Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

34
Validasi Penetapan Kadar Levofloxacin dalam Urin (in-vitro) secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. (Iyan Sopyan, Univ. Padjajaran) HASIB HABIBIE, 1208105033 KIMIA BIOANALISIS

Transcript of Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Page 1: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Validasi Penetapan Kadar Levofloxacin dalam Urin (in-vitro) secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. (Iyan Sopyan, Univ. Padjajaran)

HASIB HABIBIE, 1208105033

KIMIA BIOANALISIS

Page 2: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

PendahuluanLevofloxacin

Antibiotik baru

Validasi Metode? Analisis?

Analisis dalam urin

SPE & KCKT, UV

Page 3: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Validasi Metode

Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan yang dilakukan sebagai

pembuktian terhadap parameter-parameter tertentu yang

dipersyaratkan dan ditetapkan sehingga analisis yang dilakukan

mendapatkan hasil yang diinginkan.

Metode analisis ini memerlukan beberapa parameter yang meliputi:

linieritas, presisi (precision),

ketepatan (accuracy), batas deteksi (LOD),

batas kuantitasi (LOQ)

Page 4: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Metode PenelitianKIMIA BIOANALISIS

Page 5: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Alat & BahanALAT

Kromatografi cair kinerja tinggi

Spektrofotometer UV-Vis

pH meter (OHmeter)

ultrasonic bath (NEY 1510),

SPE cartridge HLB 30 mg 1 cc (Oasis),

timbangan analitik

penyaring vakum

saringan berpori 0,45 m

BAHAN

Levofloxacin baku pembanding

Ciprofloxacin baku pembanding

Natrium dihidrogen fosfat dihidrat

asetonitril

asam fosfat

metanol

akuabides

urin manusia

Page 6: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Prosedur PenelitianPENENTUAN PANJANG GELOMBANG PENGUKURAN

Pembuatan fasa gerak.

Pembuatan larutan baku

Penentuan panjang gelombang maksimum

Penentuan ekstingsi molar (ε)

Penentuan kondisi optimum KCKT

Ekstraksi dengan SPE

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR LEVOFLOXACIN SECARA KCKT

Selektivitas

Keterulangan

Linearitas

LOD dan LOQ

Akurasi dan Presisi

Uji kesesuaian sistem

Page 7: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Penentuan Panjang Gelombang PengukuranKIMIA BIOANALISIS

Page 8: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Pembuatan Fasa Gerak

Natrium dihidrogen fosfat dihidrat 1,7248 g

dilarutkan labu ukur 500 ml

diencerken dg akuabides

+ asam fosfat hingga pH 2,5

Fasa gerak dapar fosfat : acetonitril

(85,5:14,5v/v).

Page 9: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Levofloxacin baku ditimbang dengan seksama sebanyak 50 mg, dilarutkan ke dalam labu ukur 100 ml menggunakan fase gerak hingga tanda batas. Sehingga diperoleh konsentrasi akhir 0,5 mg/ml.

PEMBUATAN LARUTAN BAKU

Page 10: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Konsentrasi akhir larutan baku 5x10–3 mg/ml, kemudian larutan discanning dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 200-380 nm, hingga diperoleh panjang gelombang maksimum levofloxacin.

PENENTUAN PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM

Page 11: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Dari larutan baku konsentrasi 0,5 mg/ml dibuat konsentrasi 6,4; 10,8; dan 13,5 μM menggunakan HCl 0,05M dalam labu ukur 50 ml. Ketiga larutan tersebut dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum 295 nm, dan ditentukan nilai ekstingsi molarnya dengan menggunakan persamaan Lambert-Beer.

PENENTUAN EKSTINGSI MOLAR (ε)

Page 12: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Optimasi Kondisi KCKT

Kolom ODS/C18 (Phenomenex), panjang 250mm, diameter dalam 2,6 mm, dan ukuran partikel 10

Fasa gerak Natrium dihidrogen fosfat (0,025 M, pH2,5) : asetonitril (85: 14 v/v) dan (85,5: 14,5 v/v)

Kecepatan alir 1,0 dan 1,2 ml/menit

Volume injeksi 10µl

Standar internal 10µg/ml Ciprofloxacin

Deteksi UV 295 nm

Page 13: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Dilakukan conditioning menggunakan metanol: air (1: 3ml), lalu dimasukkan konsentrasi sampel yang akan diukur, lalu dilakukan tahap washing menggunakan 3% metanol dalam akuabides, dan tahap terakhir adalah eluting, menggunakan 20% ACN dalam dapar fosfat 0,025M pH2,5

EKSTRAKSI DENGAN SPE

Page 14: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Validasi MetodeKIMIA BIOANALISIS

Page 15: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Selektivitas• Selektivitas

dinyatakan dengan nilai resolusi atau daya pisah (Rs) dan nilainya 1,5.

Keterulangan• levofloxacin 1,15

µg/ml dalam urin 10 µl diinjeksikan ke KCKT, diulang sebanyak 6 kali kemudian dihitung koefisien variasinya (% KV).

Page 16: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Linearitas

Dibuat lima seri levofloxacin dengan konsentrasi (1,15; 2,8; 5,75; 11,5; dan 23 g/ml) menggunakan standar internal ciprofloxacin dengan konsentrasi 10 µg/ml dalam urin, Selanjutnya diekstraksi menggunakan SPE dengan tahapan pengkondisian cartridge SPE.

Page 17: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Limit of quantitation (LOQ)Limit of detection

(LOD)

Page 18: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Persen akurasi dilihat drkedekatan hasil sampel terhadap nilai nominal, recovery :

CT adalah konsentrasi levofloxacin hasil pengukuran, dan CA adalah jumlah

levofloxacin yang dispike (konsentrasi nominal) ke dalam urin.

Akurasi dan PresisiAKURASI DAN PRESISI PADA HARI YANG SAMA DIPEROLEH DENGAN CARA PENETAPAN KADAR TIGA SAMPEL MASING-MASING TIGA KALI (N = 3) SELAMA TIGA KALI BERTURUT-TURUT.

Presisi dinyatakan dengan KV (%), dengan persamaan :

Page 19: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Uji Kesesuaian Sistem

Sampel levofloxacin dengan konsentrasi akhir 1,15 (konsentrasi rendah) dan 23 μg/ml (konsentrasi tinggi) dalam urin dengan standar internal ciprofloxacin 10 μg/ml. Masing-masing dilakukan enam kali pengulangan (n = 6) dengan volume injeksi 10 µl ke dalam alat KCKT pada kondisi optimum.

Page 20: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Hasil dan PembahasanKIMIA BIOANALISIS

Page 21: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Penentuan panjang gelombang pengukuranFasa gerak dapar fosfat : asetonitril (85,5:14,5) didapatkan panjang gelombang maksimum levofloxacin 295 nm dan panjang gelombang maksimum ciprofloxacin 279 nm.

Page 22: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Penetapan Ekstingsi Molar

Levofloxacin dapat dideteksi menggunakan detektor ultraviolet pada sistem KCKT dikarenakan nilai rata-rata dari hasil penetapan ekstingsi molar () levofloxacin adalah 33.002,8 M-1cm-1 lebih besar dari 10.000 M-1cm-1.

Page 23: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Efisiensi Ekstraksi Luas Area Tinggi Puncak

Levofloxacin Levofloxacin

ReplikasiKonsentrasi (Μg/Ml)

ReplikasiKonsentrasi (Μg/Ml)

1,15 23 1,15 23

1 93,43 88,92 1 93,57 90,722 111,79 89,68 2 116,27 92,643 115,30 89,51 3 118,73 92,35

(%) 106,84 89,37 109,52 91,90

KV % 10,9 0,45 KV % 12,66 1,13

Page 24: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Hasil Validasi MetodeKIMIA BIOANALISIS

Page 25: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Selektivitas

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Vol

ts

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

11

.13

3

1

05

28

25

0

.00

12

.61

7

4

66

73

6

1.7

0

Detector A - 2 (295nm)devani 500ppm 85.5Dapar-14.5ACN 1.2mLmenit 11-03-2008-001

Retention TimeNameAreaResolution

Selektivitas dari suatu metode, dapat dilihat dari nilai resolusi/daya pisah antara internal standar ciprofloxacin dengan levofloxacin sebagai sampel yang memiliki nilai resolusi yang baik yaitu ≥ 1,5.

Page 26: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Keterulangan

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Vo

lts

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

9.7

42

4

71

72

0

.00

1

91

8

0.3

8

10

.97

5

17

68

72

1

.74

6

23

5

0.4

4

Uji keterulangan levofloxacin konsentrasi 1,15µg/ml dengan konsentrasi standar internal 10µg/ml, pengulangan sebanyak 6 replikasi. Uji ini dikatakan memenuhi persyaratan jika nilai dari luas area. waktu retensi berdasarkan cairan hayati KV < 15%.

Page 27: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Linearitas

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Vo

lts

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

4.7

58

4

45

1

0.0

0

20

9

0.3

5

6.0

00

2

14

7

0.0

0

14

2

0.2

4

9.8

25

7

64

41

3

0.0

0

28

63

0

0.4

1

11

.05

8

22

58

99

1

.63

7

20

3

0.4

7

5 variasi konsentrasi (1,15; 2,8; 5,75; 11,5; dan 23 g/ml) dengan penambahan standar internal levofloxacin 10 µg/ml

(r)=0.999, Y=0.143x+0.121. Hasil tersebut memenuhi persyaratan uji linearitas pada cairan biologis dengan (r) > 0.99.

Page 28: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

LOD - LOQLOD

Hasil koefisen korelasi (r) terbaik yang diperoleh dari kurva baku levofloxacin dapat digunakan untuk pengujian limit of detection (LOD).

Nilai LOD dari rasio luas area adalah 0,0220μg/ml dan nilai LOD berdasarkan tinggi puncak adalah 0,1679 μg/ml.

LOQ

Hasil LOQ didapatkan dari kurva kalibrasi rasio luas area kromatogram.

Nilai LOQ dari rasio luas area kromatogram adalah 0,0733μg/ml dan nilai LOQ pada tinggi puncak adalah 0,5598μg/ml.

Page 29: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Akurasi - PresisiKIMIA BIOANALISIS

Page 30: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Replikasi (n=3)

Konsentrasi levofloxacin nominal (μg/ml)

1,15 5,75 23

Konsentrasi yang diperoleh

Konsentrasi yang diperoleh

Konsentrasi yang diperoleh

123

0,9636 0,99231,0188

5,42235,80216,0216

22,327922,437022,8174

XSD

0,9916 0,0276

5,7487 0,3032

22,52750,2569

Akurasi (% ± SD) 1,15 5,75 23

123

83,7944 86,287688,5983

94,3022100,9061 104,7248

97,078197,552499,2064

XSD

86,22682,4025

99,97775,2729

97,94561,1173

Presisi 1,15 5,75 23

(% KV) 2,7862 5,2741 1,1407

Page 31: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Uji Kesesuaian Sistem

Hasil uji kesesuaian sistem yang diperoleh dari konsentarsi 1,15 μg/ml, memenuhi persyaratan koefisien variasi ≤ 15%.

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Vol

ts

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

9.7

42

4

71

72

0

.00

1

91

8

0.3

8

10

.97

5

17

68

72

1

.74

6

23

5

0.4

4

Page 32: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Nilai KV (%) atasWaktu retensi, luas area kromatogram

dan tinggi puncak kromatogram

Konsentrasi levofloxacin (μg/ml) 1,15 μg/ml

Nilai KV (%)

Waktu retensi

LevofloxacinCiprofloxacin

Rasio

0,660,680,07

Luas area kromatogram

LevofloxacinCiprofloxacin

Rasio

1,30,551,33

Tinggi puncak kromatogram

LevofloxacinCiprofloxacin

Rasio

1,430,361,32

Page 33: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Kesimpulan

◦ Optimasi kondisi KCKT dan ekstraksi levofloxacin dengan matrik urin menggunakan SPE Oasis HLB 1cc dapat dilakukan dengan hasil yang cukup baik.

◦ Berdasarkan hasil validasi metode analisis dengan parameter selektivitas, ketelitian, ketepatan, keterulangan, linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi dan kesesuaian sistem, diperoleh hasil bahwa metode yang telah dilakukan telah sesuai persyaratan sehingga dapat digunakan untuk penetapan levoflocxacin menggunakan KCKT dengan detektor UV

Page 34: Validasi Metode Penetapan Kadar Levofloxacine dalam Urin

Muchas Gracias