83

Sekuen Nukleotida Gene Shiga like toxin-2 dari Isolat

Lokal Escherichia coli O157:H7 asal Hewan dan Manusia

(NUCLEOTIDES SQUENCES OF SHIGA-LIKE TOXIN 2 GENES OF ESCHERICHIA COLI

O157:H7 LOCAL ISOLATES ORIGINATED FROM ANIMALS AND HUMAN)

I Wayan Suardana1, Dyah Ayu Widiasih2

Komang Januartha Putra Pinatih3

1Bagian Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Udayana, Jln. Sudirman Denpasar, Bali Tlp.(0361) 22379;

E-mail: iwayansuardana22@yahoo.com2)Bagian Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Gadjah Mada, Jl. Fauna No 2, Karangmalang, Yogyakarta 55281

E-mail: dawidiasih@yahoo.com.3)Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana,

Jl. PB. Sudirman Denpasar, Bali;, Indonesia

E-mail: kjanuartha@yahoo.com

ABSTRAK

Hewan ternak khususnya sapi, dikenal sebagai reservoir utama Escherichia coli O157:H7. Sebagai

satu-satunya serotipe E. coli yang bersifat zoonosis, patogenitas bakteri ini ditentukan oleh kemampuannya

untuk menghasilkan satu atau lebih cytotoxin yang sangat potensial yang dikenal dengan nama Shiga-

like toxin (Stx) atau verocytotoxin, khususnya dari jenis Stx2 yang terkait erat dengan kejadian hemolytic

uremic syndrome (HUS) pada manusia. Studi ini bertujuan menganalisis susunan nukleotida dari gen

stx2 antara isolat asal hewan dan manusia dalam upaya mengkaji potensi zoonosis yang ditimbulkannya.

Kegiatan penelitian diawali dengan kultivasi 20 isolat E. coli O157:H7 koleksi hasil penelitian sebelumnya

dengan rincian dua isolat asal tinja sapi, dua isolat asal daging sapi, dua isolat asal tinja ayam, dua

isolat asal tinja manusia non-klinis dan 12 isolat asal tinja manusia klinis (asal penderita gagal ginjal).

Isolat sebanyak 20 tersebut dikonfirmasi pada media selektif sorbitol Mac Conkey agar (SMAC) yang

dilanjutkan dengan uji latex O157 aglutination test serta uji antiserum H7. Analisis molekuler komplit

gen stx2 yang meliputi open reading frame (ORF) dari gen stx2 dilakukan menggunakan primer rancangan

peneliti yaitu Stx2(F)/Stx2(R). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada dua isolat yaitu KL-48(2) asal

tinja manusia dan SM-25(1) asal tina sapi positif membawa gene stx2 yang ditandai dengan produk PCR

1587 bp. Analisis hasil sekuensing menunjukkan kedua isolat memiliki susunan gene stx2 yang identik

dengan E. phaga 933 dan E. coli ATCC 43894. Hasil ini mengindikasikan kedua isolat lokal berpotensi

sebagai agen zoonosis dengan efek klinis yang serupa dengan E. phaga 933 dan E. coli ATCC 43894.

Kata-kata kunci: E. coli O157:H7; gen stx2; hemolytic uremic syndrome; zoonosis

ABSTRACT

Animals/livestock, especially cattle, are known as the main reservoir of Escherichia coli O157: H7. As the

only one of zoonotic E. coli, the pathogenicity of these bacteria is determined by its ability to produce one

or more very potent cytotoxin known as Shiga-like toxin (Stx) or verocytotoxin, particularly of the Stx2 type

that is closely related to the incidence of hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans. This study analyzed

the nucleotide sequences of stx2 gene between isolates from animals and humans in an effort to assess the

potential zoonoses of the agent. The research activity was initiated by cultivating 20 isolates of E. coli

O157:H7 collection based on result in the previous study i.e. 2 isolates originated from cattle feces, 2

isolates originated from beef, 2 isolates originated from chicken feces, 2 isolates originated from human

faeces and 12 non-clinical isolates originated from human fecal who were suffering with renal failure. All

isolates were confirmed on selective medium Sorbitol MacConkey Agar (SMAC) followed by testing on

aglutination O157 latex test, and H7 antisera. Molecular analysis of stx2 gene covering open reading

Jurnal Veteriner Maret 2017 Vol. 18 No. 1 : 83-93pISSN: 1411-8327; eISSN: 2477-5665 DOI: 10.19087/jveteriner.2017.18.1.83Terakreditasi Nasional, Dirjen Penguatan Riset dan Pengembangan, online pada http://ojs.unud.ac.id/php.index/jvetKemenristek Dikti RI S.K. No. 36a/E/KPT/2016

84

PENDAHULUAN

Sapi dikenal sebagai reservoar utama

Escherichia coli O157:H7 meskipun beberapa

jenis ternak lainnya seperti unggas, kambing,

domba, dan babi, juga diketahui berpotensi

sebagai penular agen zoonosis ke manusia

(Naylor et al., 2005; Karmali et al., 2010).

Terjadinya kontaminasi silang antara daging

dengan feses dalam tahapan prosesing,

penanganan sampai pemasaran dalam suatu

mata rantai pengadaan bahan pangan, proses

pemasakan yang tidak cukup, diduga

memberikan sumbangan yang cukup besar

terhadap munculnya kejadian food borne

infections oleh E. coli O157:H7. Penularan

melalui susu ataupun air yang terkontaminasi

feses juga sering dilaporkan (Radu et al., 2001).

Patogenitas E. coli O157:H7 sebagai satu-satu-

nya serotipe yang bersifat zoonosis, ditentukan

oleh kemampuannya menghasilkan satu atau

lebih cytotoxin yang sangat potensial yang

dikenal dengan nama Shiga-like toxin (Stx) baik

Stx1 maupun Stx2. Selain itu, kemampuan dari

bakteri ini melakukan penempelan dan

perlekatan terutama pada sekum dan kolon pada

tubuh inang (Krauss et al., 2003). Toksin Stx1

dan Stx2 yang dihasilkan oleh strain E. coli

ini, diketahui memiliki efek dalam jenis dan

derajat kerusakan jaringan yang berbeda pada

tubuh inang. Toksin Stx1 lebih terabsorpsi oleh

sel epitel usus yang berlanjut pada terjadinya

diare berdarah, sedangkan toksin Stx2 yang

bersirkulasi pada aliran darah selanjutnya

menuju ke ginjal dan berikatan dengan reseptor

globo series globotriaosylceramide (Gb3) yang

berdampak pada terjadinya kerusakan endotel

glomerulus ginjal sehingga terjadi hemolytic

uremic syndrome (HUS) (Bahrun Dahler, 2002;

Fraser et al., 2004; Cadirci et al., 2010). Me-

ngacu pada potensi zoonosis agen E. coli

O157:H7 yang cukup tinggi, serta memper-

timbangkan tingginya kejadian gagal ginjal

pada manusia akibat toksin Stx-2 E. coli

O157:H7 sebagai salah satu kausanya, maka

kajian analisis nukleotida komplit gene Stx2

dari isolat E. coli O157:H7 asal hewan dan

manusia menjadi penting diungkap.

METODE PENELITIAN

Kultivasi Stok Isolat

Kultivasi terhadap 20 isolat stok (tersimpan

dalam gliserol 30% dengan suhu penyimpanan

-20OC) yang terdiri dari satu isolat kontrol positif

E. coli ATCC 43894 serta dua isolat asal tinja

sapi, dua isolat asal daging sapi, dua isolat asal

tinja ayam, dua isolat asal tinja manusia non-

klinis, dan 12 isolat asal tinja manusia klinis

(asal penderita gagal ginjal). Keseluruhan isolat

ditumbuhkan kembali pada media selektif

Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) (Oxoid CM

0813), yang dilanjutkan dengan uji konfirmasi

menggunakan uji aglutinasi lateks E. coli O157

(Oxoid DR 620M).

Isolasi DNA Genomik Bakteri

Tahap isolasi DNA genomik bakteri

mengacu pada prosedur pabrik. Isolat E. coli

O157:H7 yang diinokulasi pada media Luria

Bertani/LB dipanen dengan cara sentrifugasi

(Beckman Microfuge 11) 7500 rpm selama 5

menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet

sel ditambah 180 µL tissue lysis buffer (Buffer

ATL) dan 20 µL larutan proteinase K (600 mAU/

mL) selanjutnya divortekS (Thermolyne

Maximi) selama 15 detik. Larutan kemudian

ditambahkan 200 µL lysis buffer (Buffer AL),

divorteks selama 15 detik, diinkubasikan pada

wáterbath suhu 56OC selama 10 menit,

ditambahkan 200 µL etanol absolut 96%, dan

divorteks selama 15 detik. Lysate E. coli yang

diperoleh digunakan untuk binding DNA.

Lysate dimasukan ke dalam penyaring yang

terletak dalam tabung kecil 2 mL (QIAamp

Mini spin column) dan dipusing dengan

kecepatan 6000xg (8000 rpm) selama satu

menit. Sisa cairan dibuang, dan filter yang telah

mengandung DNA dimasukan ke dalam tabung

kecil 2 mL yang baru untuk selanjutnya

dilakukan tahapan washing DNA. Filtrat DNA

frame (ORF) of the stx2 gene was performed using the primer which was designed by researcher i.e. Stx2 (F)

/ Stx2 (R). The results showed, there were 2 isolates i.e. KL-48 (2) originated from human feces and SM-25

(1) originated from cattle feces were positive for carrying a stx2 gene, which was marked by the 1587 bp

PCR product. Analysis of sequencing showed both isolates had identical to stx2 nucleotide squences with

E. phaga 933 as well as E. coli ATCC 933. These results indicate the both local isolates are potential as

zoonotic agents with clinical effects similar to E. phaga 933 and E. coli ATCC 43894

.

Key words: E. coli O157:H7; gene stx2; hemolytic uremic syndrome; zoonoses

Suardana, et al Jurnal Veteriner

85

Sekuensing Hasil Amplifikasi Komplit

Gen stx2

Analisis produk amplifikasi dilakukan

dengan sekuensing produk amplifikasi komplit

gen stx2 di Eijkman Institute for Molecular

Biology (Jakarta) menggunakan Big Dye

Terminator dengan alat ABI PRISM 3130 dan

3130 xl Genetic Analyzer. Data hasil sekuensing

dianalisis dengan program Molecular

Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) version

4.0 (Tamura et al., 2007). Sekuen yang diperoleh

setelah diedit dianalisis dengan metode Basic

Local Alignment Search Tool (BLAST) pada

Genebank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

Blast.cgi) dengan data nukleotida dan asam

amino yang tersedia di Genebank. Hubungan

evolusi dan pohon filogeni ditentukan

berdasarkan metode Neighbor-Joining (NJ)

(Saitou dan Nei, 1987). Nilai persentase replikasi

pohon dari taksa/isolat yang membentuk clade

diolah dengan bootstrap test 1000 dan

diperlihatkan dekat cabang, serta analisis

struktur proteinnya dilakukan dengan program

DDBJ GTOP.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi Komplit Gen Stx2

Amplifikasi komplit gen stx2 yang meliputi

daerah open ORF dilakukan pada isolat asal

hewan atapun manusia yang memiliki

similaritas yang tinggi. Dalam penelitian ini

berhasil teramplifikasi pada isolat KL-48(2) asal

manusia dan isolat SM-25(1) asal sapi, di

samping juga isolat kontrol ATCC 43894 dengan

hasil amplifikasi seperti Gambar 1.

ada Gambar 1 disajikan bahwa ketiga isolat

yaitu KL 48(2) asal manusia sakit dan isolat

SM 25(1) asal tinja sapi yang secara jelas dan

konsisten teridentifikasi membawa komplit gen

stx2 seperti halnya kontrol ATCC 43894 pada

jalur nomor 1 dengan panjang produk 1587 bp.

Hasil pada Gambar 1 sekaligus menunjukkan

bahwa waktu optimasi untuk amplifikasi DNA

target sudah cukup serta desain primer yang

dirancang peneliti juga sudah optimal.

Terdeteksinya komplit gen stx2 pada isolat

asal feses manusia sakit (penderita gagal ginjal)

dan isolat asal feses sapi, menguatkan hipotesis

bahwa isolat E. coli O157:H7 tersebut berasal

ditambah 500 µL wash buffer (buffer AW1) dan

didiamkan selama lima menit, dipusing dengan

kecepatan 6000xg atau 8000 rpm selama satu

menit. Sisa cairan tertampung dibuang dan

diganti dengan tabung kecil 2 mL yang baru.

Wash buffer (buffer AW2) sebanyak 500 µL

ditambahkan dan didiamkan selama lima

menit. Tabung kecil dipusing dengan kecepatan

penuh 14.000 rpm selama tiga menit, sisa cairan

yang tertampung dibuang dan dilanjutkan

untuk eluting DNA. QIAamp Mini spin column

yang mengandung DNA dimasukan ke dalam

tabung kecil (Nunc, Inc) steril baru,

ditambahkan 50 µL elution buffer (buffer AE),

didiamkan pada suhu kamar selama lima

menit, dan dipusing dengan kecepatan 6000xg

atau 8000 rpm selama satu menit untuk

selanjutnya disimpan pada 4OC.

Amplifikasi Komplit Gen stx2

Analisis komplit gen stx2 yang meliputi

daerah open reading frame (ORF) gen stx2

dengan prosedur PCR dilakukan pada total

volume 27 µL yang mengandung 1,5 µL DNA

templet (300 ng/µl), 17 µL FastStart PCR

Master, 6,5 µL water PCR-grade dan 1 µL

masing-masing primer rancangan peneliti yaitu

primer Stx2(F): 5’-GCCATTAGCTCATCGGGATA-’3 dan primer Stx2(R): 5’-

CGAATGCTCAGTCTGACAGG-’3 konsentrasi

20 pmol/µL. Amplifikasi dilakukan pada mesin

MJ Mini Personal Thermalcycler Biorad model

PTC-1148 dengan kondisi pre-denaturasi pada

suhu 94OC selama tujuh menit, diikuti 35

siklus dengan kondisi denaturasi 94OC selama

satu menit, annealing pada 60OC selama 35

detik, dan polimerisasi pada suhu 72OC selama

1,5 menit. Pada bagian akhir ditambahkan

dengan polimerisasi pada suhu 72OC selama

lima menit. Setelah reaksi selesai, sebanyak 4

µL produk PCR dicampur dengan 2 µL 5 x DNA

loading dye (blue/orange loading dye) dan

dielektroforesis pada gel agarose 1% yang telah

diisi GoldViewTM Nucleic Acid Stain 5 ml/30 ml

agar, bersama dengan Marker 100 bp DNA

Ladder (Invitrogen cat.no. 15628-019) dalam

buffer TBE 1 X. Elektroforesis dilakukan pada

tegangan 100V selama 35 menit. Visualisasi

band yang muncul dilakukan dengan UV

transilluminator dan difoto dengan kamera

digital FE-270 7,1 Megapixel.

Jurnal Veteriner Maret 2017 Vol. 18 No. 1 : 83-93

86

dari sumber yang sama serta diduga memiliki

ciri genetik yang hampir sama dengan E. coli

O157:H7 ATCC 43894 sehingga berpotensi besar

sebagai agen zoonosis seperti yang diungkapkan

oleh Krauss et al. (2003). Untuk lebih

memastikan susunan nukleotida penyusunnya,

perlu dilakukan konfirmasi berdasarkan hasil

sekuensing. Foley et al. (2004) menyatakan

bahwa DNA sekuensing merupakan suatu

metode yang lebih menjanjikan, mudah

dikerjakan dan merupakan instrumen pembeda

yang sangat akurat.

Analisis Nukleotida Open Reading Frame

(ORF) Gen Stx2

Analisis untuk mengetahui susunan

nukleotida dari komplit gen stx2, produk PCR

dari komplit gene stx2 isolat KL 48(2) asal

manusia sakit dan isolat SM 25(1) asal feses sapi,

serta isolat kontrol ATCC 43894 selanjutnya

disekuensing di Eijkman Institute for Molecular

Biology (Jakarta) baik dari sisi forward

menggunakan primer Stx2(F) maupun dari sisi

reverse menggunakan primer Stx2 (R). Hasil

sekuensing daerah ORF setelah dialignment

seperti pada Tabel 1.

Gambar 1. Deteksi open reading frame (ORF)gene stx2 dengan primer Stx2(F)dan Stx2(R) pada agarose 1%.Jalur 1 kontrol positif : ATCC43894; jalur 2: KL(48(2) dan jalur3: SM25(1), M: Marker 100 bpDNA Ladder (Invitrogen Cat.15628-019).K-: Kontrol negatif.

Tabel 1. Alignment susunan nukleotida (berukuran 1241 nt) daerah open reading frame (ORF)

dari gene stx2 E.coli ATCC 43894, KL-48(2) dan SM-25(1) dengan beberapa isolat lainnya

di genbank dengan program clustal W

Suardana, et al Jurnal Veteriner

87

Lanjutan Tabel 1

Jurnal Veteriner Maret 2017 Vol. 18 No. 1 : 83-93

88

Lanjutan Tabel 1

Suardana, et al Jurnal Veteriner

89

Lanjutan Tabel 1

Jurnal Veteriner Maret 2017 Vol. 18 No. 1 : 83-93

90

Lanjutan Tabel 1

Suardana, et al Jurnal Veteriner

91

Lanjutan Tabel 1

Jurnal Veteriner Maret 2017 Vol. 18 No. 1 : 83-93

92

Pada Tabel 1 disajikan bahwa dari 1241

nukleotida yang dialignment, (keseluruhan

daerah ORF gen stx2) menunjukkan bahwa

susunan nukleotida gen stx2 isolat E. coli ATCC

43894, KL-48(2) asal feses manusia penderita

gagal ginjal dan SM-25(1) asal feses sapi

memiliki susunan yang sama dengan faga 933W

yang merupakan faga yang dibawa oleh E. coli

EDL 933 asal manusia sebagai penyebab wabah

E. coli O157:H7 tahun 1982 di Amerika. Bakteri

E. coli EDL 933 diketahui sebagai strain yang

sangat virulen dengan gejala timbulnya rasa

keram yang menyeluruh di abdominal yang

diawali dengan terjadinya diare tanpa darah

ataupun dengan darah. Strain ini juga

dibuktikan sangat virulen pada saluran cerna

babi dan diasumsikan bersifat sangat berbahaya

pada manusia (Ding et al., 2010).

Di sisi lain, isolat KL-48(2) dan SM-25(1)

memiliki susunan nukleotida yang sangat

berbeda jika dibandingkan dengan isolat E. coli

O157:H7 strain 98-16 (AB168106) asal feses

manusia di Jepang, serta strain lainnya yaitu

Thai-12 (AB168110) dan Thai-1 (AB168108) asal

daging sapi, strain Thai-13 (AB168111), strain

144 (AB168104) dan strain Fu40 (AB168103) asal

feses sapi. Hasil alignment terhadap strain-

strain tersebut, strain lokal KL-48(2) dan SM-25(1) menunjukkan adanya perbedaan

nukleotida berupa substitusi transisi (urutan

nukleotida ke-45, 72, 93, 369, 513, 753, 867, 971,

1009, 1037, 1074, 1079, 1085, 1091, 1094, 1103

dan 1109), serta substitusi transversi (urutan

nukleotida ke-108, 765, 831, 1097 dan 1099).

Selain itu, urutan nukleotida berupa substitusi

transisi ke- 369 dan ke-513 dapat digunakan

sebagai marker nukleotida untuk membedakan

isolat E.coli O157:H7 strain 98-16 dengan

beberapa isolat E. coli lainnya, termasuk dengan

isolat Indonesia KL-48(2) dan SM-25(1).

SIMPULAN

Isolat KL-48(2) asal manusia memiliki

susunan nukleotida komplit gen stx2 yang

identik dengan isolat SM-25(1) asal sapi,

demikian pula halnya dengan E. phaga 933W

maupun dengan E. coli ATCC 43894 sebagai

agen infeksi dengan kemampuan toksin Stx2

yang mematikan.

SARAN

Diketahuinya susunan genetik gen stx2

yang identik antara isolat lokal E. coli O157:H7

dengan strain referen yang diketahui memiliki

sifat virulensi tinggi, disarankan untuk

melakukan kajian lebih lanjut terhadap

tampilan fenotif dari gen stx2 melalui uji pada

hewan coba ataupun pada kultur sel.

UCAPAN TERIMA KASIH

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan

terima kasih kepada pihak Direktorat Jenderal

Pendidikan Tinggi-Departemen Pendidikan

Nasional yang telah mendanai penelitian ini

melalui dana penelitian Strategis Nasional

Tahap II Tahun Anggaran 2014 dengan kontrak

No. 239.14/UN 14.2/PNL.01.03.00/2014,

Tanggal 14 Mei 2014.

DAFTAR PUSTAKA

Dahler B. 2002. Sindrom Hemolitik Uremik.

Buku Ajar Nefrologi Anak. FK-UI. Jakarta.

Cadirci O, Siriken B, Inat G, Kevenk TO. 2010.

The prevalence of Escherichia coli O157 and

O157:H7 in ground beef and raw meatball

by immunomagnetic separation and the

detection of virulence genes using multiplex

PCR. Meat Sci 84: 553-556.

Ding H, Zhang R, Liu K, Huang L, Tian M,

Jiang M, Zao Q, Mao X. 2010. Escherichia

coli O157:H7 EDL 933 has a strong

virulence to bama miniature pigs by

injection and fails to colonize to their

gastrointestinal tracts. Afr J Microbiol Res

4(16): 1742-1746.

Foley SL, Simjee S, Meng J, White DG,

McDermott PF, Zhao S. 2004. Evaluation

of molecular typing methods for E. coli

O157:H7 isolates from cattle, food, and

humans. J Food Protect 67(4): 651-657.

Fraser ME, Fujinaga M, Cherney MM, Melton-

celsa AR, Twiddy EM, O’Brien AD, James

NG. 2004. Structure of Shiga toxin type 2

(Stx2) from E. coli O157:H7. J Biol Chem

279: 27511-27517.

Suardana, et al Jurnal Veteriner

93

Karmali MA, Gannon V, Sargeant JM. 2010.

Verocytotoxin-producing Escherichia coli

(VTEC). Vet Microbiol 140: 360-370.

Krauss H, Weber A, Appel M, Enders B,

Isenberg HD, Schiefer HG, Slenczka W,

Graevenitz AV, Zahner H. 2003. Zoonoses.

Infectious diseases transmissible from

animals to humans. 3rd Ed. ASM Press.

Naylor SW, Gally DL, Low JC. 2005. Review.

Enterohaemorrhagic E. coli in veterinary

medicine. Int J Med Microbiol 295: 419-

441.

Radu S, Ling OW, Rusul G, Abdul Karim MI,

Nisibuchi M. 2001. Detection of Escherichia

coli O157:H7 by multiplex PCR and their

characterization by plasmid profiling,

antimicrobial resistance, RAPD and PFGE

Analyses. J Microbiol Meth 46: 131-139.

Saitou N, Nei M. 1987. The Neighbor-Joining

method: a new method for reconstructing

phylogenetic trees. Molecular Biology and

Evolution 4: 406-425.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007.

Mega 4: Molecular Evolutionary Genetics

Analysis (MEGA) Software Version 4.0.

Molecular Biology and Evolution 10:1093/

molbev/msm 092.

Jurnal Veteriner Maret 2017 Vol. 18 No. 1 : 83-93

KEMENTERTAI{ RTSEE TEKNOLOGT, mxDIREKTbRAT JENDERAL PENGUATAN RISET B^Ii

DIREKTORAT PENGELOLMN KEKAYM}I

Sefiit:hntKutipan dari Keputusan Direktur Jenderal Penguata;: Rrset dar,

Pengernbangan Kementerian Riset, Teknoiog:,dan Pendidikan Tinggi Republik lndonesia

Nomor:36a/E/KPT/2015, Tanggal 23 Mei 20lGTentang Hasil AkreCitasi Terbitan BerKala llmiah CetaL

Periode I Tahun 2016

Ditetapkan sebagai Ter[:itan Bei'kala llrnra]r

TEBAT(NIIE}TTASH

r\kre,:itasi sebagainran;r terseout cii aias berlal'u sela';ia5 (lima) tai'rtlr sgial< drteta*rkan

G

Ja!,:ar'ttr- 30 i\4ei 703,6ei+liran rlekay;,a n intel*xtri;li,prg;rgt:n ilisel da. Pe. ger- eangan

/

1e8508 1oEl

rr=[trilI-r- --*rillTf k--I'

a_:

Kutipan dari Keprmrsan Direktur ienderal Pendidikan TinggiKem e n terla n Pend idi kalil*ioufl I Repub I ik lndon esla

1.cover2..J.Vet 18(1) Tahun 2017 (Akreditasi)3.J.Vet 18(1) Tahun 2017Akreditasi Mei 2016Akreditasi Nop. 2011