UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL

BUAH Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl TERHADAP

LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE

SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA KEDOKTERAN

OLEH :

AYU RESKIANINGSIH

NIM: 1111103000092

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1435 H/2014 M

v

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan

karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian ini. Penulis

menyadari bahwa laporan ini dapat terselesaikan tepat waktu berkat dukungan dan

bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih

kepada :

1. Prof. Dr (hc). dr. M. K. Tadjudin, SpAnd, dr.H.M. Djauhari Widjayakusumah,

AIF.,PFK, Dr.H.Arif Sumantri, SKM, M.Kes dan Dr. Delina Hasan, M.Kes, Apt

selaku Dekan dan pembantu Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. dr. Witri Ardini, M.Gizi, SpGK selaku Ketua Program Studi Pendidikan

Dokter atas bimbingan yang diberikan selama penulis menempuh pendidikan di

PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ini.

3. dr. Nurul Hiedayati, PhD selaku pembimbing 1 yang telah banyak mencurahkan

waktu, pikiran dan tenaga untuk membimbing penulis dalam melakukan

penelitian dan menyusun laporan penelitian ini. dr. Nurul Hiedayati, PhD juga

selaku PJ Laboratorium Farmakologi yang telah memberikan izin penggunaan

laboratorium bahkan walau telah lewat jam penggunaan.

4. Bapak Supandi, M.Si, Apt selaku pembimbing 2 yang telah memberikan masukan

judul penelitian dan banyak mencurahkan waktu, pikiran dan tenaga untuk

membimbing penulis dalam melakukan penelitian dan menyusun laporan

penelitian ini.

5. dr. Flori Ratna Sari, PhD selaku penanggungjawab modul riset yang selalu

mengingatkan penulis untuk segera menyelesaikan penelitian.

6. Kedua orang tua kami, Masnur, S.Pd dan E r n i, S.Pd yang selalu mencurahkan

kasih sayangnya, selalu memberikan bimbingan dan arahan dalam melakukan hal

kebaikan serta selalu memberikan semangat untuk dalam menempuh pendidikan.

7. Pusat Konservasi Tumbuhan-Kebun Raya Bogor, Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI) yang telah bersedia memberikan surat keterangan tumbuhan

vi

sehingga buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl dapat digunakan dalam

penelitian ini.

8. Ibu Puteri Amelia, M.Farm, Apt selaku PJ laboratorium Farmakognosi dan

Fitofarmaka dan Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku PJ laboratorium Penelitian I yang

telah memberikan izin untuk penggunaan laboratorium.

9. Mbak Rani, Kak Lisna, Mas Rachmadi, Mas Panji, dan Mbak Ai sebagai laboran

yang telah bersedia membantu penulisan dalam pengambilan data.

10. Teman–teman sekelompok riset, Akbar Sepadan, Feby Wulandari dan Nurul

Khafidz S. Terima kasih atas kerja sama dan dukungannya selama 1 tahun untuk

menyelesaikan penelitian bersama–sama.

11. Teman-teman Program Studi Pendidikan Dokter angkatan 2011, dan semua pihak

yang telah membantu dan mendukung sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.

Penulis menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari kata sempurna.

Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik dari berbagai pihak. Demikian

laporan penelitian ini penulis susun, semoga dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu

pengetahuan.

Ciputat, 15 September 2014

Penulis

vii

ABSTRAK

Ayu Reskianingsih. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Toksisitas Akut Ekstrak

Metanol Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl Terhadap Larva Artemia salina

Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2014

Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) merupakan tumbuhan dari famili

Thymelaeceae. Tanaman ini mengandung beberapa senyawa aktif sehingga memiliki

potensi sebagai antikanker. Tujuan penelitian ini ialah untuk mengetahui potensi

toksisitas akut ekstrak metanol buah mahkota dewa terhadap larva Artemia salina Leach

yang akan ditunjukkan oleh nilai LC50 dengan menggunakan metode Brine Shrimp

Lethality Test (BSLT). Uji ini menggunakan 5 konsentrasi ekstrak yaitu 500 ppm, 100

ppm, 50 ppm, 25 ppm dan 12,5 ppm serta kontrol negatif dengan menggunakan air laut.

Tiap konsentrasi berisi 10 ekor larva. Dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Kematian

larva diamati setelah 24 pemberian ekstrak. Nilai LC50 dari ekstrak metanol buah

mahkota dewa adalah 81,09 ppm. Hasil LC50 < 1000 ppm menunjukkan bahwa ekstrak

metanol buah mahkota dewa bersifat toksik dan memiliki potensi sebagai antikanker.

Kata kunci : Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl), Uji Toksisitas Akut, Artemia salina

Leach, LC50

ABSTRACT

Ayu Reskianingsih. Medical Education Program. Acute Toxicity Test of Methanol

Extract of Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl on Artemia salina Leach Larva using

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. 2014

Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) is a plant from Thymelaeceae

family. This plant contain some active chemical compunds that have potency as

anticancer. The aim of this study is to investigate acute toxicity potency of methanol

extract of mahkota dewa fruit on Artemia salina Leach Larva shown by LC50 using

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. Five concentrations of extract used in this

test: 500 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm and negative control using sea

water. Each concentration contain ten larvas and performed three replications. Death

of larva observed 24 hours after giving the extract. LC50 of methanol extract mahkota

dewa fruit is on 81,09 ppm. LC50 < 1000 ppm showed that methanol extract of mahkota

dewa fruit is toxic and have potency as anticancer.

Keywords: Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl), Acute Toxicity Test, Artemia salina

Leach, LC50

viii

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ................................................................................................ i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................... ii

LEMBAR PENGESAHAN PEMBIMBING ..................................................... iii

PENGESAHAN PANITIA UJIAN ................................................................... iv

KATA PENGANTAR ......................................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................vii

DAFTAR ISI ..................................................................................................... viii

DAFTAR TABEL ................................................................................................. x

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii

BAB 1. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1. Latar Belakang .................................................................................................. 1

1.2. Rumusan Masalah............................................................................................. 2

1.3. Tujuan Penelitian .............................................................................................. 2

1.3.1. Tujuan umum ................................................................................................. 2

1.3.2. Tujuan khusus ................................................................................................ 2

1.4. Manfaat penelitian ........................................................................................ 2

1.4.1. Bagi masyarakat ............................................................................................ 2

1.4.2. Bagi instutusi ................................................................................................. 2

1.4.3. Bagi peneliti ................................................................................................... 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 4

2.1. Landasan teori................................................................................................... 4

2.1.1. Obat tradisional............................................................................................ 4

2.1.2. Mahkota dewa (Phaeria macrocarpa (Scheff) Boerl) ................................ 5

2.1.3. Simplisia ...................................................................................................... 7

2.1.4. Ekstraksi ..................................................................................................... 9

2.1.5. Toksikologi ................................................................................................ 13

2.1.6. Uji toksisitas akut ..................................................................................... 14

2.1.7. Uji toksisitas jangka pendek ...................................................................... 14

2.1.8. Uji toksisitas jangka panjang .................................................................... 14

2.1.9. Penentuan LC50 .......................................................................................... 14

2.1.10. Metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ............................................ 16

2.1.11. Larva udang Artemia salina Leach ............................................................ 17

2.2. Kerangka Konsep ........................................................................................... 23

2.3. Definisi Operasional ....................................................................................... 23

BAB 3. METODE PENELITIAN ...................................................................... 25

3.1. Desain Penelitian ............................................................................................ 25

3.2. Waktu dan Lokasi Penelitian .......................................................................... 25

3.3. Alat dan Bahan Penelitian ............................................................................. 25

3.3.1. Alat Penelitian ............................................................................................ 25

3.3.2. Bahan Penelitian .......................................................................................... 25

ix

3.4. Cara Kerja Penelitian ...................................................................................... 25

3.4.1. Determinasi tanaman ................................................................................... 25

3.4.2. Pembuatan ekstrak metanol buah mahkota dewa ....................................... 26

3.4.3. Penetasan larva udang ................................................................................. 26

3.4.4. Pembuatan konsentrasi ekstrak yang akan diuji ......................................... 26

3.5. Prosedur uji toksisitas dengan metode BSLT ................................................. 27

3.6. Pengolahan dan analisis data .......................................................................... 28

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 29

4.1. Hasil ekstraksi buah mahkota dewa................................................................ 29

4.2. Hasil uji BSLT ............................................................................................... 30

4.3. Penetapan LC50 .............................................................................................. 34

4.4. Keterbatasan Penelitian ................................................................................ 37

BAB 5. PENUTUP ............................................................................................... 39

5.1. Kesimpulan ..................................................................................................... 39

5.2. Saran ........................................................................................................39

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 40

LAMPIRAN ....................................................................................................... 45

x

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Ilustrasi konsentrasi ekstrak pada well plate ................................................. 28

Tabel 4.1 Data rendemen ekstrak buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl .............. 30

Tabel 4.2 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach ............................... 31

Tabel 4.3 Perhitungan LC50 dengan menggunakan metode probit ................................ 34

Tabel 6.1 Tabel probit ................................................................................................... 46

Tabel 6.2 Transformasi persen-probit ........................................................................... 55

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Buah mahkota dewa yang masih di pohonnya ................................ 6

Gambar 2.2. Buah mahkota dewa ......................................................................... 7

Gambar 2.3. Morfologi Artemia salina Leach ................................................... 17

Gambar 2.4. Siklus hidup Artemia salina Leach ................................................. 18

Gambar 2.5. Tahap penetasan telur Artemia ....................................................... 19

Gambar 2.6. Nauplii tingkat Artemia salina Leach ............................................. 20

Gambar 2.7. Bagian tubuh Instar II .................................................................... 20

Gambar 2.8. Bagian tubuh dewasa Artemia ...................................................... 21

Gambar 4.1. Grafik persentase mortalitas larva Artemia salina Leach pada uji

toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff.)

Boerl ............................................................................................... 32

Gambar 4.2 Grafik analisis regresi Linier konsentrasi ekstrak metanol buah

Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl ........................................... 35

Gambar 6.1. Alur penelitian ............................................................................... 45

Gambar 6.2. Keterangan determinasi tanaman .................................................. 47

Gambar 6.3 Keterangan bahan penelitian telur artemia .................................... 48

Gambar 6.4 Penghalusan simplisia .................................................................... 49

Gambar 6.5. Destilasi pelarut metanol ............................................................. 49

Gambar 6.6. Proses pemasukan simplisia ke botol maserasi ............................. 49

Gambar 6.7. Botol maserasi .............................................................................. 49

Gambar 6.8. Proses evaporasi dengan rotatory evaporator .............................. 49

Gambar 6.9. Ekstrak kental buah mahkota dewa ............................................. 49

Gambar 6.10. Neraca analitik ............................................................................. 50

Gambar 6.11. Proses penyaringan ....................................................................... 50

Gambar 6.12. Larutan induk 20.000 ppm ............................................................. 50

Gambar 6.13. Larutan ekstrak berbagai konsentrasi uji ...................................... 50

Gambar 6.14. Wadah penetasan telur artemia ..................................................... 50

Gambar 6.15. Well plate uji BSLT ...................................................................... 50

Gambar 6.16. Larva Artemia salina Leach di bawah mikroskop ........................ 57

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Alur penelitian ............................................................................... 45

Lampiran 2 Metode probit ................................................................................ 46

Lampiran 3 Surat keterangan determinasi tanaman ......................................... 47

Lampiran 4 Keterangan bahan penelitian telur Artemia .................................. 48

Lampiran 5 Gambar alat dan bahan penelitian ................................................ 49

Lampiran 6 Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol nuah mahkota dewa .... 51

Lampiran 7 Perhitungan penggunaan DMSO .................................................. 53

Lampiran 8 Transformasi persen-probit ............................................................ 55

Lampiran 9 Identifikasi Larva Artemia salina Leach ....................................... 57

Lampiran 10 Daftar riwayat hidup ....................................................................58

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penggunaan suatu jenis tanaman sebagai obat herbal merupakan suatu alternatif yang

dilakukan oleh masyarakat untuk mendapatkan pengobatan. Tanaman herbal yang diduga

memiliki potensi untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit terlebih dahulu harus

melewati beberapa tahap sebelum akhirnya dapat dijadikan suatu sediaan obat. Sesuai

dengan Permenkes No.760/Menkes/Per/IX/1992, yang membahas tentang obat tradisional

dan fitofarmaka, maka setiap bahan alam yang akan digunakan sebagai sumber obat, harus

melewati beberapa pengujian sehingga dapat memenuhi syarat yang telah ditentukan dan

aman untuk dikonsumsi masyarakat luas.1

Mahkota dewa adalah salah satu tanaman yang diharapkan berkhasiat sebagai

antikanker. Mahkota dewa adalah tanaman yang paling banyak tumbuh di benua Eropa dan

Asia. Tanaman ini memiliki senyawa aktif yaitu alkaloid, flavonoid, fenol/difenol, tanin

dan senyawa sterol/terpenoid. Senyawa-senyawa tersebut telah terbukti memiliki

mekanisme apoptosis selular dan sebagai antiproliferasi. 1,2

Tanaman ini terdiri dari akar, batang, daun, buah, biji dan bunga. Hampir seluruh dari

bagian tanaman tersebut telah dimanfaatkan sebagai obat herbal, seperti kulit dan daging

buah mahkota dewa yang telah diteliti oleh Vivi L,dkk telah terbukti berkhasiat sebagai

antikanker. Menurut penelitian Vivi L,dkk tahun 2006, buah Phaleria macrocarpa (Scheff)

Boerl memiliki potensi sebagai antiproliferasi dan memiliki fungsi sebagai apoptosis

selular dan LC50 dengan ekstrak metanol 2,46 ppm.1 Ekstrak kasar daging buah Phaleria

macrocarpa (Scheff) Boerl juga memiliki aktivitas inhbisi yang tinggi untuk sel kanker

Leukimia L1210 juga disebutkan pada penelitian Vivi L tahun 2009. Ada juga fraksi etanol

dari Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl ternyata memiliki aktivitas sitotoksik terhadap

kanker serviks Ca Ski.2

Sebagai uji awal untuk mendeteksi kemampuan ekstrak buah Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl dilakukan uji tokisitas. Pada penelitian ini dilakukan uji toksisitas akut

ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa dengan metode Brine Shrimp Lethality Test

(BSLT ). BSLT merupakan suatu metode uji toksisitas akut yang paling mudah, cepat dan

2

murah. Selain itu, BSLT juga merupakan suatu bioassay yang digunakan untuk menguji

senyawa bioaktif pada bahan alam yang diduga berkhasiat sebagai agen anti-tumor.3

Hasil

dari metode BSLT ini biasanya berhubungan dengan suatu uji spesifik sebagai agen anti-

tumor atau anti-kanker. Jika pada uji toksisitas menunjukkan LC50 dibawah 1000 ppm

berarti bahan tersebut memiliki potensi sebagai antikanker.4

Untuk membuktikan bahwa

ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl mempunyai efek anti kanker

yang sangat potensial maka dilakukan peneltian ini.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah ekstrak metanol daging buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki

aktivitas toksik terhadap larva Artemia salina Leach ?

1.3 Tujuan

1.3.1. Tujuan Umum

Untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak metanol daging buah Phaleria

macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.

1.3.2. Tujuan Khusus

1.3.2.1 Untuk mengetahui rendemen ekstrak metanol daging buah Phaleria

macrocarpa (Scheff) Boerl.

1.3.2.2 Untuk mengetahui LC50 ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl.

1.4 Manfaat

1.4.1 Bagi Masyarakat

Menambah informasi mengenai tumbuhan mahkota dewa yang memiliki

potensi sebagai antikanker.

1.4.2 Bagi Institusi

a) Penelitian ini dapat menambah jumlah dan jenis penelitian yang telah

dilakukan oleh mahasiswa kedokteran di Fakultas kedokteran dan Kesehatan

3

Universitas Negeri Islam Syarif Hidayatullah Jakarta.

b) Penelitian ini dapat menambah jumlah referensi dan kepustakaan bagi

penelitian berikutnya.

1.4.3 Bagi Peneliti

a) Mengetahui manfaat dari tanaman mahkota dewa khususnya dalam bidang

farmakologi.

b) Mendapatkan pengalaman melakukan penelitian dengan menggunakan metode

eksperimental terutama dalam bidang kesehatan khususnya bidang

farmakologi.

c) Penelitian ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana

Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

4

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Landasan Teori

2.1.1 Obat Tradisional

Obat tradisional adalah warisan bangsa Indonesia yang telah digunakan

sejak berabad-abad yang lalu untuk memelihara dan meningkatkan kesehatan

serta mencegah dan mengobati penyakit. Obat tradisional kini masih banyak

digunakan di Indonesia dan negara yang lain, obat ini telah membuktikan

khasiatnya sebagai obat herbal dalam memelihara kesehatan.5

WHO merekomendasikan penggunaan obat tradisional termasuk herbal

ditujukan pada penderita penyakit kronis, penyakit degeneratif dan kanker, hal

tersebut untuk memelihara kesehatan masyarakat. Di Indonesia sendiri telah

berkembang berbagai macam obat tradisional, maka untuk mempermudah

mengontrol dan mengawas obat–obatan yang beredar Badan Pengawas Obat dan

Makanan (BPOM) mengelompokkan dalam tiga sediaan yaitu sediaan jamu,

sediaan herbal terstandar dan sediaan fitofarmaka. Dengan persyaratan masing–

masing sediaan yaitu pada sediaan jamu untuk pemakaiannya secara empirik

berdasarkan pengalaman, sediaan herbal terstandar bahan bakunya harus sudah

distandarisasi dan sudah diuji farmakologi secara eksperimental dan untuk

sediaan fitofarmaka sama dengan obat modern bahan bakunya harus

distandarisasi dan harus melalui uji klinik.6

Sesuai dengan Keputusan Menteri Kesehatan RI No.

761/Menkes/SK/IX/1992 tentang pedoman fitofarmaka. Fitofarmaka adalah

sediaan obat yang telah terbukti tingkat keamanan dan manfaatnya serta

simplisia atau sediaan galenik yang telah diuji dan memenuhi standar yang

berlaku merupakan bahan bakunya.7 Sedangkan obat–obat tradisional yang

sekarang beredar di masyarakat tidak semuanya terjamin keamanannya untuk

dikonsumsi sama halnya dengan obat kimia. Oleh karena itu, perlu dilakukan

berbagai macam uji untuk mengetahui tingkat keamanan dari suatu obat

tradisional untuk dijadikan sediaaan fitofarmaka.8

5

Karena fitofarmaka harus dipertanggung jawabkan keamanan dan

khasiatnya ketika digunakan oleh manusia maka dilakukan serangkaian tahap

pengujian dan pengembangan secara sistematik sebagai berikut :7

a) Pemilihan

b) Pengujian Farmakologik

c) Pengujian Toksisitas

d) Pengujian Farmakodinamik

e) Pengembangan Sediaan

f) Penapisan Fitokimia dan Standarisasi Sediaan

g) Pengujiaan klinik

Setelah fitofarmaka terbukti keamanan dan khasiatnya untuk penggunaan

oleh manusia maka perlu dilakukan penelitian dan pengembangan lebih lanjut.7

2.1.2 Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl)

Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl merupakan tanaman yang banyak

tumbuh daerah Papua.9 Adapun sistematika dari tanaman ini yaitu tanaman ini

tergolong dalam : 1

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Thymelaeales

Familia : Thymelaeceae

Marga : Phaleria

Jenis : Phaleria macrocarpa

6

Gambar 2.1 Buah mahkota dewa yang masih di pohonnya

Sumber : Dalimartha,S. Atlas tumbuhan obat Indonesia. Jakarta : Puspa Swara; 2003

Tanaman ini tumbuh di sekitar daerah tropis dengan tinggi kira–kira 1–6

meter. Bagian terdiri dari batang, daun, bunga dan buah. Bentuk buah yang

dimiliki yaitu ”eclipse” dengan diameter sekitar 3 cm. Buah dari Phaleria

macrocarpa (Scheff) Boerl berwarna hijau saat masih muda dan akan berubah

menjadi berwarna merah ketika matang.10

Pada beberapa studi menyebutkan bahwa Phaleria macrocarpa (Scheff)

Boerl memiliki khasiat pada berbagai penyakit seperti penyakit pada hati,

jantung, ginjal, diabetes melitus, kanker, impotensi, hemoroid, alergi, penyakit

vaskular, stroke, migran, jerawat dan berbagai penyakit kulit.1,9,10

Selain itu, Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl juga memiliki khasiat yang

lain yaitu antihistamin, efek hipoglikemik, antioksidan, antibakteri, antiinflamasi

dan antikanker.2,10,11,12,13

Dengan berbagai khasiat yang dimiliki oleh buah Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl telah menjadikannya salah satu tanaman yang memiliki potensial

untuk dijadikan obat baru. Maka dari itu, Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

merupakan salah satu tanaman yang paling banyak diteliti oleh para peneliti

obat.

7

Gambar 2.2 Buah mahkota dewa

Sumber : Dalimartha,S. Atlas tumbuhan obat Indonesia. Jakarta : Puspa Swara; 2003

Dari data yang ada menunjukkan bahwa buah Phaleria macrocarpa (Scheff)

Boerl memiliki kemampuan untuk mengobati kanker.2 Pada salah satu sumber

dikatakan bahwa buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki

kemampuan untuk efek sitotoksik pada kanker leukimia dan kanker serviks Ca

Ski.2

Hal ini terjadi karena buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

mengandung flavonoid, terpenoid, saponin, polifenol, alkaloid, tanin dan

resin.2,13

Pada penelitian yang dilakukan oleh Vivi L dkk (2006), ekstrak kasar n-

heksan, etilasetat dan metanol dari buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

memiliki LC50 berturut–turut adalah 11,83 ppm, 10,99 ppm dan 2,46 ppm. Hal

ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar metanol memiliki efek toksik yang kuat.1

2.1.3 Simplisia

Menurut buku “Materia Medika Indonesia” simplisia adalah bahan alami

yang akan digunakan sebagai obat tetapi belum mengalami pengolahan apapun

selain pengeringan. Dalam fungsinya sebagai bahan baku obat, maka simplisia

harus memenuhi beberapa parameter standar umum yaitu : 14

a) Harus memiliki 3 kriteria mutu suatu bahan yaitu kebenaran jenis

(identifikasi), kemurnian (bebas dari kontaminasi kimia dan biologis) dan

aturan penstabilan (wadah, penyimpanan dan transportasi).

b) Memenuhi 3 kriteria paradigma obat pada umumnya yaitu Quality-Safety-

Efficacy (Mutu-Aman-Manfaat).

8

c) Mempunyai spesifikasi kimia yaitu informasi mengenai jenis dan kadar dari

senyawa yang terkandung di dalamnya.

Pembuatan simplisia terbagi 2 yaitu pembuatan simplisia secara umum dan

secara khusus. Pembuatan simplisia secara khusus dilakukan apabila simplisia

mengalami kondisi tertentu sesuai dengan asal simplisia. Sedangkan pembuatan

simplisia secara umum merupakan cara yang paling sering digunakan. Adapun

tahapan pembuatan simplisia adalah sebagai berikut : 15

a) Pengumpulan bahan baku

Pemilihan bahan baku simplisia berupa biji, buah, daun pucuk, daun tua,

kulit batang, umbi lapis, dan rimpang. Pengumpulan bahan baku ini

dilakukan sesuai dengan keperluan.

b) Sortasi basah

Sortasi basah untuk membersihkan kotoran yang menempel pada bahan

simplisia. Hal ini dilakukan untuk mengurangi kontaminasi mikrobiologi.

c) Pencucian

Pencucian juga bertujuan mengurang kontaminasi dari mikroba. Pencucian

dilakukan menggunakan air mengalir agar air hasil cucian langsung

terbuang dan tidak mengkontaminasi ulang bahan yang telah dicuci.

d) Perajangan

Perajangan dilakukan sebelum proses pengeringan, hal ini bertujuan untuk

memudahkan pengeringan. Perajangan dapat dilakukan dengan

menggunakan pisau ataupun mesin rajang.

e) Pengeringan

Pengeringan dapat membantu menjaga kualitas dari bahan simplisia. Karena

dapat mengurangi kandungan air, dengan begitu proses enzimatik yang

adapun terhenti. Pengeringan biasanya dilakukan pada suhu 30°–90° C

tetapi apabila bahan simplisia mengandung bahan aktif yang tidah tahan

panas maka suhu yang tepat adalah 30°-45° C.

f) Sortasi kering

Tahap ini bertujuan untuk memisahkan benda asing yang ada setelah

pengeringan.

9

Setelah melalui proses di atas, maka simplisia yang ada siap untuk proses

berikutnya. Tetapi ketika proses setelahnya belum dilaksanakan sebaiknya

simplisia di dalam wadah yang tertutup dan diletakkan di tempat yang memiliki

suhu kamar 15°-30° C.15

2.1.4 Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan bahan kimia dari campurannya dengan

menggunakan pelarut sehingga bahan yang terlarut akan berpisah dengan bahan

yang tidak terlarut.15,16

Sedangkan ekstrak adalah suatu bahan atau sediaan yang

diperoleh dari hasil ekstraksi tanaman obat.15

Ekstrak secara umum dibagi dalam beberapa kelompok yaitu :15

1. Ekstrak air

Menggunakan cairan pengekstraksi sebagai pelarut ekstrak. Adapun jenis–

jenis pembuatan ekstrak cair adalah sebagai berikut :

a. Decoctum

Cara ini dilakukan dengan menggunakan perbandingan dan derajat

kehalusan penyari. Kemudian penyari dipanaskan dengan suhu 90-95°

untuk 30 menit.

b. Infusum

Cara ini kurang lebih sama dengan decoctum hanya perbedaan pada

waktu ketika dilakukan penyarian yaitu sekitar 15 menit.

c. Coque

Penyarian dilakukan dengan merebus simplisia pada air yang berada

langsung di atas api lalu setelah itu dijadikan obat baik dengan ampas

maupun hanya cairannya saja.

d. Seduhan

Cara ini adalah dengan memasukkan simplisia ke dalam air mendidih

selama 5–10 menit. Lalu yang digunakan adalah hasil seduhannya.

e. Maserasi

Pada cara ini, simplisia direndam dengan menggunakan berbagai macam

pelarut dalam beberapa waktu pada suhu kamar.

10

2. Tinktura

Adalah ekstrak yang terbuat dari simplisia yang telah direndam

menggunakan berbagai konsentrasi etanol kemudian dilakukan penyarian.

3. Ekstrak cair

Ekstrak ini sama saja dengan tinktura yaitu sama–sama cair namun

perbedaannya adalah ekstrak ini lebih padat dibandingkan dengan tinktura.

4. Ekstrak encer

Sama dengan ekstrak cair namun simplisia dan hasil akhirnya memiliki

perbedaan konsentrasi.

5. Ekstrak kental

Ekstrak yang didapatkan dari ekstrak cair yang diuapkan untuk

menghilangkan penyarinya dan hanya meninggalkan bahan aktif.

6. Ekstrak kering

Ekstrak yang dikeringkan pada temperatur dan tekanan yang rendah, adapun

konsentrasinya tidak sesuai yang diinginkan maka bisa ditambahkan bahan

inert.

7. Ekstrak minyak

Simplisia yang ada disuspensi dengan perbandingan dan derajat halus

tertentu di dalam minyak yang telah dikeringkan secara maserasi.

8. Oleoresin

Sediaan yang dibuat dengan menggunakan pelarut yang sama seperti etanol-

etil asetat.

Proses pembuatan ekstrak terdiri dari 6 langkah yaitu :14

a) Pembuatan simplisia dan klasifikasinya

Pembuatan simplisia merupakan tahap awal untuk pembuatan ekstrak.

Derajat kehalusan simplisia dapat mempengaruhi mutu dari ekstrak tersebut

karena semakin halus serbuk simplisia maka proses ekstraksi semakin

efektif dan efisien.

11

b) Cairan pelarut

Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi harus mudah untuk menarik

senyawa aktif yang ada pada simplisia dan juga bersifat tidak merusak

bahan aktif itu sendiri. Faktor–faktor yang menjadi pertimbangan dalam

pemilihan pelarut adalah tingkat selektivitas, kemudahan dalam proses,

ekonomis, ramah lingkungan dan aman.

c) Separasi dan kemurnian

Hal ini dilakukan untuk memisahkan senyawa–senyawa lain yang dapat

mempengaruhi senyawa aktif yang diinginkan. Cara yang bisa dilakukan

adalah pengendapan, pemisahan dua cairan tak campur, sentrifugasi,

dekantasi, filtrasi serta proses absorbsi dan penukar ion.

d) Pemekatan/Penguapan (vaporasi/evaporasi)

Pada tahap ini ekstrak diuapkan untuk menguapkan pelarut dan memekatkan

partikel solute sampai ekstrak menjadi kental.

e) Pengeringan ekstrak

Pengeringan ekstrak akan menghasilkan serbuk, massa kering-rapuh, atau

tergantung dari proses yang digunakan untuk menghilangkan pelarut dari

ekstrak.

f) Rendemen

Rendemen ekstrak adalah membandingkan antara berat ekstrak dengan berat

awal simplisia.

Metode pembuatan ekstrak terdiri dari 2, yaitu :15

1. Ekstraksi dengan penggunakan pelarut

a. Cara dingin

Maserasi

Ektraksi yang dilakukan dengan menggunakan pelarut dan diletakkan

pada suhu ruangan. Selama proses perendaman dilakukan pengocokan

beberapa kali dengan tujuan agar pelarut dapat menarik zat aktif dari

bahan simplisia.

12

Perkolasi

Perendaman simplisia dengan menggunakan pelarut yang selalu baru dan

dilakukan pada suhu ruangan sampai didapatkan jumlah ekstrak 1-5 kali

bahan. Proses dari metode perkolasi dimulai dari tahapan pengembangan

bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetasan atau

penampungan ekstrak).

b. Cara panas

Refluks

Ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang mendidih selama waktu

tertentu dan dengan titik didihnya. Cara ini dilakukan secara berulang

sebanyak 3–5 kali untuk menjadi ekstrak yang sempurna (minyak astiri).

Soxhlet

Ekstraksi dengan memasukkan pada alat khusus sehingga ekstraksi

terjadi secarara kontinu dengan jumlah pelarut yang ada relatif konstan.

Digesti

Teknik ekstraksi secara maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu)

pada temperatur 40°–50° C.

Infus

Ekstraksi yang dilakukan di dalam penangas air (bejana infus tercelup

dalam penangas air mendidih) dengan menggunakan temperatur terukur

96°- 98° C selama 15–20 menit.

Dekok

Melakukan ektraksi dengan cara infus tetapi temperaturnya lebih tinggi

yaitu sampai titik didih air dan juga waktunya lebih lama.

2. Destilasi uap

Adalah suatu cara yang dilakukan dengan menguapkan bahan dengan uap

air sehingga kandungannya ikut terdestilasi.

Simplisia yang telah diekstrak akan menghasilkan bahan–bahan aktif.

Bahan–bahan aktif inilah yang akan digunakan untuk melakukan berbagai

percobaan. Bahan aktif yang ada berrgantung pada pelarut yang digunakan. Hal

13

ini karena pelarut yang digunakan akan menarik bahan aktif pada simplisia

ekstrak bergantung pada kepolaran dari senyawa.16

Pemilihan pelarut untuk ekstraksi bergantung pada jumlah kepolaran suatu

senyawa. Senyawa non polar akan larut pada pelarut non polar. Pelarut yang

termasuk pelarut non polar yaitu pelarut n-heksana. Etil-asetat merupakan

pelarut yang bersifat semi polar sehingga akan menarik senyawa yang bersifat

semi polar juga. Senyawa polar akan larut dalam pelarut yang bersifat polar.17

Metanol merupakan pelarut yang bersifat polar dan akan menarik senyawa–

senyawa yang bersifat polar. Seperti terpenoid, saponin, tanin, polifenol,

flavones, dan phenones.16

Setelah dilakukan maserasi, dilakukan pengukuran berat hasil ekstrak yang

didapatkan. Kemudian persentase rendemen ekstrak dihitung dengan

menggunakan rumus.17

Rendemen (%) = Berat ekstrak (gram) x 100 %

Berat Simplisia awal (gram)

2.1.5 Toksikologi

Toksikologi adalah cabang ilmu dari farmakologi yang mempelajari tentang

sifat toksik dari suatu zat kimia yang digunakan dan bagaimana mekanisme

terjadinya efek toksik tersebut baik saat digunakan maupun saat di lingkungan,

baik yang terpapar secara sengaja maupun tidak sengaja sehingga dapat

meminimalkan dampak negatif yang ada.18

Toksisitas merupakan kemampuan suatu zat kimia/beracun (xenobiotoik)

menimbulkan efek toksik tertentu pada makhluk hidup. Uji toksikologi dibagi

menjadi 3 kategori berdasarkan efek lamanya (waktu) pajanan, yaitu : 18

a. Uji toksisitas akut

b. Uji toksisitas jangka pendek (subakut/kronis)

c. Uji toksisitas jangka panjang

Pada penelitian ini, uji yang akan digunakan adalah uji toksisitas akut

sehingga yang akan lebih banyak dibahas adalah uji toksisitas akut.

14

2.1.6 Uji Toksisitas Akut

Toksisitas akut merupakan efek berbahaya yang timbul setelah pemberian

suatu zat atau kombinasi zat dalam dosis tunggal atau berulang selama 24 jam.

Sedangkan uji toksisitas akut adalah suatu cara yang digunakan untuk

menentukan dosis letal median (LC50, LD50) suatu zat serta mekanisme dan

target organnya. LC50 atau LD50 didefinisikan sebagai suatu dosis yang dapat

mematikan 50 % hewan coba dengan dosis tunggal atau berulang dalam waktu

24 jam.18

2.1.7 Uji Toksisitas Jangka Pendek (subakut/subkronik)

Uji toksisitas yang dilakukan dengan pemberian zat secara berulang–ulang,

dilakukan setiap hari tau 5 kali setiap minggu selama waktu kurang 10 % masa

hidup hewan, yaitu 3 bulan untuk tikus dan 1 atau 2 tahun untuk anjing. Uji ini

dilakukan untuk mengetahui pengaruh paparan suatu zat pada dosis atau

konsentrasi yang tidak toksik atau yang kemungkinan akan diberikan pada

manusia. Terkadang dosis dinaikkan untuk melihat efek toksik yang lebih

cepat. 18,19

2.1.8 Uji Toksisitas Jangka Panjang (kronis)

Merupakan suatu uji yang dilakukan dengan memberikan zat kimia terhadap

hewan coba secara berulang–ulang selama masi hidup hewan coba atau

disebagian besar masa hidup hewan coba. Misalnya 18 bulan untuk mencit, 24

bulan untuk tikus, dan 7–10 tahun untuk anjing dan monyet. 18,19

Perbedaan antara uji toksisitas akut dan kronis adalah uji toksisitas akut

dilakukan untuk mengetahui efek toksik dari suatu zat kimia sedangkan untuk uji

toksisitas kronis dilakukan untuk mengetahui tingkat keamanan suatu obat.20

2.1.9 Penentuan LC50

Untuk menentukan LC50 dapat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu :18,19,21

a. Cara Weil

Cara atau metode Weil ini menggunakan tabel Weil yang telah ada, dimana

tabel tersebut berisi tentang respons dan koefisien nomor/angka. Pada tabel

15

Weil juga terdiri dari beberapa kelompok subjek untuk tiap dosis obat,

dimana 4 atau lebih kelompok dosis yang beda dapat digunakan dan jika

diukur tiap kelompok menjadi sama merupakan syarat pada tabel Weil.

Rumus :

Log m = log D + d (f + 1)

Ket :

m = nilai LC50

D = dosis terkecil yang digunakan

d = log dari kelipatan dosis

f = suatu nilai dalam tabel weil, karena angka kematian tertentu (r)

b. Metode Probit

Analisis probit merupakan suatu metode yang telah digunakan secara luas

untuk menghitung toksisitas dengan cara membandingkan setiap konsentrasi

ataupun dosis.20

Metode probit ini terutama digunakan untuk menghitung

nilai LD5 atau LD95, atau jika persentase kematian yang didapatkan pada uji

toksisitas menujukkan kurang dari 16 % atau lebih dari 84 %.

Dalam penggunaan metode probit syaratnya adalah :

1. Mempunyai tabel probit.

2. Menentukan nilai probit dari setiap % kematian tiap kelompok hewan uji.

3. Menentukan log dosis tiap–tiap kelompok.

4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan

log dosis.

5. Memasukkan nilai 5 (probit 50 % kematian hewan uji) pada persamaan

garis lurus.

Persamaannya :

Y = mX + b

Ket :

Y = 5 = nilai probit dari 50 % kematian hewan coba

X = merupakan nilai LC50 ketika diubah menjadi antilog X.

16

c. Cara Farmakope Indonesia III ( FI III)

Jika menggunakan cara FI III, maka syarat yang harus dipenuhi adalah :

1. Dosis yang digunakan merupakan seri dari kelipatan yang tetap

2. Hewan uji yang digunakan harus sama untuk setiap kelompok uji

3. Dosis yang digunakan untuk uji harus mematikan hewan uji mulai dari 0

%-100 % dan hitungan terbatas pada rentang tersebut.

Rumus :

M = a–b (∑ pi–0,5)

Ket :

M = log LD50

A = logaritma dosis terendah yang masih menyebabkan jumlah kematian

100 % tiap kelompok

b = beda log dosis yang berurutan

pi = jumlah hewan yang mati menerima dosis i dibagi jumlah hewan

seluruhnya yang menerima dosis i

2.1.10 Metode BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test )

BSLT adalah suatu metode yang digunakan untuk menentukan toksisitas

suatu senyawa dan terkadang digunakan untuk bioassay untuk mengisolasi

senyawa dari ekstrak tumbuhan.21

Metode ini juga biasa digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa

aktif yang terkandung dalam ekstrak tanaman.22

Metode ini dilakukan dengan

menggunakan larva udang Artemia salina Leach. Kemudian diberikan ekstrak

tanaman dan diinkubasi selama 24 jam, lalu dilakukan penghitungan LC50

berdasarkan kematian 50 % larva udang. Hasil LC50 yang didapat dimasukkan ke

dalam kategorinya, LC50 yang lebih dari 1000 ppm termasuk dalam kategori

tidak toksik, LC50 30–1000 ppm termasuk dalam kategori toksik dan LC50 yang

kurang dari 30 ppm termasuk dalam kategori sangat toksik.21,1

Beberapa keuntungan menggunakan metode BSLT adalah :1

a. Metode yang telah teruji untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di

dalam ekstrak kasar tumbuhan dengan tingkat kepercayaan 95 %.

17

b. Metode penapisan farmakologi awal yang mudah, cepat, dan murah.

c. Sering digunakan untuk pencarian senyawa antikanker.

d. Digunakan sebagai tahap awal isolasi toksik yang terkandung dalam suatu

ekstrak.

2.1.11 Larva Udang Artemia salina Leach

Artemia salina Leach adalah hewan uji yang sering digunakan yang biasa

disebut brine shrimp Artemia. Hewan ini adalah sejenis udang–udang primitif.

Udang ini pertama kali ditemukan oleh seorang Geografer dari Iran pada tahun

982 di Danau Urnia, lalu oleh Schlosser pada tahun 1976. Kemudian pada tahun

1758 diberi nama Cancer salinus oleh Linnaeus,dan yang terakhir 61 tahun

berikutnya nama udang tersebut diganti menjadi Artemia salina oleh Leach pada

tahun 1819.23

Artemia salina Leach hidup sebagai plankton di perairan dengan

kadar garam yang tinggi sekitar 15-300 per mil. Suhu sekitar 25-30° C, lalu

kadar oksigen sekitar 3 mg/L dan hidup pada daerah dengan pH 7,3–8,4. Untuk

mekanisme pertahanan hidupnya Artemia salina Leach hanya mengandalkan

lingkungan sekitar, dimana hewan ini dapat hidup pada kondisi air dengan kadar

garam yang tinggi sehingga pemangsanya tidak dapat bertahan hidup pada

kondisi tersebut. 24

Adapun morfologi dari larva ini, bisa dilihat pada gambar di bawah ini : 24

Gambar 2.3 Morfologi Artemia salina Leach

Sumber : Abatzopoulos,Th.J et al. Artemia : Basic and Apllied Biology Volume 1 dari Biologi

of Aquatic Orgaism. Netherland : Springer Netherland;2010

18

Klasifikasi dan Morfologi Artemia salina Leach : 23

Kingdom : Animalia

Filum : Arthropoda

Subfilum : Crustacea

Kelas : Branchiopoda

Subkelas : Sarsostraca

Ordo : Anostraca

Famili : Artemiidae

Genus : Artemia

Spesies : Artemia salina Leach

Morfologi dari larva Artemia salina Leach akan berubah–ubah sesuai

dengan fase pada siklus hidupnya. Siklus hidup Artemia salina Leach.24

Gambar 2.4 Siklus Hidup Artemia salina Leach

Sumber : Abatzopoulos,Th.J et al. Artemia : Basic and Apllied Biology Volume 1 dari Biologi of

Aquatic Orgaism. Netherland : Springer Netherland;2010

19

Secara umum memiliki 3 fase yaitu fase telur, larva (nauplii) dan artemia

dewasa. Telur Artemia salina Leach atau biasa disebut kista memiliki bentuk

bulat dengan ukuran 0,2–0,3 mm. Kemudian akan berubah menjadi larva. Telur

yang memiliki kualitas yang baik akan menetas setelah dimasukkan ke dalam air

laut atau air dengan kadar garam yang tinggi selama 18–24 jam.24

Gambar 2.5 Tahap penetasan telur Artemia

Sumber : Baraja M, Uji Toksisitas ekstrak daun Ficus elastica Nois ex Blume terhadap larva

Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis, (Skiripsi). Surakarta :

Universitas Muhammadiyah Surakarta;2008.

Pada tahapan penetasan Artemia yang terjadi adalah hidrasi sehingga akan

menjadi bulat dan embrio yang di dalamnya akan menjadi aktif sehingga sekitar

24 jam kemudian cangkang kista akan pecah dan munculah embrio yang masih

dibungkus dengan selaput dan disebut nauplii. Nauplii tingkat I disebut Instar I.

Instar I yang baru menetas berbentuk bulat lonjong dengan ukuran panjang 400

mikron dan lebar 170 mikron serta beratnya 0,002 mg. Pada awalnya nauplii

akan berwarna orange kecokelatan karena masih mengandung kuning telur.

Selain itu, pada saat fase ini nauplii tidak akan makan, karena mulut dan anusnya

20

belum terbentuk dengan sempurna. Lalu kemudian setelah 12-24 jam menetas,

para nauplii ini akan melakukan pembelahan menjadi tahap instar II dan

akhirnya memulai makan.24,25

Gambar 2.6 Nauplii tingkat I Artemia salina Leach

Sumber : Mudjiman,A. Udang resik air asin. Jakarta : Bhrata Karya Aksara;1995

Kemudian selanjutnya akan terus bermetamorfosis menjadi nauplii ke

tinggat lebih tinggi. Pada tahap instar III akan terbentuk sepasang mata majemuk

dan akan berangsur–angsur tumbuh tunas-tunas kakinya. Setelah menjadi instar

III, instar IV, instar V hingga sampai instar XV dan kemudian menjadi dewasa.

Biasanya waktu yang dibutuhkan menjadi larva menjadi dewasa adalah 2

minggu.25

Gambar 2.7 Bagian tubuh Instar II

Sumber : http://www.ecotao.co.za/html/artemia.html

21

Gambar 2.8 Bagian tubuh Dewasa Artemia

Sumber : http://www.ecotao.co.za/html/artemia.html

Pada saat dewasa, memiliki panjang tubuh tubuh umunya sekitar 8-10 mm,

tapi ada juga yang mencapai 15 mm. Terdiri dari 20 segmen dan 10 pasang

phyllopodia pipih yang merupakan alat gerak menyerupai daun dan bergerak

dengan ritme yang teratur. Pada saat dewasa Artemia salina Leach berwarna

putih pucat, merah muda, hijau atau transparan dan hanya dapat bertahan hidup

dalam hitungan bulan.25

Selain itu, artemia yang telah dewasa memiliki morfologi yang lebih

sempurna dan lebih mirip dengan udang kecil, panjang badannya sekitar 1 cm

dengan kaki yang dilengkapi dengan 10 pasang torakopoda yang merupakan alat

gerak dari artemia. Artemia dewasa baik jantan maupun betina memiliki

sepasang antena, dimana antena I berfungsi sebagai sebagai alat peraba dan

antena II untuk jantang berfungsi sebagai alat bantu dalam perkawinan dengan

artemia betina sedangakan antena II untuk betina tetap berfungsi sebagai alat

peraba juga. Pada daerah belakang kaki torakopoda, artemia jantan memiliki

penis sedangkan pada betina memiliki sepasang ovarium yang masing–masing

letaknya disebelah kanan dan kiri saluran pencernaannya.25

Untuk lingkungan hidup dari Artemia salina Leach harus sesuai dengan : 24,26

a. Suhu yang tidak kurang dari 6° C dan lebih dari 35° C karena spesies ini

tidak bisa hidup pada suhu tersebut. Suhu terbaik 25-30° C.

b. Kadar garam yang tinggi adalah salah satu pertahanan diri untuk larva. Air

dengan kadar garam yang bisa menjadi tempat artemia berkisar 2,9–3,5 %

(seawater) sampai 25–35 % (the great salt lake) bahkan masih ada yang bisa

22

hidup pada kadar garam 50 %.25,26

Kadar garam pada air yang digunakan

untuk hidrasi kista yaitu sekitar 5 %-70 %.

c. Oksigen dibutuhkan kista agar perkembangan embrio menjadi baik. Kadar

oksigen minimal adalah 3 ppm. Baik untuk hidrasi kista maupun perawatan

kista hingga menjadi artemia dewasa.

d. Saat penetasan dilakukan makan dibutuhkan pula penyinaran pada wadah

penetasan. Hal ini dilakukan dengan alasan bahwa cahaya juga dapat

merangsang pengaktifan dari perkembangan embrio dalam kista.

Selain itu, pada dasarnya perilaku dari udang artemia ini yaitu bersifat

fototaksis yang berarti menyukai cahaya. Hal ini yang menyebabkan ketika

siang hari udang–udang ini akan terlihat pada permukaaan air atau

mendekati ke arah cahaya.

e. Selain hal di atas, perlu diperhatikan juga pH pada air laut yang digunakan.

Hal ini berguna pada enzim-enzim yang bekerja pada metamorfosis dari

artemia. Dimana enzim tersebut akan bekerja secara optimum pada pH 8,0–

9,0.

Alasan mengapa Artemia salina Leach digunakan pada metode BSLT

adalah karena spesies ini memiliki kesamaan dengan mamalia. Dimana tipe

DNA-dependent RNA polimerase yang dimiliki oleh Artemia salina Leach

sama dengan mamalia. Sebagaiamana fungsi yang dimiliki oleh DNA-dependent

RNA polimerase yaitu untuk pembentukan protein dan protein merupakan

komponen utama semua sel. Jadi ketika DNA-dependent RNA polimerase

dihambat makan tidak akan terjadi pembukaan pilinan DNA menjadi RNA, lalu

tidak terjadi juga penerjemahan kodon pada tiap–tiap kodon yang ada di RNA

tersebut sehingga tidak dapat terbentuk protein baru. Penghentian pembentukan

protein ini akan menyebabkan gangguan metabolisme dan akhirnya

menyebabkan kematian sel.25

Seperti manusia, Artemia salina Leach juga

berespon terhadap stresor di lingkungan.27

23

2.2 Kerangka Konsep

Ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

Memiliki senyawa kimia yang berpotensi bioaktivitas

Uji toksisitas akut

Dengan metode BSLT

Hewan uji larva udang Artemia salina Leach

Menghitung persentase kematian larva

Mencari nilai LC50

2.3 Definisi Operasional

No Variabel Definisi Cara ukur Alat

Ukur

Skala

Ukur

Hasil

Ukur

1

2

Konsentrasi

ekstrak

metanol buah

Phaleria

macrocarpa

(Scheff) Boerl

Persentase

kematian larva

Artemia salina

Leach

Konsentrasi

ekstrak dalam

ppm ( 1 µg/ml )

Hasil perkalian

rasio dengan

100 % , jumlah

larva yang mati

dibagi jumlah

seluruh larva

dikali 100 %.

V1M1=V2 M2

Jumlah larva

yang mati

dibagi jumlah

seluruh larva

-

-

Numerik

Numerik

1000 ppm

500 ppm

250 pm

100 ppm

50 ppm

25 ppm

10 ppm

Persentase

Kematian

larva

24

3 LC50 Konsentrasi

yang diberikan

sekali (tunggal)

atau beberapa

kali dalam 24

jam dari suatu

zat yang secara

statistik

diharapkan

dapat

mematikan 50

% hewan uji.

Dihitung dari

persamaan

garis lurus

Y=mX+b, lalu

memasukkan

angka 5

sebagai probit

dari 50 %

kematian

hewan uji

sehingga

didapatkan X

sebagai log,

dan antilog X

sebagai LC50

-

Numerik LC50

terbagi 3

kategori

yaitu,

lebih dari

1000 ppm

tidak

toksik,30-

1000 ppm

bersifat

toksik dan

dibawah

30 ppm

sangat

toksik

4 Rendemen

Ekstrak

Hasil bagi antara

berat ekstrak

dengan berat

simplisia dan

dikalikan 100 %

Berat ekstrak

dibagi berat

simplisia dikali

100 %

- Numerik Persentase

rendemen

ekstrak

25

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan eksperimental dengan pendekatan post test-only

control group design di laboratorium dengan perlakuan pemberian ekstrak

metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina

Leach ( BSLT ).

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2014 sampai dengan bulan

Agustus 2014 di Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka FKIK,

Laboratorium Penelitian dan Laboratorium Farmakologi Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah.

3.3 Alat dan Bahan Penelitian

3.3.1 Alat Penelitian

Rotatory evaporator Eyela, corong, bejana maserasi, blender, mikropipet 10

ml, mikropipet 5 ml, mikropipet 1 ml, neraca analitik, pipet tetes, tabung reaksi,

seperangkat alat penetasan telur (wadah plastik dan sterofoam), erlenmeyer 250

ml, erlenmeyer 100 ml, lup, kaca arloji, cawan penguap,spatula dan well plate.

3.3.2 Bahan Penelitian

Simplisia Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl, metanol teknis, telur udang

Artemia salina Leach, aluminium foil, air laut, kertas saring, aquades dan DMSO.

3.4 Cara Kerja Penelitian

3.4.1 Determinasi Tanaman

Identifikasi terhadap daging buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

untuk mengetahui identitas taksonominya di Herbarium Bogoriense, Balai

Penelitian dan Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan

Biologi, LIPI Bogor.

26

3.4.2 Pembuatan Ekstrak Metanol Buah Mahkota Dewa

Pembuatan ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa)

menggunakan metode maserasi (memakai pelarut dengan beberapa kali

pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan) dengan metanol sebagai

pelarutnya. Buah mahkota dewa dengan berat 3 kg dirajang kemudian dijemur.

Buah mahkota dewa yang kering dengan berat 368 gram dihaluskan menggunakan

blender. Serbuk simplisia sebanyak 72,6 gram dimaserasi dengan menggunakan

pelarut metanol di dalam bejana maserasi. Sebelum digunakan metanol yang ada

didestilasi terlebih dahulu untuk menghilangkan faktor-faktor pengotor.

Proses maserasi dilakukan selama 2 hari lalu kemudian disaring untuk

memisahkan filtrat dan ampasnya. Ampasnya diambil dan direndam lagi

menggunakan metanol. Sedangakan filtratnya dimasukkan ke dalam rotatory

evaporator dengan suhu 48° C yang bertujuan untuk mengentalkan ekstrak.

Ekstrak yang kental kemudian dimasukkan ke cawan penguap.

3.4.3 Penetasan Larva Udang

Untuk penetasan larva udang menggunakan 2 wadah plastik. Wadah plastik

yang pertama dibagi menjadi 2 bagian yaitu bagian gelap (ditutupi dengan

aluminium foil) yang merupakan tempat telur dan bagian terang merupakan

bagian tempat larva yang sudah menetas. Lalu dimasukkan air laut sebanyak 1

liter untuk 1gram telur Artemia salina Leach. Air laut yang digunakan memiliki

pH sekitar 8–9.

Untuk penetasan telur diberikan penerangan selama 48 jam. Larva yang

telah menetas dan berumur 24 jam dipindahkan pada wadah yang kedua. Larva

dikembangkan lagi sampai berumur 48 jam. Larva yang digunakan pada

penelitian ini adalah larva yang masih aktif bergerak dan berusia 36-48 jam.

3.4.4 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Akan Diuji

Mulanya untuk mendapatkan konsentrasi uji yang digunakan pada metode

BSLT dilakukan trial atau uji orientasi konsentrasi. Konsentrasi yang digunakan

untuk uji trial yaitu 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm.

27

Ekstrak kental buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl ditimbang

menggunakan neraca analitik hingga mencapai berat 2000 mg. Dilakukan

pengenceran menggunakan DMSO sebanyak 2 ml. Lalu ditambahkan aquades

sebanyak 98 ml. Sehingga ekstrak yang didapatkan 100 ml dengan konsentrasi

20.000 ppm yang akan digunakan sebagai larutan induk.

Pembuatan larutan uji dengan menggunakan rumus pengenceran:

V1 M1 = V2 M2

Keterangan :

V1 = Volume awal

M1 = Konsentrasi awal

V2 = Wolume akhir

M2 = Konsentrasi akhir

3.5 Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT

Pada uji BSLT akan digunakan plate yang berisi sumur–sumur. Di dalam 1

plate terdapat 24 sumur. Langkah pertama yang dilakukan adalah membagi 5

kelompok sumur untuk masing–masing konsentrasi dan 1 untuk kontrol negatif

(air laut). Percobaan ini dilakukan pengulangan 3 kali (triplo) sehingga masing–

masing konsentrasi mendapatkan 3 sumur.

Memasukkan 1 ml masing–masing konsentrasi pada setiap sumur dan pada

kontrol negatif yang dimasukkan adalah air laut sebanyak 1 ml. Memindahkan

larva udang ke cawan petri untuk memudahkan penghitungan. Pemindahan larva

dengan menggunakan lup. Memasukkan 10 ekor larva ke dalam masing–masing

sumur dicampur 1 ml air laut. Sehingga volume dalam 1 sumur menjadi 2 ml

yaitu 1 ml ekstrak dan 1 ml air laut.

28

Tabel 3.1 Ilustrasi Konsentrasi Ekstrak pada Well Plate

1 ml ekstrak

1000 ppm +

1 ml air laut

1 ml ekstrak

1000 ppm +

1 ml air laut

1 ml ekstrak

1000 ppm +

1 ml air laut

1 ml ekstrak

50 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

50 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

50 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

250 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

250 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

250 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

25 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

25 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

25 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

100 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

100 ppm + 1

ml air laut

1 ml ekstrak

100 ppm + 1

ml air laut

2 ml air laut

2 ml air laut

2 ml air laut

Plate dibiarkan di udara terbuka selama 24 jam. Lalu dilakukan

penghitungan larva yang mati. Ciri larva yang mati adalah larva yang terlihat

sudah tidak bergerak lagi dalam beberapa detik pengamatan. Larva yang mati

dihitung dengan mengurangkan jumlah total larva pada tiap konsentrasi dengan

jumlah larva yang masih hidup.

3.6 Pengolahan dan Analisis Data

Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan metode probit. Hasil

kematian dari larva Artemia salina Leach dimasukkan ke dalam tabel probit. Lalu

dihitung nilai probitnya dengan melalui persentase kematian dan nilai logaritma

dari konsentrasi yang digunakan. Adapun contoh tabel probit terdapat lampiran 2.

Selain itu, bisa juga menggunakan metode analisis pada Mirosoft Office

Excel dengan membuat persamaan garis lurus yang menghubungkan antara nilai

log konsentrasi dengan nilai probit dari persentase kematian. Setelah mendapatkan

persamaannya, maka Y diganti dengan angka 5 sebagai probit dari 50 % kematian

hewan uji yang nantinya akan menghasilkan X sebagai log konsentrasi. Antilog X

merupakan nilai LC50.

29

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Ekstraksi Buah Mahkota Dewa

Simplisia yang digunakan pada peneltian ini adalah benar tumbuhan mahkota

dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.) yang telah melalui proses

identifikasi taksonomi oleh Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan

Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor.

Surat identifikasi taksonomi tumbuhan dengan Nomor Surat

887/IPH.3/KS/III/2014 (lampiran 3).

Serbuk simplisia yang didapatkan dari hasil pengeringan dan penghalusan

dengan berat 72,6 gram, digunakan untuk proses esktraksi. Proses ekstraksi yang

digunakan adalah dengan metode maserasi. Metode maserasi merupakan cara

ekstraksi yang mudah dilakukan dan dalam tahapannya tidak dilakukan proses

pemanasan sehingga menghindari kerusakan dari zat aktif yang dikandung oleh

simplisia.15

Metode ini merupakan cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut,

sedangkan pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah metanol. Metanol

yang digunakan terlebih dahulu didestilasi untuk mengurangi faktor pengotor

yang ada sehingga yang digunakan untuk perendaman simplisia adalah metanol

murni yang didapatkan dari hasil destilasi.

Metanol merupakan pelarut yang bersifat polar sehingga dapat bercampur

dengan air, jenis alkohol lain dan pelarut organik lainnya.28

Metanol sangat

mudah menguap pada titik didihnya yaitu 65° C.29

Sehingga pada saat cairan

maserasi dimasukkan ke dalam rotatory evaporator metanol akan menguap dan

terpisah dengan zat aktif buah mahkota dewa yang ditarik saat perendaman.15

Setelah proses maserasi maka ekstrak dimasukkan ke dalam alat rotatry

evaporator. Dengan alat ini, ekstrak yang masih bercampur dengan pelarut

dipisahkan sehingga didapatkan ekstrak kental yang akan digunakan untuk uji

BSLT dengan larva Artemia salina Leach sebagai hewan ujinya.

Dari hasil ekstraksi dengan metode maserasi yang telah dilakukan maka

didapatkan :

30

Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.

Nama Simplisia Bobot ekstrak Bobot simplisia Rendemen

ekstrak

Ekstrak metanol buah

Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl.

19,8 gram 72,6 gram 27,27 %

Setelah didapatkan ekstrak yang akan digunakan pada penelitian, selanjutnya

dilakukan pembuatan larutan konsentrasi ekstrak untuk uji BSLT. Larutan

pertama yang dibuat adalah larutan induk dengan konsentrasi 20.000 ppm

sebanyak 100 ml.

Pada proses ini dilakukan pengenceran ekstrak kental buah mahkota dewa

yang telah ditimbang sebanyak 2000 mg menggunakan aquades. Namun pada

penelitian ini dilakukan penambahan bahan inert yaitu dimetisulfoksida (DMSO).

Penggunaan bahan inert ini bertujuan untuk membantu melarutkan ekstrak.

DMSO merupakan salah satu zat yang bersifat toksik. Namun pada penelitian ini

kadar DMSO yang digunakan tidak termasuk dalam kategori yang toksik karena

DMSO yang digunakan ≤ 2 %, sedangkan efek toksik baru akan timbul ketika

DMSO dimasukkan sebanyak ≥ 7,5 %. 30

4.2 Hasil Uji BSLT

Larutan induk dari ekstrak kental metanol buah Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl yang telah dibuat terlebih dahulu kemudian diencerkan menjadi

menjadi 5 konsentrasi, yaitu 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm

yang akan digunakan untuk uji orientasi konsentrasi terlebih dahulu. Selain itu

dibuat pula kontrol negatif berupa air laut dan larva udang tanpa penambahan

ekstrak. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh air laut maupun faktor lain

terhadap kematian larva. Sehingga dapat dipastikan bahwa kematian larva

hanyalah akibat dari penambahan ekstrak yang dilakukan.

Setelah dilakukan uji orientasi konsentrasi untuk mendapatkan persentase

kematian larva pada rentang 10 %-90 % maka didapatkan konsentrasi uji yaitu

1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 25 ppm.

31

Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali replikasi/pengulangan (triplo) dengan

tujuan agar mendapat data yang lebih baik dan lebih akurat. Larva yang telah

berumur 36-48 jam dimasukkan ke dalam well plate masing-masing 10 ekor larva

yang ditambahkan 1 ml air laut. Kemudian memasukkan masing-masing

konsentrasi uji sebanyak 1 ml ke dalam well plate. Setelah 24 jam pasca

penambahan ekstrak, dilakukan pengamatan kematian larva.

Hasil kematian larva Artemia salina Leach pada setiap sumur dibandingkan

satu sama lain termasuk pada sumur kontrol negatif. Berikut ini adalah hasil

penelitian dari uji konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa

(Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.

Tabel 4.2 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol buah Phaleria

macrocarpa (Scheff) Boerl terhadap larva Artemia salina Leach.

Sumur ke

Angka Kematian Larva Artemia salina Leach Kontrol

negatif Konsentrasi ekstrak pada tabung uji (ppm)

12,5 25 50 125 500

1 1 2 4 4 9 0

2 1 2 3 7 8 0

3 1 2 4 7 10 0

Total Kematian 3 6 11 18 27 0

Rata-Rata

kematian

0,10 ±

0 0,20 ± 0

0,36 ±

0,5774

0,60 ±

1,7321

0,90 ±

1,1547 0,00 ± 0

Persentase

Kematian (%) 10 20 36 60 90 0

Total larva yang digunakan pada percobaan ini dengan 3 kali percobaan

sebanyak 30 ekor. Sehingga total larva yang digunakan pada seluruh percobaan

adalah 180 ekor. Total kematian diperolah dengan menjumlah kematian karva

pada setiap konsentrasi. Rata–rata kematian diperoleh dari total kematian dibagi

total larva yang digunakan tiap konsentrasi. Persentase kematian didapatkan

dengan mengalikan rata–rata kematian dengan 100.

32

Dari data pada tabel 4.1 menunjukkan bahwa adanya hubungan antara

konsentrasi ekstrak dengan total kematian larva.

Gambar 4.1 Grafik Persentase mortalitas larva Artemia salina Leach pada uji

toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff)

Boerl

Berdasarkan grafik di atas maka menunjukkan bahwa jumlah kematian larva

pada konsentrasi 12,5 ppm adalah 10 % sedangkan pada konsentrasi 25 ppm

sebanyak 20 %, hal ini menunjukkan peningkatan kematian larva sebesar 10 %.

Lalu pada konsentrasi 50 ppm, total kematian larva yaitu 36 %. Jika dibandingkan

dengan total kematian larva pada konsentrasi 125 ppm, maka akan terlihat

peningkatan angka kematian sebesar 24 %. Lalu pada konsentrasi 500 ppm angka

kematiannya juga meningkat jika dibandingkan dengan konsentrasi 125 ppm yaitu

sebesar 30 %. Sehingga bisa disimpulkan bahwa peningkatan konsentrasi yang

semakin tinggi akan meningkatkan kematian larva.

Penggunaan larva Artemia salina Leach pada uji BSLT ini karena larva ini

memiliki kesamaan dengan mamalia. Seperti memiliki DNA-dependent RNA

polimerase yang sama seperti yang dimiliki oleh mamalia.25

33

Sedangkan telur Artemia salina Leach yang digunakan pada percobaan yaitu

larva yang berusia 36-48 jam. Hal ini disebabkan karena setelah berumur 24 larva

akan memasuki fase instar I dimana pada tahap ini larva belum bisa makan karena

mulut dan saluran pencernaannya belum terbentuk secara sempurna.

Lalu setelah 12-24 jam setelah menetas instar I akan bermetamorfosis

menjadi instar II, dimana instar II sudah memiliki mulut dan sistem

pencernaannya telah sempurna.24,25

Sehingga ekstrak yang ada di lingkungan larva

masuk ke dalam tubuh larva dan menyebabkan kematian larva. Lalu pada saat

larva menjadi instar III atau lebih dari 48 jam, tubuhnya akan bermetamorfosis

lebih lanjut dan meningkatkan ketahanan tubuh larva. Oleh karena itu, pada

penelitian ini digunakan larva yang berumur 36–48 jam.

Pada buah mahkota dewa mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder

seperti alkaloid, terpenoid, polifenol, saponin, tanin, resin dan flavonoid.

Senyawa–senyawa inilah yang menyebabkan kematian pada larva.

Mekanisme kematian pada larva disebabkan oleh adanya alkaloid, terpenoid

dan glikosid yang berperan sebagai stomach poisoning (racun perut). Proses ini

menyebabkan larva mengalami gangguan pada saluran cernanya. Selain itu,

senyawa ini juga menghambat reseptor rasa yang berada di permukaan mulut

larva sehingga larva tidak bisa mendeteksi makanan dan akhirnya mati karena

kelaparan.31,32

Berdasarkan kriteria standar larva dikatakan mati apabila larva tidak bergerak

selama 10 detik observasi.33

Observasi kematian larva dilakukan setelah 24 jam

pemberian ekstrak. Namun untuk memastikan bahwa larva benar-benar telah mati

maka dilakukan pewarnaan larva menggunakan trypan blue. Dimana larva yang

mati akan menyerap warna biru sehingga larva akan terlihat berwarna biru ketika

dilihat dengan menggunakan mikroskop.34

34

4.3 Penetapan LC50

Tabel 4.3 Perhitungan LC50 dengan menggunakan Metode probit.

m = ∑ (X) ∑ (Y) – n ∑(XY) = 2,3786

(∑ (X))2 - n ∑ (X

2)

b = ∑ (X) ∑ (XY) - ∑ (X2) ∑ (Y) = 0,5542

(∑ (X))2

- n ∑ (X2)

Nilai di atas dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus y = mX + b, dimana

nilai y merupakan nilai probit 50 % dari persentase kematian lalu X merupakan

log konsentrasi serta antilog X merupakan LC50.

Konsentrasi

Log Persentase

Probit (Y) X2 Y

2 XY Konsentrasi

(X) Kematian

12.5 1.09 10 3.72 1.19 13.83 4,05

25 1.39 20 4.17 1,39 17.39 5,79

50 1.69 36 4.64 2.87 21.53 7,84

125 2.09 60 5.25 4.37 27.56 10,97

500 2.69 90 6.28 7.24 39.44 16,89

Jumlah 8,95 24.06 17,06 119,75 45,54

35

Gambar 4.2 Grafik Analisis Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Metanol

Buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

Analisis Probit

Y = mX + b

Y = 1,596x + 1,953

5 = 1,596x + 1,953

1,596x = 3,047

X = 3,047 / 1,596 = 1,909

LC50 = antilog X = 81,09 ppm

Hasil uji toksisitas ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl

yang ditunjukkan oleh grafik di atas dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi

konsentrasi suatu ekstrak maka akan semakin tinggi tingkat kematian larva.

Perhitungan LC50 dengan menggunakan Microsoft Office Excel didapatkan

persamaan garis lurus Y = 1,596x + 1,953, lalu dimasukkan angka 5 pada nilai Y

sehingga didapatkan LC50 81,09 ppm. Perhitungan melalui kedua metode ini

menghasilkan LC50 yang sama–sama termasuk ke dalam kategori toksik. LC50

yang dikatakan toksik adalah dengan nilai kurang dari 1000 ppm.

Sedangkan dari penelitian Vivi L, dkk pada tahun 2006 disebutkan bahwa

LC50 dari ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl adalah 2,46

36

ppm. Hal penelitian tersebut sangat berbeda jauh dengan hasil yang didapatkan

pada penelitian ini. Hal ini dikarenakan metode ekstrak yang dilakukan pada

penelitian tersebut merupakan ekstraksi bertingkat. Sehingga ekstrak yang

didapatkan merupakan ekstrak yang lebih banyak mengandung zat aktif dari buah

Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl baik jumlah maupun senyawa-senyawanya.1

Sehingga dari analisis data dan perhitungan nilai LC50 menunjukkan bahwa

ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki potensi

toksik dan dapat digunakan sebagai anti-kanker.

Potensi antikanker tersebut diduga karena buah mahkota dewa memiliki

berbagai macam kandungan senyawa- senyawa metabolit sekunder yang bersifat

toksik. Salah satu senyawa yang terkandung di dalam buah mahkota dewa adalah

flavonoid. Berdasarkan beberapa teori, flavonoid memiliki beberapa efek pada sel

kanker yaitu : 35,36,37,38

1. Sebagai antioksidan, flavonoid dapat menimbulkan terjadinya fragmentasi

DNA yang disebabkan oleh adanya oksigen reaktif seperti radikal hidroksil

sehingga mengaktifkan jalur apoptosis sel.

2. Flavonoid juga menghambat transduksi sinyal ke inti melalui inhibisi protein

kinase sehingga menghambat proliferasi sel kanker.

3. Menghambat pertumbuhan suatu keganasan dengan menginhibisi reseptor

tirosin kinase. Reseptor ini merupakan reseptor yang berperan dalam

meningkatkan pertumbuhan keganasan.

4. Meningkatkan sensitivitas agen kemoterapi dan menurunkan angka resistensi

agen kemoterapi.

Selain karena adanya kandungan flavonoid yang diduga sebagai senyawa

toksik yang dikandung oleh buah mahkota dewa, senyawa–senyawa lain juga

berperan potensinya sebagai antikanker. Oleh karena itu, dengan LC50 < 1000 ppm

buah mahkota dewa dikatakan sebagai obat yang memiliki potensi sebagai

antikanker.21,1

Namun sebelum dijadikan sebagai obat antikanker, terlebih dahulu tanaman

ini harus melewati beberapa tahap uji farmakologi yang telah ditentukan untuk

membuktikan kualitas, keamanan dan efek samping yang ditimbulkan. Selain itu,

37

bahan baku yang digunakan harus memenuhi standar yang telah ditetapkan juga,

sehingga menjamin keamanan saat digunakan oleh masyarakat. Hal inilah yang

membuat setiap bahan alam yang akan dikembangkan menjadi obat selain

melewati beberapa tahap uji farmakologi, harus melwati uji klinik juga.6,7,8

4.4 Keterbatasan Penelitian

4.4.1 Waktu

Pada penelitian ini, sebenarnya masih banyak yang harus dilakukan untuk

mendapatkan hasil yang lebih baik. Tetapi karena keterbatasan waktu penelitian

maka ada beberapa hal yang tidak dilakukan seperti penghitungan susut

pengeringan, kadar abu dan kadar air ekstrak.

Lalu pada proses untuk memastikan kematian larva, yang pada umumnya

menggunakan trypan blue tidak dilakukan pada penelitian ini. Hal ini disebabkan

karena keterbatasan waktu dan tempat untuk mendapatkan trypan blue.34

Selain itu, pada awalnya penelitian ini akan dibandingkan dengan obat

antikanker yaitu methotrexate. Namun setelah penelitian ini berjalan, tidak

terdapat cukup waktu untuk mengerjakannya.

4.4.2 Jenis Pelarut Tunggal

Pelarut yang digunakan pada penelitian ini hanya satu yaitu metanol. Hal ini

disebabkan karena metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi

biasa, bukan dengan metode maserasi bertingkat. Metanol merupakan pelarut

yang polar sehingga hanya akan menarik senyawa aktif yang larut dalam pelarut

polar juga. Oleh karena itu, pada penelitian ini LC50 yang didapatkan berbeda

dengan penelitian sebelumnya.

Jika hanya dengan menggunakan satu jenis pelarut lalu menghasilkan LC50

yang masuk dalam kategori toksik (kurang dari 1000 ppm), maka hasil yang

didapatkan dengan menggunakan beberapa jenis pelarut akan menghasilkan LC50

yang lebih toksik (kurang dari 30 ppm).

38

4.4.3 Konsentrasi ekstrak yang untuk dosis aman

Pada penelitian ini yang dilakukan adalah untuk menentukan nilai LC50 suatu

ekstrak. Untuk penentuan dosis aman tidak dilakukan pada penelitian ini karena

keterbatasan waktu. Namun jika untuk mengetahui bahwa suatu ekstrak

mempunyai aktivitas toksik maka bisa ditentukan dengan melihat LC50 yang lebih

dari 1000 ppm.

39

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

1. Rendemen ekstrak dari ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff)

Boerl adalah 27,27 %.

2. Ekstrak metanol buah Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl memiliki aktivitas

sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach LC50nya adalah 81,09 ppm

sehingga masuk dalam kategori toksik karena memiliki LC50 < 1000 ppm.

5.2 Saran

1. Untuk mendapatkan hasil hitungan kematian larva yang tepat, sebaiknya

perhitungannya kematian larva dilakukan oleh 2 orang atau lebih.

2. Dilakukan penelitian dengan membandingkan ekstrak metanol buah Phaleria

macrocarpa (Scheff) Boerl dengan obat anti-kanker sebagai kontrol

positifnya.

3. Dilakukan penelitian dengan pengukuran susut pengeringan, kadar air, kadar

abu serta penggunaan trypan blue dalam memastikan kematian larva.

40

DAFTAR PUSTAKA

1. Lisdawati V, Wiryowidagdo S dan Kardono LB. Brine Shrimp Lethality Test

(BSLT) dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan kulit biji makota dewa

(Phaleri macrocarpa). Bul.Penelitian Kesehatan Vol. 34 No. 3; 2006: 111-118.

2. Lisdawati V. Kajian terhadap prospek pengembangan bahan bioaktif buah

mahkota dewa (P. macrocarpa) sebagai kandidat New Chemical Entity untuk

pengobatan kanker (Sitostatika). Bul.Penelitian Kesehatan Vol. 37 No. 1; 2009:

23-32.

3. Pisutthanan S, et al. Brine Shrimp lethality activity of thai medicinal plant in the

Family Maliaceae. Naresuan University Journal Vol.12 No.2; 2004: 13-18.

4. Meyer BN, et al. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant

constituent. Planta Medica; 1982.

5. Menkes RI. Farmakope Herbal Indonesia Edisi Pertama. Jakarta: Menkes; 2009.

6. Sukandar EY. Tren dan paradigma dunia farmasi. Industri-klinik-teknologi

kesehatan. Bandung : Institut Teknologi Bandung; 2004.

7. Menkes RI. Pedoman Fitofarmaka. Jakarta: Menkes; 1992.

8. Yuningsih R. Pengobatan tradisional di unit pelayanan kesehatan. Info singkat

kesejahteraan sosial Vol. IV No. 05/I/P3DI/Maret/2012; 2012: 9-12.

9. Widowati L. Kajian hasil penelitian mahkota dewa. Jurnal bahan alam Indonesia

Vol. 4 No. 1; 2005: 223-227.

41

10. Hendra R, et al. Antioxidant, Anti-inflammatory and cytotoxicity of Phaleria

macrocarpa (Boerl.) Scheff fruit. BMC complementary & alternative medicine,

Vol. 11, No.110; 2011.

11. Meiyanti, et al. Efek hipoglikemik daging buah mahkota dewa (Phaleria

macrocarpa (Scheff.) Boerl.) terhadap kadar gula darah pada manusa sehat

setelah pembebanan glukosa. Universa medicina Vol. 25 No. 3; 2006: 114-120.

12. Rohyami Y. Penentuan Kandungan flavonoid dari ekstrak metanol daging buah

mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl). [Skripsi]. Yogyakarta:

Universitas Islam Indonesia; 2008

13. Dewanti T, Wulan SN dan Nur Indira. Aktivitas antioksidan dan antibakteri

produk kering, instan dan effervescent dari buah mahkota dewa (Phaleria

macrocarpa (Scheff.) Boerl). Malang: Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 6 No. 1

Universitas Brawijaya; 2005: 29-36.

14. Anonim. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta: Departemen

Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan, Direkorat Pengawasan Obat Tradisional; 2000: 3-6 dan 9-12.

15. Agoes, Goeswin. Teknologi bahan alam. Bandung: Penerbit ITB Press; 2007: 11-

14 dan 21-23.

16. Tiwari P, et al. Phytochemical screening and extraction: A review. Internationale

Pharmaceutica Sciencia (IPS) Vol. 1. Jan-March 2011.

17. Amelia P. Isolasi, elusidasi struktur dan aktivitas antioksidan senyawa kimia dari

daun Garcinia benthami Pierre. [Tesis]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia; 2011.

18. Priyanto. Toksikologi: mekanisme, terapi antidotum, dan penilaian resiko.

Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia (LESKONFI); 2009.

42

19. Harmita dan Radji M. Buku ajar analisis hayati Edisi 3. Jakarta : EGC; 2008.

20. Landis, Wayne G. Introduction to environmental toxicology molecular

substuctures to ecological landscape. Fourth edition. USA: CRC Press; 2011: 52.

21. McLauughlin JL dan Rogers LL. The use of biological assays to evaluate

botanicals. USA: Drug Information Journal Vol. 32; 1998: 512-524.

22. Widianti A dan Suhardjono. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah cabai rawit

(Capsicum frutescens) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine

shrimp lethality test (BST). Semarang : Universitas Diponegoro; 2010

23. Asem A, Pouyani NR dan Escalente PD LR. The genus Artemia Leach, 1819

(Crustaceae: Branchiopoda). True and false taxonomical descriptions. Iran : Lat.

Am. J Aquat Res Vol. 38; 2010: 501-506.

24. Ramdhini, RN. Uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach dan toksisitas akut

komponen bioaktif Pandanu conoideus var. Conoideus Lam sebagai kandidat

antikanker. [Skripsi]. Surakarta: Universitas Sebelas Maret; 2010.

25. Panjaitan, RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae cortex)

dengan metode brine shrimp lethality test (BST). [Skripsi]. Yogyakarta:

Universitas Sanata Dharma; 2011.

26. Panggabean, MG. Teknik penetasan dan pemanenan Artemia salina Leach.

Jakarta: Pusat Penelitian Ekologi Laut, Lembaga Oseanologi Nasional-LIPI.

Oseana Vol IX No. 2; 1984: 57-65

27. Gajardo, Gonzola M dan Beardmore, John A. The brine shrimp Artemia : adapted

to critical life conditions. Chile: Frotiers in Physiology; 2012.

28. Utomo, DP. Analisis matematis dan ekonomis penggunaan metanol dan etanol

pada kompor “HD”. Malang: Jurnal teknik industri, Vol 11 No 1; Februari 2011:

50-55.

43

29. Anonim. Methanol. Europe: International Programme on Chemical Safety (IPCS)

and European Commission; 2012.

http://www.inchem.org/documents/icsc/icsc/eics0057.htm (Diunduh September

2014)

30. Amalia FR, et al. Pengaruh Glutathione terhadap kualitas semen kambing Boer

Post Thawing dalam pengencer yang mengandung Dimetylsulfoxie (DMSO).

Malang: Universitas Brawijaya; 2012.

31. Rita WS, Suirta IW, Sabikin A. Isolasi & Identifikasi Senyawa Yang Berpotensi

Sebagai Antitumor Pada Daging Buah Pare (Momordica charantia L.). Jurusan

Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran. Jurnal Kimia Vol.2; 2008.

32. Nguyen HH, Widodo S. Momordica L. In: Medicinal and Poisinous Plant

Research of South-East Asia 12. De Padua L. S. N. Bunyapraphatsana and R.H.

M. J. Lemmens (eds.). Pudoc Scientific Publisher. Wageningen, the Netherland;

1999: 353-359.

33. Rolliana, ER. Uji toksisitas akut ekstrak etanol Daun Kamboja (Plumeria alba L)

terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test

(BST). [Skripsi]. Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro; 2010.

34. Perry SW, et al. In Situ Trypan blue staining of monolayer cell cultures for

permanent fixation and mounting. New York: University of Rochester Medical

Center. BioTechniques Vol. 22 No.2; 1997.

35. Ogata S, et al. Apoptosis induced by the flavonoid from lemon fruit (citrus limon

BURM. F.) and its metabolites in HL-60 cells. Japan: Biosci Biotechnol Vol 64

No 5; 2000: 1075-1078. PMID 10879486. Available from: http://www.ncbi.nlm

44

36. Vizcaino F, et al. The flavonoid quercetininduced apotosis and inhibits JNK

activation in intimal vascular smooth muscle cells. London: Biochemical and

Biophysical Research communications Vol 346 No 3; 4 Agustus 2006: 919-925.

Available from: http://www.sciencedirect.com.

37. Ren W, et al. Tartary Buckwheat Flavonoid Activates caspase 3 And Induces Hl-

60 Cell apoptosis. China: Clin Pharmacol Vol 23 No 8; 2001: 427-432. Available

from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11838316.

38. Demeule M et al. Grean tea catechin as novel antitumor and antiangiogenic

compounds. Canada: Curr. Med. Chem-Anti-Cancer Agent Vol 2 No 4; 2002:

441-463. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12678730.

45

LAMPIRAN

Lampiran 1

Alur penelitian

Gambar 6.1 Alur penelitian

1 gram telur Artemia salina Leach

Penetasan telur Artemia salina Leach

Pengambilan larva secara random

Sumur A: 10 larva + 1 ml ekstrak 1000 ppm + 1 ml air laut

Sumur B : 10 larva + 1 ml ekstrak 500 ppm + 1 ml air laut

Sumur C : 10 larva + 1 ml ekstrak 250 ppm + 1 ml air laut

Sumur D : 10 larva + 1 ml ekstrak 100 ppm + 1 ml air laut

Sumur E : 10 larva + 1 ml ekstrak 50 ppm + 1 ml air laut

Sumur F : 10 larva + 1 ml ekstrak 25 ppm + 1 ml air laut

Sumur G : 10 larva + 1 ml ekstrak 10 ppm + 1 ml air laut

Sumur 22 – 24 : 10 larva + 2 ml air laut

Volume akhir masing-masing sumur adalah 2 ml

Dilakukan replikasi 3 kali pada tiap konsentrasi

Setelah 24 jam pemberian ekstrak, dilakukan penghitungan jumlah larva yang mati

Menghitung persentase kematian larva pada tiap konsentrasi

Menentukan LC50 dengan metode probit

Larva Artemia salina berumur 48 jam

Larva Artemia salina Leach dengan jenis dan cara

penyediaan yang sama dan telah bersifat homogen

46

Lampiran 2

Metode probit

Tabel 6.1 Tabel probit

Konsentrasi

Log

Konsentrasi

(X)

%

Kematian

Probit

(Y) X

2 Y

2 XY

∑

Baik konsentrasi maupun persentase kematian dimasukkan ke dalam tabel

probit seperti di atas. Lalu melakukan log dari setiap konsentrasi dan mencari nilai

probit dari setiap persentase kematian dengan menggunakan tabel probit.

Setelah mengisi semua bagian tabel, maka dilakukan penghitungan dengan

menggunakan persamaan garis lurus : y = mX + b.

Dimana Y merupakan angka probit dan X adalah nilai log konsentrasi serta antilog X

adalah nilai LC50.

Nilai slope (m) dihitung dengan rumus :

m = ∑ (X) ∑ (Y) – n ∑(XY)

(∑ (X))2 - n ∑ (X

2)

Nilai Intersep (b) dihitung dengan rumus :

b = ∑ (X) ∑ (XY) - ∑ (X2) ∑ (Y)

(∑ (X))2 - n ∑ (X

2)

47

Lampiran 3

Surat Keterangan Determinasi Tanaman

Gambar 6.2 Keterangan Determinasi Tanaman

48

Lampiran 4

Keterangan Bahan Penelitian Telur Artemia

Gambar 6.3 Keterangan bahan penelitian telur artemia

49

Lampiran 5

Gambar Bahan dan Alat Penelitian

Gambar 6.4 Penghalusan simplisia Gambar 6.5 Destilasi pelarut metanol

Gambar 6.6 Proses pemasukan simplisia Gambar 6.7 Botol Maserasi

ke botol maserasi

Gambar 6.8 Proses evaporasi dengan Gambar 6.9 Ekstrak kental buah

rotatory evaporator mahkota dewa

50

Lanjutan...

Gambar 6.10 Neraca analitik Gambar 6.11 Proses Penyaringan

Gambar 6.12 Larutan Induk 20.000 ppm Gambar 6.13 Larutan ekstrak berbagai

Konsentrasi uji

Gambar 6.14 Wadah penetasan telur artemia Gambar 6.15 Well plate uji BSLT

51

Lampiran 6

Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Metanol Buah Mahkota Dewa

Konsentrasi = ekstrak metanol buah mahkota dewa

Volume aquade (mL)

20.000 ppm = x = 2.000.000 µg = 2000 mg

100

Untuk mendapatkan ekstrak dengan konsentrasi 1000 ppm, 250 ppm, 100 ppm dan 50 ppm

dan 25 ppm maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan rumus V1 M1 = V2 M2.

a) Konsentrasi ekstrak 1000 ppm

V1 M1 = V2 M2

20000 µg/mL x V1 = 1000 µg/mL x 10 mL

V1 = 10.000 µg = 0,5 mL

20.000 µg/mL

Maka kita mengambil 0,5 mL larutan ekstrak 20.000 ppm

b) Konsentrasi ekstrak 250 ppm

V1 M1 = V2 M2

1000 µg/mL x V1 = 250 µg/mL x 4 mL

V1 = 1000 µg = 1 mL

1000 µg/mL

Maka kita mengambil 1 mL larutan ekstrak 1.000 ppm

c) Konsentrasi ekstrak 100 ppm

V1 M1 = V2 M2

1000 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 4 mL

V1 = 400 µg = 0,4 mL

1000 µg/mL

Maka kita mengambil 0,4 mL larutan ekstrak 1.000 ppm

52

d) Konsentrasi ekstrak 50 ppm

V1 M1 = V2 M2

1000 µg/mL x V1 = 50 µg/mL x 4 mL

V1 = 200 µg = 0,2 mL

1000 µg/mL

Maka kita mengambil 0,2 mL larutan ekstrak 1.000 ppm

e) Konsentrasi ekstrak 25 ppm

V1 M1 = V2 M2

1000 µg/mL x V1 = 25 µg/mL x 4 mL

V1 = 100 µg = 0,1 mL

1000 µg/mL

Maka kita mengambil 0,2 mL larutan ekstrak 1.000 ppm

53

Lampiran 7

Perhitungan Penggunaan DMSO

Pembuatan larutan DMSO induk 20.000 ppm :

2 ml DMSO = 0,02

100 ml aquades

Sehingga persen DMSO yang digunakan untuk larutan induk 20.000 ppm yaitu 0,02 x 100 %

= 2 %, kadar DMSO dilakukan pengenceran sesuai dengan pembuatan konentrasi ekstrak.

a) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 1.000 ppm.

V1 M1 = V2 M2

0,5 x 2 % = 10 x M2

M2 = 1 = 0,1 %

10

Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 1.000 ppm adalah 0,1 %.

b) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 250 ppm.

V1 M1 = V2 M2

1 x 0,1 % = 4 x M2

M2 = 0,1 = 0,025 %

4

Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 250 ppm adalah 0,025 %.

c) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 100 ppm.

V1 M1 = V2 M2

0,4 x 0,1 % = 4 x M2

M2 = 0,04 = 0,01 %

4

Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 100 ppm adalah 0,01 %.

54

d) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 50 ppm.

V1 M1 = V2 M2

0,2 x 0,1 % = 4 x M2

M2 = 0,02 = 0,005 %

4

Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 50 ppm adalah 0,005 %.

e) Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 25 ppm.

V1 M1 = V2 M2

0,1 x 0,1 % = 4 x M2

M2 = 0,01 = 0,0025 %

4

Sehingga persentase DMSO ang terdapat pada larutan 25 ppm adalah 0,0025 %.

55

Lampiran 8

Tabel 6.2 Transformasi Persen-Probit

56

Lanjutan...

57

Lampiran 9

Identifikasi Larva Artemia salina Leach

Gambar 6.16 Larva Artemia salina Leach di bawah mikroskop

58

Lampiran 10

Keterangan Daftar Riwayat Hidup

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Nama : Ayu Reskianingsih

Tempat, tanggal lahir : Malili, 21 Desember 1993

Alamat : Jl. Dr. Sam Ratulangi

Perumahan BTN Wija Virgo Kel. Puncak Indah, Kec.

Malili, Kab. Luwu Timur, Prov. Sulawesi Selatan.

No. HP : 081242030607

Email : ayhu_ayra@rocketmail.com

Riwayat Pendidikan :

1. SDN No. 221 Malili (2000-2005)

2. SMP Neg. 1 Malili (2005-2008)

3. SMA Neg. 1 Malili (2008-2011)

4. PSPD FKIK UIN Jakarta (2011-sekarang)