V. PEMURNIAN VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN

KERITING KUNING CABAI

SRI S U W D A R I . Pemurnian Virus Penyebab Penyalut Daun Keriting Kuning Cabai. Di bimbing oleh RUSMILAH SUSENO, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, JUMANTO HARJOSUDARMO, dm SOEMARTONO SOSROMARSONO.

Virus murni ymg diisolasi dari Physaiis flariaha L. ymg tehfeksi penyebslb penyakit dam keriting lnming wbai dapat digunakan untuk m g a i kajian sifat-sifat fisik virus tersebut maupun sebagai bahan d a m untuk pembuatan antiserum.

Penelitian ini bertujuan untuk rnemurnikan virus penyebab penyakit daun keriting kuning cabai isolat Segunung seam ultraseotrifugsi men- gradien sulfht sesium.

Hasil penelitian rnenunjukkan bahwa dari zona virus yang dibagi menjadi lima M s i diperoleh virus murni sebanyak 220 ug dari 250 g bahan sew. Melalui karakterisasi spektmfotometri, pada h k s i keempat diketahui rnernpunyai nilai A 260 = 1,83, dan A 260/280 = 1,48. B e r W m analisis elektroforesis secara SDS-PAGE , ukuran protein selubung geminivirus sekitar 29 k Da.

P. jloridana sangat prospktif diguoakan sebagai hang perbanyakan geminivirus karena b&ya banyak dan mudab diperoleh, mudah dibudidayakan, cepat pertumbuhannya, dapat dipanen berulang Mi, serta batangnya bersifat sukulen sehingga mempemudah proses ekstraksi.

V. PURWICATION OF PEPPER YELLOW LEAF CURL VIRUS

SRI SlL4NDARI. Ptnificatim of Ppperye11ow leafcurl v i m . Supervised by R U S W SUSENO, SRI HENDRASTUTI HIDAYAT, JUMANTO HARJOSUDARMO, and SOEMARTON0 SOSROMARSONO.

The purified virus which has been isdatd b m Phymlisflorih L which was infected by Pepper ye1Iow leafcud v i m is very useful for the *S of the physcrrl properties of the virus and also as a raw material far pmhwmg antisemti.

The aim of the research is to purrfy the Pepper yellow I e q f crrrJ v i m of Segunung isolate by cesium sulphate gradient ultracentrrfirgattcw.

The result showed, that the virus which was kvided into fi= M m s mtained a total of about 220 ug of jmre virus; this amount was exlra&d fimn 250 g M materials ( d i d P. $la+&). By spdqhtaneter &mc?uidrn , it can be shown that the, fourth h t i c m of tk vhvs zone has a value of A 260 =

1,83, and A 250/280 = 1. 48. Based on the SDS- PAGE analysis, the molecular weight of the coat protein was about 29 kDa

P. Jondana is very prospective to be used as a propagation host of geminivinrs of pepper isolate because it produces a lot of seeds, the plant is easily propagated by seeds and growing W, whereas the leaves can be h w t e d s e d times and are succulent, so that it i s easy to be extmcted

Pemurnian virus menrpakan d a h satu lmgkah yang penting d a m

kajian suatu vim penyebab penyakit tumbuharr. Terssdianya virus murni sangat

diperlukan antam lain uatuk kajim sifat-sifat fislk, pengamatan bentuk dan

ukuran partikel serta pernbuatan antiserum. W a g a i metode dan modifikasi

pernumian suam virus telah diketahui yang disem- dengm sifat dan jenis

virusnya (Matthews 1 M ) . Secm umum pernumian suatu virus dilakukan

melalui beberap tahapan yaitu: 1) perbanyakan v i m pada inang yang

menpdung sedikit atau tidak mengandung zat inhibitor, 2) mengmngi

aktivitas enzim inhibitor melalui pemiiihan media homogenisasi yang tepat

d e n p cara mengguIlakan penyrtngga pada molaritas dan pH larutan yang tepat,

serta penambahan bahan aditif seperti antidrsidan atau bahan pengkelat , 3)

penjernihan ekstrak tanaman y g terinfeksi virus yang bertqjuan untuk

menghllangkan molekul makro seperti mitokondria, ribosom, polisom,

polisakarida dengan cara menam- bahan pelarut organik misalnya eter,

kloroform, a tau butanol yang dapat mendenaturisasi lemak dan protein tan pa

merusak struktur virusnya, dan 4) pemimhan virus dari komponen tanaman

dengan presi pi tasi parti kel menggunakan plye~hyleneglycok (PEG), dengan

cam uImsentrifugasi d e n w gradien kepekatan sukrosa atau d f h t &urn p g

dapat rnemi sahkan partikel virus berdasarkan bentuk, ukuran dan berat jenisnya.

Geminivirus merupakan salab satu jemis virus yang sangat sulit untuk

dimurnikan karena adanya beberapa kendaIa yaitu konsefltmi virus dalarn

inangnya yang sangat rendah, ukuran partikel virus yang relatif kecil dan lokasi

virus dalam tanaman berada di dalam inti sel floem . Beberap geminivirus yang

subh berhasil dimumikan m?am lain adalab Tampepper v i m (TPV) dan Bean

golden rnmajc geminivim (J3GMV) menggunakan @en sulfat sesium

(Stager et al. 1990, Morale et a/. 1990), Tomato golden yellow mosaic v i m

(TGYMV) dan Squash leafcurl v i m (SLCV) menggudm gradien sukrosa 10 -

40% (Hamilton et al. 1981, Cohen et 01. 1983). Geminivirus lain yaitu Mungbean

yellow mosaic v i m (MYMV) dunurnikan menggunakan metode reverse PEG

clan dilanjutkan dengan gradien kepekatan sukrosa (Honda et d. 1983), dan

Trisusilowati (1 989) telah berhasi I memurnikan (partial purycation) virus

krupuk yang menyerang ternbidmu.

Oleh irarena penyakit daun keriting laming yang menyerang cabai di

Indonesia merupakan penyakit b maka belum banyak dilakukan penelitian-

penel i tian yang mengungkap lebih jauh tentang ciri-ciri penyebabnya. Guna

mengetahui si fat-si fat fisik geminivirus perryebab penyakit dam keriting b n g

cabai dan sebagai bahan dasar untuk pembuatan antiserum maka dilakukan

pemurnian virus tersebut.

TUJUAN PENELITIAN

Penelitia~i ini ba-tujuan untuk mendapatkan virus murni dari penyebab

penyak~t dam keriting kuning cab& isolat Segunung. Virus murni png

dihasilkan selanjutkan dikaji si fat-si fat fisihya untuk bahan identifikasi dan juga

di gunakm sebagai bahan dasar untuk pembuatan antiserum.

BAHANDANMETODE

Tempt dm Waldu Penelitian

Penelitian dilakukan di rumah katx Mai Penelitian Bioteknologi

Tanaman (Bditbio) dan di laboratorium Virologi , Jurusan Hama dan Penyakit

Tumbuhan Fakultas Pertanim IPB, Bogor pada bulm Oktober 2001 sampai Juni

2002.

Perbanyakan Virus Pada Tanaman Inang

Pa& peneiitian ioi sebapi hang perbanyakan digunakan t a m a n

ceplukan (Physoiis J o n h L.). Bibit ceplukan ditmam dari biji yang sehat.

Pada m u r sepuluh hari setelah tanam, trmamsln diindrulasi menggunakm

kutukebd t e m k u sebanyak 10 ekor setiap tanman. Serrlngga vektor dibiarkan

melakukan periode makan akuisisi s e l m 24 jam pa& tanaman tomat sakit

sebagai sumber inokulurn dan periode inokulasi selama 24 jam pada tanaman

ceplukan . Setelah 10 hari dari saat indrulasi, dam dan ranting tanaman dipanen

dan tunas-tunas yang turnbuh dibiarkan untuk dapat dipanen pada periode panen

berikutnya. Daun dan bagim tanaman lain misdnya ranting batang yang masih

muda juga digunakan sebagai bahan untuk pernumian virus.

Pemurdan Virus

Metode pernumian gerninivirus isolat cabai dilakukan sesuai dengan

prosedur dari Attathorn et al. (1990) yang dirnodi fikasi. Sebanyak 250 gram daun

sena bagim tanaman ceplukan lainnya yaog baru dipanen dishpan pada suhu -

80 C selcitar 2 minggu, kemudiau digerus dalm nitrogen cair. Serbuk hasil

gerusan tersebut kemudian ditambah 500 ml pyanggd Tris, pH 8,4 ( bufer Tris

0,l M mengandung 2-merkaptaetanol 1%) dan diaduk menggunakan rnesin

pengaduk bemagnit (magnetic stirrer). Larutan dijernihkan dm- menambah

kloroform (0,5 vol) dm dihomogenisasi pada suhu 4 C dengan menggmakan

mesin pengaduk bennagnit selama 30 menit, selmjutnya disentrifugasi pada

12.000 rpm sdama 10 menit. Supematan dimbil dan dipmipita& dengm PEG

8% dm NaCI 0,2 M, selanjutnya campursrn dibomogenisasi dengan mesin

pengaduk bermagmt pada suhu 4 C selafna 2 jam, dm disentrifugasi pada 12.000

rpm selama 10 menit. Supematan diambil kernudian disentrifugrlsi pa& 45.000

rpm selama 2 jam. Pelet diresuspnsi denw lamtan penyangga Tris 5 mM yang

mengandung EDTA 2,s m M , pH 8, selmjutnya disentrihgasi seam gradien

sulfat sesium menggtmakan rotor swing tip P 65 ST pa& 50.000 rpm selama

18 jam pads ultrasenbifus Hitachi , model Him= CP 80 @. Zuna vimvs dimbil

dan dipisahkan ke ddm beberaps Wi.

Karalberisasi Virus Murni

Virus mumi yang dihasilkan selanjutnya dikamkterisasi uatuk mengetabui

tingkat kemurniannya p t u d e n p wa sebagai beriht.

Speldrofotometri

Tingkat kemurni an virus di ukur menggunakan spektrofotometzr pada

panjang geiornbang 220- 300 nm. Berdasdan absrbansi sampel pa& partjag

gelom bang A 2601280 dapat dihitung konsentrasi dan tingkat kernurniannya.

Elektroforesis protein secara SDSPAGE

Berat molekul protein selubmg virus mumi d~ukur dengan menggunakan

s d i u m &cyl sut'phte-plyacryImide gel elecimphresis (SDS-PAGE)

mengrkuti metode Leammli (Gall et a/. 1980).

Preparasi sampel

Suspensi virus mumi dicampur dengan penyangga Tris-HCl 0,l M, pH

83, yang mengandung SDS 4 0/4 2 - m e r k a p t ~ o I 2% dan bromofenol biru

0,001% (dengan volume yang m a ) . Carnpm d i p a n a h sampai mendidih

(1 00 C) selama 2 menit. SeteIah dingin sebanyak 15 ul dimasukkan ke dalam

lubang get poliakrilamid 10% darn penyangga Tris-HC1 pH 8,3 yang

mengandung glisin 0,2 M dan SDS 1%. Bea-at rnol&ul standm (marker protein,

da1m dalton) yang digunakan dalah myosin (205.000), B-gaIaktosicdase

( 1 20.0001, bovine semm albumin (84.000), woIbumine (52.200), carbonic

anhydrare (36.300), soybean bypin inhibitor (30.200), lysmime (2 1,900 j dan

aprotemin (7.400).

Preparasi gel

Gel pemisah dibuat den@ cara mencampur akrilamid 1 P? dengan bis-

akrilamid 0,294, Tris-HCI 0,375 M pH 8,8, SDS 0,lX Teaned 0,025% dm APS

(amonium pem!phate) 0,025%. Setelah tercampw mta kemudian dimasukkan ke

dalam pelat gelas yang telah dipasang pa& gel sland. Permukstan atss gel

diratakan dengin menambah butanol, dm setelah 30 menit butanol dibuang

Stacking gel dibuat dengan can mencampur akrilamid 3% dengan bis-

akrilamid O,O$%, Tris-HC1 0,125 h4, pH 6 3 , SDS O,lD/o, Temed 0,025%&

APS 0,025%. C a m p m tersebut selanjutnya dituang di atas gel pemisab yang

sudah dipsang sisir, setelah membeku sisir dicabut dm gel siap d i g m a h .

Pewarnarn dengan Cmmmb blue

Setelah elektroforesis, gel direndam dalam ssam asetat glasid 12,5 %

selama 5 menit kemudian direndam dalam larutan Cwmassie blue 025% sambil

~ P E N E ~ D A N P E M B A H @ A N

Pemuraian dan V l

Z o n a v j n r s y a n g ~ ~ t i d a k m m m ~ ~ p i t a ( % c w d ) y a n g

bertrarrts tegas p g men ~ ~ ~ Y i n r s b t m k Tid&tc&em&am

y i m swam j h mm@ dise.Wkan frsrena k m t d sesium d & t ymg

di- mtuk m&t @en ampun waldu ultraseutriibgpsi ymg bIm

tepat. . O l e b ~ i t a a m e ~ d i t ~ I m d i a a s ~ t a b u q g ( G a m b s r

V. 1). Untuk mqptahui kandmgm vhmya m h am virus mebut (volume

Misr 1 d) seiqjmqa dihgmenjadi b faksi.

virus mulai terdeteksi pada lapsan di bawahnya yAtu pada W i k e 2 sampai

ke-5. Salab satu W s i tersebut yaitu h k s i ke-4, nilai a b w h m i pada pmjang

gelombang 260 nm sekitar 1,83. Pada fhksi tersebut mempuuyai tingkat

kernmian yang cukq tinggi yaitu ditunjukhn dengn nisbab A 2601280 =

1,83/1,23 = 1,48 (Gambar V.2). Berdasarkad ammi extinction coeflctent atau

E O,lD/dI cm pada A260 nm= 7,7, total virus murni y m g d i h a s i b dmi 250

gram bshan segar ( W i ke 2 sampai 5 ) adalah sekitar 220 ug.

Tingkat kemuroian hasil dm rendemen pemurnian tmyata

bavan'asi antara kelompok @virus. Menggunakan metode ymg sama tetapi

berkda jenis vinrsnya dm inaag perbmyakmya diperoleh hail yang berbeda.

M e n W met& pernudm yang sama, pad& pernumian geminivirus, yaitu

Tomato y e l h leaf cud (TYW) menggmakan hang -yakan tomat

diperoleh basil sekitmrr 80 ug dari 1 kg babm %gar denm nilai A 260/280 = 1,85

(Atlathom ei al. 1990). Hamilton e? al. (1981) memumikan TYL€ menggumkan

bang perbanyakan n! b e n t b i m m dengan metode lain mempm1eh hasil sekitar

5 - 10 mg dmi 1 kg bahan sew. Selain jenis virus, metade ymg dipakan dm

inang perbanyakan, tin&at kestabilan virus juga bqmgaruh ?mar tdadap

rendemen hasil pemm'nnnnya.

Pads SLCV dari 100 g bahan segar dhasilkan virus mumi 130 ug

dengan nilai A 2601280 = 1.5 (Cohen el 01. 1983). Pemurnian MYMV diperoleh

sekitar I rng dari 1 kg bahan segar yang diperbyak p a tanaman buncis dm

nilai A 2601280 = 1,3 - 1,4 (Honda et al. 1 983). KestabiIan geminivirus selain

dapat dinilai berdasarkan tingginya hasil (konsentmi virus) yang diperoleh, juga

dapt dinilai berdasarkan had pengpmatan menggunakan &&op elehmn

Kestabilan geminivirus dapat diketahui berdasarkan jumlah partikel pada setiap

bidang pandangaa yang sangat tinggi dan k t u k partikelnya masih banyak yang

bepasangan (geminate) , clan ha1 ini tampak pada SUlV dan MYMV (Cahen et

a/. 1983, Horlda etal. 1983).

Analisis SDS - PAGE

Melalui andisis den@ SDS-PAGE diketahui berat molekul protein

selubung partikel virus hasil pemurnian sekitar 29 ma. Berdasafkan kriteria

International Committee on Taxonomy of V i m e s (ICTV), virus tersebvt

tennasuk dalm kelornpok geeminivirus. Berat molekul protein selubung anggota

kelompok geminivirus ternyata bervariasi antara jenisnya, misdnya TYLCV yang

menyerang tomat mempunyai BM sekitar 32 kDa (Kato et al. 1998), BGMV

yang menyerang buncis BMnya &tar 28 kDa (Mamilton et al. 1983), Sweet

p o i m leaf mrf v i m (SPLCV) BMnya sekitar 30 kDa (Onuki et d. 2000),

TYLCV 32 kDa (Kato er al. 19981, dan Bean dwuj mosaic virus (BDMV)

sekitar 27,5 kDa (Modes er al. 1990).

~~hhiug ~ v h w yang paling jalm @atah 110.3 yahg 'b- dari fhbi k M

r t ibianhgbu pita no 1 dan 2 ymg b d dati frWsi ke-2 dm k* 3. T&al

tiphyt pita ymg t&mt& bah$?mgm mat deq$u FEandwngm damya.

l3mbdm pmgam@n mar&udm spkhbfotmbteq pa& fmbi ke-2

m&gvitus~m4Oug d m d w i % i b 3 d d t & mug.

GambarV.3. p'& di@@&b M k ' m m: SDSf AGE U m q a n : ah, fl-3) kisii- &,Z, L; 3 , i h ' k e 4).

penyebab penyakit dam keriting kuning cabai dengan menggunakan tamman

ceplukan sebagai inang perbanyakan memberikan hasil dan tingkat kemurnian

yang lebih tin@ dihdingkan d e n p menggunakan tamman n! b e n t h i a m

ataupun t omst. Menggunakan ceplukan sebagai inang perbanyakan hail

pemurniannya lebih baik, hal ini mungkh karena h d m ~ idibitornya sangat

rendah sehingga tidak merusak partikel virus selama proses pernumian.

P. Jorihna (ceplukan) sangat prospektif digunakan sebagai hang

perbanyakan gerninivirus. Biji taaaman tersebut banyak dm mudah diperoleh,

mudah ditanam dan dipelihm. Sifat batang ceplukan yang sukulen sangat

rnenguntungkan karma sernua bagian trtnaman dapat digudcau sebagai bahan

pernumian dan &an mempemudah ekstrakslnya , sehinggst proses pernumian

dapat lebih mudah, cepat dan m e n d a n resiko terjadinya proses oksidasi.

Terjadinya proses oksidasi sering menjadi kendala dalam setiap proses

pernumian virus tumbuhan.

Ukuran partikel gerninivims yang relatif kecil dm sifatnya yang tidali

stabil sangat krpengaruh terhadap hasil pernumian. Metode pemumiau yang

digunakan pada penelitian ini relatif cepat, prosesnya sederhana dan mudah

dibandingkan dengan metde lain. Semakin cepat dan sederhana metode yang

digunakan, degradasi virus karena proses oksidasi makin di perkecil sehngga

diperoleh partikel virus dengan konsentd tinggi dan tidak d.

KESIMPUW

P. f r o r i h sangat prospektif diguuakan sebagai hang perbanyakan

geminivirus isolat cabai karma mudah dibudidayakan, cepat pertumbuhannya,

&pat dipanen berulang kali, dan batangnya bersil%t sdden sehingga

mempermudah proses ekstraksi.

P. $lorickma yang diinokulasi virus penyebab penyakit daun keriting

kuning cabai menghasil kan virus murni cukup tinggi yaitu sekitar 220 ug dari

250 gram bahan segar. Pada M s i ke-4 dari wna virus mernpunyai nilai A 260 =

1,83 dan tingkat kemurnian ymg cukup tinggi dengan nisbah A 2601280 =

1,48. Bedasarkan andisis elektrofds secara SDS-PAGE , ukuran protein

selubung gemhivirus penyebab penyakit daun keriting kuning sekitar 29 kDa.

DAFTAR PUSTAKA

Attathorn S, Chiemsombat P, Sutabutra T, Pongpanitanmd R 1990. Characterization of nucleic acid of Tomato yeIIow leqfcurl virus. Kasetsut~ J flat. Sci. S W . ) (24) : 1 -5.

Cohen S, Duffus JE, Lrtrsen RC, Liu HY, Flock RA. 1983. Pllrifimtion, serology, and vector relationships of %uash leaf curl v i m a whitefly trausmitted gemhivirus. P&toparhol 73: 1669 - 1673.

Gall 0, Medgyesi G A, Verezkey L. 1980. Electmphoresis in the separution of biological macromolecules. New York: Job WilIey & Sons.

Hamit ton WIXI, Sanders RC, Coutts RHq Buck KW. 198 1. Mtcrubiology Leliers 1 I : 263 - 267.

Honda Y, Iwaki M, Saito Y. 1983. Mechanical transmission, purification, and some properties of whi tefly-borne Mungbean yellow mosaic v i m in Tnai land. Plant Dis 67:80 1 - 804.

Kato K, Olluki M, Fuji S, Hanada K. 1 998. The first occurrence of Tomalo yellow leaf curl virus in tomato (Lycopersicon esculeniwn Mil I . ). Jpn Ann Phyropthol Soc 64: 552 - 559.

Matthews REF. 1 992. Foundomental of Pi& Vimlogv. Academic Press. Morales F, Niessen A, Ramirez B, Castano M 1990. Isolation and partial

characterization of a geminivirus causing Bean dwarf mosaic. PhytopthoI 80: 96 - 1 0 1.

Onuki M, Honda Y, Hanada K. 2000. Geminate particle morphology of Sweet potato leqf curl v i m in partially purified preparation and its serological relationship to two Begornoviruses by western blotting. J Gen Plant Pathol 66: 1 82 - 184.

Sulandari S, Hidayat SH, Suseno R, Jumanto El, Sosrommno S. 2003. Pen@ j d s hang perbanyakan terhadap kualitas h i 1 purnim gemimvirus isolat cabai. Seminar Regional PFI KO& Jateng&DIY. UPN Veteran, Yogyakarta

Stenger DC, Duffus JE, Vilalon B. 1590. Biologid and g e n d c properties of geminivirus isolated from pepper. Phytopthd 80: 704 - 709.

Trisusi~owati EB. 1989. Studi sifal v i m psrtyebab penyubt h m p k p a h tanaman iembakarr flicorium rubmum L.). Disertasi $3 Program Pasca Sajana Institut Pertanian Bogor.