amati hasilnya.

20

Gambar 5.1. Proses persiapan gel agarosa (Sumber: VNTR Human DNA typing Using PCR (Edvotek)

21

BAB VI

KLONING DNA DENGAN METODE HEAT SHOCK

Tujuan:

Memahami proses kloning DNA dengan metode heat shock.

Prinsip:

Kloning DNA dilakukan dengan proses transformasi plasmid yang membawa gen target

ke dalam sel inang. Proses transformasi dapat dilakukan dengan menggunakan metode heat

shock, yaitu menggunakan perubahan temperatur secara mendadak sehingga memicu

terbentuknya pori-pori pada membran sel inang. Sebelumnya sel inang yang digunakan telah

dibuat kompeten dengan penambahan senyawa tertentu, misalnya CaCl2 yang dapat menginduksi

perningkatan permiabilitas sel.

Bahan:

Sel kompeten Escherichia coli DH5α

Plasmid pET

Ampisilin (100mg/mL)

Media Luria Bertani Agar

Media Luria Bertani Broth

Es

Sealing film

Tip

Alat:

Mikropipet

Water bath

Sentrifus mikro

Bunsen

Inkubator goyang

Inkubator oven

Ose steril

22

Spreader steril

Cawan petri disposable

Prosedur:

1. Sel E.coli kompeten sebanyak 50 µl dipipet ke dalam tabung mikro.

2. Ditambahkan 300 ng plasmid ke dalam sel kompeten kemudian dihomogenkan secara

perlahan dengan pipet.

3. Campuran sel dan plasmid diinkubasi di dalam es selama 30 menit.

4. Dilakukan heat shock pada suhu 42°C selama 45 detik.

5. Tabung berisi sel diinkubasi kembali di dalam es selama 2 menit.

6. Ditambahkan media Luria Bertani Broth sebanyak 800 µl ke dalam tabung mikro dan

inkubasi kembali selama 1 jam pada suhu 37°C 150 rpm.

7. Tabung disentrifuga selama 1 menit 6000 rpm.

8. Supernatan sebanyak 600 µl diambil dan pelet diresuspensi.

9. Suspensi bakteri disebarkan pada media Luria Bertani Agar yang telah disuplementasi

dengan antibiotik.

10. Dilakukan inkubasi semalam pada suhu 37°C kemudian diamati hasilnya.

11. Klon yang tumbuh dipindahkan ke media baru.

23

BAB VII

KARAKTERISASI HASIL KLONING

Tujuan:

Memahami proses karakterisasi klon dengan metode PCR.

Prinsip:

Klon yang berhasil tumbuh pada media seleksi perlu dikarakterisasi untuk dikeathui

kebenaran kandungan plasmid dan gen yang dibawanya. Salah satu metode yang dapat

digunakan untuk mengkarakterisasi klon adalah dengan metode PCR dengan menggunakan

primer yang spesifik terhadap gen target yang dikandung dalam plasmid.

Bahan:

Klon yang tumbuh pada media seleksi

Primer spesifik gen target

Master mix PCR

ddH20

Alat:

jarum ose/tusuk gigi steril

bunsen

thermal cycler

Prosedur:

1. Diambil klon yang sudah dipindahkan ke media baru (hasil replica platting) dengan tusuk

gigi steril dan dimasukkan ke dalam tabung PCR (tutup terbuka). Microwave dengan

kekuatan 600 watt selama 20 detik.

2. Dibuat campuran reaksi PCR dengan komponen sebagai berrikut:

Master mix solution 12,5 L

Primer forward 10 pmol/Ul 1 L

Primer reverse 10 pmol/Ul 1 L

ddH2O 9,5 L

24

Total 24 L

3. Dilakukan pencampuran dengan menggunakan pipet hingga homogen

4. Komponen reaksi dimasukkan ke dalam alat thermal cycler.

5. Hasil PCR dianalisa dengan elektroforesis agarosa.

25

BAB VIII

ISOLASI PROTEIN

Tujuan khusus:

Melakukan isolasi protein dari Eschericia coli

Prinsip:

Isolasi protein merupakan suatu proses untuk memisahkan protein target dari komponen

penggangu lainnya, baik berupa protein lain atau komponen non-protein, sehingga protein target

dapat digunakan lebih lanjut, misalnya untuk dipelajari strukturnya, aktivitasnya, dsb. Materi

yang biasa digunakan dapat berupa jaringan atau kultur bakteri. Isolasi protein diawali dengan

pemecahan sel atau jaringan di mana terdapat protein target, dapat dilakukan dengan metode

fisik, misalnya freeze-thawing atau sonikasi, dan metode kimia dengan menggunakan pelarut

organik. Setelah protein terlarut dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan protein target dari

membran sel, DNA, dsb. Selanjutnya dapat dilakukan metode purifikasi lebih lanjut, misalnya

dengan kromatografi.

Bahan:

Kultur E.coli yang ditumbuhkan pada media cair yang sesuai

Phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4

NOG (N-octyl-L-D-glucopyranoside)

Tip

Alat:

Sentrifuga

Mikropipet

Vortex

Prosedur:

1. Sentrifuga 1,5 mL kultur cair E.coli dengan kecepatan 3000rpm

2. Buang supernatannya, resuspensi pelet sel dengan PBS sejumlah 15x jumlah pelet.

3. Tambahkan 0,5% NOG.

26

4. Homogenasikan dengan vorteks selama 1 menit.

5. Sentrifuga pada kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4⁰C.

6. Supernatan yang berisi crude protein dapat digunakan untuk analisa berikutnya.

27

BAB IX

KUANTIFIKASI PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD

Tujuan khusus:

Memahami dan mampu melakukan kuantifikasi protein dengan menggunakan metode Bradford

Prinsip:

Metode Bradford merupakan metode analisis protein berbasis kolorimetri yang menggunakan

spektrofotometri UV-vis (595nm). Metode ini menggunakan Commasie Briliant Blue G-250

yang mengalami perubahan warna setelah berikatan dengan protein dalam suasana asam. Secara

umum, metode Bradford dapat digunakan untuk mendeteksi protein dengan rentang konsentrasi

0 µg/ml to 2000 µg/ml. Keunggulan dari metode ini, diantaranya adalah cepat, tidak perlu

pemanasan sampel, dan memberikan reaksi kolorimetri yang relatif stabil dibandingkan metode

kolroimetri lainnya.

Bahan:

Reagen Bradford: 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml 95% ethanol, tambahkan

100 ml 85% (w/v) phosphoric acid, add aquadest 1 liter

Protein yang akan dihitung kadarnya

Bovine serum albumin (BSA) sebagai standar

Alat:

Alat gelas

Spektrofotometer

Prosedur:

1. Siapkan larutan standard BSA dengan konsentrasi 100 µg/ml sebagai larutan baku induk.

2. Siapkan larutan baku kerja BSA, blanko, dan protein sampel sesuai dengan Tabel 1.

(Pengenceran protein perlu dilakukan agar terdeteksi dalam rentang absorbansi linier).

3. Inkubasi larutan selama 5 menit

4. Ukur absorbansinya pada 595 nm menggunakan spektrofotometer UV-vis.

5. Tentukan konsentrasi protein sampel

28

Table 1: Jumlah Sampel dan Reagen Bradford

29

Test Sample Sample vol.,

µl

PBS,

µl

Bradford reagent,

µl

Blank 0 100 400

BSA Standard (10 µg/ml) _______ _______ 400

BSA Standard (20 µg/ml) _______ _______ 400

BSA Standard (30 µg/ml) _______ _______ 400

BSA Standard (40 µg/ml) _______ _______ 400

BSA Standard (50 µg/ml) _______ _______ 400

Protein Sample 100 0 400

BAB X

KARAKTERISASI PROTEIN DENGAN SDS-PAGE

Tujuan:

Memahami proses karakterisasi protein dengan menggunakan metode elektroforesis SDS-PAGE

Prinsip:

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), merupakan

metode pemisahan protein yang sangat umum digunakan di bidang biologi molekuler. Metode

ini berdasarkan pada mobilitas protein sesuai ukurannya di bawah medan elektromagnetik. SDS

merupakan suatu senyawa surfaktan anionik yang dapat memberikan muatan negatif dan

melinierkan protein. Dengan adanya SDS, semua protein menjadi linier dan bermuatan negatif

sehingga dapat bergerak menuju muatan positif saat dilektroforesis.Setelah dielektroforesis, gel

dapat distaining untuk menampilkan protein, misalnya dengan Commasie Briliant Blue G-250.

Bahan:

Akrilamid 30%

Separating buffer (Tris Cl 1,5 M pH 8,8)

Stacking buffer (Tris Cl 0,5 M pH 6,8)

Ammonium persulphate (APS) 10%

N, N, N', N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)

Buffer elektroforesis

ddH2O

Asam asetat glasial

Reducing sample buffer (RSB)

Metanol

Glisin

Tris base

Tip

Tube 15 ml dan microtube

30

Alat:

Bio Rad vertical electrophoresis system

Power supply

Micropipe

Heater

Resep

Separating gel 12,5%

Akrilamid 30% 2,063 ml

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 1,25 ml

ddH2O 1,637 ml

SDS 10% 50 µl

APS 10% 12,5 µl

TEMED 10 µl

Stacking gel 4%

Akrilamid 30% 0,5 ml

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 0,625 ml

ddH2O 1,325 ml

SDS 10% 25 µl

APS 10% 7,5 µl

TEMED 5 µl

Staining solution

Coomasie blue (R) 0,1%

Metanol 40%

Asam asetat glasial 10%

add H2O ad 100 ml

Destaining solution

Metanol 20%

31

Asam asetat glasial 10%

add H2O ad 100 ml

Running buffer

Glisin 14,2 gram

Tris base 3,03 gram

SDS 1 gram

Aquadest 1 L

Prosedur:

1. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan menggunakan alat Bio-Rad Mini Protean II.

2. Lempengan kaca dan alat pencetak gel (gel sandwich) dibersihkan dan dikeringkan.

3. Gel sandwich disusun dengan menggabungkan kedua lempengan kaca kemudian untuk

memastikan tidak adanya kebocoran dimasukkan aquadest ke ruang pencetak gel.

4. Disiapkan separating gel 12,5% (b/v) dan stacking gel 4% (b/v). APS 10% dan TEMED

dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan dengan mem-pipet naik-turun secara

perlahan. Polimerisasi mulai terjadi pada tahap ini, larutan harus segera dituang ke gel

sandwich.

5. Secara perlahan larutan separating gel dimasukkan ke dalam gel sandwich hingga

mecapai garis batas dengan stacking gel (sekitar 0,5 mm dari ujung sisir pencetak sumur

gel pada stacking gel)

6. Segera dimasukkan aquadest dibagian atas separating gel untuk mendapatkan permukaan

gel yang rata.

7. Separating gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 15 menit).

8. Setelah separating gel padat, aquadest pada bagian atas dibuang

9. Pada stacking gel yang telah disiapkan, ditambahkan APS 10% dan TEMED untuk

memulai proses polimerisasi.

10. Secara perlahan stacking gel dimasukkan ke gel sandwich hingga penuh.

11. Sisir pencetak sumur diselipkan pada stacking gel secara berhati-hati sampai menyentuh

bagian atas dari separating gel.

12. Stacking gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 40 menit).

32

13. Sambil menunggu gel memadat, sampel protein disiapkan. Ekstrak protein total induksi,

non-induksi dan protein murni diambil dalam jumlah yang setara dan ditambahkan bufer

sampel 1:1 (10 µL sampel protein,10 µL bufer sampel).

14. Campuran sampel protein dididihkan selama 5-10 menit. Sampel protein di-spin sebentar

dan siap untuk dimasukkan ke sumur gel.

15. Pada stacking gel yang sudah memadat, sisir pencetak sumur ditarik dan gelembung

udara pada sumur dikeluarkan dengan menambahkan aquadest. Gel dikosongkan

kembali.

16. Gel sandwich yang berisi gel siap pakai dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dan

chamber diisi dengan bufer elektroforesis hingga sumur penuh.

17. Sampel protein dimasukkan pada sumur sebanyak 20 µL dan juga marka protein.

18. SDS-PAGE dilakukan menggunakan pada tegangan 125 V selama 60 menit. Gel hasil

elektroforesis selanjutnya diwarnai dengan merendam gel dalam staining solution

coomasie blue selama 15 menit

19. Selanjutnya gel di-destaining untuk menghilangkan sisa staining.

20. Lakukan pengamatan pada pita protein yang terbentuk.

33