Viro arti

26
TEMPO DAN MODEL PENANAMAN RNA VIRUS DARI KETAHANAN INTERFERENSI DAN MEDIASI RNA Sebuah aplikasi bioteknologi microRNAs buatan ( amir ) adalah generasi tanaman yang tahan terhadap infeksi virus . Resistensi ini telah terbukti sangat efektif dan urutan tertentu . Namun, sebelum ini tanaman transgenik dapat digunakan di lapangan , penting untuk mengevaluasi kemungkinan munculnya resistensi memecahkan mutan . Dua masalah adalah kepentingan tertentu : ( i ) apakah mutan tersebut dapat timbul dalam tanaman nontransgenic yang dapat bertindak sebagai reservoir dan ( ii ) apakah tingkat ekspresi suboptimal dari transgen , sehingga konsentrasi subinhibitory dari Amir , akan mendukung munculnya mutan melarikan diri . Untuk mengatasi masalah pertama, kami eksperimental berevolusi garis keturunan independen Turnip mosaic virus ( TuMV ) (keluarga Potyviridae ) di sepenuhnya rentan tipe liar tanaman Arabidopsis thaliana dan kemudian disimulasikan spillover virus berkembang untuk resisten sepenuhnya tanaman A. thaliana transgenik . Untuk mengatasi masalah kedua , evolusi fase berlangsung dengan tanaman transgenik yang mengungkapkan Amir pada konsentrasi subinhibitory . hasil kami menunjukkan bahwa populasi TuMV mereplikasi dalam rentan host akumulasi alel perlawanan - melanggar yang mengakibatkan mengatasi perlawanan dari tanaman yang tahan sepenuhnya . Tingkat di mana resistensi rusak adalah 7 kali lebih tinggi untuk populasi TuMV yang mengalami konsentrasi subinhibitory dari Amir antivirus . Sebuah karakterisasi molekuler alel melarikan diri menunjukkan bahwa mereka semua mengandung setidaknya satu substitusi nukleotida di urutan target , umumnya transisi dari tipe G -to - A dan C -to - U , dengan banyak contoh konvergen evolusi molekuler . Untuk lebih memahami dinamika populasi virus yang terjadi dalam setiap tuan rumah , serta untuk mengevaluasi parameter populasi yang relevan genetik , kami melakukan simulasi di silico dari percobaan . Bersama-sama , hasil kami memberikan kontribusi pada manajemen rasional perlawanan antivirus Amir berbasis pada tanaman .

Transcript of Viro arti

Page 1: Viro arti

TEMPO DAN MODEL PENANAMAN RNA VIRUS DARI KETAHANAN INTERFERENSI DAN MEDIASI RNA

Sebuah aplikasi bioteknologi microRNAs buatan ( amir ) adalah generasi tanaman yang tahanterhadap infeksi virus . Resistensi ini telah terbukti sangat efektif dan urutan tertentu . Namun, sebelum initanaman transgenik dapat digunakan di lapangan , penting untuk mengevaluasi kemungkinan munculnyaresistensi memecahkan mutan . Dua masalah adalah kepentingan tertentu : ( i ) apakah mutan tersebut dapat timbul dalamtanaman nontransgenic yang dapat bertindak sebagai reservoir dan ( ii ) apakah tingkat ekspresi suboptimal daritransgen , sehingga konsentrasi subinhibitory dari Amir , akan mendukung munculnya mutan melarikan diri .Untuk mengatasi masalah pertama, kami eksperimental berevolusi garis keturunan independen Turnip mosaic virus ( TuMV )(keluarga Potyviridae ) di sepenuhnya rentan tipe liar tanaman Arabidopsis thaliana dan kemudian disimulasikan spillovervirus berkembang untuk resisten sepenuhnya tanaman A. thaliana transgenik . Untuk mengatasi masalah kedua , evolusifase berlangsung dengan tanaman transgenik yang mengungkapkan Amir pada konsentrasi subinhibitory . hasil kamimenunjukkan bahwa populasi TuMV mereplikasi dalam rentan host akumulasi alel perlawanan - melanggar yangmengakibatkan mengatasi perlawanan dari tanaman yang tahan sepenuhnya . Tingkat di mana resistensi rusakadalah 7 kali lebih tinggi untuk populasi TuMV yang mengalami konsentrasi subinhibitory dari Amir antivirus .Sebuah karakterisasi molekuler alel melarikan diri menunjukkan bahwa mereka semua mengandung setidaknya satu substitusi nukleotidadi urutan target , umumnya transisi dari tipe G -to - A dan C -to - U , dengan banyak contohkonvergen evolusi molekuler . Untuk lebih memahami dinamika populasi virus yang terjadi dalam setiaptuan rumah , serta untuk mengevaluasi parameter populasi yang relevan genetik , kami melakukan simulasi di silico daripercobaan . Bersama-sama , hasil kami memberikan kontribusi pada manajemen rasional perlawanan antivirus Amir berbasispada tanaman .

gambarGambar . 1 . ( A) Skema representasi dari desain eksperimental . Untuk ilustrasi kita menunjukkan hanya satu dari WT A. thaliana - berevolusigaris keturunan . Protokol yang sama diulang untuk 10-4 garis keturunan , dengan pengecualian bahwa bagian-bagian seri dilakukan pada A. thaliana 10-4

Page 2: Viro arti

tanaman transgenik . Dalam contoh ilustrasi , resistance breaking terjadi pada bagian 2 ( gejala catatan dalam sesuai 12-4 tanaman ) .( B ) Skema diagram in silico model simulasi . ( a) Setiap keturunan dianggap populasi bit - string yang berisi 21 bit dariwilayah sasaran ditambah 10 lokus , masing-masing sesuai dengan cistrons yang berbeda dalam genom TuMV . Model simulasi dalam host replikasi virus denganmutasi dan hambatan transmisi antara ayat-ayat . Untuk simulasi virus evolusi di WT tanaman A. thaliana , kita tidak menganggaptarget- spesifik degradasi string , sedangkan untuk simulasi evolusi di 10-4 tanaman , kita termasuk kemungkinan degradasi , ε , untuk string denganurutan sasaran WT . ( b ) genom Digital TuMV mana urutan target telah secara eksplisit dipertimbangkan.

Fungsi alami dari tanaman microRNAs ( miRNAs ) adalah untukmengatur kelimpahan mRNA target dengan membimbing RNAinducedmembungkam kompleks ( RISC ) untuk membelah yang sesuaiurutan komplementer . Hal ini juga telah menunjukkan bahwa perubahandalam Mirna 21 - nukleotida ( nt ) urutan tidak mempengaruhi nyabiogenesis dan pematangan ( 24 , 46 ) , dan temuan ini membukakemungkinan untuk merancang ulang dari urutan Mirna kemenargetkan transkrip yang berbeda menggunakan berbagai pra - miRNAs sebagaitulang punggung ( 38 , 39 , 50 ) . Salah satu dari banyak aplikasi initeknologi untuk menghasilkan miRNAs buatan ( amir ) menargetkangenom virus , sehingga menghasilkan tanaman transgenik yang resistenuntuk infeksi virus ( 38 , 39 ) . Niu et al . ( 38 ) yang sebelumnya digunakanprekursor pra - miRNA159a untuk mengungkapkan dua amiR159s denganurutan komplementer dengan genom RNA dari Turnipvirus mosaik kuning ( TYMV ) dan Turnip mosaic virus ( TuMV ) ,masing-masing. amiR159 - P69 dirancang untuk menargetkan urutanprotein penekan P69 pembungkaman TYMV . Demikian pula ,amiR159 - HCPro dirancang untuk menargetkan urutanTuMV membungkam penekan HC - Pro . Ekspresi transgenikdari amir diberikan tingkat tinggi resistensi khusus untukvirus yang sesuai .Mirip dengan kasus tanaman transgenik tahan virus , amekanisme gen - membungkam ( RNA gangguan [ RNAi ] ) memilikitelah digunakan dalam uji in vitro sebagai terapi antivirus untuk menghambatreplikasi beberapa virus manusia , termasuk human immunodeficiencyvirus tipe 1 ( 12 ) , virus hepatitis C ( 30 ) , danvirus influenza A ( 22 ) . Masalah utama yang dihadapi ini in vitro

Page 3: Viro arti

tes dengan virus mamalia , bagaimanapun, telah munculnyavarian resistensi ( 4 , 17 , 23 , 52 ) . Varian ini berbedadari wild type ( WT ) virus oleh satu atau lebih mutasi titikdi urutan target 21 - nt mengarah ke pencocokan sempurnadan, karenanya , tidak menjadi baik atau efisien diproses olehRISC ( 40 , 48 , 52 ) . The RNAi mesin mentolerir perubahanposisi tertentu dari target 21 - nt tapi sangat sensitifperubahan dalam posisi sentral ( terutama posisi 9 dan11 ) ( 19 , 51 ) . Lin et al . ( 31 ) diperpanjang pengamatan ini kekasus virus tanaman . Dengan penggunaan transgenik Arabidopsis thalianatanaman mengekspresikan amiR159 - P69 yang dijelaskan di atas dan versi rekayasa dari TuMV yang memuat sebuah insert yang sesuaidengan target 21 - nt TYMV P69 , itu menunjukkan bahwa konservasiposisi 3 sampai 6 , 9 , dan 12 adalah sangat penting bagiRISC untuk membelah genom virus , perubahan posisi 2 , 10 ,11 , 13 , 15 , dan 18 memiliki efek moderat pada pembelahanefisiensi , sedangkan perubahan dalam sembilan posisi yang tersisa harusefek yang sangat kecil pada efisiensi pengolahan ( 31 ) . Selain itu ,ketika virus bermutasi pada setiap salah satu target 21 - ntdiizinkan untuk bereplikasi dalam transgenik amiR159 - P69tanaman , penghapusan panjang variabel atau perubahan tambahan padalokasi alternatif muncul dan meningkat pada frekuensi dalam viralpenduduk, lanjut membahayakan ketahanan transgeniktanaman ( 31 ) . Adalah penting bahwa dalam percobaan ini,Target 21 - nt adalah noncoding , dengan demikian , seleksi dioperasikan hanya padaTingkat RNA dan tidak dibatasi oleh protein - coding persyaratan .Secara keseluruhan , hasil ini menunjukkan bahwa perubahan tertentusitus dalam target 21 - nt dapat menghasilkan virus escapevarian . Namun, relevansi , jika ada , varian melarikan diri inipada populasi virus alam masih harus dibentuk . diDengan kata lain , untuk mengevaluasi kelayakan terapi antivirusberdasarkan ekspresi transgenik dari amir pada tanaman , makapenting untuk mengevaluasi kemungkinan populasi virus menginfeksispesies inang reservoir yang rentan mengandung varian melarikan diriyang mungkin kemudian ditransmisikan ke tanaman transgenikoleh vektor . Selain itu, juga penting untuk mengevaluasi apakahvariasi dalam ekspresi dari transgen Amir, terutamapada konsentrasi subinhibitory , akan mempengaruhi akumulasidan evolusi melarikan diri mutan virus . Lebih khusus , kamitertarik dalam menangani isu-isu berikut . Apa kemungkinanmutasi melarikan diri timbul dan terakumulasi di sebuah WTtuan rumah penduduk ? Apakah perlawanan parsial mendukung akumulasidari melarikan diri mutan ? Apa situs di target 21 - nt lebihpenting untuk melarikan diri dari RNAi pengawasan ? Apa dasarparameter genetik populasi yang mengatur proses melarikan diri ?

Page 4: Viro arti

Untuk mengatasi masalah ini , kami melakukan dua set evolusieksperimen bersama-sama dengan mereka yang sesuai pada simulasi silico .Di set pertama , 25 independen populasi TuMVberkembang di WT sepenuhnya rentan A. thaliana tanaman yang secara berkaladiuji untuk kehadiran mutan melarikan diri dengan menantangtanaman yang tahan sepenuhnya A. thaliana (Gambar 1A ) . Kami mengamatipeningkatan yang stabil dalam jumlah garis keturunan berkembang mampumematahkan perlawanan. Set kedua percobaan adalah serupake set pertama , kecuali bahwa 25 independen populasi TuMVyang berkembang di sebagian rentan tanaman A. thaliana mengekspresikankonsentrasi subinhibitory dari amiR159 - HCPro . kamimenemukan bahwa resistensi melanggar terjadi lebih cepat di keduapercobaan . Dalam semua kasus , perubahan dalam urutan target 21 - ntdiamati . Hasil ini menunjukkan bahwa varian escape dipertahankanpada frekuensi rendah sensitif dan resisten sebagiantanaman transgenik dengan cepat disaring pada transmisiuntuk tanaman transgenik tahan sepenuhnya . Simulasi in silicoalgoritma digunakan untuk mengevaluasi parameter genetik populasimengatur dinamika evolusi mutan melarikan diri .BAHAN DAN METODEBahan tanaman dan kondisi pertumbuhan . Dua transgenik A. thaliana Col - 0 barismengekspresikan amiR159 - HCPro yang digunakan dalam penelitian ini : 10-4 dan 12-4 ( 38 ) . benihberhubungan dengan generasi T4 homozigot . Tanaman yang dipelihara dalamruang pertumbuhan dalam kondisi 16 jam cahaya pada 25 ° C dan 8 jam kegelapan di22 ° C.Kuantifikasi ekspresi amiR159 - HCPro . RNA total diekstraksi dandimurnikan dari jaringan A. thaliana dengan menggunakan Trizol reagen ( Invitrogen ) . RNA adalahdiendapkan dengan isopropanol , disuspensi kembali dalam H2O , dan diukur secara spektrofotometri .Kuantifikasi amiR159 - HCPro dalam persiapan RNA adalahdilakukan oleh reverse transcriptase ( RT ) PCR kuantitatif ( qPCR ) dalam rangkap tiga( 45 ) . Standar disiapkan dengan penambahan jumlah yang telah diketahui sintetisoligoribonucleotide 5 ? - r ( ACUUGCUCACGCACUCGACUG ) -3 ? , sesuaisecara berurutan untuk amiR159 - HCPro , ke nontransgenic A. thaliana RNA totalpersiapan . Reaksi RT dilakukan dengan 10 - l campuran yang mengandung 100 ng TotalRNA , 1 pmol primer I ( PI ) ( 5 ? - GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGTCG - 3 ? [ urutan melengkapiamiR159 - HCPro adalah dalam cetak tebal ] ) , dan 30 U Moloney murine leukemia virus( M - MuLV ) RT ( Fermentas ) , dengan inkubasi selama 10 menit pada 25 ° C , 45 menit pada 42 ° C ,10 menit pada 50 ° C , 5 menit pada 60 ° C , dan , akhirnya , 15 menit pada 70 ° C. qPCR dilakukan dengan20 - l campuran yang mengandung 2 l campuran reaksi RT dan 10 pmol masing-masing primer PII ?( 5 ? - CGGCGGACTTGCTCACGCACT - 3 ? [ Urutan melengkapiamiR159 - HCPro adalah dalam cetak tebal ] ) dan PIII ( 5 ? - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3 ? [ homolog dengan urutan digarisbawahi di PI ] ) dengan Maxima SYBR hijau

Page 5: Viro arti

campuran induk ( Fermentas ) dan inkubasi selama 10 menit pada 95 ° C , diikuti 40 siklusdari 15 s pada 95 ° C , 30 detik pada 60 ° C , dan 30 detik pada 72 ° C.Bagian Populasi dan evaluasi patogenisitas pada A. thaliana 12-4tanaman . Sebagai sumber inokulum TuMV untuk semua percobaan kami , kami menggunakansaham besar dari getah menular yang diperoleh dari TuMV terinfeksi Nicotiana benthamianatanaman diinokulasi dengan plasmid yang mengandung TuMV cDNA ( GenBank aksesino . AF530055.2 ) di bawah kendali Cauliflower mosaic virus 35Spromotor . Ini TuMV urutan varian sesuai dengan mengisolasi YC5 dari callalily ( Zantedeschia sp . ) ( 10 ) . Tanaman Sap menular diperoleh dengan menggilingjaringan yang terinfeksi dalam mortar dengan 20 volume penggilingan penyangga ( 50 mM kaliumfosfat [ pH 7,0 ] , 3 % polietilen glikol 6000 [ PEG 6000 ] ) .Gambar 1A merangkum rancangan percobaan untuk eksperimen evolusi .Aliquots dari 5 ? L dari 10 % Carborundum di penggilingan penyangga yang diterapkan ke tigaA. thaliana berbeda daun , dan inokulasi dilakukan secara mekanis dengan lembutmenggosok dengan kapas yang dibasahi dengan getah menular . Dua puluh lima WT A.thaliana dan 25 10-4 tanaman transgenik pada awalnya diinokulasi . setiap tanamanmewakili titik awal untuk sebuah evolusi garis keturunan independen. Pada 14 haripostinfection ( dpi ) , jaringan gejala dikumpulkan untuk setiap keturunan dan homogendi penggilingan penyangga . Sebagian dari Sap dihasilkan digunakan untuk menyuntikset berikutnya tanaman . Bagian kedua dari getah homogen membekudi ? 80 ° C untuk karakterisasi lebih lanjut . Sisanya digunakan untukpercobaan tantangan yang dirancang untuk memperkirakan patogenisitas pada 12-4 tanaman . iniProsedur ini diulang sampai semua 50 garis keturunan evolusi mengatasi perlawanandari garis 12-4 . Setelah garis keturunan itu mampu memecah resistensi , itudihapus dari percobaan terjadi penyaluran .Untuk percobaan uji patogenisitas , 20 tanaman dari garis 12-4 diinokulasiseperti dijelaskan di atas . Tanaman yang secara visual diperiksa untuk kehadirangejala pada 14 dpi , dan frekuensi tanaman yang terinfeksi , yaitu , patogenisitas ,tercatat . Tantangan Percobaan ini dilakukan setelah setiap evolusionerbagian untuk masing-masing dari 50 garis keturunan berkembang . Sebuah percobaan percontohanmenunjukkan bahwa infeksi selalu sependapat dengan perkembangan gejala . Sebuah garis keturunandianggap mampu memecahkan resistance jika setidaknya satu 12-4 tanamanmenunjukkan gejala .Analisis urutan 21 - nt wilayah sasaran . Wilayah sekitar 21 - nttarget amiR159 - HCPro dibariskan pada populasi virus melanggar perlawanan.RNA total dari A. thaliana yang terinfeksi 12-4 tanaman transgenik dimurnikandengan menggunakan kolom silika ( Zymo Research) , dan cDNA virus diamplifikasi olehRT - PCR . Reaksi RT dilakukan dengan 10 - l larutan yang mengandung 50 l ?M - MuLV RT dan 5 pmol primer IV ( 5 ? - CCTGGTGACAGTAAAGCATATAATGG - 3 ? ) Selama 45 menit pada 42 ° C , 5 menit pada 50 ° C , dan 5 menit pada 60 ° C. satu mikroliterreaksi RT digunakan untuk amplifikasi PCR dalam 20 - l campuran dengan 0,4 UPolimerase Phusion DNA ( Finnzymes ) dan 10 pmol masing-masing primer PV ( 5 ? - GACAATGAGTCACAAGATTGTGCACTTT - 3 ? ) Dan PVI ( 5 ? - CATGAGTGTCCT

Page 6: Viro arti

CCCATTCTGTCCC - 3 ) , dengan inkubasi selama 30 detik pada 98 ° C ; ? 30 siklus dari 10 s di98 ° C , 30 detik pada 55 ° C , dan 30 s pada 72 ° C , dan langkah ekstensi akhir selama 10 menit pada 72 ° C.Produk amplifikasi dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa 1 % ,dan TuMV cDNA pencocokan diharapkan 1.427 bp itu dielusi dan sequencingdengan primer PVII ( 5 ? - AAACGATTCTTCAGCAACTACTTTG - 3 ? ) .Simulasi algoritma . Percobaan disimulasikan dengan menggunakan bit -stringMonte Carlo Model ( 20 , 34 ) , di mana genom digital diwakili olehstring biner , S , dari panjang , L , dari 31 bit . Genom digital secara eksplisit dianggap21 nt dari target amiR159 - HCPro dan menambahkan 10 bit lebih , masing-masingsesuai dengan salah satu dari 10 cistrons virus (Gambar 1 ) . Kami membuat perbedaan iniuntuk memisahkan efek karena mutasi pada target ( dievaluasi padaTantangan langkah percobaan ) dari yang berhubungan dengan perubahan laingen virus dan yang menentukan keseluruhan kebugaran virus . maksimumstring ukuran populasi ditetapkan untuk sebuah Nmax 5.000 genom . Seperti dalam percobaan ,model simulasi dianggap 25 garis keturunan independen (Gambar 1 ) . masing-masingsilsilah dimulai dengan sampel berukuran N ? Nmax dari WT genom . Untuk setiap keturunankita membiarkan pengalaman populasi ? peristiwa replikasi . Pada setiap peristiwa , dua lokasidalam populasi dipilih secara acak . Jika lokasi saya sudah berisiString , itu disalin ke situs j dengan probabilitas Pij ?11 ? exp ? ? ? fij / T ?bahwatergantung pada perbedaan kebugaran ? fij fi ? fj antara string Si dan Sj ( jika situs jkosong , fj 0 ) . T adalah temperatur Boltzman , yang merupakan ukuran dari kebisinganterkait dengan peristiwa replikasi , dan hal itu tetap menjadi T 0.2 . The fitness dari string yang diberikan ,Sk , diperoleh dari komposisi biner dari 10 lokus . Kami mempertimbangkan empatjenis lanskap kebugaran merusak : aditif standar , antagonis , danyang sinergis ditambah satu di mana mutasi pada bit yang mewakili 10 viruscistrons dianggap mematikan . Selama tiga lanskap merugikan kita dihitungkebugaran sebagai fk ? 1 ? dH

/ 10 , di mana dH adalah jarak Hamming ( yaitu ,berapa banyak bit yang berbeda kami memiliki ) antara urutan k dan lokus yang sesuaidari genom WT . mengukur tanda dan kekuatan epistasis , di mana sama1 jika aditif , adalah ? 1 jika antagonis , dan adalah ? 1 jika sinergis ( 42 ) . selamareplikasi , setiap bit dari target amiR159 - HCPro dapat bermutasi dengan probabilitas? . 10 lokus lain dari string bermutasi dengan probabilitas? li ? 3 ? V/2li , dimana li adalah panjang lokus i dan 2/3 diperkenalkan untuk mempertimbangkan ,

Page 7: Viro arti

sebagai pendekatan pertama , bahwa mutasi pada posisi kodon ketiga yang netral .Koreksi ini dilakukan untuk memastikan bahwa semua lokus bermutasi secara proporsional kepada merekapanjang . Dalam rangka untuk membedakan antara percobaan yang dilakukan dengan WTtanaman dan mereka dilakukan dengan 10-4 A. thaliana tanaman , kami menganggap bahwa jikaString yang dipilih untuk replikasi adalah genom WT , itu akan terdegradasi dengan probabilitasε 0 untuk simulasi di pabrik WT dan ε ? 0 untuk simulasi di 10-4 tanaman .Sebagaimana disebutkan di atas , untuk setiap garis keturunan kita membiarkan penduduk berkembang lebih ? sahutanperistiwa menurut aturan yang dijelaskan di atas . Kami kemudian mengambil dua randomsampel berukuran N (Gambar 1 ) . Sampel pertama digunakan untuk memulai populasi berikutnya( simulasi bagian berikutnya dalam garis keturunan evolusi eksperimental ) hingga resistancerusak . Sampel kedua digunakan untuk mengevaluasi kemungkinan resistensimelanggar sebagai berikut . Untuk setiap string Si dalam sampel kedua , kami mengevaluasi nyapatogenisitas sebagai ? Si ? ? 1 ?k 121? 1 ? ? Sik ? , Dengan ? ( Sik ) menjadi empirisprobabilitas bahwa perubahan posisi k dari target 21 - nt akan menjadi mutasi escape(data frekuensi dari Gambar . 4 dikoreksi dengan menggunakan estimator Laplace ) . Selanjutnya, kitadievaluasi kemungkinan resistensi melanggar untuk sampel kedua ini setelah 20 percobaan( jumlah tanaman diinokulasi selama percobaan menantang ) sebagai Pb 1 ?( 1 ? ? P ? ) 20 , di mana ? P ? ?1N ? I 1N ( Si ) adalah patogenisitas rata-rata semua strainyang terkandung dalam sampel . Jika Pb adalah ? 0,05 , kita mengasumsikan bahwa perlawanan rusak .

Untuk sampel dari 20 tanaman , batas ini berarti bahwa setidaknya satu tanaman menjadigejala .Pas Data dan parameter inferensi . Untuk sesuai dengan data eksperimen untukmodel simulasi dan untuk menyimpulkan parameter populasi yang relevan , kami menggunakan optimasialgoritma ( OA ) ( 33 ) yang secara sistematis mencari ruang parameter yang didefinisikanoleh C { ? , ? , N ,, Ε } sebagai berikut . Pertama , kita mendefinisikan populasi mulai dari 150parameter set , C1 ( 0 ) , C2 ( 0 ) , ... , C150 ( 0 ) . Nilai-nilai parameter untuk masing-masing iniCh ( 0 ) parameter set secara acak ditugaskan dalam kisaran berikut : 1 ? ? ?105 , 1 ? N ? Nmax , 10 ? 7 ? ? ? 10 ? 3 , 0.2 ? ? 1.8 , dan 0.1 ? ε ? 0.5 . untuk masing-masingsalah satu parameter set ini , kami berlari simulasi algoritma yang dijelaskan dalam duaparagraf sebelumnya . Pada akhir setiap simulasi kita membandingkan diamatifrekuensi kumulatif pada bagian j ditunjukkan pada Gambar. 3 , ? Obs ( j ) , dengan yang diperoleh di

Page 8: Viro arti

simulasi , ? i ( j ) , dengan menggunakan persamaan dh ? ? j 128 ? ? H ? J ? ? ? obs ? j ? ? , yang mewakilinilai jarak antara empiris dan data simulasi . prosedur inimenghasilkan vektor dari 150 nilai dh antara data yang diamati dan disimulasikan .Kami dihitung maka jarak rata-rata , D ?1150 ? H-1150 dh , dari semua 150parameter set dan memilih orang- set dengan jarak lebih kecil dari D sebagai titik awaluntuk iterasi berikutnya dari OA , Ci ( 1 ) . Karena kurang dari 150 parameter set yang tersisauntuk iterasi berikutnya , sisa set yang dihasilkan oleh penambahan kecilgangguan terhadap parameter set dipertahankan . Seluruh proses ini diulang sampaiada perubahan diamati untuk ? d ( t ) ? setelah t iterasi OA . Perhatikan bahwa untuk WTtanaman , C { ? , ? , N ,} , Karena degradasi Amir - dimediasi adalah tetap untuk ε 0 .

HASILBaris A. thaliana 10-4 dan 12-4 berbeda dalam amiR159 - HCProekspresi dan kerentanan terhadap infeksi TuMV . Pertama, kitadievaluasi apakah TuMV memiliki tingkat yang sama patogenisitas ,p , baik A. thaliana transgenik baris 10-4 dan 12-4 . semua tanamandiinokulasi pada Boyes ' tahap 1,03 (yaitu , ketika tiga rosetdaun lebih besar dari 1 mm ) ( 6 ) dan dengan TuMVgetah menular yang diterapkan oleh abrasi lembut ke daunposisi yang sama pada tanaman . Tak satu pun dari 30 diinokulasi 12-4tanaman mengembangkan gejala infeksi pada 14 dpi ( P 0.000 ?0,048 [ ? 95 % confidence interval { } CI , dihitung dengan menggunakanMetode disesuaikan Wald ] ) . Dalam kontras yang tajam , 152 dari 218diinokulasi 10-4 tanaman mengembangkan gejala yang jelas setelahperiode waktu yang sama ( P 0,697 ? 0,063 ) . perbedaannyaantara hasil yang diperoleh 10-4 tanaman dan yang diperoleh12-4 tanaman sangat signifikan ( P ? 0,001 denganUji eksak Fisher ) . Secara signifikan , TuMV patogenisitas pada 10-4tanaman hanya 11,80 % lebih rendah dibandingkan di sepenuhnya rentanTanaman WT ( 166 dari 210 ; ? P 0,791 0,057 ) , meskipun hal iniperbedaan kecil masih signifikan secara statistik ( P 0,035 denganUji eksak Fisher ) .Untuk menjelaskan perbedaan antara pathogenicitiesdua baris transgenik , pertama kita dievaluasi apakah adaperbedaan dalam akumulasi keseluruhan amiR159 - HCPro . untuktujuan ini , kami menganalisis konsentrasi Amir akumulasidi set setiap baris transgenik di Boyes ' tahap 1.03 ( thetahap perkembangan di mana patogenisitas yang dijelaskan di atastes dilakukan ) oleh RT - qPCR . Dua belas 12-4 tanaman dan10-04 November tanaman dianalisis , tiga kuantifikasi independen

Page 9: Viro arti

diperoleh untuk setiap tanaman . Data dianalisis denganmenggunakan model linier umum ( GLM ) , menggunakan " tanaman genotipe " sebagaifaktor random utama dan " tanaman mereplikasi " bersarang dalamgenotipe tanaman. Analisis ini menunjukkan bahwa heterogenitas yang signifikanada di antara tanaman dari genotipe yang sama ( 2 264,698 ;21 df ; P ? 0,001 ) . Meskipun heterogenitas ini , perbedaanantara genotipe yang sangat signifikan ( 2 389,442 ; ? 2 df ;P ? 0,001 ) . Rata-rata , 12-4 tanaman akumulasi 111,367 ?6,998 pg amiR159 - HCPro per mg jaringan tanaman ( di sini kesalahanmewakili ? 1 standard error dari mean [ SEM ] ) , sedangkan 10-4tanaman akumulasi 4,961 ? 1.370 pg / mg ( yaitu , 22,45 kali lipat kurangdari 12-4 tanaman ) .Kedua , kita ditandai pola temporal akumulasidari amiR159 - HCPro di 10-4 daun yang perkembanganpanggung setara dengan tahap perkembanganyang diinokulasi dalam tes patogenisitas ( misalnya, nol diordinat sesuai dengan Boyes ' panggung 1,03 ) . empat independen10-4 tanaman dianalisis pada setiap titik waktu , dan perkiraanyang rata-rata di antara tanaman . Gambar 2A menunjukkan bahwa jumlahdari amiR159 - HCPro akumulasi per nanogram dari total tanamanRNA meningkat secara nonlinear sebagai daun dikembangkan .Memang, selama hari-hari pertama percobaan peningkatankonsentrasi amiR159 - HCPro adalah kecil , tapi akumulasisecara signifikan dipercepat 10 hari setelah awaleksperimen ( yaitu , akumulasi tidak linear tetapi eksponensial )(Gambar 2A ) .Ketiga , kita melihat perbedaan dalam jumlah amiR159 -HCPro pada daun yang berbeda dari tanaman yang sama ( pada tahap Boyes '1.06 , yaitu , enam daun roset lebih besar dari 1 mm ) untuk melihatapakah pola akumulasi ini konsisten di antaratanaman . Untuk melakukannya , kami memperkirakan konsentrasi Amirdi masing-masing enam daun dari empat pabrik yang berbeda . Gambar 2B menunjukkanpola diamati dari akumulasi amiR159 - HCPro . AModel GLM di mana " tanaman " diperlakukan sebagai faktor randomdan " daun " diperlakukan sebagai kovariabel disorot beberapa yang menarikhasil . Pertama, jumlah amiR159 - HCPro signifikanbervariasi antara daun pada tahap perkembangan yang berbeda ,secara signifikan meningkatkan daun menjadi lebih tua ( 2 88,713 ; ? 1df ; P ? 0,001 ) . Kedua , sesuai dengan data dari pertama kamites, tanaman yang heterogen dalam jumlah rata-rata merekaakumulasi amiR159 - HCPro ( 2 497,603 ; ? 4 df , P 0,001 ? ) .Ketiga , perbedaan ada di antara tanaman dalam tingkat di manakonsentrasi amiR159 - HCPro meningkat ( 2 96,531 ; ? 3 df ;P ? 0.001 [ uji homogenitas lereng ] ) . Dengan kata lain,Peristiwa stochastic awal selama pengembangan menentukan

Page 10: Viro arti

jumlah awal amiR159 - HCPro yang akan mencirikandaun , dan perbedaan tersebut semakin diperkuat sebagai daundiperluas dan dikembangkan .Oleh karena itu , semua analisis ini membawa pada kesimpulan bahwabaris transgenik 10-4 menunjukkan penetrasi genetik lengkap ( yaitu ,tidak semua tanaman transgenik individu resisten ) dan variabelekspresivitas gen untuk resistensi (yaitu , tidak semua individu resistenmengekspresikan amiR159 - HCPro pada tingkat yang sama ) . Sebaliknya ,baris 12-4 menunjukkan penetrasi genetik lengkap dari perlawanansifat . Perbedaan-perbedaan fenotipik yang disebabkan oleh perbedaandalam jumlah dan waktu ekspresi amiR159 - HCPro .Alih-alih menjadi masalah , kami akan mengambil keuntungan penuh dari10-4 keganjilan untuk mengevaluasi efek berkembang populasi TuMVpada ekspresi subinhibitory dan variabelamiR159 - HCPro .Perlawanan melanggar pada populasi TuMV berkembang di WTTanaman A. thaliana pada keseimbangan mutasi -drift . Kami bertujuan untukmengevaluasi kemungkinan bahwa populasi TuMV mereplikasi danberkembang dalam sepenuhnya rentan WT A. thaliana host yang terkandungmelarikan diri mutan mampu mengatasi perlawanan dimediasi olehamiR159 - HCPro . Untuk tujuan ini , 25 garis keturunan evolusi independendidirikan oleh inokulasi WT A. thaliana dengan tanamangetah yang diperoleh dari kolam tanaman benthamiana N. sebelumnyadiinokulasi dengan menular TuMV cDNA genom . Oleh karena itu ,jumlah variabilitas genetik dalam inokulum tidak akanmenjadi nol tetapi jumlah terendah teknis mungkin . semua tanamandiinokulasi dengan jumlah yang sama getah menular ini .Semua tanaman menjadi terinfeksi , seperti ditegaskan oleh adanyagejala . Setiap 14 dpi , tanaman yang terinfeksi sampel ; satusebagian dari sampel digunakan untuk menyuntik set berikuttanaman , bagian lain disimpan untuk analisis masa depan , danBagian ketiga digunakan untuk menantang 20 12-4 tanaman transgenikper berkembang keturunan ( total, 20 ? 25 500 tanaman per tantanganpercobaan ) (Gambar 1 ) . Patogenisitas setiap garis keturunan berkembangdi setiap bagian dievaluasi dengan pemeriksaan gejala ;silsilah yang dianggap mampu memecah resistensiapakah itu mampu menginfeksi setidaknya satu 12-4 tanaman dalam tantanganpercobaan (yakni , patogenisitas ? 0,05 ) . Kami hipotesisbahwa mutan dalam target amiR159 - HCPro akan timbul dantinggal di populasi sebesar saldo mutasi -drift danmereka akan dipindahkan ke 12-4 tanaman selama tantangandalam cara yang agak stokastik . Garis hitam pada Gambar . 3 menunjukkanfrekuensi kumulatif dari garis keturunan yang mengatasi hambatan padasetiap bagian . Pertama pecah terjadi pada bagian 6 , dan semua25 garis keturunan yang mampu memecah perlawanan setelah 28 bagian .

Page 11: Viro arti

Sebuah regresi Kaplan - Meier menunjukkan bahwa medianwaktu untuk ketahanan melanggar adalah 14.000 ? 0,480 bagian dalamWT A. thaliana tanaman .Perlawanan melanggar pada populasi TuMV berkembang secara parsialrentan tanaman 10-4 A. thaliana . Selanjutnya, kami berusaha untukmengevaluasi efek yang TuMV replikasi bawah subinhibitorykonsentrasi amiR159 - HCPro memiliki daya tahan pada resistensi .Untuk tujuan ini , kami mengulangi eksperimen evolusi denganmelakukan bagian serial tahan sebagian A. thaliana 10-4tanaman , semua operasi lainnya tetap sama . Kami beralasanbahwa dalam kasus ini , populasi TuMV menginfeksi tanaman akanberada di bawah tekanan selektif yang dikenakan oleh kehadiranAmir dalam sel , tetapi pada konsentrasi yang mungkin masih memungkinkan virusreplikasi . Kami memperkirakan bahwa dalam situasi seperti itu , melarikan diri mutasiakan memiliki keuntungan selektif dan terakumulasi dalampopulasi sebesar saldo mutasi - seleksi -drift , pada frekuensilebih tinggi dibandingkan pada percobaan sebelumnya . ini akanmemungkinkan resistensi lebih cepat setelah melanggar tantangan 12-4tanaman . Garis merah pada gambar . 3 menggambarkan akumulasi perjalanan waktudari garis keturunan mampu mematahkan perlawanan. Seperti yang kita prediksi ,garis keturunan pecah perlawanan lebih cepat dari pada sebelumnyabereksperimen , dengan banyak dari mereka yang sudah mengandung mutan melarikan dirisetelah berlalunya pertama dan ke-25 mampu melakukannya setelahhanya delapan bagian . Sebuah regresi Kaplan - Meier menunjukkan bahwa padakasus ini , waktu rata-rata untuk ketahanan melanggar adalah 2.000 ?0.343 bagian dalam tanaman 10-4 , nilai yang secara signifikan lebih rendahdari yang diperoleh untuk garis keturunan 12-4 - berevolusi ( 2 54,971 ;1 df ; P ? 0,001 [ dengan uji Mantel - Cox ] ) .Perubahan target amiR159 - HCPro . setelah menentukanbahwa garis keturunan TuMV mampu melarikan diri dari amiR159 -HCPro - dimediasi resistensi , kami berusaha untuk mengkarakterisasi genetikperubahan yang berhubungan dengan fenotipe baru . berdasarkanhasil yang dilaporkan sebelumnya oleh Lin et al . dengan TuMV ( 31 ) ,didukung oleh akumulasi pengetahuan sebelumnya dari HIV - 1 ( 4 ,17 , 48-52 ) dan virus polio ( 23 ) percobaan kultur sel , kamihipotesis bahwa dalam semua kasus, TuMV genotipe dominan dalamterinfeksi 12-4 tanaman setelah tantangan akan membawa setidaknya satumutasi pada urutan target . Untuk menguji harapan ini , kitadiperoleh urutan target konsensus 21 - nt untuk virusPopulasi mereplikasi di setiap 12-4 tanaman . Tabel 1 dan 2 menunjukkanalel melarikan diri yang berbeda ditemukan pada populasi TuMV berkembangdi WT A. thaliana dan 10-4 tanaman , masing-masing. mengenaiTabel 1 , total 10 alel yang berbeda ditandai , meskipunempat dari mereka ( alel 1 , 2 , 3 , dan 4 ) yang pervasivelyterlihat dalam lebih dari satu garis keturunan , contoh yang jelas dari konvergen

Page 12: Viro arti

evolusi . Dua substitusi nukleotida yang paling umumadalah salah satu identik di situs target 11 ( dalam 10 kasus ) dannonsynonymous satu di posisi 12 ( dalam 7 kasus ) , yang memberikannaik ke pengganti konservatif asam amino , V ke M , diProtein HC - Pro . Setengah dari alel berisi substitusi tunggal( alel 1 , 2 , 4 , 8 , dan 10 ) , sedangkan setengah lainnya yang terkandungdua mutasi . Empat dari substitusi ini adalah identik ,dan delapan dikaitkan dengan penggantian asam amino .Menariknya , garis keturunan 6 , 11 , dan 23 semua menunjukkan polimorfismepada posisi 20 dari target . Dalam semua tiga kasus salah satuhidup bersama alel adalah substitusi identik , sedangkanyang lain yang terlibat pengganti asam amino konservatif , Kuntuk N , di HC - Pro .Mengenai Tabel 2 , tujuh alel melarikan diri diidentifikasi dalampopulasi TuMV berkembang di tahan sebagian 10-4tanaman . Empat dari mereka tidak diamati untuk populasiberkembang di WT A. thaliana tanaman ( alel 11 , 12 , 13 , dan 14 ) ,meskipun hanya satu dari mutasi pada alel tersebut tidakdiamati sebelumnya ( perubahan nonsynonymous A - to- C diposisi 19 dari alel 11 ) . Dua alel yang paling umum dalam hal iniPercobaan juga yang diamati dalam percobaan pertama( alel 1 dan 2 ) : substitusi identik pada posisi 11 daritarget ( dalam 12 kasus ) dan yang paling melimpah kedua,penggantian nonsynonymous di situs 12 ( dalam 8 kasus ) .Pooling data dari kedua percobaan , 52 dari 55 diamatimutasi transisi , dengan G -to - A dan C - to- U perubahanmendominasi spektrum mutasi . Konsisten dengan prinsipbahwa transisi biokimia lebih mungkin terjadidaripada transversi , estimasi kemungkinan maksimum kompositdari tingkat rasio transisi -to - transversi keseluruhan14,176 . Kelebihan ini juga terjadi ketika purin ( rasio , 20,599 )dan pirimidin ( rasio , 40,639 ) dianggap secara terpisah . sekarangjuga diketahui bahwa daerah viral coding menunjukkan kelebihan transisilebih pelintasan ( 9 , 26 , 31 , 43 ) . Tiga alasan dapataccount untuk bias ini : ( i ) mekanisme yang mendasari mutasimembuat transisi lebih mudah daripada transversi , ( ii ) redundansidari kode genetik diharapkan untuk membuat rata-rataefek transisi lebih kecil dari pelintasan , dan ( iii )RNA editing oleh enzim deaminase - seperti telah terbuktimenginduksi mutasi transisi di daerah-daerah beruntai tunggal tertentugenom virus ( 3 ) .Evolusi konvergen akan berarti bahwa distribusi frekuensiperubahan sepanjang target 21 - nt harus serupa dalamkedua percobaan . Gambar 4 menunjukkan distribusi ini untuk keduajenis populasi TuMV . Sebuah uji homogenitas terdeteksi tidak

Page 13: Viro arti

perbedaan di antara kedua distribusi pola ( 2 8,388 ; ? 11df , P 0,678 ) , sehingga mendukung gagasan konvergen luasevolusi , kemungkinan didorong oleh keuntungan selektifmutasi di lokasi 11 dan 12 dari target .Estimasi parameter genetik populasi secara in silico simulasi .Untuk memberikan wawasan baru ke dalam - dijelaskan di atashasil serta untuk mengevaluasi berbagai parameter populasikompatibel dengan pengamatan kami , kami disimulasikan duaevolusi percobaan dengan menggunakan genom virus bereplikasi digital ,bermutasi , dan menjadi sasaran kemacetan transmisiseperti dalam percobaan yang dijelaskan di atas (Gambar 1B dan lihat Bahandan Metode ) . Kami melakukan pencarian dari parameterruang menggunakan algoritma optimasi ( OA ) untuk menemukan satu setparameter yang meminimalkan jarak antara dataditunjukkan pada Gambar . 3 dan yang disimulasikan . Untuk simulasi daripercobaan evolusi dilakukan dengan tanaman WT A. thaliana( yaitu , tanpa degradasi - urutan tertentu ) , kami menganalisisSebanyak 393 berjalan dari OA : 129 berjalan dengan asumsi bahwa mutasimemiliki efek aditif , 210 berjalan dengan asumsi bahwa mereka berinteraksiepistatically , dan 54 berjalan dengan asumsi bahwa mutasi di luartarget dan mempengaruhi gen lain yang mematikan . Setiap lari dariOA terdiri dari 400 generasi , dengan populasi parameterset 150 , menghasilkan lebih dari 25 juta simulasi .Set parameter yang dihasilkan terendah dan lebih kuatjarak ( d 0,56 ; R2 0,976 , F1 , 27 1,114.571 , P 0,001 ? )antara percobaan dan model simulasi diperolehdengan aditif kebugaran lanskap dengan berikutparameter : ? ? 13,918.23 ? 75.64 ulangan virus antarabagian , ? ? ? ( 4.11 ? 0.33 ) ? 10 ? 5 mutasi per situs dangenerasi , dan ? Ne ? 956,89 ? 23.76 virus digital ditransmisikanper kejadian bottleneck (yaitu , ? 19 % dari total penduduk ) .Gambar 5A menunjukkan hasil simulasi diperoleh denganset parameter . Nilai-nilai simulasi frekuensidari garis keturunan melarikan diri dari amiR159 - HCPro ditunjukkan dengan warna merahtitik di atas garis hitam yang mewakili eksperimentaldata.Untuk percobaan evolusi di tahan sebagian 10-4tanaman ( misalnya , dengan degradasi - urutan tertentu ) , kami mengikutiprosedur yang sama , meskipun kami membatasi penelitian hanyalanskap kebugaran aditif ( yang memberikan paling cocok untuk WTtanaman ) dan menambahkan laju degradasi , ε ? 0 , untuk parameterditetapkan . Laju degradasi ini simulasi asumsi bahwa 10-4tanaman diungkapkan amiR159 - HCPro dan bahwa , karenanya , membungkammesin mungkin masih mampu menurunkan sebagian kecil daripopulasi virus ( yaitu, string yang berisi target WT

Page 14: Viro arti

urutan terdegradasi dengan probabilitas ε [ lihat Bahan danMetode ] ) . Untuk kasus ini , kami berlari 150 replika OA , sehinggamenjelajahi total 6 juta simulasi . Di antara semua inisimulasi , kombinasi parameter menyediakan terkeciljarak antara data eksperimen dan simulasi ( d 0,16 ;R2 0,995 , F1 , 7 733,253 ; P ? 0,001 ) adalah sebagai berikut : ? ?5,629.51 ? 63.79 , ? ? ? ( 7.69 ? 1.12 ) ? 10 ? 5 , ? Ne ? 68.61 ?11.78 (yaitu , ? 1,4 % dari potensi ukuran populasi maksimum) ,dan ? ε ? 0.223 ? 0.098 per genom . Paling cocok untuk exper –theData ditunjukkan pada Gambar . 5B . Seperti dijelaskan di atas , merahtitik mewakili nilai-nilai simulasi untuk parameter set ini . tidakmengherankan, tingkat mutasi diperkirakan untuk kedua percobaanberada di urutan yang sama besarnya dan dekat dengan satu-satunyanilai eksperimental dilaporkan sebelumnya untuk potyviruses ( 43 ) .Degradasi genom yang mengandung nonmutatedamiR159 - HCPro target di 10-4 tanaman memiliki dua salingefek . Pertama , ada penurunan dari 92,83 % di Ne : ? ? Tidak semuagenom yang terkandung dalam inokulum yang mampu mereplikasidalam tanaman sebagian rentan , dan fraksi tertentu adalahterdegradasi . Kedua , kita diharapkan pengurangan jelas dalamsejumlah peristiwa replikasi virus didukung oleh dua pabrikgenotipe . Dalam Col - 0 tanaman semua anakan virus diproduksi mungkinakhirnya berkontribusi terhadap ulangan masa depan . Di sisi lain ,di 10-4 tanaman , kita diharapkan bagian dari keturunan yang akan terdegradasioleh amir dan , karenanya , tidak memberikan kontribusi terhadap masa depan ulangan .Model ini menangkap harapan ini dan menunjukkan bahwa tanaman 10-4didukung ? peristiwa replikasi 2.5 - kali - lebih sedikit daripada WTtanaman . Secara konsisten , populasi virus bereplikasi di 10-4tanaman tidak mencapai daya dukung , dan karena itu, jumlahgenom ditransmisikan ke siklus infeksi berikutnya adalah13.95 - kali lipat lebih rendah . Penurunan ukuran ditransmisikanpopulasi meningkatkan efek dari pergeseran genetik dalam 10-4garis keturunan . Yang sedang berkata , adalah penting untuk mengingat bahwa duarezim evolusi yang berbeda dalam bermain untuk setiap genotipe tanaman.Dalam tanaman WT sepenuhnya rentan , seleksi pemurni danpenyimpangan harus menjadi satu-satunya faktor yang mempengaruhi frekuensi alel ,karena mutasi pada target akan baik merusak ataunetral; alel merugikan tidak akan mencapai frekuensi tinggi . ituwaktu untuk fiksasi alel netral yang frekuensi awal adalahdiabaikan adalah 4 ? Ne ? 3,827.56 generasi ( 27 ) , yang kurangdaripada perkiraan jumlah ulangan virus , ? ? ? , sehingga membuatkemungkinan bahwa beberapa alel netral dalam target akan melayang kefrekuensi tinggi dalam populasi . Sebaliknya , secara parsialtahan 10-4 tanaman , seleksi positif juga memasuki gambar ,karena alel melarikan diri jelas akan bermanfaat di hadapan

Page 15: Viro arti

amiR159 - HCPro . Memang , kami memperkirakan bahwa seleksi rata-rataKoefisien untuk suatu alel yang menguntungkan untuk bertahan hidup melayangharus ? s ? ? 1 / ? Ne ? 0,015 ( 27 ) , nilai yang rendah yang memastikan bahwabanyak mutasi resistansi akan bertahan melayang .Akhirnya, tingkat mutasi diperkirakan untuk kedua percobaanberada di kisaran 4 ? 10 ? 5 sampai 8 ? 10 ? 5 mutasi per situs ,nilai-nilai yang sangat dekat dengan perkiraan terakhir yang diperoleh untukpotyvirus lain , Tembakau etch virus ( 41 , 43 ) , dan , lebih umum ,virus tanaman lainnya ( 33 , 41 ) . Baik perjanjian inimemberikan dukungan kepada validitas pendekatan pemodelan kami sebagaiserta kesimpulan yang berasal dari itu .PEMBAHASANEfektivitas jangka panjang resistensi genetik untuk tanamanvirus terus-menerus ditantang oleh potensi evolusivirus RNA ( 21 ) , menciptakan kebutuhan untukpengembangan strategi perlawanan baru . Pada awal 1990-an itudiakui bahwa ekspresi transgenik virus yang diturunkanurutan menghasilkan pertahanan yang sangat efisien terhadap tanamanvirus ( 32 ) , dengan pertahanan ini sedang dimediasi oleh posttranscriptional yangdegradasi genom RNA dipandu oleh virus yang diturunkanRNA campur kecil ( Sirnas ) ( 25 ) . Dalam beberapa tahun terakhir ,tanaman yang tahan terhadap infeksi virus telah direkayasadengan menggunakan pendekatan ini ( 11 , 18 , 29 , 36 , 49 ) . Namun,ekspresi transgenik dari urutan virus panjang menimbulkan biosafetykekhawatiran mengenai kemungkinan rekombinasi dangenerasi strain baru dan berpotensi mematikan ( 44 ) .Mengambil keuntungan dari kesamaan fungsional antara siRNAdan miRNAs , Niu et al . ( 38 ) diubah tulang punggung A.thaliana pra - miRNA159 , menggantinya dengan singkat 21 - nt virusurutan , sehingga tanaman tahan yang sangat spesifik . inipendekatan memiliki setidaknya dua keunggulan dibandingkan dengan ekspresiurutan virus panjang . Pertama , harus memiliki lebih sedikitefek off-target , sebagai urutan Amir lebih pendek dibandingkandiperlukan untuk tergantung homologi membungkam gen . Kedua, rekombinasitidak menjadi perhatian lagi , mengingat sesakpara amir . Namun, pendekatan ini mungkin masih menaikkan utamaPerhatian : hal berubah-ubah tinggi virus RNA membuatnya mungkinvarian virus yang resisten akan muncul , seperti telah dibahas dalampercobaan in vitro dengan virus mamalia ( 4 , 12 , 17 , 22 , 23 ,30 , 40 , 48 , 52 ) . Tujuan dari penelitian ini adalah untukmengevaluasi kemungkinan munculnya varian melarikan diri tersebutpada populasi virus mereplikasi dalam reservoir sepenuhnya rentantanaman serta pada tanaman mengekspresikan resistance di subinhibitorytingkat . Menuju mencapai tujuan ini , kita harusdilakukan dua percobaan evolusi yang berbeda menggunakan

Page 16: Viro arti

pathosystem TuMV / A. thaliana , bersama-sama dengan in silico komputasiModel simulasi kedua percobaan evolusi . ituPercobaan pertama dirancang untuk meniru situasi di manatanaman tanaman transgenik tahan hidup berdampingan dengan tanaman sepenuhnyayang rentan yang bertindak sebagai reservoir virus . Dalam hal ini , kitamengamati peningkatan jumlah garis keturunan yang berkembangyang mampu berhasil menginfeksi host tahan sepenuhnya .Mutan melarikan diri tersebut harus kemungkinan besar akan netral , atau mungkinbahkan sedikit merusak , dikelola oleh komplementasi , dipopulasi berkembang . Percobaan kedua kami ditujukan untukmeniru situasi di mana tingkat ekspresiantivirus Amir adalah variabel antara tanaman , dengan beberapa dari merekamemiliki tingkat suboptimal yang memungkinkan replikasi virus danpemilihan varian melarikan diri . Dalam kasus kedua kami menemukan bahwapopulasi akumulasi mutasi melarikan diri pada banyakfrekuensi yang lebih tinggi dan , oleh karena itu , mampu berhasil menginfeksihost tahan sepenuhnya pada waktu sebelumnya dalam evolusi virus .Hasil kedua adalah sangat diprediksi , karena mengulangievolusi bakteri pada konsentrasi antibiotik di bawahMIC ( 14 ) dan telah kokoh didirikan . pada subinhibitorykonsentrasi antivirus Amir, genotipe mutan mendapatkanKeuntungan kebugaran , mengingat kemampuan mereka untuk meniru meskipunKehadiran Amir antivirus , sedangkan tipe liar genommasih mungkin menderita dari efek penghambatan . Keuntungan kebugaran inihasil dalam akumulasi alel melarikan diri atas apadiharapkan dari percobaan pertama .Dalam semua 50 kasus , karakterisasi molekuler dari pelarianmutan mengkonfirmasikan adanya mutasi pada amiR159 -HCPro sasaran. Dalam perjanjian dengan spektrum mutan dijelaskansebelumnya untuk virus lain, termasuk TuMV , kami telah mengamatikelebihan mutasi transisi ( 9 , 26 , 31 , 43 ) . khususnyamenarik adalah kenyataan bahwa G -to - A dan C - to- U transisimewakili 95 % dari semua mutasi yang diamati . transisi iniadalah dari jenis tertentu yang disebabkan oleh deaminases cytidine selulerterlibat dalam respon imun bawaan terhadap infeksi virus( 13 ) , fenomena sangat baik dijelaskan untuk HIV - 1 danretrovirus lain ( 16 ) , tetapi sampai sekarang tidak dijelaskan untuk RNAvirus . Pengamatan ini dalam perjanjian yang baik dengan yang diuraikansebelumnya Lin et al . ( 31 ) , sehingga memberikan dukungan tambahanhipotesis bahwa sebagai strategi antivirus , tanaman mungkin memilikisistem RNA - editing yang menginduksi hypermutagenesis viralgenom . Kami mencatat bahwa A. thaliana berisi keluarga sembilangen paralogous yang telah dijelaskan deaminases cytidinekarena homologi mereka dengan lokus CdA1 ( 47 ) .Memang , mutasi merata sepanjang 21 - nt

Page 17: Viro arti

target dan terkonsentrasi terutama di posisi 11 dan 12 , dalamkasus yang jelas dari evolusi konvergen pada tingkat molekuler . konvergenevolusi adalah fenomena yang luas dalam virus RNAbaik dalam percobaan ( 8 , 15 , 53 ) dan alam ( 5 , 35 ) populasi .Meskipun konvergensi ini bisa pada prinsipnyamenjelaskan dari sudut pandang netral pandang sebagai akibat dariBias mutasi , itu lebih mungkin bahwa paralel dan konvergensubstitusi yang adaptif . Pola ini akan dihasilkan dari virusmenghadapi tekanan selektif yang identik , dengan beberapa alternatifjalur adaptif , seperti yang diharapkan untuk mereka yang sederhana dan dipadatkangenom . Dalam perjanjian dengan pengamatan kami , Lin et al . ( 31 )posisi 11 diklasifikasikan sebagai cukup penting dan posisi12 sebagai penting untuk ketahanan melanggar , meskipun situs lainkualifikasi sebagai penting tidak menunjukkan frekuensi tinggivariasi dalam percobaan kami . Berbeda dengan studi oleh Lin etal . ( 31 ) , di mana urutan ditargetkan adalah netral terhadapvirus , di sini amiR159 - HCPro menargetkan wilayah coding dariTuMV HC - Pro cistron , dan akibatnya , mutasi dalam pelarianvarian harus menghasilkan membentuk keseimbangan antara menghindari pengakuanby amiR159 - HCPro dan mempertahankan fungsi biologis .Memang , efek coding ini mungkin menjelaskan mengapa Lin et al . diamatikelebihan posisi penting di 5 ? akhir Amir . Selain itu ,penjelasan potensial untuk konvergensi dalam dua inisitus pusat bergantung pada kenyataan bahwa pasangan yang tidak sempurna dengan pusatketidaksesuaian di kecil hibrida RNA - sasaran mempromosikan translasirepresi karena melibatkan mengiris ( 7 ) . pengamatan inimenunjukkan kemungkinan bahwa pasangan yang tidak sempurna antaraAmir dan target bermutasi dapat mengakibatkan represi translasidaripada virus RNA belahan dada . Berbeda dengan katalitikefek dari Amir - dimediasi virus RNA pembelahan , translasirepresi membutuhkan jumlah stoikiometri amir danOleh karena itu tidak efisien . Penghambatan terjemahan tidak efisienmungkin memungkinkan replikasi virus residual , dan virus keturunan bisamasih bisa lolos represi dengan memperbaiki perubahan urutan target .Semua dalam semua , hasil kami menunjukkan bahwa daya tahan amiRbasedresistensi mungkin terlalu singkat waktu untuk membuatnya menjadi menguntungkanpendekatan . Namun, pernyataan ini harus hati-hatidipertimbangkan dalam konteks yang kita dirancang percobaan kami disedemikian rupa sehingga mereka mewakili paling menguntungkan mungkinSituasi ketahanan melanggar . Misalnya , tantangan kitaPercobaan dilakukan dengan inokulum yang mewakili 1 sampai 20% daripopulasi virus keseluruhan , menurut simulasi kami . dalamSituasi alam di lapangan , transmisi akan dimediasioleh vektor , yang memberlakukan kemacetan lebih dramatis , dalamurutan unit per vektor dan acara transmisi ( 1 , 2 , 37 ) , sehingga

Page 18: Viro arti

meminimalkan kemungkinan transmisi frekuensi sangat rendahmelarikan diri alel , meskipun populasi vektor besar akanberkontribusi terhadap peningkatan dari kemungkinan penularan . Selain itu ,cara di mana kita sampel populasi virus , homogenisasiseluruh tanaman , disediakan probabilitas transmisiuntuk semua genom hadir di pabrik . Struktur spasialdikenakan oleh aliran gen batas arsitektur tanaman antara distalbagian tanaman , sampai ke titik bahwa setiap bagian mungkindidominasi oleh genotipe virus yang berbeda ( 28 ) . Ini berarti bahwavarian mungkin tidak mencapai frekuensi tinggi dalam keseluruhanmetapopulation walaupun memiliki beberapa keuntungan kebugaran lokal .Oleh karena itu , dengan memberi makan pada daun tertentu , vektor akan kehilanganmutan pemuatan melarikan diri yang mungkin melimpah di bagian lain daritanaman . Semua faktor-faktor ini , ditambah beberapa yang pasti tambahan ,meningkatkan stochasticity alel melarikan diri tumpah dariwaduk mereka ke Amir tanaman transgenik , sehingga mungkinmeningkatkan daya tahan perlawanan . Faktor lain yang dapat mempengaruhidaya tahan , seperti yang disarankan oleh hasil penelitian kami , adalah tingkat di manaAmir diungkapkan . Kami telah menunjukkan bahwa ekspresi subinhibitorytingkat memang akan memilih untuk alel resistensi , memfasilitasipenyebarannya pada populasi transgenik . Ini menambahkan peringatan yangcatatan untuk bioteknologi ketika memilih baru merekatanaman transgenik . Cara lain untuk meningkatkan daya tahandaya tahan bisa mengungkapkan lebih dari satu Amir di sebuah transgeniktanaman , untuk menargetkan urutan RNA sangat kekal yang berbedadalam genom virus , atau untuk menggabungkan Amir - dimediasi resistensidengan resistensi genetik lainnya . Dengan menggabungkan beberapa amirmenjadi tanaman tunggal , kemungkinan resistensi melanggar kehendakturun secara eksponensial . Saat ini, kami sedang menjajaki kemungkinan inidi laboratorium .UCAPAN TERIMA KASIHKami berterima kasih kepada SD Yeh untuk ramah memberikan p35STuMV dan J. Formentuntuk bantuan komputasi teknis .Karya ini didukung oleh Program Ilmu Frontiers ManusiaOrganisasi RGP12/2008 hibah , Generalitat Valenciana hibahPROMETEO/2010/019 , dan CSIC memberikan 2010TW0015 . Kami juga mengakuidukungan dari The Santa Fe Institute .