Gita Asapuri240210110043TIP-A

VI. PEMBAHASANPraktikum yang dilaksanakan pada tanggal 29 April 2013 adalah mengenai khromatografi. Kromatografi berasal dari kata khroma yang berarti warna. Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran yang digunakan untuk menguraikan campuiran berupa artikel warna menjadi komponen-komponen penyusunnya. Beberapa zat yang diteteskan pada kertas dapat bergeak pindah lebih cepat daripada yang lain. Kelarutan suatu partikel terhadap pelarutnya mempengaruhi kecepatan perpindahan tersebut. Semakin mudah suatu partikel larut, semakin cepat laju geraknya. Suatu campuran pewarna dapat dipisahkan dengan teknik kromatografi karena adanya perbedaan kelarutan antara zat penyusun campuran pewarna tersebut. Selain itu, kecepatan bergerak partikel penyusun sangat dipengaruhi oelh ukuran partikel penyusunnya. Partikel penyusun yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat daripada partikel penyusun yang berukuran lebih besar (Kamilati, 2006). Kromatografi telah didefiniskan terutama sebagai suatu proses pemisahan yang digunakan untuk pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler. Kromatografi bergantung pada pembagian ulang molekul-molekul campuran antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi mencakup kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi cairan, dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi adalah partisi gas dan cairan. Contoh dari kromatografi ini salah satunya adalah kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam tiap kasus terjadi distribusi antara fase cair yang terserap secara stasioner dan zat alir bergerak yang kontak dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada suatu pendukung, dalam kromatografi kertas pendukung itu adalah kertas atau kertas terolah, sedangkan dalam kromatografi lapis tipis adsorbennya disalurkan pada lempeng kaca atau lembaran plastik (Basset J. et all, 1991).Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Anonim, 2011).Pengukuran uji kromatografi dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kuantitatif, perbandingan jarak ditempuh oleh suatu warna dengan jarak pelarut tersebut disebut dengan Rf.Rf = Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat (Anonim, 2011).Variasi jumlah Rf, menunjukan banyaknya komponen penyusun campuran yang sedang dipisahkan dengan metode kromatografi ini. Berbagai nilai Rf ini kita bandingkan satu sama lain. Nilai Rf yang terbesar dimiliki oleh komponen penyusun yang memiliki ukuran partikel penyusun yang terbesar (Kamilati, 2006).Prosedur yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah perta disiapkan kertas 2,5 x 7,5 cm, kemudian kertas tersebut diberi garis batas pada kedua ujungnya, ditandai start dan finishnya, Larutan sampel yang digunakan dilarutkan terlebih dulu dengan menimbang sampel asam amino sebanyak 0,2 gram. Selain itu, dibuat larutan pembawa yang dibagi menjadi 3 jenis larutan. Larutan pertama dengan rasio1- butanol : asam asetat : aquades 2 : 0,5 : 2,5. Selain itu dibuat larutan kedua dengan rasio fenol : aquades 4 : 1. Lalu larutan ketiga butanol : asam asetat : aquades 3 :1 : 1, kemudian masing-masing dari larutan tersebut dimasukkan ke dalam chamber, kemudian ditunggu dan dibiarkan jenuh sambil digoyang-goyang. Kemudian dilakukan prosedur pengembangan, dengan cara kertas yang telah ditotoli sampel asam amino, dimasukkan ke dalam chamber yang telah berisi cairan pembawa dan ditutup, ditunggu hingga pelarut naik sampai garis finish, setelah cairan sampai garis finish, ambil kertas dan keringkan dengan hair dryer, kemudian semprotkan kertas saring tersebut dengan ninhidrin dan keringkan lagi, kemudian akan terbentuk warna ungu dan hitung harga Rf sampel.Pengembang yang terdapat pada praktikum ini adalah fase fenol dan perbandingan larutan. Pengembang bergerak oleh kerja kapiler ke dalam kertas dan dibantu oleh gaya berat., bergerak ke bawah melewati campuran dan mulailah pengembangan. Fase bergerak yang meruah adalah perbandingan larutan yang telah dibuat dan fase stasioner adalah air yang terserap pada kertas. Setelah larutan bergerak menuju garis finish. Kemudian kertas dibiarkan mongering. Asam-asam amino tidak berwarna dan untuk menunjukan posisi zona, digunakan reaksi ninhidrin. Kertas yang telah diberi ninhidrin dihangatkan dalam waktu singkat untuk mempercepat reaksi dengan asam amini. Zona asam amino Nampak sebagai noda merah-ungu (Basset J. et all, 1991).. Sampel asam amino yang digunakan pada praktikum kali ini adalah serin, tirosin, threonine, metionin, dan leusin. Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona relative terhadap garis depan pengembang. Nilai Rf akan menunjukan identitas asam-asam amino dan intensitas zona itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan noda-noda standar. Posisi pelarut depan ditandai dengan pensil dan kromatogram lalu dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat atau ungu.

Gambar 1. Analisis Kromatografi Lapis Tipis(Anonim, 2011)

Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi. Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

+

Ninhidrin Anion Ungu + RCHO + CO2 + 3H2O + H+Gambar 2. Reaksi Umum pada Kertas Kromatografi(Anonim, 2011)

Berikut merupakan data hasil pengamatan praktikum kromatografi lapis tipis. ninhidrinninhidrinninhidrin

Tabel 1. Tinggi Spot Berbagai SampelKelSampelPelarut IPelarut IIPelarut III

1.Serin3,10,0,5

2.Tirosin1,50,33,3

3.Threonin0,63,81,7

4.Metionin3,82,72,3

5.Leusin4,23,84

6.Serin0,50,80,6

7.Tirosin0,320,5

8.Threonin1,921

9.Metionin2,12,31,08

10.Leusin41,52,5

Tabel 2. Nilai Rf Berbagai SampelKelSampelPelarut IPelarut IIPelarut III

1.Serin0,5640,0540,09

2.Tirosin0,270,090,64

3.Threonin0,1090,6990,309

4.Metionin0,690,490,418

5.Leusin0,7630,690,727

6.Serin0,09090,1450,109

7.Tirosin0,0540,36360,0909

8.Threonin0,3480,3640,182

9.Metionin0,3280,4180,196

10.Leusin0,72730,27270,4545

Data Gambar Khromatografi

Kelompok 6A

Kelompok 8 A

Kelompok 9A

Kelompok 10 ADalam percobaan ini dilakukan teknik kromatografi kertas dengan cara tiga dimensi, yaitu menggunakan tiga macam larutan eluen yakni eluen pertama berupa 1-butanol : asam asetat : aquades 2 : 0,5 : 2,5. Sedangkan eluen kedua, yaitu fenol : aquades 4 : 1. Dan eluen ketiga, yaitu butanol : asam asetat : aquades 3 :1 : 1. Penggunaan cara tiga dimensi ini dikarenakan dalam percobaan ini menggunakan sampel dengan komponen yang cukup banyak yaitu 5 macam sampel (serin, tirosin, threonine, metionin, dan leusin). Eluen pertama terdiri atas 1-butanol, asam asetat dan aquades. Ketika larutan dicampurkan, terbentuk dua lapisan. Hal ini terjadi karena 1-butanol bersifat non polar sedangkan asam asetat dan air bersifat polar, jadi asam asetat dan air akan saling bercampur, sedangkan 1-butanol dan dua pelarut lain tidak akan saling campur. Eluen kemudian dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup selama beberapa waktu, tujuannya yaitu untuk menjenuhkan chamber dengan uap pelarut sehingga mempercepat pemisahan. Penjenuhan udara dalam chamber dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.Sedangkan eluen kedua terdiri atas fenol yang bersifat non polar dan aquades yang bersifat polar. Lapisan atas dari eluen digunakan sebagai fase gerak dalam kromatografi kertas karena pada lapisan tersebut merupakan pelarut yang bersifat nonpolar. Sedangkan eluen ketiga sama dengan eluen pertama, yang membedakan hanya rasionya saja, hanya untuk mengetahui apakah peredaan rasion memengaruhi kdaya adosrpsi sampel terhadap kertas. Sampel asam amino yang akan digunakan yakni serin, tirosin, threonin, metionin, dan leusin. Asam-asam amino ini dilarutkan ke dalam etanol dan ditambahkan setetes HCl pekat. Dalam hal ini terjadi reaksi esterifikasi. Adanya gugus karboksilat, menyebabkan asam amino dapat terjadi reaksi esterifikasi oleh adanya alkohol dalam kondisi asam.Tetapi hasil ester yang diperoleh ini tidak stabil karena dapat bereaksi lebih lanjut sesamanya menghasilkan siklis amida (diketopiperazina). Jadi, penambahan etanol dan HCl pekat bertujuan untuk melarutkan asam amino tersebut, sehingga mudah untuk dipisahkan lebih lanjut.Dalam percobaan ini alasan untuk menutup rapat botol reagent/chamber adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang mengelilingi sisi chamber yang terbasahi oleh pelarut.Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai noda-noda asam amino yang berwarna.Masing-masing sampel larutan asam amino ditotolkan pada kertas kromatografi (kertas Whatman) dengan menggunakan pipa kapiler, penggunaan pipa kapiler pada saat penotolan adalah agar tetesan asam amino yang diteteskan tidaklah terlalu banyak sehingga dalam satu kertas saring mampu menampung tiga jenis sampel asam amino. Kemudian dimasukkan ke dalam chamber/botol reagent yang telah dijenuhi oleh uap eluen. Kemudian chamber ditutup rapat agar terjadi pemisahan yang sempurna. Pemisahan asam amino dengan cara kromatografi kertas disebabkan adanya perbedaan koefisien partisi antara air dan pelarut organik. Perbedaan koefisien partisi menunjukkan perbedaan laju rambatan pada permukaan kertas dari air dan pelarut organik yang merambat secara perlahan. Fase air akan tertahan dengan kuat di pori-pori kertas karena adanya interaksi yang kuat antara air dengan gugus hidroksil dari selulosa kertas saring.

Gambar 3. Struktur seluluosa pada kertas saring(Anonim, 2011)

Ketika kertas kromatografi yang telah ditotolkan sampel asam amino, maka akan terjadi pemisahan, dimana pelarut organik merambat ke atas melalui kapiler kertas mengangkut campuran asam amino yang ada ditotolkan pada kertas kromatografi. Asam amino yang paling larut di dalam pelarut organik, akan diangkut paling cepat dan asam amino yang paling kurang larut akan tertinggal paling bawah. Pelarut yang digunakan adalah 1-butanol : asam asetat : air dan fenol : air bersifat nonpolar, maka dari ketiga sampel asam amino yang digunakan (alanin, treonin, glisin), dapat dilihat sifat kepolarannya. Molekul-molekul nonpolar dalam campuran akan memiliki sedikit interaksi dengan molekul-molekul air dan molekul-molekul yang melekat pada selulosa, iterature akan menghabisakan banyak waktunya untuk larut dalam pelarut yang bergerak. Maka sampel yang paling atas merupakan sampel yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non polar dibandingkan sampel asam amino lainnya. Molekul-molekul seperti ini akan bergerak sepanjang kertas diangkut oleh pelarut. Mereka akan memiliki nilai Rf yang iteratu tinggi.Dengan kata lain, molekul-molekul polar akan memiliki atraksi yang tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena molekul-molekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak, molekul-molekul tidak akan bergerak sangat cepat pada kertas.Berdasarkan iterature, dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.Kromatogram dapat dikeringkan dan ditambahkan dengan larutan ninhidrin.Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna khas ungu-biru sampai kecoklatan atau kuning.Asam amino merupakan jenis zat tidak berwarna, sehingga untuk mengetahui letak noda diperlukan pereaksi lokasi, maka pada kertas kromatografi disemprotkan larutan ninhidrin. Dalam percobaan ini digunakan larutan ninhidrin yang disemprotkan pada kertas kromatografi setelah dikeringkan, sehingga noda-noda pada kertas kromatografi dapat terlihat yakni noda yang berwarna ungu. Terbentuknya noda berwarna ungu ini disebabkan karena terjadinya reaksi antara hidrat dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam amino. Noda-noda ini kemudian diukur dengan membandingkan jarak komponen yang dipisahkan (analit) dengan jarak pergerakan pelarut, disimbolkan dengan Rf.

Rumusnya : Contoh perhitungan:(Sampel Serin) Rf = = 0,09Sering kali pengukuran diperoleh dari kertas untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.Berdasarkan perhitungan diperoleh bahwa masing-masing asam amino memiliki harga Rf yang berbeda. Perbedaan ini dipengaruhi oleh keterikatan analit terhadap eluen. Karena eluen yang digunakan bersifat non polar maka senyawa yang lebih non polar akan terikat lebih kuat pada eluen sehingga harga Rf akan semakin besar. Berikut adalah data nilai Rf berdasarkan literatur.

Tabel 3. Nilai Rf Berdasarkan LiteratureAmino acidRf value

Leucine0.73

Isoleucine0.72

Phenylalanine0.68

Valine0.60

Methionine0.55

Tyrosine0.45

Proline0.43

Alanine0.38

Threonine0.35

Glutamic acid0.30

Serine0.27

Glycine0.26

Aspartic acid0.24

Arginine0.20

Lysine0.14

(http//:Spolem.co.uk)

Jika dibandingkan dengan harga Rf asam-asam amino standar yakni untuk berbeda dengan harga Rf hasil percobaan. Hal ini karena harga Rf dipengaruhi oleh eluen, sedangkan pada harga Rf standar tidak diketahui eluen yang digunakan, bisa saja eluen yang digunakan berbeda sehingga hasil daripada harga Rf juga berbeda.

VII. KESIMPULAN1) Kromatografi kertas dapat digunakan untuk mengidentifikasi/memisahkan asam amino dalam suatu campuran2) Harga Rf berbeda dipengaruhi oleh keterikatan analit terhadap eluen. Karena eluen yang digunakan bersifat non polar maka senyawa yang lebih non polar akan terikat lebih kuat pada eluen sehingga harga Rf akan semakin besar.3) Nilai Rf berdasarkan hasil percobaan dan literature berbeda karena harga Rf dipengaruhi oleh eluen, sedangkan pada harga Rf standar tidak diketahui eluen yang digunakan, bisa saja eluen yang digunakan berbeda sehingga hasil daripada harga Rf juga berbeda.4) Dengan eluen organik yang bersifat polar maka semakin besar harga Rf, semakin bersifat polar sampel asam amino tersebut.

VIII. SARANKetidakkondusifan kelas menyebabkan chamber ketika sudah dimasukan kertas kedalamnya masih dogoyang-goyang oleh mahasiswa, sebaiknya sebelum praktikum mahasiswa diberitahu terlebih dahulu agar lebih hati-hati dan tidak main-main dalam praktikuk kromatofgrafi kertas.

DAFTAR PUSTAKAAnonim. 2011. Kromatografi Kertas Daripada Asam-Asam Amino. Laboratorium Kimia FKIP Unlam Banjarmasin. Basset, J. et all. 1991. Buku Ajar Vogel: Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Kamilati, Nurul. 2006. Mengenal Kimia. Jakarta: Yudhistira.