Variasi somaklonal amrullah
-
Upload
smpn-4-kerinci -
Category
Education
-
view
141 -
download
6
description
Transcript of Variasi somaklonal amrullah
Evaluasi Variasi Somaklonal pada Benih Jeruk Hasil Perbanyakan Melalui Embriogenesis Somatik
“Yulianti, F, Devy, NF, dan Widyaningsih, S”Jurnal Hortikultur Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah
Subtropika, Jl. Raya Tlekung No.1, Junrejo, batu 65301Vol. 22 no. 3, 2012, hal. 210-216
OlehAmrullah M8136173002
Pendidikan Biologi (A) “2013Program Pascasarjana Universitas Negeri Medan
2014
Dosen Pengampu:Prof. Dr. Ir. A . Rafiqi Tantawi, M.Si
Pendahuluan
Kultur jaringan tanaman melalui embriogenesis somatik dipercaya paling efektif untuk perbanyakan masal (Debergh & Zimmerman 1990)
Keseragaman genetik tanaman hasil perbanyakan melalui embriogenesis somatik perlu diuji lebih lanjut karena teknik perbanyakan tersebut dapat menyebabkan terjadinya variasi somaklonal
Variasi yang dihasilkan dapat terjadi secara berkelanjutan. Hal ini tidak diinginkan pada perbanyakan klon secara vegetatif. Oleh sebab itu perlu deteksi dini terjadinya variasi somaklonal menjadi sangat penting untuk menghindari kerugian secara ekonomis.
Beberapa teknik yang dikembangkan untuk mendeteksi variasi somaklonal
Deskripsi morfologi Pengamatan fisiologis Kajian sitologi Isozim(Gupta & Varshney 1999) Pengamatan pertumbuhan di lapangan Kajian molekuler(Devarumath et al. 2007)
Dalam penelitian ini teknik yang digunakan adalah teknik kajian molekuler yang dilakukan dengan menggunakan penanda ISSR untuk menguji stabilitas genetik tiga varietas tanaman jeruk ( JC, Volkameriana, dan Siam Kintamani) hasil perbanyakan melalui embriogenesis somatik
Tujuan Penelitian Untuk mendapatkan kepastian ada
tidaknya variasi somaklonal pada tanaman hasil mikropropagasi melalui embriogenesis somatik sejak dini
Hipotesis Penelitian Perbanyakan tanaman melalui
embriogenesis somatik memungkinkan terjadinya variasi somaklonal
Bahan dan Metode
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (Balitjestro), pada Bulan Oktober 2010 sampai dengan Desember 2011
Bahan-bahan yang digunakan ialah : kalusEmbrioPlanlet danSemai benih jeruk hasil perbanyakan massal melalui embriogenesis somatikPrimer ISSRPCR core kit sistem dan Bahan kimia lainnya
Alat-alat yang digunakan ialah :
- mortar- sentrifuse- inkubator- mesin PCR (Biometra)- Bio Doc Analyzer (Biometra)- mesin elektroforesis- timbangan- pipet dan- gelas-gelas
Prosedur PenelitianMateri hasil perbanyakan melalui teknik embriogenesis somatik diuji stabilitas genetiknya dengan teknik PCR menggunakan lima jenis penanda ISSR :1. (GA) 8YG (ISSR A)2. (TCC) 5RY (ISSR B)3. (AG) 8YT (ISSR C)4. (AG) 8YG (ISSR D)5. BDB (TCC)5 (ISSR E)
Analisis dilakukan terhadap tanaman hasil perbanyakan varietas JC, Volkameriana, dan Siam Kintamani yang disubkultur : 5 kali (fase planlet dan semai)10 kali (fase kalus,embrio, planlet, dan semai)Hasil amplifikasi DNA masing-masing sampel dibandingkan dengan Tanaman induk
Ekstraksi, Isolasi, dan Kuantifikasi DNA
Sampel daun digerus dengan menggunakan mortar + 1 ml buffer ekstraksi ( 2% CTAB; 20 mM EDTA; 100 mM Tris HCL; 1,4 M NaCL; 2% PVP, dan 0,2% mercapto ethanol)
Campuran hasil gerusan dan buffer ekstraksi diinkubasi pada suhu 65⁰C (30 menit) Campuran didiamkan (2 menit) pada suhu ruang lalu ditambah Na-asetat 1/10 volume
campuran dan 1 ml CHISAM (chloroform: isoamil alkohol 24:1) Campuran diaduk kemudian disentrifuse (10 menit) pd kecepatan 12.000 rpm Supernatan yang terbentuk diambil dan ditambah Na-asetat (1/10 x volume) dan di
campur Selanjutnya + isopropanol (0,6 x volume) atau etanol absolut (2,5 x volume) untuk
presipitasi DNA dan campur dengan cara membolak-balik tabung secara perlahan. Campuran disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm (10 menit) untuk mengendapkan
DNA Cairan yang terbentuk dibuang dan endapan DNA dicuci dengan etanol 70% Endapan DNA dikeringanginkan dan dilarutkan kembali dengan 50-100 µl buffer TE
yang mengandung RNAse (1 µl) DNA diinkubasi pada suhu 37⁰C (30 menit) dan siap digunakan untuk proses
selanjutnya
Amplifikasi dan Separasi DNA
• Amplifikasi sampel DNA dengan penanda ISSR dilakukan berdaasarkan metode Scarano et al. (2002)
• PCR diprogram satu siklus denaturasi suhu 94⁰C (3 menit)
• 28 siklus denaturasi suhu 94⁰C (45 detik)• Annealing suhu 53⁰C (1 menit)• Dengan ekstensi suhu 72⁰C (2 menit)• Dan diakhiri dengan satu siklus ekstensi suhu 72⁰C (10
menit)
Lanjutan• Setiap sampel DNA dicampur dengan 20 µl
campuran yang mengandung 10 ng DNA genomik sebagai cetakan, 0,25 mM dNTP, 0,5 pmol primer ISSR, 1 unit Taq DNA polimerase dalam larutan buffer 1 x dan 3 mM MgCl₂
• Pemisahan pita DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan metode elektroforesis pada gel agarose 2% yg mengandung etidium bromida (10 mg/l) di dalam larutan 0,5 x TBE (70 menit) pada kekuatan arus 100 volt.
• Deteksi pita DNA dilakukan dengan sistem biodokumentasi.
• Skoring dan analisis dendogram pita DNA dilakukan berdasarkan keberadaan pita DNA
Hasil dan Pembahasan
• Pengamatan secara visual, penotif tanaman hasil mikropropagasi tanpak tidak mengalami penyimpangan pada fase planlet maupun semai aklimatisasi
Hasil amplifikasi dan separasi DNA planlet yang telah disubkultur sebanyak lima kali tidak menunjukkan pola pita yang berbeda dengan tanaman induk. Terlihat pada Gambar 2. ( Kintamani (A), JC (B), dan Volkameriana(C) )
Namun, kalus, embrio, planlet, dan semai tanaman hasil embriogenesis somatik yang disubkultur lebih dari 10 x mempunyai beberapa pola pita dibandingkan dengan tanaman induk yaitu:- pita yang sama- kehilangan pita- mengalami penambahan pita (Gambar 3).
A) ISSR A
B) ISSR B
C) ISSR C
D) ISSR D
E) ISSR E
Berdasarkan analisis pengelompokan dengan menggunakan dendogram
sebagian besar tanaman hasil perbanyakan dengan embriogenesis somatik setelah 10 kali subkultur telah mengalami perubahan genetik (variasi somaklonal)
pada JC, penyimpangan genetik terjadi pada kalus (2%), embrio(12%), planlet (12%), dan semai (6%)
pada Volkameriana, penyimpangan genetik terjadi pada planlet (15%), embrio(15%), semai (17%), kalus (17%), dan
pada jeruk siam Kintamani, penyimpangan genetik pada kalus (17%), embrio (4%), planlet(10%), dan semai (0%)
“Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa subkultur lebih dari 10 kali dan periode kultur lebih dari 1 tahun (lebih dari 10 kali subkultur)
mulai terjadi variasi somaklonal”
Simpulan
Pengujian stabilitas genetik dapat dilakukan sejak tanaman masih berada pada fase kalus, embrio, maupun planlet
Variasi somaklonal terjadi pada fase kalus, embrio, planlet, dan semai hasil embriogenesis somatik yang disubkultur lebih dari 20 kali.
Persentase variasi somaklonal antarvarietas dan fase pertumbuhan tidak sama.
Terima kasih