i

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR MERK KIRANTI®

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Marsella Widjaja

NIM: 078114030

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2011

i

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR MERK KIRANTI®

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Marsella Widjaja

NIM: 078114030

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2011

ii

Persetujuan Pembimbing

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR MERK KIRANTI®

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

Skripsi yang diajukan oleh:

Marsella Widjaja

NIM : 078114030

telah disetujui oleh:

Pembimbing

Christine Patramurti, M.Si., Apt. tanggal ……………………………….

iii

iv

Karya untuk yang terkasih . . .

TUHAN-ku, ALLAH yang Maha Mulia;

Keluargaku tersayang;

Sahabat, teman-teman, dan Almamaterku

v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang telah saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan yang berlaku. Yogyakarta, 29 Desember 2010 Penulis

Marsella Widjaja

vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Marsella Widjaja

Nomor Mahasiswa : 07 8114 030

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM

SEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR MERK KIRANTI®

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya

ataupun memberi royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal: 4 Februari 2011

Yang menyatakan

(Marsella Widjaja)

vii

PRAKATA

Segala hormat dan puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang

Maha Pengasih atas hikmat, berkat, kasih karunia, dan penyertaan-Nya sehingga

skripsi yang berjudul “Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin dalam

Sediaan Cair Obat Herbal Terstandar Merk Kiranti® secara Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun

untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan

banyak pihak, oleh karena itu pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan

terima kasih sebesar-besarnya kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta sekaligus dosen pembimbing akademik penulis.

2. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah

banyak meluangkan waktu, mendampingi dan memberi masukan, kritik,

solusi, serta semangat kepada penulis selama penelitian dan penyusunan

skripsi. Terima kasih untuk ilmu dan pengalaman yang dibagikan kepada

penulis.

3. Jefrry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji atas saran dan kritik yang

diberikan. Terima kasih untuk “semangat yang tidak pernah padam”.

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji atas semua saran dan kritik

yang diberikan.

viii

5. Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk

melakukan penelitian di laboratorium.

6. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah memberikan senyawa baku

untuk penelitian yang dilakukan oleh penulis.

7. C.M. Ratna Rini Nastiti, M. Pharm., Apt. dan Phebe Hendra, M.Si., Ph.D.,

Apt. untuk bantuan, semangat, dan perhatian yang diberikan.

8. Seluruh staf laboratorium kimia: Mas Bimo, Pak Parlan, dan Mas Kunto yang

telah membantu penulis selama penelitian di laboratorium.

9. Staf sekretariat Farmasi: Mas Dwi, Pak Mukimin, dan Mas Narto atas

bantuanya.

10. Teman seperjuangan, Nana “Upil” dan “Pakde” Toro atas kebersamaan, kerja

sama, dan bantuan yang diberikan. Terima kasih untuk semua masukan dan

kritik.

11. Katrin, Benny, Pace, Tere, Seno, Lilis, Eliz, Yunita, dan Veny atas dukungan

dan kebersamaan selama penelitian di laboratorium.

12. Fransisca Ayu Ningtyas Wiranti yang selalu setia mendengar setiap keluh

kesah penulis. Terima kasih sudah menjadi sahabat yang baik.

13. Kelompok belajar malam: Dika, Ius, Daniel, Yudi, dan Wawan untuk

kebersamaan yang indah di tiap malam selama ujian. Harus tetap semangat,

teman.

14. Sere, Oneng, Manda, Santi, Eka, Yoga, Oki, Reka, Siwi, Ferdian, dan Wicak

yang telah menjadi rekan kelompok praktikum abadi selama penulis

ix

menempuh studi S1 di Farmasi USD. Terima kasih untuk suka duka yang

pernah terjadi.

15. Teman-teman FST 2007 atas hari-hari penuh kebersamaan yang tidak akan

pernah terlupakan.

16. Teman-teman satu atap di Kost Putri Wulandari yang telah menjadi keluraga

baru bagi penulis selama menempuh studi di Yogyakarta.

17. Eurike Chrtistiani Hutauruk dan Andrias Pratiwi yang telah menjadi saudara

yang baik bagi penulis. Terima kasih untuk kasih sayang dan motivasi yang

tidak pernah putus.

18. Debora Inggraini dan Ade William Widjaja yang selalu menjadi motivasi

bagi penulis.

19. Semua orang yang mungkin tidak dapat disebutkan satu per satu oleh penulis,

terima kasih atas semua bantuan yang telah diberikan.

Sama seperti kata pepatah “tak ada gading yang tak retak”, demikian juga

halnya dengan skripsi yang disusun ini. Skripsi ini masih memiliki kekurangan,

oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk membantu penulis

dalam perkembangan selanjutnya. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat

bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...………………………………………………….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………………………… ii

HALAMAN PENGESAHAN …………………………………………... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ………………………………………… iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………………………………… v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ……………. vi

PRAKATA …………………………………………………………….... vii

DAFTAR ISI ……………………………………………………………. x

DAFTAR TABEL ………………………………………………………. xiv

DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………. xv

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………….. xvi

INTISARI ……………………………………………………………….. xvii

ABSTRACT ………………………………………………………………. xviii

BAB I. PENGANTAR …………………………………………………... 1

A. Latar Belakang ……………………………………………… 1

1. Permasalahan ……………………………………………. 3

2. Keaslian penelitian ……………………………………… 3

3. Manfaat penelitian ………………………………………. 4

B. Tujuan Penelitian ……………………………………………. 5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA …………………………………... 6

A. Kurkumin …………………………………………………... 6

xi

B. Obat Herbal Terstandar ……………………………………. 9

C. Sediaan Cair ………………………………………………... 10

D. Spektrofotometri Visibel …………………………………… 11

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi …………………………. 14

1. Definisi …………………………………………………. 14

2. Instrumentasi …………………………………………… 16

3. Pemisahan puncak dalam kromatografi ………………. 20

4. Pengembangan metode KCKT …………………………. 22

F. Validasi Metode Analisis ………………………………….. 23

1. Selektivitas ……………………………………………... 24

2. Linearitas dan rentang …………………………………. 25

3. Ketepatan (accuracy) ………………………………….. 26

4. Ketelitian (precision) …………………………………… 27

G. Landasan Teori …………………………………………….. 29

H. Hipotesis ……………………………………………………. 30

BAB III. METODE PENELITIAN …………………………………….. 31

A. Jenis dan Rancangan Penelitian …………………………… 31

B. Variabel Penelitian ………………………………………… 31

C. Definisi Operasional ………………………………………. 32

D. Bahan-bahan Penelitian …………………………………… 32

E. Alat-alat Penelitian …………………………………………. 32

F. Tata Cara Penelitian ……………………………………….. 33

1. Pembuatan fase gerak KCKT …………………………. 33

xii

2. Pembuatan pelarut metanol pH 4 ……………………… 33

3. Pembuatan larutan baku kurkumin ……………………. 34

4. Penentuan panjang gelombang maksimum kurkumin ….. 34

5. Preparasi sampel ………………………………………... 35

6. Validasi metode analisis ………………………………... 35

G. Analisis Hasil ………………………………………………. 37

1. Selektivitas ……………………………………………... 37

2. Linearitas ……………………………………………….. 37

3. Akurasi …………………………………………………. 37

4. Presisi …………………………………………………... 38

BAB IV. PEMBAHASAN ……………………………………………… 39

A. Pembuatan Fase Gerak KCKT ……………………………. 39

B. Pembuatan Larutan Baku Kurkumin ……………………… 40

C. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kurkumin ……. 41

D. Pengamatan Waktu Retensi (tR) Kurkumin ………………… 43

E. Pembuatan Kurva Baku Kurkumin ………………………… 46

F. Validasi Metode Analisis …………………………………... 48

1. Selektivitas ……………………………………………... 49

2. Linearitas ……………………………………………….. 50

3. Akurasi …………………………………………………. 50

4. Presisi …………………………………………………... 53

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………... 55

A. Kesimpulan …………………………………………………. 55

xiii

B. Saran ………………………………………………………... 55

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………… 56

LAMPIRAN ……………………………………………………………... 61

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………... 99

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai indeks polaritas beberapa pelarut pada KCKT fase

terbalik ……………………………………………………..

19

Tabel II. Kategori metode pengujian ……………………………....... 23

Tabel III. Parameter analisis yang dibutuhkan dalam validasi metode

analisis ………………………………………......................

24

Tabel IV. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima ……............. 27

Tabel V. Kriteria akurasi dan presisi yang masih dapat diterima …… 29

Tabel VI. Data perolehan AUC seri baku kurkumin ……………….... 47

Tabel VII. Hasil perhitungan resolusi (Rs) ………………………….... 49

Tabel VIII. Hasil penetapan recovery baku kurkumin ……………….... 50

Tabel IX. Hasil penetapan recovery baku yang diadisi …………….... 53

Tabel X. Data koefisien variasi baku kurkumin …………………….. 54

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur kurkumin ………………………………………… 6

Gambar 2. Reaksi degradasi kurkumin dalam suasana alkali ………… 7

Gambar 3. Logo OHT ………………………………………………… 10

Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik ………………………… 12

Gambar 5. Diagram alir instrumentasi spektrofotometer visibel ……... 13

Gambar 6. Reaksi silanisasi …………………………………………… 16

Gambar 7. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan ………………….. 16

Gambar 8. Skema instrumen KCKT ………………………………….. 17

Gambar 9. Pemisahan dua puncak ……………………………………. 21

Gambar 10. Langkah pengembangan metode KCKT ………………….. 22

Gambar 11. Reaksi degradasi kolom C18 dalam suasana asam ………… 39

Gambar 12. Gugus metilen aktif pada kurkumin ………………………. 40

Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada kurkumin …………. 41

Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin ……….. 42

Gambar 15. Gugus polar dan nonpolar kurkumin ……………………… 44

Gambar 16. Interaksi kurkumin dengan fase gerak metanol : asam

asetat glasial 2% …………………………………………..

44

Gambar 17. Interaksi kurkumin dengan fase diam oktadesilsilan (C18) ... 45

Gambar 18. Kromatogram baku kurkumin dan sampel ………………... 46

Gambar 19. Kurva baku kurkumin ……………………………………... 48

Gambar 20. Kromatogram baku kurkumi, sampel, dan sampel adisi ….. 52

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Pernyataan jaminan keaslian bahan kurkumin standar

hasil sintesis ……………………………………………...

62

Lampiran 2. Data penimbangan bahan ………………………………... 63

Lampiran 3. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin ……… 64

Lampiran 4. Kromatogram baku kurkumin …………………………… 65

Lampiran 5. Contoh perhitungan konsentrasi baku kurkumin ………... 76

Lampiran 6. Perolehan AUC seri baku kurkumin …………………….. 77

Lampiran 7. Persamaan dan gambar kurva baku kurkumin …………... 78

Lampiran 8. Kromatogram baku kurkumin untuk validasi metode …… 79

Lampiran 9. Perolehan nilai AUC dan contoh perhitungan konsentrasi

terukur baku kurkumin …………………………………...

87

Lampiran 10. Contoh perhitungan persen perolehan kembali (recovery)

dan koefisien variasi (KV) baku kurkumin ………………

88

Lampiran 11. Kromatogram sampel dan sampel adisi …………………. 89

Lampiran 12. Perolehan nilai AUC sampel dan sampel adisi, contoh

perhitungan konsentrasi terukur, perhitungan recovery

dan KV baku kurkumin adisi …………………………….

94

Lampiran 13. Contoh perhitungan resolusi pemisahan kurkumin dalam

sampel ……………………………………………………

96

Lampiran 14. Kromatogram pelarut metanol pH 4 (blanko) ............... 97

xvii

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR MERK KIRANTI®

SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

INTISARI

Kurkumin merupakan senyawa alam yang banyak terkandung dalam obat tradisional. Kurkumin dapat ditetapkan kadarnya menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik. Untuk menjamin bahwa karakteristik kinerja metode yang digunakan memenuhi persyaratan aplikasi analitik, maka perlu dilakukan tahap validasi terlebih dahulu.

Penelitian yang dilakukan bersifat non eksperimental deskriptif. Kurkumin dianalisis secara kuantitatif menggunakan sistem KCKT fase terbalik dengan detektor visibel pada panjang gelombang 432 nm menggunakan fase diam oktadesilsilan (C18) dan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2 % (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Validitas metode yang digunakan ditunjukkan oleh parameter selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode memiliki selektivitas yang baik dengan nilai resolusi (Rs) 1,4383 dan linearitas yang baik dengan nilai koefisien korelasi (r) 0.9992 pada konsentrasi 1,515-4,545 ppm. Nilai recovery dan KV untuk baku kurkumin pada konsentrasi 1,515 ppm; 3,030 ppm, dan 4,545 ppm berturut-turut adalah 101,9208-107,5049% dan 2,3435%; 99,1947-101,9703% dan 1,1346% serta 92,3524-108,4202% dan 5,8678%, sedangkan untuk baku kurkumin yang diadisi dalam sampel adalah 102,9600-106,8267% dan 1,4504%. Berdasarkan hasil tersebut maka metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair Obat Herbal Terstandar merk Kiranti® secara KCKT fase terbalik memenuhi parameter validitas yang baik. Kata kunci: kurkumin, KCKT, validasi

xviii

VALIDATION OF CURCUMIN QUANTIFICATION METHOD IN LIQUID DOSAGE FORM OF STANDARDIZED HERBAL MEDICINE

KIRANTI® USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY REVERSE PHASE

ABSTRACT

Curcumin is a natural substance contained in many traditional medicines. Curcumin can quantify using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) reversed phase. To ensure that the performance characteristics of the methods used meet the requirements for analytic applications, it is necessary to advance the validation stage. Research conducted in non experimental descriptive. Curcumin was analyzed quantitatively using reverse phase HPLC system with visible detector at a wavelength of 432 nm using octadecylsylane stationary phase (C18) and a mobile phase of methanol: 2% glacial acetic acid (90:10 v / v) with flow rate 0.5 ml / minutes. The validity of the method used is indicated by the parameters selectivity, linearity, accuracy, and precision. The results showed that the method has good selectivity with the resolution (Rs) 1.4383 and a good linearity with correlation coefficient (r) of 0.9992 at a concentration of 1.515 to 4.545 ppm. Recovery value and CV for raw curcumin at the concentration 1.515 ppm, 3.030 ppm and 4.545 ppm respectively 101.9208-107.5049% and 2.3435%, 99.1947-101.9703% and 1.1346%, 92.3524-108.4202% and 5.8678%, while for the raw curcumin which added in the sample is from 102.9600-106.8267% and 1.4504%. Based on these results, the method of determination of curcumin in liquid dosage form of standardized herbal medicine Kiranti® using reverse phase HPLC has good validity. Keywords: curcumin, HPLC, validation

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Semakin banyak manusia yang memilih gaya hidup back to nature

berpengaruh terhadap meningkatnya minat konsumsi obat tradisional. Hal ini

mendorong dilakukannya pengembangan terhadap obat tradisional sehingga

penggunaannya dapat diterima dalam pengobatan formal di kalangan masyarakat.

Salah satu hasil pengembangan obat tradisional tersebut adalah obat herbal

terstandar (OHT) yang khasiat dan keamanannya telah terbukti secara ilmiah

melalui uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi.

Sebagian besar sediaan OHT yang beredar di pasaran banyak

mengandung kurkumin sebagai kandungan utamanya. Salah satunya adalah

sediaan cair OHT merk Kiranti® yang banyak dikonsumsi masyarakat dan sangat

dipercaya berkhasiat sebagai anti nyeri. Akan tetapi, dibalik khasiat yang dimiliki,

kurkumin bermasalah dalam stabilitasnya. Kurkumin akan terdegradasi pada pH

di atas 6,5 atau karena terpapar cahaya berlebih (Tonnesen dan Karlsen, 1985b).

Karena sifatnya yang tidak stabil tersebut, maka besar kemungkinan terjadinya

penurunan kandungan kurkumin selama proses distribusi dan penyimpanan

sehingga perlu dilakukan upaya penjaminan keseragaman kadar sediaan. Untuk

itu, diperlukan suatu metode analisis yang tepat.

Analisis kurkumin dapat dilakukan dengan menggunakan metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Metode KCKT dipilih karena

2

memiliki sensitivitas dan selektivitas yang lebih baik dibandingkan dengan

metode analisis yang lain. Hal ini ditandai oleh kemampuan daya pisah yang baik

dan kemampuan untuk mendeteksi analit dalam jumlah kecil.

Beberapa penelitian analisis kurkumin secara KCKT yang pernah

dilakukan antara lain menggunakan fase diam C18 serta fase gerak campuran

asetonitril dan asam trifluoro asetat dengan detektor visibel, fase diam C18 dengan

detektor UV, fase diam Nucleosil NH2 dengan detektor UV, serta fase diam

amino-bonded dengan detektor visibel. Hal yang membedakan penelitan ini

dengan beberapa penelitian sebelumnya terletak pada fase gerak yang digunakan.

Pada penelitian ini fase gerak yang digunakan merupakan campuran metanol dan

asam asetat glasial 2%. Metanol dan asam asetat glasial 2% dipilih karena

kurkumin memiliki kelarutan yang baik dalam keduanya sehingga dapat

mengelusi kurkumin dari kolom lebih cepat.

Pada penelitian ini dilakukan validasi terhadap sistem KCKT fase

terbalik hasil optimasi yang merupakan tahap kedua dalam rangkaian penelitian

penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti® secara KCKT

fase terbalik yang terdiri dari tahap optimasi, validasi, dan aplikasi. Berdasarkan

hasil optimasi diperoleh kondisi optimal sistem KCKT fase terbalik menggunakan

fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan

kecepatan alir 0,5 ml/menit yang selanjutnya dijadikan acuan dalam penelitian ini.

Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa karakteristik kinerja metode yang

dikembangkan telah memenuhi persyaratan aplikasi analitik. Jenis karakteristik

3

kinerja metode yang perlu dipertimbangkan dalam validasi meliputi selektivitas,

linearitas, akurasi, dan presisi (United States Pharmacopeial Convention, 2007).

1. Permasalahan

Berdasarkan uraian latar belakang tersebut, maka permasalahan yang

muncul adalah apakah metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT

merk Kiranti® secara KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase

gerak metanol : asam asetat glasial 2% dengan perbandingan 90:10 (v/v)

memenuhi parameter validitas yang baik, meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,

dan presisi?

2. Keaslian penelitian

Beberapa penelitian analisis kurkumin yang telah dilakukan

menggunakan metode kromatografi antara lain: KLT dengan detektor visibel

(Dwivedi, Raman, Seth, dan Sarin, 1992; Tonnesen dan Karlsen, 1986a; Martono,

1996), kromatografi elektrokinetik mikroemµlsi (Nhujak, Saisuwan, Srisaart, dan

Petsom., 2006), KCKT dengan kolom Nucleosil NH2 detektor UV-Vis dan

fluorometri (Tonnesen dan Karlsen, 1983), KCKT dengan kolom RP18 dan

Nucleosil NH2 detektor UV-Vis (Tonnesen dan Karlsen, 1985a), KCKT dengan

kolom RP18 dan Nucleosil NH2 detektor UV-Vis dan fluoresensi (Tonnesen,

1986), KCKT dengan kolom C18 detektor fluoresensi (Tonnesen dan Karlsen,

1986), KCKT dengan kolom Nucleosil NH2 detektor UV (Khurana dan Ho,

1988), KCKT dengan kolom C18 detektor visibel (Jayaprakasha, Rao, dan

4

Sakariah, 2002), KCKT dengan kolom ODS menggunakan detektor UV (Smith

dan Witowska, 1984), KCKT menggunakan kolom HiQ-Sil C18 (Rungphanichkul,

2004), KCKT menggunakan kolom C18 detektor UV (Heath, Pruitt, Brenner,

Begun, Frautschy, dan Roch, 2005), KCKT fase terbalik dengan detektor visibel

(Jadhav, Mahadik, dan Paradkar, 2007), KCKT dengan kolom amino-bonded

detektor visibel (Sumule, 2007), kromatografi high-speed countercurrent (Inoue,

Nomura, Ito, Nagatsu, Hino, dan Oka, 2008), Kromatografi Lapis Tipis Kinerja

Tinggi (KLTKT) dengan detektor visibel (Paramasivam, Aktar, Poi, Banerjee, dan

Bandyopadhyay, 2008). Akan tetapi sejauh pengamatan penulis, validasi metode

penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti® secara KCKT

fase terbalik dengan fase diam C18 dan fase gerak berupa campuran metanol dan

asam asetat glasial 2% belum pernah dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberi

sumbangan informasi ilmiah mengenai validasi metode kadar kurkumin dalam

sediaan obat cair OHT merk Kiranti® secara KCKT fase terbalik.

b. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

prosedur penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti®

dengan metode KCKT yang tervalidasi.

5

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode penetapan

kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti® secara KCKT fase

terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial

2% dengan perbandingan 90:10 (v/v).

6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kurkumin

Kurkumin merupakan senyawa α-β-diketon tak jenuh dengan beberapa

pusat elektrofilik (Martono, 1996). Kurkumin terdiri atas dua molekul asam

ferulat yang dihubungkan dengan jembatan metilen pada atom karbon dari gugus

karboksilnya (Gambar 1).

HO

H3CO OCH3

OH

O O

Gambar 1. Struktur kurkumin (Aggarwal dkk., 2006)

Kristal kurkumin berbentuk batang atau prisma dan berwarna kuning

jingga. Jumlah atom karbon pada kurkumin kurang dari 40 namun dapat

dikelompokkan dalam karotenoid (pigmen yang berstruktur tetraterpenoid dan

bersifat larut lemak) dengan memberikan warna kuning sampai merah. Karena

kekhasan dalam strukturnya, senyawa ini disebut berasal dari penguraian

karotenoid dan bukan terbentuk dari satuan yang lebih kecil (Robinson, 1995).

Kurkumin sukar larut dalam air, heksan, dan petroleum eter, agak larut

dalam benzena, kloroform, eter, namun larut dalam alkohol, aseton, dan asam

asetat glasial (Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1996). Secara

spektrofotometri, kurkumin memiliki serapan maksimum pada panjang

7

gelombang 430 nm dalam pelarut metanol dan pada 415 sampai 420 nm dalam

pelarut aseton. Kurkumin akan berfluoresensi pada panjang gelombang 524 nm

dalam pelarut asetonitril dan pada 549 nm dalam pelarut etanol (Aggarwal dkk.,

2006).

Stabilitas kurkumin dipengaruhi oleh pH dan cahaya. Kurkumin dalam

larutan air akan mengalami reaksi hidrolisis yang sangat tergantung pada pH

lingkungan. Pada larutan asam (pH rendah), kurkumin berwarna kuning,

sedangkan dalam suasana alkali kurkumin menghasilkan warna coklat kemerahan

yang pekat sampai kuning muda (Tonnesen dan Karlsen, 1995a). Kurkumin stabil

pada pH di bawah 6,5 dan akan terdegradasi pada pH di atas 6,5. Hal ini

disebabkan adanya gugus metilen aktif. Produk degradasi kurkumin dalam

suasana alkali (pH 7-10) akan menghasilkan asam ferulat dan feruloil metan

(Tonnesen dan Karlsen, 1995b).

HO

H3CO OCH3

OH

O O

kurkumin

O

HO

O

OH

asam ferulat

O

HO

Oferuloil metan

OH-OH-

HO

OO

vanillin

OH-

+O

aseton

Gambar 2. Reaksi degradasi kurkumin dalam suasana alkali (Tonnesen dan Karlsen, 1985a)

8

Kurkumin disintesis pertama kali oleh Lampe pada tahun 1913 (Majeed,

Badmaev, Shivakumar, dan Rajendran, 1995). Kurkumin dan turunannya dapat

disintesis dari vanillin atau turunan benzaldehid dan asetil aseton (Hakim, 2002).

Isolasi kurkumin pertama kali dilakukan pada tahun 1815. Pada tahun 1910,

Daube berhasil memperoleh bentuk kristalnya. Walaupun demikian, potensi

kurkumin dalam bidang kesehatan baru diteliti pada era tahun 1970 dan 1980

(Majeed dkk., 1995).

Aktivitas kurkumin antara lain sebagai antiinflamsi, analgesik,

antipiretik, antimikroba, antimutagenik, antioksidan, dan antikanker (Jankun dkk.,

2003; Jayaprakasha dkk., 2002). Kurkumin juga memiliki efek hepatoprotektif,

neuroprotektif, hipoglikemik, dan antireumatik (Anand, Kunnumakkara, Newman,

dan Anggarwal, 2007). Kurkumin juga poten menghambat aktivitas

siklooksigenase dan lipoksigenase serta memiliki efek inhibitor kuat pada DNA

dan RNA terhadap karsinogenesis dan pertumbuhan tumor dengan menghambat

sintesis DNA pada beberapa jenis sel kanker (Huang dkk., 1997).

Kurkumin dapat diperoleh dari ekstrak tanaman dari famili Zingiberaceae

khususnya Curcuma seperti Curcuma longa, Curcuma aromatica, Curcuma

amada, Curcuma zedoaria, Curcuma caesia, Curcuma aerugiosa, Curcuma

angustifolia, Curcuma leucorrhiza, Curcuma pierreana, Curcuma domestica,

Curcuma mangga dan Curcuma xanthorrhiza. Kurkumin dari alam ditemukan

dalam bentuk kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin (~77%),

demetoksikurkumin (17%), dan bis-demetoksikurkumin (~3%) (Aggarwal dkk.,

2006). Kandungan senyawa bioaktif tersebut sangat dipengaruhi oleh jenis serta

9

kondisi tempat tumbuh tanaman tersebut. Sebagai contoh, kandungan kurkumin di

dalam tanaman Curcuma zedoaria berkisar 0,5-0,73% sedangkan kandungan

kurkumin di dalam tanaman Curcuma xanthorrhiza ROXB berkisar 1,6-2,2%

(Zahro, Cahyono, dan Hastuti, 2009).

Analisis kurkumin dapat dilakukan dengan KCKT fase normal maupun

terbalik (Tonnesen dan Karlsen, 1983), namun karena sifat kurkumin yang sangat

labil maka KCKT fase terbalik dengan kolom C18 lebih disukai dalam analisis

(Khurana dan Ho, 1988). Pelarut yang sering digunakan dalam KCKT fase

terbalik dalam analisis kurkumin adalah metanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran

(Smith dan Witowska, 1984).

B. Obat Herbal Terstandar (OHT)

Berdasarkan Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan

Republik Indonesia Nomor: HK.00.05.41.1384 tahun 2005, obat herbal terstandar

adalah sediaan obat bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya

secara ilmiah dengan uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi (Badan

Pengawas Obat dan Makanan RI, 2005a). OHT harus memenuhi kriteria yang

ditetapkan dalam Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan

Republik Indonesia Nomor: HK.00.05.4.2411, yaitu aman sesuai dengan

persyaratan yang ditetapkan, klaim khasiatnya dibuktikan secara ilmiah melalui

uji praklinik, menggunakan bahan baku yang telah distandarisasi, serta memenuhi

persyaratan mutu yang berlaku, dengan jenis klaim penggunaan sesuai dengan

tingkat pembuktian yaitu tingkat pembuktian umum dan medium.

10

Bahan baku sediaan OHT dapat berupa simplisia maupun ekstrak dari

simplisia nabati maupun hewani. Mutu simplisia dan ekstrak yang digunakan

sangat berpengaruh terhadap kualitas produk OHT yang dihasilkan. Untuk itu

maka perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi adalah serangkaian parameter,

prosedur, dan cara pengukuran yang hasilnya berupa paradigma mutu sesuai

standar dan jaminan stabilitas produk. Simplisia dan ekstrak yang telah

distandarisasi memiliki kadar senyawa aktif yang ajeg serta memenuhi parameter

standarisasi yang diperbolehkan (Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2005b).

Gambar 3. Logo OHT (Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2004)

C. Sediaan Cair

Sediaan cair obat tradisional yang dimaksudkan untuk penggunaan

peroral disebut sebagai cairan obat dalam, dapat berupa emulsi atau suspensi

dalam air yang bahan bakunya berasal dari serbuk simplisia atau sediaan galenik

(Kementerian Kesehatan RI, 1994). Emulsi adalah sistem dua fase, dimana salah

satu fase terdispersi dalam fase yang lain, dan terbentuk dalam bentuk tetesan

kecil, sedangkan suspensi adalah sediaan cair yang mengandung partikel padat

tidak larut yang terdispersi dalam fase cair (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat

dan Makanan RI, 1995).

11

D. Spektrofotometri Visibel

Spektrofotometri visibel merupakan teknik analisis spektroskopik

menggunakan sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak dalam rentang

panjang gelombang 380-780 nm. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas

interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan atom atau molekul. Interaksi

tersebut menyebabkan terjadinya absorpsi, yaitu perpindahan energi dari sinar

radiasi ke molekul. Akibat absorpsi radiasi elektromagnetik oleh molekul tersebut

maka terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai

orbital elektron antibonding (Mulja dan Suharman, 1995). Hasil interaksi antara

radiasi elektromagnetik dengan atom atau molekul dapat digambarkan oleh suatu

grafik yang menghubungkan banyaknya radiasi elektromagnetik yang diserap

dengan panjang gelombangnya, yang disebut dengan spektrum absorpsi (Rohman,

2007).

Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin terjadi yaitu σ→σ*,

n→σ*, n→π*, dan π→π*. Eksitasi elektron (σ→σ*) memberikan energi yang

terbesar dan terjadi pada daerah ultraviolet jauh yang diberikan oleh ikatan

tunggal, misalnya alkana. Eksitasi elektron (π→π*) diberikan oleh ikatan rangkap

dua dan tiga, juga terjadi pada daerah ultraviolet jauh. Eksitasi elektron (n→σ*)

terjadi juga pada gugus karbonil (dimetil keton dan asetaldehid) yang terjadi pada

daerah ultraviolet jauh (Mulja dan Suharman, 1995).

12

Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik (Mulja dan Suharman, 1995)

Transisi elektronik yang berguna dalam penelitian adalah transisi n→π*

dan π→π* karena memberikan spektra pada 200-700 nm. Kedua transisi ini

membutuhkan adanya kromofor dan auksokrom dalam struktur molekulnya.

Kromofor adalah suatu gugus fungsional tidak jenuh yang menyediakan orbital π

yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet. Molekul yang mengandung

kromofor disebut kromogen. Sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang

bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan

maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor.

Gugus auksokrom paling sedikit memiliki sepasang elektron bebas yang dapat

berinteraksi dengan elektron π, misalnya -OH, -NH2 (Christian, 2004;

Sastrohamidjojo, 2002).

Instrumen yang digunakan disebut spektrofotometer. Spektrofotometer

adalah suatu instrumen yang akan memisahkan radiasi polikromatis menjadi

beberapa panjang gelombang yang berbeda. Instrumentasi dari spektrofotometer

meliputi sumber radiasi kontinyu pada λ tertentu, monokromator untuk

mendapatkan berkas sempit dari sumber spektrum, sel sampel, detektor, dan

recorder (Christian, 2004).

13

Gambar 5. Diagram alir instrumentasi spektrofotometer visibel

Spektrofotometer visibel dapat digunakan untuk analisis kualitatif

maupun kuantitatif. Dalam analisis kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan

pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur

besarnya. Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan

intensitas sinar yang diteruskan bila spesies penyerap tidak ada dengan intensitas

sinar yang diteruskan bila spesies penyerap ada. Intensitas sinar yang diteruskan

bila tidak ada spesies penyerap merupakan intensitas sinar yang masuk dikurangi

dengan yang hilang karena penghamburan, pemantulan, dan serapan konstituen

lain (Sastrohamidjojo, 2002).

Analisis kuantitatif selalu melibatkan pembacaan serapan radiasi

elektromagnetik oleh molekul yang dikenal dengan absorban (A) tanpa satuan

atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan yang dikenal dengan transmitan

dengan satuan persen (% T). Bouger, Lambert, dan Beer membuat formula secara

matematik hubungan antara transmitan atau absorban terhadap intensitas radiasi

atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan, sebagai berikut:

(1)

(2)

T= It

Io=10�ε.C.b

A= 1

T= ε.C.b

14

Dimana:

T = persen transmitan

I0 = intensitas radiasi yang datang

It = intensitas radiasi yang diteruskan

ε = daya serap molar (L mol-1 cm-1)

C = konsentrasi (mol L-1)

b = tebal larutan (cm)

A = serapan/absorbans

(Mulja dan Suharman, 1995).

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Definisi

Kromatografi adalah prosedur pemisahan senyawa berdasarkan

perbedaan kecepatan migrasi karena adanya perbedaan koefisien distribusi

masing-masing senyawa di antara dua fase yang saling bersinggungan dan tidak

saling campur, yang disebut sebagai fase gerak (mobile phase) yang berupa zat

cair atau gas dan fase diam (stationary phase) yang berupa zat cair atau zat padat

(Noegrohati, 1994). Pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase

geraknya dialirkan menuju kolom secara cepat dengan bantuan tekanan dari

pompa, kemudian hasilnya dideteksi dengan detektor (Hendayana, 2006). KCKT

merupakan teknik analisis yang paling sering digunakan dalam analisis farmasi

untuk pemisahan, identifikasi, dan determinasi dalam campuran yang kompleks

(Skoog, Holler, dan Nieman, 1998).

Pada mulanya teknik kromatografi ini disebut dengan High Pressure

Liquid Chromatography karena pada instrumen ini terdapat sistem pompa tekanan

tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak pada tekanan tinggi sampai 300

15

atmosfer dan tekanan pada bagian atas kolom kurang dari 70 atmosfer (Direktorat

Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Pada akhir tahun 1970,

perkembangan instrumen ini dapat menghasilkjan poemisahan yang baik sehingga

sistem ini lebih dikenal dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Kromidas,

2000).

KCKT merupakan kromatografi partisi. Prinsip kromatografi partisi

didasarkan pada partisi solut di antara dua fase yang tidak saling campur karena

adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing senyawa. Jika solut

ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut tidak saling campur

dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, maka solut akan tersebar di antara

dua fase menurut persamaan:

(3)

Dimana K adalah koefisien distribusi, Cs adalah konsentrasi solut dalam

fase diam dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fase gerak (Johnson dan

Stevenson, 1978).

Kolom yang biasa digunakan dalam kromatografi partisi fase terbalik

adalah kolom yang fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga sehingga

tidak mudah terbawa oleh fase gerak. Penyangga yang digunakan biasanya terbuat

dari silika yang sudah diseragamkan, berpori, dan umunya terdiri dari partikel

berdiameter 3,5 atau 10 µm (Skoog dkk., 1998).

KCKT partisi fase terbalik biasanya mengandung bagian organik yang

terikat secara kimia dengan gugus silanol pada permukaan silika. Bagian organik

K= Cs

Cm

16

tersebut umumnya berupa hidrokarbon rantai panjang. Gugus silanol permukaan

dapat direkasikan dengan berbagai cara untuk menempelkan berbagai jenis gugus

organik. Kemasan fase terikat dengan tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-O) dibuat

dengan mereaksikan organosiloksan dengan gugus silanol pada permukaan silika

gel yang terhidrolisis (Gambar 6).

Si OH + Cl Si(CH3)2R Si O Si(CH3)2R + HCl

Gambar 6. Reaksi silanisasi (Harris, 1999)

Reaksi tersebut (Gambar 7) digunakan untuk membuat isian kolom

oktadesilsilan dari gugus silanol dan oktadesilklorosilan sepertipada Gambar 7.

Si OH + Cl Si Si O Si + HCl(CH2)17CH3 (CH2)17CH3

Gambar 7. Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan

Pada kromatografi parisi fase terbalik dengan kemasan fase terikat, R

pada siloksan biasanya berupa gugus C18 atau C8. Panjang atau pendeknya rantai

karbon mempengaruhi tertambatnya suatu senyawa pada fase diam (Skoog dkk.,

1998).

2. Instrumentasi

Peralatan KCKT terdiri dari beberapa komponen seperti yang dapat

dilihat pada gambar di bawah ini:

17

Gambar 8. Skema instrumen KCKT

Menurut Gritter, Bobbit, dan Schwarting (1991) sistem KCKT terdiri dari

tiga variabel utama yang harus diperhatikan, yaitu fase diam, fase gerak, dan

detektor.

a. Fase diam. Fase diam dalam KCKT berupa kolom yang merupakan

bagian sangat penting dalam pemisahan komponen-komponen sampel.

Keberhasilan pemisahan komponen sampel bergantung pada keadaan kolom

(Mulja dan Suharman, 1995). Kolom dapat berupa gelas atau baja anti karat yang

dapat diisi dengan silika gel, alumina, dan elit. Panjang kolom bervariasi antara

15-150 cm (Khopkar, 1990).

Pada penggunaan fase diam silika terikat, analit polar yang bersifat basa

atau memiliki gugus amin akan memberikan puncak yang mengekor (tailing peak)

karena ada interaksi adsorpsi antara gugus amin pada analit dengan residual

silanol dan pengotor logam pada kolom. Untuk mengatasi hal tersebut digunakan

silika dengan kemurnian tinggi (kandungan logam < 1 ppm) dan dilakukan end-

18

capping, yaitu suatu proses penutupan residual silanol dengan gugus trimetilsilil

(Rohman dan Gandjar, 2007).

b. Fase gerak. Kemampuan KCKT untuk memisahkan senyawa

tergantung pada fase gerak yang digunakan, terutama dalam hal tambatan dan

pemisahan senyawa (Munson, 1984). Fase gerak dapat berupa pelarut tunggal atau

pelarut campuran. Pengembangan KCKT menggunakan pelarut campuran yang

susunannya terus menerus berubah, biasanya terdiri dari dua atau tiga pelarut

disebut elusi gradien (Gritter dkk., 1991). Fase gerak untuk analisis secara KCKT

harus murni, tanpa cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan, dapat melarutkan

cuplikan (solute), viskositas rendah, memungkinkan memperoleh kembali

cuplikan dengan mudah, dan harganya wajar (Johnson dan Stevenson, 1978).

Menurut Gritter dkk. (1985), fase gerak untuk KCKT harus bebas dari gas terlarut

karena adanya gas dapat mempengaruhi respon detektor sehingga menghasilkan

sinyal palsu dan mempengaruhi kolom.

Pada pemilihan fase gerak yang terpenting adalah kepolaran pelarut yang

digunakan. Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut untuk

mengelusi suatu senyawa. Kandungan utama fase gerak pada kromatografi fase

terbalik adalah air. Kecenderungan air untuk melarutkan sampel dapat diubah

dengan menambahkan garam untuk menimbulkan pengaruh penggaraman, asam,

dan basa; dapar untuk melarutkan atau mengendapkan asam atau basa; pereaksi

pengompleks untuk menimbulkan jenis pengaruh pelarutan yang khas untuk

gugus fungsi tertentu atau golongan senyawa tertentu, atau pelarut organik yang

19

dapat bercampur dengan air. Pemodifikasi organik yang banyak digunakan adalah

metanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran (Gritter dkk., 1985; Munson, 1984).

Kepolaran dinyatakan dalam indeks polaritas (P’) yang dapat dihitung

dengan persamaan berikut ini:

(4)

Dengan Φa dan Φb adalah fraksi pelarut a dan b dalam campuran,

sedangkan P’a dan P’b adalah angka P’ pelarut murni (Grtitter dkk., 1991).

Berikut ini adalah nilai indeks polaritas (P’) dari beberapa pelarut :

Tabel I. Nilai indeks polaritas beberapa pelarut pada KCKT fase terbalik (Snyder, Kirkland, dan Glajch, 1997)

Pelarut Indeks Polaritas

Eluotropic Value UV Cut off (nm) Alumina ODS Silika

Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195 Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200 Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284 Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212 Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256 Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330 Metanol 5,1 0,95 1,0 0,70 205 Asetonotril 5,8 0,65 3,1 0,52 190 Dimetilformamid 6,4 - 7,6 - 268 Dimetilsulfoksid 7,2 0,62 - - 268 Air 10,2 - - - 190

Tabel I tersebut menunjukkan bahwa semakin besar eluotropic values

dari pelarut menunjukkan semakin mudah untuk mengelusi sampel. Semakin

besar indeks polaritas yang dimiliki pelarut, maka semakin polar pelarut yang

digunakan (Snyder dkk., 1997).

P’ = Φa P’a + Φb P’b

20

c. Detektor. Menurut John dan Stevenson (1978), detektor diperlukan

untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan yang terdapat dalam kolom serta

untuk mengukur jumlah komponen yang ada dalam cuplikan. Detektor yang baik

adalah detektor yang memenuhi persyaratan sensitivitas yang tinggi dengan

rentang sensitivitas 10-8 -10-15 gram solut per detik, kestabilan dan reprodusibilitas

yang sangat baik, respon yang linear terhadap konsentrasi solut, dapat bekerja dari

temperatur kamar sampai 400oC, tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan

kecepatan pelarut pengembang, mudah didapat, mudah dipakai operator, selektif

terhadap macam-macam linarut dalam pelarut pengembang dan tidak merusak

sampel (Mulja dan Suharman, 1995).

Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu:

1. Bulk property detector

Jenis detektor ini mengukur sifat solut dan fase gerak. Contohnya adalah

detektor indeks bias. Kelemahan detektor ini adalah kurang sensitif dan tidak

cocok untuk kondisi elusi landaian (Munson, 1991).

2. Solute property detector

Detektor ini merupakan detektor yang selektif mengukur sifat solut dan lebih

sensitif dibandingkan bulk property detector. Contohnya adalah detektor UV-

Vis dan detektor fluoresensi (Settle, 1997).

3. Pemisahan puncak dalam kromatografi

Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom

dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan

21

kolom dalam memisahkan senyawa dan menghasilkan puncak yang sempit

(Johnson dan Stevenson, 1978). Ukuran pemisahan dari dua puncak adalah nilai

resolusi yang dapt diukur dengan persamaan:

(5)

Keterangan:

tR1 dan tR2 = waktu retensi senyawa diukur pada titik maksimum puncak

Δt = selisih waktu antara tR2 dan tR1

W1 dan W2 = lebar alas puncak

Pemisahan dua puncak berari pemisahan dua senyawa, dapat

digambarkan sebagai berikut:

Gambar 9. Pemisahan dua puncak (Jasco International, 2004).

Harga Rs > 1,5 disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna

dari dua puncak dengan ukuran yang sama. Dalam prakteknya, pemisahan dengan

harga Rs = 1,0 dianggap memadai (Pescok, Shields, dan Cains, 1976).

Resolusi (Rs) = (tR2 − tR1)

12� (W1 − W2)

22

4. Pengembangan metode KCKT

Pengembangan metode KCKT diharapkan menghasilkan suatu metode

analisis yang memiliki waktu analisis singkat untuk analisis secara rutin,

menghasilkan puncak yang sempit untuk rasio signal to noise yang besar, dan

meminimalkan penggunaan fase gerak. Oleh karena itu validasi metode analisis

setelah pengembangan metode merupakan tahap terpenting.

Namun sebelum masuk pada tahap validasi, tahap yang juga sangat

penting adalah menentukan kesesuaian sistem KCKT, antara lain verifikasi

pompa, sistem injeksi, dan detektor. Ini sangat penting dilakukan untuk

meyakinkan bahwa sistem KCKT telah layak digunakan dalam validasi dan

penetapan kadar suatu senyawa (Miller dan Miller, 1988). Berikut ini adalah

langkah-langkah umum dalam pengembangan metode analisis menggunakan

KCKT:

Gambar 10. Langkah pengembangan metode KCKT (Snyder dkk., 1997)

23

F. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah proses yang dibangun melalui studi

laboratorium untuk meyakinkan bahwa performa karakteristik suatu metode

memenuhi persyaratan untuk aplikasi analisis (United States Pharmacopeial

Convention, 2007). Dengan kata lain, validasi metode analisis merupakan

penilaian terhadap parameter analisis tertentu. Parameter analisis tersebut adalah

ketepatan (akurasi), ketelitian (presisi), selektivitas, limit deteksi, limit kuantitasi,

linearitas, dan rentang (United States Pharmacopeial Convention, 2007).

Tujuan utama validasi metode adalah untuk menjamin bahwa metode

analisis yang dikembangkan dapat memberikan hasil pengukuran yang cermat dan

sesuai dengan tujuan yang diharapkan. Validasi metode perlu dilakukan karena

adanya kesalahan pada analisis seperti kesalahan sistematik dan kesalahan acak.

Metode pengujian yang berbeda membutuhkan validasi yang berbeda

pula. Terdapat 4 kategori metode pengujian dengan parameter validasi metode

analisis berbeda (Tabel II dan III).

Tabel II. Kategori metode pengujian (United States Pharmacopeial Convention, 2007)

Kategori Keterangan I

Metode untuk penetapan kadar komponen utama bahan baku atau bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk jadi sediaan farmasi

II

Metode analisis untuk penetapan ketidakmurnian bahan baku atau hasil degradasi dalam produk jadi sediaan farmasi

III Metode analisis untuk penetapan karakteristik performa (seperti disolusi, pelepasan obat).

IV Uji identifikasi

24

Tabel III. Parameter analisis yang dibutuhkan dalam validasi metode analisis (United States Pharmacopeial Convention, 2007)

Karakteristik Analisis

Kategori I

Kategori II

Kategori III

Kategori IV

Akurasi Y Y * * T Presisi Y Y T Y T Selektivitas Y Y Y * Y Batas deteksi T T Y * T Batas kuantitasi T Y T * T Linearitas Y Y T * T Rentang Y Y * * T

1. Selektivitas

Selektivitas suatu metode analisis adalah kemampuan untuk mengukur

analit secara cermat dan seksama dengan adanya komponen yang mungkin ada

dalam sampel. Selektivitas sering dinyatakan sebagai derajat bias dari hasil yang

diperoleh dengan membandingkannya terhadap impurities, produk degradasi, atau

senyawa kimia yang mirip. Bias dapat dinyatakan sebagai perbedaan antara hasil

uji antara 2 kelompok sampel. Selektivitas juga merupakan ukuran derajat

interferensi dalam analisis campuran sampel yang kompleks. Selektivitas

ditentukan dengan menginjeksikan sampel pada sistem kromatografi. Puncak yang

muncul tidak boleh terpengaruh oleh puncak lain yang dibuktikan dengan

perhitungan resolusi (Yuwono dan Indrayanto, 2005).

Selektivitas metode analisis dapat ditentukan oleh kemampuan senyawa

utama dalam menunjukkan pemisahan puncak dengan senyawa lain dari

kromatogram dan kemudian ditentukan nilai resolusinya (Rs). Harga Rs > 1,5

disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna dari dua puncak dengan

ukuran yang sama. Namun dalam prakteknya, pemisahan dengan harga Rs = 1,0

25

(kedua puncak berhimpit lebih kurang 2%) dianggap memadai (Pescok dkk.,

1976).

2. Linearitas dan rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis untuk menunjukkan hasil

uji yang secara langsung atau dengan persamaan matematis proporsional terhadap

konsentrasi analit dalam sampel pada rentang tertentu. Linearitas dapat ditentukan

dengan pengukuran pada beberapa konsentrasi analit. Hasil slope (b), intersep (a)

dan koefisien korelasi (r) menggambarkan informasi linearitas. Sebagai parameter

adanya hubungan linear digunakan koefisien korelasi (r) pada analisis regresi

linear y = bx + a. Hubungan linear yang ideal dicapai apabila nilai a = 0 dan r =

+1 atau –1 tergantung pada arah garis. Nilai a menunjukkan kepekaan analisis

terutama instrumen yang digunakan (Harmita, 2004). Nilai koefisien korelasi

0,999 diterima untuk sebagian besar metode khususnya komponen dalam jumlah

besar pada metode pengujian. Jika koefisien korelasi memiliki nilai kurang dari

0,999 maka perlu dilakukan perhitungan terhadap parameter lain yaitu Vxo ≤ 5 %

(Yuwono dan Indrayanto, 2005).

Rentang adalah jarak antara kadar terendah dan tertinggi analit yang

sudah ditunjukkan dapat diterapkan dengan ketepatan, ketelitian dan linearitas

yang dapat diterima. Rentang dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil

yang diperoleh dengan metode analisis (Harmita, 2004).

26

3. Ketepatan (accuracy)

Ketepatan adalah ukuran kedekatan antara hasil analisis dan kadar analit

yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali

(recovery). Ketepatan hasil analisis sangat tergantung pada sebaran galat

sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu, untuk mencapai

ketepatan yang tinggi dapat dilakukan dengan mengurangi galat sistematik

tersebut seperti menggunakan peralatan yang terkalibrasi, menggunakan pereaksi

dan pelarut yang dapat melarutkan senyawa dengan sempurna, pengontrolan suhu,

pelaksanaan yang cermat dan taat asas serta sesuai prosedur (Harmita, 2004).

Kesulitan utama yang dihadapi pada evaluasi ketepatan suatu metode

analisis adalah fakta bahwa nilai sebenarnya kadar analit biasanya tidak diketahui.

Secara internasional, dikenal tiga macam cara yang umum digunakan untuk

mengevaluasi ketepatan metode analisis kimia, yaitu dengan menggunakan bahan

rujukan baku (Standard Reference Material / SRM), menggunakan baku sebagai

pembanding (standard method), dan recovery dengan menempatkan analit plasebo

(spiked placebo recovery) (Snyder dkk., 1997).

SRM digunakan untuk mengevaluasi ketepatan suatu metode dengan

kesepakatan bahwa komposisi yang direkomendasikan oleh badan pembuat

dianggap sebagai nilai sebenarnya. Dalam metode penggunaan baku sebagai

pembanding, dilakukan pengujian secara paralel atas sampel menggunakan

metode analisis yang sedang dievaluasi dan metode analisis lain yang telah diakui

secara internasional sebagai metode baku. Jika dalam analisis tidak terdapat

kesalahan sistematik maka pengujian menggunakan metode baku dianggap

27

memiliki ketepatan yang tinggi sehingga menghasilkan data yang dapat dianggap

sebagai hasil yang sebenarnya. Metode spiked placebo recovery dilakukan dengan

menganalisis sampel suatu obyek yang diperkaya dengan sejumlah analit baku

yang telah ditetapkan. Berat total analit yang diperoleh dari analisis sampel yang

diperkaya dikurangi dengan berat analit dalam sampel yang tidak diperkaya,

dibandingkan terhadap jumlah analit baku yang ditambahkan (Snyder dkk., 1997).

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit

yang ditambahkan (Harmita, 2004). Persen perolehan kembali yang dapat diterima

bergantung pada matriks analit, prosedur pengolahan analit dan konsentrasi analit

(Anonim, 2004). Berikut ini adalah rentang recovery yang masih dapat diterima:

Tabel IV. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima (United States Pharmacopeial Convention, 2007)

Konsentrasi analit (%)

Unit Akurasi (recovery, %)

100 100 % 98-102 ≥ 10 10 % 98-102 ≥ 1 1 % 97-103

≥ 0,1 0,1 % 95-105 0,01 100 ppm 90-107

0,001 10 ppm 80-110 0,0001 1 ppm 80-110

0,00001 100 ppb 80-110 0,000001 10 ppb 60-115

0,0000001 1 ppb 40-120

4. Ketelitian (precision)

Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan kesesuaian antara hasil uji

individual diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang

28

homogen (Snyder dkk., 1997). Ketelitian diukur sebagai simpangan baku atau

simpangan baku relatif/koefisien variasi (Harmita, 2004).

Pengertian presisi suatu metode dapat dikelompokkan menjadi tiga, yaitu

keterulangan (repeatability), intermediet presisi, dan ketertiruan (reproducibility).

Keterulangan adalah ketelitian metode analisis dalam kondisi operasi yang sama

pada laboratorium yang sama pada interval waktu yang singkat dengan analis dan

peralatan yang berbeda. Keterulangan terbagi lagi dalam dua aspek yaitu presisi

instrumental dan intra-assay precision. Keterulangan dinilai melalui penetapan

terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik dari batch yang sama.

Keterulangan memberikan ukuran ketelitian pada kondisi normal (Harmita, 2004).

Intermediet presisi adalah keseuaian pengukuran ketika metode analisis yang

sama diaplikasikan beberapa kali pada hari, instrumen atau analis yang berbeda

pada laboratorium yang sama (Snyder dkk., 1997). Ketertiruan adalah ketelitian

metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda (Harmita, 2004).

Suatu metode akan memenuhi persyaratan presisi apabila memberikan

koefisien variasi (KV) < 2 %, namun persyaratan ini tergantung pada konsentrasi

analit. KV meningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. Karena presisi suatu

metode merupakan fungsi penetapan konsentrasi pada rentang yang dapat

diterima, maka pada analisis menggunakan KCKT digunakan ketentuan seperti

pada tabel V.

29

Tabel V. Kriteria akurasi dan presisi yang masih dapat diterima (United States Pharmacopeial Convention, 2007)

Konsentrasi analit (%)

Unit Presisi (KV, %)

100 100 % 1,3 ≥ 10 10 % 2,7 ≥ 1 1 % 2,8

≥ 0,1 0,1 % 3,7 0,01 100 ppm 5,3

0,001 10 ppm 7,3 0,0001 1 ppm 11

0,00001 100 ppb 15 0,000001 10 ppb 21

0,0000001 1 ppb 30

G. Landasan Teori

Kurkumin merupakan senyawa alam berwarna kuning atau kuning jingga

yang banyak ditemukan dalam obat tradisional. Kurkumin terdiri atas dua molekul

asam ferulat yang dihubungkan dengan jembatan metilen pada atom karbon dari

gugus karboksilnya. Kurkumin stabil pada pH di bawah 6,5 dan akan terdegradasi

pada pH di atas 6,5.

Kurkumin dapat dianalisis dengan menggunakan metode KCKT dengan

tingkat selektivitas dan sensitivitas yang tinggi. Salah satu sistem KCKT yang

dapat digunakan untuk menganalisis kurkumin adalah sistem KCKT fase terbalik

menggunakan detektor visibel. Kurkumin memiliki gugus kromofor yang dapat

menyerap gelombang elektromagnetik yang melaluinya sehingga dapat ditentukan

kadarnya menggunakan detektor visibel. Fase gerak yang digunakan adalah

campuran metanol dan asam asetat glasial 2 % karena kurkumin memiliki

kelarutan yang baik di dalamnya.

30

Keberhasilan analisis menggunakan metode KCKT sangat tergantung

pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang optimum. Kondisi optimum

tersebut diperoleh dari hasil optimasi. Sistem KCKT yang telah dioptimasi

selanjutnya divalidasi. Validasi dilakukan untuk meyakinkan bahwa metode yang

digunakan telah memenuhi persyaratan aplikasi analisis. Validasi suatu metode

analisis ditentukan oleh parameter validasi yang meliputi akurasi, presisi,

linearitas, sensitivitas, dan selektivitas. Selektivitas ditentukan dari nilai resolusi,

linearitas dinyatakan dengan nilai koefisien korelasi, akurasi dinyatakan sebagai

persen perolehan kembali, dan presisi dinyatakan dengan koefisien variasi.

H. Hipotesis

Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk

Kiranti® secara KCKT fase terbalik pada kondisi optimum hasil optimasi

memenuhi parameter validitas yang baik, meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,

dan presisi.

31

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan mengikuti jenis penelitian non eksperimental

dengan rancangan penelitian deskriptif, sebab pada penelitian ini tidak dilakukan

manipulasi pada subjek uji dan hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah sistem KCKT yang telah

dioptimasi.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter-parameter validasi

yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi.

3. Variabel pengacau terkendali

a. Pelarut yang digunakan, berupa pelarut pro analysis yang memiliki tingkat

kemurnian tinggi.

b. pH larutan dengan melakukan pengaturan pH terhadap larutan baku

kurkumin, yaitu pada pH 4.

32

C. Definisi Operasional

1. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan terdiri atas fase diam berupa

kolom oktadesilsilan (C18) serta fase gerak berupa campuran metanol p.a dan

asam asetat glasial p.a 2 % (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit.

2. Kadar kurkumin dinyatakan dalam satuan part per million (ppm).

3. Parameter validasi yang digunakan pada penelitian ini meliputi selektivitas,

linearitas, akurasi, dan presisi.

D. Bahan-bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah baku kurkumin hasil sintesis Prof. Dr.

Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah dikonfirmasi strukturnya dengan metode

spektroskopi 1H-NMR dan Mass Spectra dengan titik lebur 181,2-182,4o-C,

metanol p.a EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), asam asetat glasial

p.a EMPARTA® ACS (E. Merck), aquabidestilata dan OHT merk Kiranti®.

E. Alat-alat Penelitian

Alat yang digunakan adalah organic solvent membrane filter (Whatman)

ukuran pori 0,45μm; diameter 47mm, indikator pH, penyaring Millipore,

mikropipet Socorex, neraca kasar, neraca analitik (Ohaus PAJ1003),

ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 Ey), vaccum (Gaast model

DOA-P104-BN), magnetic stirrer, seperangkat alat spektrofotometri UV-VIS

merk Milton Ray Spectronic 3000 Array yang dihubungkan dengan printer merk

Epson LQ-1170, sistem KCKT (gradien, model LC-2010C HT, CAT No. 228-

33

46703-38, SERIAL No. C21254706757 LP, Shimadzu Corporaion), kolom

oktadesilsilan (C18) berukuran 250 x 4,6 mm merk KNAUER No. 25EE181KSJ

(B115Y620), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant System

RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000

625 730), dan alat-alat gelas yang umum digunakan dalam analisis (Pyrex).

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan fase gerak KCKT

Fase gerak yang digunakan terdiri dari asam asetat glasial p.a 2% dan

metanol p.a Masing-masing komponen fase gerak disaring melalui organic

solvent membrane filter (Whatman) berukuran pori 0,45 μm; diameter 47 mm

dengan bantuan pompa vakum, selanjutnya diawaudarakan dengan ultrasonikator

selama 15 menit. Pencampuran kedua komponen fase gerak dilakukan di dalam

instrument KCKT dengan perbandingan metanol : asam asetat glasial 2% sebesar

90:10 v/v.

2. Pembuatan pelarut metanol pH 4

Pelarut yang digunakan berupa metanol yang diatur pada pH 4.

Pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan asam asetat glasial 2% sebanyak

1 bagian ke dalam 9 bagian metanol.

34

3. Pembuatan larutan baku kurkumin

a. Pembuatan larutan stok kurkumin. Ditimbang lebih kurang seksama

10,0 mg baku kurkumin dilarutkan dengan metanol pH 4 dalam labu takar 10,0 ml

hingga tanda sehingga diperoleh konsentrasi 1000 ppm.

b. Pembuatan larutan intermediet kurkumin. Larutan stok kurkumin

diambil sebanyak 1,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 dalam labu takar

10,0 ml hingga tanda sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 100 ppm.

c. Pembuatan seri larutan baku kurkumin. Dibuat seri larutan baku

kurkumin dengan konsentrasi 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 dan 4,5 ppm dengan

mengambil 150; 200; 250; 300; 350; 400 dan 450 µl larutan intermediet

kurkumin, masukkan dalam labu takar 10,0 ml dan tambahkan metanol pH 4

hingga tanda. Larutan kemudian disaring dengan Millipore dan diawaudarakan

dengan ultrasonikator selama 15 menit.

4. Penentuan panjang gelombang (λ) maksimum kurkumin

Sebanyak 40; 100 dan 160 µl larutan intermediet kurkumin diencerkan

dengan metanol p.a pH 4 dalam labu takar 10,0 ml sampai tanda sehingga

diperoleh konsentrasi 0,4; 1,0 dan 1,6 ppm. Dari kadar baku kurkumin tersebut

dilakukan pengukuran absorbansi pada rentang panjang gelombang 300-500 nm

menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Kemudian dari spektrum yang

dihasilkan tersebut ditentukan panjang gelombang maksimumnya. Nilai panjang

gelombang maksimum yang diperoleh selanjutnya digunakan sebagai panjang

gelombang deteksi pada sistem KCKT.

35

5. Preparasi sampel

Sebanyak 1,0 ml sampel sediaan cair OHT merk Kiranti® dimasukkan ke

dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda.

Kemudian diekstraksi menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Ekstrak

disaring dan filtrat diencerkan dengan metanol pH 4 sampai 10,0 ml.

6. Validasi metode analisis

a. Penentuan resolusi sampel. Sebanyak 20 µl larutan ekstrak sampel

yang telah diawudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada sistem KCKT fase

terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam asetat glasial

2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan repetisi sebanyak 5

kali. Resolusi dihitung dengan memasukkan selisih waktu retensi dan lebar peak

ke dalam rumus perhitungan resolusi.

b. Pembuatan kurva baku kurkumin. Sebanyak 20 µl larutan kurkumin

dengan konsentrasi 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 dan 4,5 ppm yang telah disaring

dengan Millipore dan diawaudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada sistem

KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol : asam

asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan

replikasi sebanyak 3 kali. Persamaan kurva baku tiap replikasi ditetapkan dari

hasil analisis regresi linear antara konsentrasi tiap seri baku dengan AUC yang

diperoleh. Kemudian dipilih persamaan kurva baku terbaik dengan nilai koefisien

korelasi (r) lebih besar dari 0,999 yang selanjutnya digunakan untuk menghitung

konsentrasi kurkumin.

36

c. Penentuan persen perolehan kembali dan koefisien variasi baku

kurkumin. Sebanyak 20 µl larutan baku kurkumin 1,5; 3,0 dan 4,5 ppm yang telah

disaring dengan Millipore dan diawaudarakan selama 15 menit diinjeksikan pada

sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol :

asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan

replikasi sebanyak 5 kali. Konsentrasi baku kurkumin dihitung dengan

memasukkan nilai AUC yang diperoleh ke dalam persamaan kurva baku.

d. Penentuan persen perolehan kembali dan koefisien variasi adisi baku

kurkumin dalam sampel. Dibuat 2 macam larutan yaitu larutan sampel dan larutan

sampel adisi. Larutan sampel dibuat dengan mengambil 1,0 ml ekstrak sampel ke

dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga tanda.

Larutan sampel adisi dibuat dengan mengambil 75 µl larutan stok kurkumin dan

1,0 ml ekstrak sampel dalam labu takar 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol

pH 4 hingga tanda. Keduanya disaring dengan Millipore dan diawaudarakan

selama 15 menit. Kemudian sebanyak 20 µl dari tiap larutan diinjeksikan pada

sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak metanol :

asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) dengan kecepatan alir 0,5 ml/menit. Dilakukan

repetisi sebanyak 5 kali. Konsentrasi baku kurkumin yang ditambahkan dalam

sampel dihitung dengan memasukkan selisih nilai AUC sampel adisi dan AUC

sampel ke dalam persamaan kurva baku.

37

G. Analisis Hasil

Kesahihan metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT

secara KCKT fase terbalik dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:

1. Selektivitas

Menurut Harmita (2004), selektivitas ditentukan dengan parameter resolusi

(Rs). Rumus perhitungan resolusi:

Resolusi (Rs) = (tR2− tR1)

12� (W1+ W2)

(6)

Keterangan: Rs = resolusi

tR1 = waktu retensi puncak analit pertama

tR2 = waktu retensi puncak analit kedua

W1 = lebar dasar puncak pertama

W2 = lebar dasar puncak kedua

2. Linearitas

Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Konsentrasi larutan baku

kurkumin yang diperoleh diplotkan terhadap luas area pada kromatogram

sehingga diperoleh nilai koefisien korelasi (r) dari persamaan y = Bx + A.

3. Akurasi

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) dan dapat

dihitung dengan rumus:

Recovery = konsentrasi terukurkonsentrasi sebenarnya

x 100% (7)

38

4. Presisi

Presisi dihitung sebagai simpangan deviasi relatif (RSD) atau koefisien

variasi (KV). Rumus perhitungan koefisien variasi

KV = simpangan deviasi (SD)

rata-rata (x�) x 100% (8)

Keterangan: KV = koefisien variasi

SD = simpangan deviasi

x� = rata-rata

39

BAB IV

PEMBAHASAN

A. Pembuatan Fase Gerak KCKT

Sistem kromatografi yang digunakan pada penelitian ini merupakan

sistem kromatografi partisi fase terbalik karena menggunakan fase gerak yang

bersifat lebih polar dibandingkan fase diamnya. Fase gerak yang digunakan pada

penelitian ini adalah campuran metanol dan asam asetat glasial 2% dengan

perbandingan 90:10 (v/v). Baik metanol maupun asam asetat glasial dipilih

sebagai fase gerak karena keduanya dapat melarutkan kurkumin dengan baik

sehingga diharapkan dapat mengelusi kurkumin lebih cepat.

Campuran fase gerak metanol dan asam asetat glasial 2% (90:10 v/v)

memiliki nilai pH 4 sehingga tidak akan merusak kolom kromatografi. Jika pH

fase gerak ≤ 2, maka kolom oktadesilsilan (C18) akan melepaskan gugus

oktadesilnya kembali ke bentuk silanol (Gambar 11).

Si O Si (CH2)17CH3 Si (CH2)17CH3HOSi OH + + H+H2O/H+

Gambar 11. Reaksi degradasi kolom C18 dalam suasana asam

Sebelum digunakan, masing-masing komponen fase gerak disaring

terlebih dahulu menggunakan penyaring Whatman untuk menyaring partikel-

partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya diawaudarakan untuk

menghilangkan gelembung udara sehingga tidak mengganggu pemisahan sampel.

40

Pencampuran masing-masing komponen fase gerak dilakukan di dalam instrument

KCKT (sistem gradien).

B. Pembuatan Larutan Baku Kurkumin

Larutan baku kurkumin dibuat dengan melarutkan baku kurkumin dalam

pelarut metanol p.a. yang telah diatur pada pH 4 untuk menjaga stabilitas

kurkumin. Pengaturan pH metanol pada pH 4 dilakukan dengan menambahkan

asam asetat glasial 2% ke dalam metanol dengan perbandingan (9:1). Pengaturan

pH ini dilakukan karena kurkumin bersifat pH-sensitive. Kurkumin stabil pada pH

di bawah 6,5 dan akan terdegradasi pada pH di atas 6,5 menghasilkan asam ferulat

dan feruloil metan. Hal ini disebabkan adanya gugus metilen aktif (Tonnesen dan

Karlsen, 1995b).

Gambar 12. Gugus metilen aktif pada kurkumin

Adanya penambahan asam asetat glasial 2% pada pelarut metanol yang

digunakan akan menyediakan suasana asam sehingga kurkumin tetap dalam

bentuk molekulnya.

41

Larutan baku yang dibuat pada penelitian ini terdiri dari tiga macam,

yaitu larutan stok, larutan intermediet, dan larutan seri baku. Larutan stok dibuat

dengan konsentrasi 1000 ppm, sedangkan larutan intermediet dibuat dengan

konsentrasi 100 ppm. Larutan seri baku dibuat dalam tujuh konsentrasi berbeda

yaitu 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 dan 4,5 ppm.

C. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kurkumin

Panjang gelombang maksimum suatu senyawa adalah panjang

gelombang dimana senyawa memiliki absorbansi atau serapan maksimum.

Penetapan panjang gelombang maksimum pada penelitian ini dilakukan dengan

mengukur serapan analit kurkumin menggunakan spektrofotometer visibel.

Kurkumin memiliki gugus kromofor yang panjang dan gugus auksokrom pada

strukturnya sehingga dapat memberikan serapan pada daerah sinar tampak

(Gambar 13). Kromofor adalan ikatan rangkap terkonjugasi yang mengandung

elektron π yang mudah terkesitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yaitu orbital

π* jika terkena radiasi elektromagnetik, sedangkan auksokrom adalah gugus yang

terikat pada kromofor dan dapat mengubah atau meningkatkan intensitas

maksimum dari senyawa.

Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada kurkumin

42

Kurkumin diukur serapannya dalam bentuk larutan menggunakan pelarut

metanol dengan tiga konsentrasi berbeda, yaitu 0,4; 1,0 dan 1,6 ppm. Pelarut yang

digunakan dalam penetapan panjang gelombang maksimum sama dengan pelarut

yang digunakan untuk analisis pada sistem KCKT. Pembacaan serapan dilakukan

pada rentang panjang gelombang 300-500 nm yang berada pada daerah visibel.

Rentang pembacaan panjang gelombang ditetapkan berdasarkan panjang

gelombang maksimum teoritis kurkumin dalam pelarut metanol yaitu 430 nm

(Aggarwal dkk., 2006).

Spektra yang dihasilkan pada penetapan panjang gelombang kurkumin

menggunakan tiga konsentrasi berbeda ditunjukkan pada gambar di bawah ini:

Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin

Dari spektra ketiga larutan baku kurkumin konsentrasi 0,4; 1,0 dan 1,6 ppm

diperoleh panjang gelombang maksimum berturut-turut sebesar 432, 433, dan 432

43

nm sehingga ditetapkan panjang gelombang maksimum kurkumin dalam

penelitian ini sebesar 432 nm. Panjang gelombang hasil pengukuran dapat

digunakan apabila besarnya tidak lebih dari ± 2 nm terhadap panjang gelombang

teoritis (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1979). Panjang

gelombang maksimum yang diperoleh dari pengukuran ini menunjukkan

pergeseran sebesar 2 nm dari panjang gelombang maskimum teoritis sehingga

dapat digunakan selanjutnya untuk mengukur serapan larutan baku maupun

sampel yang akan dianalisis.

D. Pengamatan Waktu Retensi (tR) Kurkumin

Waktu retensi (tR) untuk senyawa tertentu pada kondisi tertentu bersifat

spesifik sehingga dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Waktu retensi suatu

senyawa dipengaruhi oleh interaksi senyawa tersebut terhadap fase diam dan fase

gerak yang digunakan. Pada penelitian ini digunakan metode KCKT fase terbalik

dimana fase diamnya bersifat lebih nonpolar daripada fase geraknya. Fase diam

yang digunakan adalah oktadesilsilan (C18) sedangkan fase geraknya berupa

campuran metanol dan asam asetat glasial 2%. Oleh karena itu, senyawa yang

bersifat lebih polar akan terelusi lebih dahulu, sedangkan senyawa yang bersifat

lebih nonpolar akan tertambat lebih lama pada fase diam.

Dilihat dari strukturnya, kurkumin memiliki gugus polar dan nonpolar

yang dapat berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak.

44

Gambar 15. Gugus polar dan nonpolar kurkumin

Gugus polar berinteraksi dengan fase gerak melalui ikatan hidrogen, sedangkan

gugus nonpolar berinteraksi dengan fase diam melalui interaksi Van Der Waals.

O

H3CO OCH3

O

O OH

H

H

O

CH3

O

CH3

H

H

H H

H

HH

OCH3

O

CH3

OO

O

O

CH3CH3 CH3

CH3

H H

H

H

OCH3

OCH3

O

O

CH3

H3CHH

H

H H

H

OCH3

OCH3

OCH3

OCH3

OCH3

OCH3

H

H

O

C CH3

OOC

CH3

O

H

H

H

H

O

H3C

OCH3

O

O CH3

CH3

Gambar 16. Interaksi kurkumin dengan fase gerak metanol : asam asetat glasial 2%

45

HO

H3CO OCH3

OH

O O

Si

CH3

CH3

OCH3

Interaksi Van Der Waals

Interaksi Van Der Waals (Watson, 2003)

Gambar 17. Interaksi kurkumin dengan fase diam oktadesilsilan (C18)

Dari gambar 16 dan 17 diketahui bahwa interaksi kurkumin dengan fase

gerak lebih kuat dibandingkan dengan fase diam. Hal ini disebabkan oleh adanya

ikatan hidrogen antara kurkumin dengan fase gerak dengan energi disosiasi

sebesar 5 Kkal/mol yang bersifat lebih kuat daripada interaksi Van Der Waals

antara kurkumin dengan fase diam dengan energi disosiasi sebesar 1 Kkal/mol

(Fessenden dan Fessenden, 1986).

Dari kromatogram (Gambar 18) diketahui bahwa baku kurkumin

memiliki tR selama ± 6,000 menit. Demikian pula halnya dengan larutan sampel

yang memiliki tR yang sama dengan baku. Oleh karena itu dapat dipastikan bahwa

dalam sampel yang digunakan terdapat kandungan kurkumin.

46

(a)

(b)

Gambar 18. Kromatogram baku kurkumin (a) dan sampel (b)

E. Pembuatan Kurva Baku Kurkumin

Pembuatan kurva baku bertujuan untuk mendapatkan persamaan regresi

linear yang selanjutnya digunakan untuk analisis kuantitatif. Persamaan yang

diperoleh menyatakan korelasi yang linear antara konsentrasi analit dengan respon

Area Under Curve (AUC) yang dihasilkan. Persamaan regresi diperoleh dengan

mengukur respon beberapa konsentrasi analit.

47

Penelitian ini menggunakan tujuh seri konsentrasi larutan baku kurkumin

yaitu 1,515; 2,020; 2,525; 3,030; 3,535; 4,040dan 4,545 ppm yang masing-masing

dibuat replikasi 3 kali. Dari ketiganya dibuat kurva hubungan antara konsentrasi

dan respon AUC sehingga dapat dipilih salah satu kurva baku yang akan

digunakan selanjutnya. Pemilihan kurva baku didasarkan pada nilai koefisien

korelasi (r). Nilai r yang masih dapat diterima untuk sebagian besar pengujian

adalah lebih besar dari 0,999 (Yuwono dan Indrayanto, 2005).

Tabel VI. Data perolehan AUC seri baku kurkumin

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC

1,515 436453 1,500 490279 1,515 504645 2,020 576159 2,000 604061 2,020 650146 2,525 734421 2,500 814609 2,525 800553 3,030 903940 3,000 921890 3,030 952204 3,535 1035906 3,500 1074232 3,535 1174700 4,040 1172320 4,000 1368847 4,040 1326970 4,545 1361779 4,500 1484459 4,545 1461741

A = -26242,7857 B = 301964,9929 r = 0,9992

A = -57032,2143 B = 340838,2143 r = 0.9928

A = -3952,2143 B = 325253,3946 r = 0,9982

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada tabel VI, data kurva baku yang

akan digunakan selanjutnya berasal dari replikasi 1 dengan nilai r sebesar 0,9992.

Nilai r yang dihasilkan tersebut dapat diterima karena bernilai lebih besar dari

0,999 (Yuwono dan Indrayanto, 2005). Oleh karena itu, persamaan kurva baku

yang digunakan untuk analisis kuantitatif kurkumin pada penelitian ini adalah y =

301964,9929 x – 26242,7857.

48

Gambar 19. Kurva baku kurkumin

Hubungan yang linear antara seri konsentrasi kurkumin dengan respon

AUC ditunjukkan dalam gambar 19. Dari kurva tersebut dapat dilihat bahwa

respon AUC meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi.

F. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis merupakan penilaian terhadap parameter

analisis yang terdiri dari ketepatan (akurasi), ketelitian (presisi), selektivitas, limit

deteksi, limit kuantitasi, linearitas, dan rentang (United States Pharmacopeial

Convention, 2007). Validasi dilakukan untuk membuktikan dan menjamin bahwa

suatu metode analisis memiliki validitas yang baik sehingga hasilnya dapat

dipercaya dan dipertanggungjawabkan. Parameter analisis yang dibutuhkan dalam

validasi metode ditentukan oleh kategori metode analisis yang digunakan. Pada

penelitian ini metode analisis yang digunakan mengikuti kategori I karena

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000

AU

C

Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi vs AUC

49

merupakan metode untuk analisis kuantitatif komponen utama bahan baku dalam

produk jadi sediaan farmasi. Dengan demikian, parameter analisis yang

dibutuhkan dalam penelitian ini adalah selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi.

1. Selektivitas

Selektivitas suatu metode berkaitan dengan kemampuannya untuk

mengukur analit secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang

mungkin terdapat dalam matriks sampel. Penentuan selektivitas pada metode

KCKT dapat diamati dari pemisahan peak kurkumin dalam sampel dan

dinyatakan sebagai nilai resolusi (Rs). Metode KCKT dikatakan memiliki

selektivitas yang baik apabila nilai resolusi yang dihasilkan (Rs) > 1,5. Namun

dalam prakteknya, pemisahan dengan harga Rs = 1,0 (kedua puncak berhimpit

lebih kurang 2%) dianggap memadai (Pescok dkk., 1976).

Berikut ini adalah hasil perhitungan resolusi (Rs) sampel yang diperoleh:

Tabel VII. Hasil perhitungan resolusi (Rs) sampel

Repetisi Resolusi (Rs) Rata-rata 1 1,3371

1,4383

2 1,4975 3 1,5398 4 1,5090 5 1,3081

Berdasarkan data yang disajikan pada tabel VII, diperoleh nilai resolusi (Rs) rata-

rata untuk 5 kali repetisi sebesar 1,4383 sehingga metode KCKT yang digunakan

pada penelitian ini dapat dikatakan memiliki selektivitas yang baik.

50

2. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

menunjukkan hubungan yang proporsional antara konsentrasi analit dengan

respon yang dihasilkan. Linearitas ditunjukkan oleh besarnya nilai koefisien

korelasi (r) kurva baku. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik jika

memiliki nilai r lebih besar dari 0,999 (Yuwono dan Indrayanto, 2005).

Berdasarkan hasil pembuatan kurva baku diperoleh nilai r sebesar 0,9992

sehingga dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan memiliki linearitas

yang baik.

3. Akurasi

Akurasi suatu metode dinyatakan sebagai persen perolehan kembali

(recovery) konsentrasi analit yang terukur terhadap konsentrasi sebenarnya. Pada

penelitian ini dilakukan penetapan recovery baku menggunakan 3 konsentrasi

larutan baku kurkumin yang direplikasi sebanyak 5 kali. Karena analit yang

diukur merupakan baku dan konsentrasinya dalam matriks sebesar 100% maka

rentang recovery yang dapat diterima adalah 98-102% (United States

Pharmacopeial Convention, 2007). Hasil penetapan recovery baku kurkumin

disajikan pada tabel berikut:

Tabel VIII. Hasil penetapan recovery baku kurkumin

Konsentrasi (ppm)

Recovery (%) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5

1,515 102,0462 101,9208 107,5049 105,1287 105,8746 3,030 101,9703 101,6898 99,1947 101,4917 101,7888

4,545 101,4323 101,6568 92,5324 97,2915 108,4202

51

Dari tabel VIII dapat diketahui bahwa rentang recovery baku kurkumin

pada konsentrasi rendah (1,515 ppm) adalah sebesar 101,9208-107,5049%, pada

konsentrasi tengah (3,030 ppm) sebesar 99,1947-101,9703%, dan pada

konsentrasi tinggi (4,545 ppm) sebesar 92,5324-108,4202%. Dari ketiga level

konsentrasi baku kurkumin tersebut, hanya konsentrasi tengah (3,030 ppm) saja

yang masuk pada rentang 98-102%. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa

metode yang digunakan memiliki akurasi yang baik pada konsentrasi tengah, yaitu

3,030 ppm.

Selain penetapan recovery baku kurkumin, pada penelitian ini dilakukan

juga penetapan recovery baku menggunakan metode penambahan baku (standard

addition method). Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis kemudian

sejumlah tertentu analit ditambahkan ke dalam sampel dan dianalisis lagi. Selisih

hasil analisis sampel sebelum dan setelah ditambahkan baku dibandingkan dengan

kadar yang sebenarnya (Harmita, 2004). Pada penelitian ini analit yang

ditambahkan ke dalam sampel adalah sebanyak 0,75 ppm sehingga respon AUC

kurkumin yang dihasilkan mendekati respon AUC baku kurkumin konsentrasi

tengah (3,030 ppm) yang telah terbukti akurat melalui penetapan recovery baku

yang telah dilakukan sebelumnya seperti yang terlihat pada gambar 20. Dari

kromatogram tersebut dapat dilihat bahwa penambahan baku kurkumin ke dalam

larutan sampel menyebabkan peningkatan respon AUC.

52

(a)

(b)

(c)

Gambar 20. Kromatogram baku kurkumin 3,030 ppm (a), sampel (b), dan sampel adisi (c)

53

Berikut ini adalah hasil penetapan recovery menggunakan metode

penambahan baku:

Tabel IX. Hasil penetapan recovery baku yang diadisi

Repetisi

ke-

AUC Konsentrasi terukur baku

kurkumin adisi (ppm)

Recovery

(%) Adisi

sampel

Sampel Baku

kurkumin adisi

1 813713 603914 206941,2 0,7722 102,9600 2 817349 608249 210577,2 0,7843 104,5733 3 815878 608239 209106,2 0,7794 103,9200 4 819999 609056 213227,2 0,7930 105,7333 5 822452 604401 215680,2 0,8012 106,8267

Rentang yang dapat diterima pada penetapan recovery menggunakan

metode penambahan baku adalah 80-110% karena konsentrasi baku kurkumin

yang ditambahkan dalam matriks sampel kurang dari 1 ppm. Berdasarkan hasil

yang diperoleh, diketahui rentang recovery baku yang diadisi sebesar 102,9600-

106,8267% masuk dalam rentang recovery yang ditetapkan. Dengan demikian

dapat dipastikan bahwa konsentrasi tengah (3,030 ppm) pada metode yang

digunakan memiliki akurasi yang baik.

4. Presisi

Presisi dalam suatu metode analisis dinyatakan sebagai koefisien variasi

(KV). Semakin kecil nilai KV, maka presisi suatu metode dikatakan semakin baik.

Secara umum suaatu metode analisis dikatakan memiliki presisi yang baik jika

nilai KV kurang dari 2% (Harmita, 2004).

54

Tabel X. Data koefisien variasi baku kurkumin

Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi rata-rata (x�)

Simpangan deviasi (SD)

Koefisien variasi (KV)

1,515 1,5831 0,0371 2,3435 %

3,030 3,0672 0,0348 1,1346 % 4,545 4,5571 0,2674 5,8678 %

Dari tabel X dapat dilihat bahwa baku kurkumin pada konsentrasi rendah

(1,515 ppm) dan konsentrasi tinggi (4,545 ppm) memiliki nilai KV yang lebih

besar dari 2% yaitu 2,3435% untuk konsentrasi rendah dan 5,8678% untuk

konsentrasi tinggi. Sebaliknya, baku kurkumin pada konsentrasi tengah (3,030

ppm) memiliki nilai KV yang lebih kecil dari 2%, yaitu 1,1346%. Oleh karena itu

dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki presisi yang baik pada

konsentrasi tengah (3,030 ppm). Pernyataan ini didukung pula oleh hasil

perhitungan KV baku kurkumin yang ditambahkan dalam sampel dengan nilai KV

sebesar 1,4504%.

55

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk

Kiranti® secara KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C18 dan fase gerak

metanol : asam asetat glasial 2% (90:10 v/v) memenuhi parameter validitas yang

baik, meliputi selektivitas (Rs = 1,4383), linearitas (r = 0,9992), akurasi dan

presisi (pada konsentrasi 3,030 ppm).

B. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengaplikasikan metode

penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT merk Kiranti® menggunakan

metode KCKT dengan kondisi tersebut.

56

DAFTAR PUSTAKA

Aggarwal, B. B., Bhatt, I. D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sandur, S. K., dkk., 2006, Curcumin-Biological and Medical Properties, http://www.indsaff.com/10%20Curcumin%20biological.pdf, diakses tanggal 23 September 2010.

Anand, P., Kunnumakkara, A. B., Newman, R. A. and Anggarwal, B. B., 2007,

Bioavailability of Curcumin: Problems and Promises, Mol. Pharm., 4 (6), 807-818.

Badan Pengawas Obat Dan Makanan, 2004, Keputusan Kepala Badan Pengawas

Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor: HK.00.05.4.2411 tentang Ketentuan Pokok Pengelompokan Dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia, BPOM RI, Jakarta, http://www.pom.go.id/public/hukum_perundangan/pdf/Penandaan_OAI.pdf, diakses tanggal 13 Desember 2010.

Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2005a, Peraturan Kepala Badan Pengawas

Obat dan Makanan Nomor HK.00.05.41.1384 tentang Kriteria dan Tata Laksana Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka, BPOM RI, Jakarta, http://www.pom.go.id/public/hukum_perundangan/pdf/KRITCARA%20PENDAFT.OT.pdf, diakses tanggal 13 Desember 2010.

Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2005b, Standarisasi Ekstrak Tumbuhan Obat

Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalam Pengembangan Obat Asli Indonesia, InfoPOM, 6 (4), 1-5, http://perpustakaan.pom.go.id/KoleksiLainnya/Buletin.pdf, diakses tanggal 13 Desember 2010.

Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 6th ed., Jhon Willey & Sons, Inc.,

USA, 65, 66, 483, 484. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1979, Farmakope

Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, 773. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, 6, 17, 1009. Dwivedi, A. K., Raman, M., Seth, R. K. and Sarin, J. P. S., 1992, Combined Thin

Layer Chromatography-Densitometry for The Quantitation of Curcumin in Pharmaceutical Dosage Forms and in Serum, Indian J. Pharm. Sci., 54 (5), 174-177.

57

Fessenden, R. J. and Fessenden, J. S., 1986, Organic Chemistry, jilid 1, edisi 3, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A. H., Penerbit Erlangga, Jakarta, 23-26.

Gritter, R. J., Bobbit, J. M., and Schwarting, A. E., 1991, Introduction to

Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi II, ITB, Bandung, 205-219.

Hakim, A. R., 2002, Sintesis Kurkumin, Demetoksikurkumin, Bis-

demetoksikurkumin an Pentagamavunon-O serta Pengaruhnya terhadap Farmakokinetika Teofilin pada Tikus, Tesis, Sekolah Pascasarjana, UGM, Yogyakarta, 38-41.

Harris, D. C., 1999, Quantitative Chemical Analysis, 2nd ed., W. H. Freeman

Company, New York, 643, 648, 716-717. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, 1 (3), 117-134, Departemen Farmasi FMIP, Universitas Indonesia, Jakarta.

Heath, D. D., Pruitt, M. A., Brenner, D. E., Begun, A. N., Frautschy, S. A. and

Roch, C. L., 2005, Tetrahydrocurcumin in Plasma and Urine: Quantitation by High Performance Liquid Chromatography, J. Chrom. B.

Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern, PT Remaja Rosdakarya, Bandung, 21-25. Huang, M., Ma, W., Yen, P., Guo-Xie, J., Han, J., Frenkel, K., Grunberger, B. and

Conney, A. H., 1997, Inhibitory Effect of Topical Application of Low Dose of Curcumin on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Induced Tumor Promotion and Oxidized DNA Bases in Mouse Epidermis, Carcinogenesis, 18 (1), 83-88.

Inoue, K., Nomura, C., Ito, S., Nagatsu, A., Hino, T. and Oka, H., 2008,

Purification of Curcumin, Demethoxycurcumin, and Bisdemethoxycurcumin by High-Speed Countercurrent Chromatography, J. Agric. Food. Chem., 56 (20), 9328-9336.

Jadhav, B.K., Mahadik, K.R. and Paradkar, A.R., 2007, Development and

Validation of Improved Reversed-Phase HPLC Method for Simultaneous Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin, and Bis-Demethoxycurcumin, Chrom., 65 (7/8), 483-488.

Jankun, E. S., Zhou, K., Patrick, N., Selman, S. H. and Jankun, J., 2003, Structure

of Curcumin in Complex with Lipoxygenase and Its Significance in Cancer, Int. J. Mol. Med., 12, 17-29.

58

Jasco International Co., Ltd., 2004, High Performance Liquid Chromatography

(HPLC), http://www.jascofrance.fr/pdf/hplc, diakses tanggal 4 November 2010.

Jayaprakasha, G. K., Rao, J. M. and Sakariah, K. K., 2002, Improved HPLC

Method for Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin, and Bisdemethoxycurcumin, J. Agric. Food Chem., 50, 3668-3672.

Johnson, E. L. dan Stevenson, R., 1978, Basic Liquid Chromatography,

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung. Kementerian Kesehatan RI, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan Republik

Indonesia Nomor: 661/MENKES/SK/VII/1994, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, diterjemahkan oleh A.

Saptohardjo, Pendamping Agus Nurhadi, UI Press, Jakarta, 189. Khurana, A. L and Ho, C. T., 1988, High Performance Liquid Chromatographic

Analysis of Curcuminoid and Their Photo-Oxidative Decomposition Compounds in Curcuma longa L., J. Liq. Chrom., 11 (11), 2295-2304.

Kromidas, S., 2000, Practical Poblem Solving in HPLC, Wiley-VCH, Weinheim,

36-40. Martono, S., 1996, Penetapan Kadar Kurkumin secara Kromatografi Lapis Tipis-

Densitometri, Buletin ISFI, 2 (4), 11-21, Yogyakarta. Majeed, M., Badmaev, V., Shivakumar, U. and Rajendran, R., 1995,

Curcuminoids Antiokidant Phytonutrients, NutriScience Publishers, Inc., New Jersey, 3-80.

Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, 1996, The Merck Index, An

Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biological, Merck & Co., Inc., USA, 2743.

Miller J.C. dan Miller J.N., 1991, Statistika untuk Kimia Analitik diterjemahkan

oleh Drs. Suroso, M. Sc., Penerbit ITB, Bandung, 104-124. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,

Surabaya, 6-11, 26, 31, 34. Munson, J. W., 1984, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan

oleh Harjana dan Parwa B., Universiutas Airlangga Press, Surabaya, 15, 33-34.

59

Nhujak, T., Saisuwan, W., Srisaart, W. and Petsom, A., 2006, Microemulsion

Electrokinetic Chromatography for Separation and Analysis of Curcuminoids in Tumeric Samples, J. Sep. Sci., 29 (5), 666-667.

Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakartal 6-17. Paramasivam, M., Aktar, Md.W., Poi, R., Banerjee, H. and Bandyopadhyay, A.,

2008, Occurrence of Curcuminoids in Curcuma longa: A Quality Standardization by HPTLC, Bangladesh J. Pharmacol., 3, 55-58.

Pescok, R. L., Shields, L. D. and Cains, T., 1976, Modern Methods of Chemical

Analysis, 2nd edition, John Wiley Sons, Canada, 51. Rahayu, H. D. I., 2010, Pengaruh Pelarut yang Digunakan terhadap Optimasi

Ekstraksi Kurkumin pada Kunyit (Curcuma domestica Vahl.), Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, edisi 6,diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata, ITB, Bandung, 164. Rohman, A., dan Gandjar, I. G., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua,

Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, 323-345, 378-389. Rungphanichkul, N., 2004, Preparation and Characterization of Curcuminoids

Niosomes, Faculty of Pharmaceutical Science, Chulalongkorn University. Sastrohamidjojo, H., 2002, Spektroskopi, Penerbit Liberty, Yogyakarta, 9, 11, 15,

22-26. Settle, F. A., 1997, Handbook of Instrumental Techniques for Analytical

Chemistry: An Introduction, 6th edition, Harcourt Brace College Publishers, Orlando, Florida, 490.

Skoog, D. A., Holler, F. J. and Nieman, T. A., 1998, Principles of Instrumental

Analysis, 5th edition, Harcourt Brace College Publishers, Philadelphia, 325-351.

Smith, R. and Witowska, B., 1984, Comparison of Detectors for The

Determination of Curcumin in Tumeric by High Performance Liquid Chromatography, Analyst, 109, 259-261.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J. and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method

Development, 2nd edition, , John Wiley and Sons, Inc., New York 687-688, 690, 691, 695.

60

Sumule, A.W., 2007, Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan Aplikasinya dalam Sediaan Sirup, Tesis, Sekolah Pascasarjana, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Tonnesen, H.H. and Karlsen, J., 1983, High Performance Liquid Chromatography

of Curcumin and Related Compounds, J. Chrom., 1259, 367-371. Tonnesen, H.H. and Karlsen, J., 1985a, Studies on Curcuminand Curcuminoids,

V. Alkaline Degradation of Curcumin, Z. Lebensm. Unters. Forsch., 180, 132-134.

Tonnesen, H.H. and Karlsen, J., 1985b, Studies on Curcuminand Curcuminoids,

VI. Kinetics of Curcumin Degradation in Aqueous Solution, Z. Lebensm. Unters. Forsch., 180, 402-404.

Tonnesen, H.H. and Karlsen, J., 1986, Studies on Curcuminand Curcuminoids,

VII. Chromatographic Separation and Quantitation Analysis of Curcumin and Related Compounds, Z. Lebensm. Unters. Forsch., 182, 215-218.

Tonnesen, H.H., 1986, Chemistry, Stability and Analyst of Curcumin-A Naturally

Occuring Drug Molecule, Ph. D, Thesis, Institute of Pharmacy, University of Oslo, Oslo.

United States Pharmacopeial Convention, 2007, United State Pharmacopoeia,

Edisi 30 (monograph on CD-ROM), United States Pharmacopoeial Convention, Inc.

Watson, D. G., 2003, Pharmaceutical Analysis, Churcill Livingstone, London,

265. Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods

of Analysis, Profile of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, Elseiver Inc., 32, 243-259.

Zahro, L., Cahyono, B. dan Hastuti, R. B., 2009, Profil Tampilan Fisik dan

Kandungan Kurkuminoid dari Beberapa Simplisia Temulawak (Curcuma xanthorrhiza ROXB.) pada Beberapa Metode Pengeringan, Jurnal Sains & Matematika, 17 (1).

61

LAMPIRAN

62

Lampiran 1. Pernyataan jaminan keaslian bahan kurkumin standar hasil

sintesis

63

Lampiran 2. Data penimbangan bahan

1. Baku kurkumin untuk pembuatan kurva baku

Berat (g) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Kertas 0,2457 0,2461 0,2490 Kertas + zat 0,2558 0,2562 0,2591 Kertas + sisa 0,2457 0,2462 0,2490

Zat 0,0101 0,0100 0,0101

2. Baku kurkumin untuk validasi metode

Berat (g) Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Replikasi 4

Replikasi 5

Kertas 0,2461 0,2453 0,2487 0,2463 0,2453 Kertas + zat 0,2562 0,2554 0,2589 0,2564 0,2454 Kertas + sisa 0,2461 0,2453 0,2488 0,2463 0,2453

Zat 0,0101 0,0101 0,0101 0,0101 0,0101

3. Baku kurkumin untuk sampel adisi

Berat (g) Kertas 0,2553 Kertas + zat 0,2654 Kertas + sisa 0,2554

Zat 0,0100

64

Lampiran 3. Spektra panjang gelombang maksimum kurkumin

65

Lampiran 4. Kromatogram baku kurkumin

1. Konsentrasi 1,5 ppm

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

66

c. Replikasi 3

2. Konsentrasi 2,0 ppm

a. Replikasi 1

67

b. Replikasi 2

c. Replikasi 3

68

3. Konsentrasi 2,5 ppm

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

69

c. Replikasi 3

4. Konsentrasi 3,0 ppm

a. Replikasi 1

70

b. Replikasi 2

c. Replikasi 3

71

5. Konsentrasi 3,5 ppm

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

72

c. Replikasi 3

6. Konsentrasi 4,0 ppm

a. Replikasi 1

73

b. Replikasi 2

c. Replikasi 3

74

7. Konsentrasi 4,5 ppm

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

75

c. Replikasi 3

76

Lampiran 5. Contoh perhitungan konsentrasi baku kurkumin

1. Konsentrasi larutan stok kurkumin

Berat baku kurkumin yang diambil sebanyak 10,1 mg, dilarutkan dengan

metanol p.a pH 4 dalam labu takar 10,0 ml hingga tanda.

C stok = berat baku kurkumin yang ditimbang

volume larutan

C stok = 10,1 mg

10,0 ml = 1,01

mgml� = 1001 ppm

2. Konsentrasi larutan intermediet kurkumin

Sebanyak 1,0 ml larutan stok diencerkan dengan metanol p.a pH 4 dalam labu

takar 10,0 ml hingga tanda.

C1 x V1 = C2 x V2

1001 ppm x 1,0 ml = C2 x 10,0 ml C2 = 100,1 ppm

3. Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan baku kurkumin

Sebanyak 150 µl larutan intermediet diencerkan dengan metanol p.a pH 4

dalam labu takar 10,0 ml hingga tanda.

C1 x V1 = C2 x V2

1001 ppm x 0,150 ml = C2 x 10,0 ml C2 = 1,515 ppm

77

Lampiran 6. Perolehan AUC seri baku kurkumin

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 C (ppm) AUC C (ppm) AUC C (ppm) AUC

1,515 436453 1,500 490279 1,515 504645 2,020 576159 2,000 604061 2,020 650146 2,525 734421 2,500 814609 2,525 800553 3,030 903940 3,000 921890 3,030 952204 3,535 1035906 3,500 1074232 3,535 1174700 4,040 1172320 4,000 1368847 4,040 1326970 4,545 1361779 4,500 1484459 4,545 1461741

A = -26242,7857 B = 301964,9929 r = 0,9992

A = -57032,2143 B = 340838,2143 r = 0.9928

A = -3952,2143 B = 325253,3946 r = 0,9982

78

Lampiran 7. Persamaan dan gambar kurva baku kurkumin

1. Persamaan kurva baku kurkumin yang digunakan berasal dari replikasi 1

dengan persamaan sebagai berikut:

y = 301964,9929 x – 26242,7857

2. Gambar kurva baku kurkumin

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000

AU

C

Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi vs AUC

79

Lampiran 8. Kromatogram baku kurkumin untuk validasi metode

1. Konsentrasi rendah (1,515 ppm)

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

80

c. Replikasi 3

d. Replikasi 4

81

e. Replikasi 5

2. Konsentrasi tengah (3,030 ppm)

a. Replikasi 1

82

b. Replikasi 2

c. Replikasi 3

83

d. Replikasi 4

e. Replikasi 5

84

3. Konsentrasi tinggi (4,545 ppm)

a. Replikasi 1

b. Replikasi 2

85

c. Replikasi 3

d. Replikasi 4

86

e. Replikasi 5

87

Lampiran 9. Perolehan nilai AUC dan contoh perhitungan konsentrasi

terukur baku kurkumin

1. Nilai AUC baku kurkumin

Konsentrasi (ppm)

AUC Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5

1,515 440604 440011 465556 454684 458118

3,030 906737 904163 881347 902357 905089 4,545 1365839 1368918 1243691 1335257 1334892

2. Contoh perhitungan konsentrasi terukur baku kurkumin

Diperoleh nilai AUC = 440604 dan dimasukkan dalam persamaan kurva baku. y = 301964,9929 x – 26242,7857

440604 = 301964,9929 x – 26242,7857 466846,7857 = 301964,9929 x x = 1,5460 ppm

Konsentrasi sebenarnya

Konsentrasi terukur (ppm) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5

1,515 ppm 1,5460 1,5441 1,6287 1,5927 1,6040

3,030 ppm 3,0897 3,0812 3,0056 3,0752 3,0842

4,545 ppm 4,6101 4,6203 4,2056 4,4219 4,9277

88

Lampiran 10. Contoh perhitungan persen perolehan kembali (recovery) dan

koefisien variasi (KV) baku kurkumin

1. Contoh perhitungan persen perolehan kembali (recovery)

Recovery =konsentrasi terukur

konsentrasi sebenarnya x 100%

Diketahui konsentrasi baku kurkumin terukur sebesar 1,5460 ppm dan

konsentrasi sebenarnya sebesar 1,515 ppm, maka:

Recovery =1,5460 ppm

1,515 ppm x 100%

Recovery = 102,0462%

Konsentrasi

(ppm) Recovery (%)

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5 1,515 102,0462 101,9208 107,5049 105,1287 105,8746 3,030 101,9703 101,6898 99,1947 101,4917 101,7888

4,545 101,4323 101,6568 92,5324 97,2915 108,4202

2. Contoh perhitungan koefisien variasi (KV)

KV = simpangan deviasi (SD)

rata-rata (x�) x 100%

Diketahui konsentrasi terukur rata-rata (x�) baku kurkumin konsentrasi rendah

(1,515 ppm) sebesar 1,5831 ppm dengan simpangan deviasi (SD) sebesar

0,0371 maka: KV = 0,0371

1,5831 x 100%

KV = 2,3435%

Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi rata-rata (x�)

Simpangan deviasi (SD)

Koefisien variasi (KV)

1,515 1,5831 0,0371 2,3435 %

3,030 3,0672 0,0348 1,1346 %

4,545 4,5571 0,2674 5,8678 %

89

Lampiran 11. Kromatogram sampel dan sampel adisi

1. Sampel

a. Repetisi 1

b. Repetisi 2

90

c. Repetisi 3

d. Repetisi 4

91

e. Repetisi 5

2. Sampel adisi

a. Repetisi 1

92

b. Repetisi 2

c. Repetisi 3

93

d. Repetisi 4

e. Repetisi 5

94

Lampiran 12. Perolehan nilai AUC sampel dan sampel adisi, contoh

perhitungan konsentrasi terukur, perhitungan recovery dan KV baku

kurkumin adisi

1. Nilai AUC sampel dan sampel adisi

Repetisi ke-

AUC

Sampel adisi Sampel 1 813713 603914 2 817349 608249 3 815878 608239 4 819999 609056 5 822452 604401 AUC rata-rata sampel 606771,8

2. Contoh perhitungan konsentrasi terukur baku kurkumin adisi

Diketahui AUC sampel adisi sebesar 813713 dan AUC sampel rata-rata sebesar

606771,8 maka:

AUC baku kurkumin adisi = AUC sampel adisi – AUC sampel = 813713 – 606771,8 = 206941,2

y = 301964,9929 x – 26242,7857 206941,2 = 301964,9929 x – 26242,7857

233183,9857 = 301964,9929 x x = 0,7722 ppm

3. Contoh perhitungan recovery baku kurkumin adisi

Diketahui konsentrasi terukur baku kurkumin adisi sebesar 0,7722 ppm dan

konsentrasi sebenarnya sebesar 0,75 ppm maka:

Recovery =konsentrasi terukur

konsentrasi sebenarnya x 100%

Recovery =0,7722 ppm

0,75 ppm x 100%

95

Recovery = 102,9600%

4. Contoh perhitungan KV baku kurkumin adisi

Diketahui konsentrasi terukur rata-rata (x�) baku kurkumin adisi sebesar 0,7860

ppm dengan simpangan deviasi (SD) sebesar 0,0114 maka:

KV = SD

x� x 100%

KV = 0,0114

0,7860 x 100%

KV = 1,4504%

Repetisi

ke-

AUC Konsentrasi terukur baku

kurkumin adisi (ppm)

Recovery

(%) Sampel

adisi

Sampel Baku

kurkumin adisi

1 813713 603914 206941,2 0,7722 102,9600 2 817349 608249 210577,2 0,7843 104,5733 3 815878 608239 209106,2 0,7794 103,9200 4 819999 609056 213227,2 0,7930 105,7333 5 822452 604401 215680,2 0,8012 106,8267 AUC rata-rata sampel 606771,8 Konsentrasi terukur rata-rata baku

kurkumin adisi (ppm) 0,7860

SD 0,0114 KV (%) 1,4504

96

Lampiran 13 . Contoh perhitungan resolusi pemisahan kurkumin dalam

sampel

Diketahui: tR1 = 5,525 W1 = 0,3158

tR2 = 6,000 W2 = 0,3947

Resolusi (R) = (tR2 − tR1)

12� (W1 − W2)

Resolusi (R) = (6,000-5,525)

12� (0,3158+-0,3947)

= 1,3371

97

Lampiran 14. Kromatogram pelarut metanol pH 4 (blanko)

1. Replikasi 1

2. Replikasi 2

98

3. Replikasi 3

99

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sediaan Cair Obat Herbal Terstandar Merk Kiranti® secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” ini bernama lengkap Marsella Widjaja yang akrab dipanggil Lala. Penulis dilahirkan di Cirebon, Jawa Barat pada tanggal 31 Maret 1989. Penulis adalah anak pertama dari dua bersaudara pasangan (Alm.) Hartodjono Widjaja dan Debora Inggraini Hidayat. Penulis pernah menempuh pendidikan formal di TK Kristen BPK Penabur Cirebon (1993-1995), SD Kristen BPK Penabur Cirebon (1995-2001), SLTP Kristen 1 BPK Penabur Cirebon (2001-

2004), SMA Kristen 1 BPK Penabur Cirebon (2004-2007), dan pada tahun 2007 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain sekretaris Seminar Anti Tembakau (2008), penyuluh Program Pengabdian Masyarakat “Pemilihan Obat Bebas Analgesik dan Antipiretik untuk Anak” (2008), koordinator kesekretariatan PPnEC (2008), koordinator Humas Kampanye Informasi Obat ISMAFARSI USD (2008), Humas ISMAFARSI USD (2008), panitia Seminar Nasional “Arah Penelitian Obat Bahan Alam” (2009), dan manajer UKF Basket Farmasi (2008-2009). Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten dosen Praktikum Kimia Organik (2009-2010), Praktikum Farmasetika Dasar (2009-2010), Praktikum Spektroskopi (2010), dan Praktikum Bioanalisis (2010). Penulis juga aktif dalam berbagai kegiatan sosial, diantaranya adalah anggota tim pengobatan gratis GKI Gejayan Yogyakarta, Mission Care, dan Gerakan Kemanusiaan Indonesia.