Vi. Sentrifugasi

7/18/2019 Vi. Sentrifugasi

http://slidepdf.com/reader/full/vi-sentrifugasi 1/40

Laboratorium Biokimia

Fakultas Biologi UGM



Pemisahan BiokimiawiProduk/Sumber alam

Ekstrak kasar/crude extract

Konsentrasi ekstrak kasar

Produk murni

Ekstraksi, dialisisFiltrasi/Sentrifugasi

Fraksinasi (garam, solvent,asam, pemanasan)Metode sentrifugasi

Teknik kromatografi

Metode elektroforasi

Desain untuk isalasi

dan puriikasi produk!ang diinginkan

Hasil (%)

Kemurnian

Aktivitas iologi



Pemisahan Makromolekul

" Kromatograi# presipitasi" Elektrooresis# ultrasentriugasi



Prinsip Sentriugasi

Sentrius adalah alat !ang digunakan untukmemisahkan berbagai partikel dalamlarutan berdasarkan ukuran# bentuk#

densitas# $iskositas medium danke%epatan rotor &

Di dalam larutan# partikel !ang mempun!ai

densitas lebih besar/berat akanmengendap dan partikel !ang lebihke%il/ringan akan mengapung



Prinsip sentriugasi

" Semakin besar perbedaan densitasn!a semakin%epat mereka bergerak

" 'ika tidak ada perbedaaan densitas (kondisi

isopiknik) partikel* tersebut akan tetap tinggal(sta! stead!)

" Untuk memisahkan partikel+partikel dalam

larutan !ang mempun!ai perbedaan densitassangat ke%il digunakan ,%entriugal or%e-(menggunakan sentrius)



SE.01FUG2S1

Memisa!kan partikel/makromolekul "# Sel# komponen su$selular

# protein, lipid# asam nukleat (&A,'&A)

asar pemisa!an "

# kuran# entuk# ensitas

Metode pemisa!an "

# per$edaan densitas antarpartikel/makromolekul danmedium dimana merekaterdispersi

erdasarkan grafitasi



" Ban!ak partikel atau sel dalam suspensi larutan dalamwaktu tertentu akan mengendap oleh karena graitasi (34 g)

" Partikel !ang lain (sangat ke%il) tidak akan mengendap

apabila tidak digunakan kekuatan sentriugal&" Pada saat suspensi dirotasi pada ke%epatan tertentuatau revolutions per minute (0PM)# kekuatan sentriugalmengakibatkan partikel tsb bergerak memutar men5auhiaksis rotasi& Kekuatan partikel (dibandingkan dengangraitasi) disebut Relative Centrifugal Force (06F)&

" 6ontoh 7 06F dari 899 4 g menun5ukkan bahwakekuatan sentriugaln!a 899 kali lebih besar dari padakekuatan graitasi bumi

Prinsip sentriugasi



Dasar eori

Apabila suatu partikelbergerak melingkar denganradius (r) dan kecepatanangular (ω) tertentu, maka

partikel tersebut akanmendapatkan gayasentrifugasi (Fc) yangbesarnya merupakan hasilkali medan sentrifugal(ω 2r) dengan massa efektif

partikel tersebut



emisa!an partikel selama sentrifugasi



Untuk menaikkan nilai a dengan memberikan gaya yang besar bila bendatersebut ditempatkan dalam medan sentrifugal (a = ω 2r)

Kecepatan alat untuk menempatkan benda (rotor) berputar adalahekuialen dengan 2! " radius, maka kecepatan sudut rotor dalamberputar per menit adalah#

2π.rad menit-1

ω = --------------------------- ………….(5) 60

$ehingga percepatan dalam gaya sentrifugal adalah#

:π2 (rad. menit-1)2 r a = ---------------------------------- ………….(6)

3600



*%aya sentrifugal bila ditulis dalam satuan graitasi atau &'F(relatie centrifuge field) dengan konstanta graitasi * cm det+ adalah#

4π2 (rad. menit-1)2 r

RCF = --------------------------------- ……… (7)

3600 x 980

ta! dirin"#a$ men%adi&

RCF = 1'11 . 10-5 . 2 . r …………(8)

Keterangan#&'F dalam satuan g (graitasi)- = gaya dalam rpmr = .arak rotor ke pusat putaran

Untuk mengkonersikan satuan rpm kedalam g dapat dilakukan denganmenggunakan skala yang sangat ditentukan oleh .arak rotor ke pusatputaran (dalam cm) dapat dilihat pada skala di %ambar berikut#



*n+er$i #e,eatan !tar dari RCF (") #e R/ (rm) erda$ar#an diameter r*t*r (,m)



*ei$ien edimenta$i

Kecepatan sedimentasi berbanding lurus dengan gayasentrifugal

Fc = f

$ehingga koefisien sedimentasi ($) dapat diuraikan sebagaiberikut# Fc$ = +++++++++++ =

f

= Fc = f / m( 0 1)

= ++++++++++++++ = +++++++++ 33 ()

ω2 r

$atuan untuk $ adalah unit $edburg ($)

$ = *+4 detik



C*nt* $*a&

Apabila suatu protein antibodi dengan berat molekul (56) 7* k8, diputar dengaUltrasentrifuge yang radius rotornya cm, dengan kecepatan 973*** rpm3 :adakondisi tsb medan sentrifugasinya adalah ;, " * cm dt+2, dan kecepatan$edimentasi pada gaya tsb 4,; " *+; cm dt+3 5erapakah koefisien sedimentasi<

8iketahui#ω2 r = 4'9 x 108 ,m dt-2

= 3'4 x 10-4 ,mdt

aa&

+ 3'4 x 10-4 ,mdt

= ---------- = ------------------------------ = 0'7 x 10-12 dt = 7 x 10-13 dt = 7

ω

2

r 4'9 x 10

8

,mdt

-2



eni$ $entri!$

Lowspeed ;igh+speed Ultra/mi%ro+ultra

Ma4imum speed (rpm 439<)Ma4imum 06F (4 39< )

39

=

*>

399

399/389

>99/?99

2plikasi pembentukanpeletbakteri @ @ (@)

Sel hewan dan tumbuhan @ @ (@)

.ukleus @ @ (@)

Presipitat beberapa ban!ak (@)Fraksi membran beberapa beberapa @

0ibosom/polisom + + @

makromolekul + + @

Airus + ban!ak @



'enis pemisahan sentriugal

" Sentriugasi dierensial" Sentriugasi gradien densitas 7

+ pemisahan rate onal (sie) dan + pemisahan isopiknik



Sentrifugasi iferensial

erdasarkan pada ukuran partikeligunakan untuk meng!asilkan pelet dan preparasi organela su$selular dan

makromolekul!omogenat sel dapat disentrifus $erta!ap dengan meningkatkan ke+epatan sentrifugasi (g) dan aktu sentrifugasi se!ingga di!asilkan pelet -ang

mengandung organela -ang tela! dipurifikasi

Sentrifugasi gradien densitas



Sentrifugasi gradien densitasilakikan untuk purifikasi organela su$seluler dan makromolekulilakukan dengan mem$uat lapisan gradien media (misal sukrosa) dari

-ang paling $erat di $agian paling $aa! Ada dua ma+am " &ate =onal (si=e) separation dan >sopycnic separation



Sedimentasi $erdasarkan "# ukuran partikel# massa partikel# densitas partikel

Aplikasi "# memisa!kan organela su$selular(endosom)# memisa!kan protein (anti$odi)Misal " .enis antiodi memiliki densitas

-ang !ampir sama, tetapi mempun-aimassa -ang $er$eda

Hal -ang perlu diper!atikan "# densitas larutan sampel !arus le$i! ke+il

dari densitas gradien# densitas partikel sampel !arus le$i!$esar dari gradien -ang tertinggi# Tinggi gradien !arus men+ukupi untukter.adin-a pemisa!an#0aktu sangat penting (.ika terlalu lama

semua partikel mungkin akan mem$entukpelet)



Selama sentrifugasi, suatu partikeldengan densitas tertentu akan men+apaisuatu tempat -ang mempun-ai densitas

-ang $enar*$enar sama dengan

larutann-a

Aplikasi "# memisa!kan asam nukleat dalamgradien 1s1l

Hal -ang perlu diper!atikan "# densitas partikel sampel !arus turundalam $atas dari densitas gradien

# $er$agai pan.ang/tinggi gradien dapatdigunakan#0aktu sentrifugasi !arus +ukup untukmenempatkan partikel pada titikisopiknikn-a



Sentriugasi dierensial

" Pemisahan didasarkan padaukuranpartikel

" Digunakan dalam preparasi organelasubsellular atau pemisahan makromolekul



Sentriugasi gradien densitas

" Metode ini digunakan untuk puriikasi organelasubselular dan makromlekul&

" Gradien densitas dilakukan dengan membuat

lapisan+lapisan gradien media (misal sukrosa)&Lapisan !ang lebih berat diletakkan di bagiandasar diikuti dengan lapisan dengan konsentrasi!ang lebih rendah&

" Fraksi sel !ang akan dipisahkan diletakkan padalapisan paling atas# kemudian disentrius&

l f k h k l



Ultrasentrifugasi untuk pemisahan komponen sel



? k ik b di



?eknik pembuatan gradiendensitas larutan

:emisahan dengan ultrasentrifugasi dilan.utkan dengan fraksinasi komponen



:emisahan dengan ultrasentrifugasi dilan.utkan dengan fraksinasi komponenyang terpisahkan selama sentrifugasi

:emisahan organel berdasarkan gradien sentrifugasi



:emisahan organel berdasarkan gradien sentrifugasi



?eknik sentrifugasi untuk pemisahan sampel dengan gradien sukrosa



Komponen penting alatsentrifuge

a) &otor tempat untukmeletakkan tabungsampel yang akandipisahkan3&otor tersebut

dihubungkan dengan

motor pemutarb) &uangan (chamber)

sentrifuge yang berisirotor dan motorpemutar

c) ?ombol pengatur

kecepatan, suhu dan@aktu (timer) dll

' t h l t lt t if



'ontoh alat ultrasentrifuge

'ontoh alat



ultrasentrifuge

&otor tempat meletakkan tabung sentrifuge



&otor tempat meletakkan tabung sentrifuge



en"*era$i*an aat $entri!"a$i

) :ilihlah alat sentrifugasi sesuai dengan kebutuhan, misal# + besarnya rotor tempat sampel + sentrifuge dengan pengatur suhu atau tidak + berapa kecepatan yang dipergunakan (&:6 atau &'F)2) etakkan tabung sentrifuge didalam rotor secara seimbang (lihat pada

%ambar berikut)

4) Bolume larutan sampel dalam tabung kurang dari C olume tabung

;) Apabila larutan sampel mudah menguap maka tabung ditutup rapat

7) $ebelum dilakukan pemutaran (start), tutuplah penutup sentrifugesecara rapat

D) Aturlah suhu sesuai yang diperlukan sebelum mulai pengoperasian



) y g p p g palat sentrifuge

9) :utarlah sentrifuge dengan kecepatan sesuai dengan prosedur yang diikuti,pertama dimulai dengan kecepatan rendah, apabila suara atau gerakan

putaran normal maka kecepatan dapat dinaikkan sesuai dengan keperluan3Apabila suara atau gerakan dari rotor terdengar kasar, maka kecepatan dikembalikan ke nol atau dihentikan (stop) dan periksa posisi sampel

di dalam rotor3

) :erhatikan @aktu putar yang diperlukan (sesuai dengan prosedur)

) $etelah selesai, tunggu sampai kecepatan putaran berhenti (menun.ukkanangka nol)

*) Ambil tabung sampel secara hati+hati, .angan sampai terguncang dan lekasdipisahkan antara pelet (endapan3partikel yang tersedimentasi pada

bagian ba@ah tabung) dan supernatan (cairan bagian atas) secara hati+hati

) 5ersihkan rotor dan ruangan bagian dalam sentrifuge maupun pada bagian rotor tempat untuk meletakkan sampel, dan tutuplah alat sentrifuge

Vi. Sentrifugasi

Documents

Transcript of Vi. Sentrifugasi