Uji konfirmasi merupakan uji lanjutan dari uji screening narkotika / psikotropika dimana uji konfirmasi merupakan pemeriksaan yang lebih akurat karena hasil yang diperoleh merupakan hasil yang sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika / psikotropika dalam suatu sampel yang dianalisis. Dalam uji konfirmasi narkotika / psikotropika, sampel yang digunakan adalah sampel urine pasien yang dicurigai mengandung zat narkotika / psikotropika. Penggunaan sampel urine dikarena dalam sampel urine obat, racun, dan metabolit ada dalam konsentrasi yang lebih besar dibandingkan dalam darah. Sebelum melakukan uji konfirmasi terhadap jenis narkotika / psikotropika, dilakukan suatu pemisahan zat narkotika / psikotropika terlebih dahulu dari sampel yang akan dianalisis. Pemisahan tersbut dilakukan dengan menggunakan proses ekstraksi.

Ekstraksi merupakan proses pemisahan analit dari suatu matriks sampel menggunakan pelarut dimana analit tersebut sangat larut dalam pelarut yang digunakan namun zat pengotornya tidak larut. Dalam proses ekstraksi, setelah analit dalam sampel larut dalam pelarut organik yang digunakan, kemudian dilakukan suatu proses penguapan untuk menghilangkan pelarut tersebut sehingga diperoleh analitnya saja untuk selanjutnya dianalis, dimana hal ini disebut dengan tahap isolasi. Dalam proses ekstraksi, syarat untuk pelarut sesuai yang dapat digunakan yaitu memiliki kakuatan mengekstraksi yang baik sehingga analit yang akan diekstraksi dapat dipisahkan sepenuhnya dari matriks sampel dan zat pengotor, kelarutannya rendah dalam air, memiliki kerapatan yang rendah dalam air, memiliki volalitas moderat agar mudah diuapkan saat akan memperoleh analit yang larut dalam pelarut tersebut namun pelarut tersebut tidak boleh terlalu volatile sehingga pada saat digunakan untuk melarutkan analit atau preparasi sampel pelarut tersebut tidak cepat menguap seluruhnya, bersifat stabil dan tidak mudah terbakar, murah, kemurniannya tinggi, tidak mengabsorpsi sinar UV atau tdak memiliki aktivitas elektrokimia sehingga tidak mengganggu proses analisis analit.Dalam praktikum yang dilakukan, proses ekstraksi dilakukan untuk memperoleh obat obat golongan Amfetamin dan Opiat dari sampel urine yang selanjutkan akan dianalisis dengan menggunakan spektrofotodensitometri. Dalam proses analisis obat golongan Amfetamin, yang menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu amfetamin, metamfetamin, methylendioxy amfetamin (MA) dan methylendioxy metamfetamin (MDMA). Sedangkan untuk obat golongan Opiat, yang menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu kodein dan morfin.

Ada beberapa metode ekstraksi, yaitu ekstraksi padat cair, ektraksi cair cair, dan ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction/ SPE). Dalam praktikum yang dilakukan, metode ekstraksi yang digunakan yaitu ekstraksi cair cair dan ekstraksi fase padat (SPE).

Ekstraksi cair cair merupakan ekstraksi suatu analit yang didasarkan atas distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Dalam proses ektraksi cair cair terdapat beberapa tahap, yaitu adjust pH (penyesuaian pH), partition, dan separated phase. Pada proses pengerjaannya, sampel urine yang akan dianalisis diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung centrifuge, kemudian ditambahkan dengan buffer fosfat pH 9,3 sebanyak 1 ml dengan tujuan untuk mengkondisikan pH sampel agar sesuai dengan pH yang baik untuk proses ekstraksi (basa) karena semakin tinggi pH larutan akan semakin tinggi pula jumlah analit yang akan dperoleh.. Setelah itu ditambahkan dengan 2 ml campuran kloroform isopropanol yang sebelumnya telah dicampurkan dengan perbandingan 3:1, dimana campuran kloroform isopropanol berfungsi sebagai pelarut yang akan membuat analit dalam sampe diperoleh kembali dengan jumlah yang lebih tinggi dibandingkan dengan menggunakan yang lain. Sampel urine, buffer fosfat pH 9,3 dan campuran kloroform isopropanol dalam tabung centrifuge tersbut kemudian di vortex dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit agar terbentuk emulsi yang sempurna sehingga analit atau sasaran zat dalam proses analisis dapat larut dengan baik hingga selanjutnya dilakukan proses centrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk memperoleh hasil pemisahan antara fase kloroform dan fase airnya. Fase kloroform merupakan fraksi yang mengandung analit yang diinginkan. Setelah proses centrifuge, fase kloroform akan berada dibagian bawah tabung centrifuge karena kloroform memiliki berat jenis yang lebih besar dibandingkan dengan berat jenis air. Fase kloroform tersbut kemudian di pipet dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Sedangkan fase air yang tersisa dalam tabung centrifuge diekstraksi kembali. Hal ini dilakukan karena diduga dalam fase air tesbut masih terdapat analit / zat yang diinginkan. Oleh karenanya, dilakukan kembali penambahan buffer fosfat dengan pH yang lebih tinggi dari pH buffer fosfat sebelumnya yaitu 10,5 untuk memaksimalkan perolehan analit yang terdapat dalam fase air tersbut. Kemudian ditambahkan campuran kloroform isopropanol kembali dan dilakukan proses vortex dan centrifugasi dengan waktu dan kecepatan yang sama. Dari proses tersebut juga akan diperoleh fase kloroform dimana fase kloroform ini ditambahkan pada fase kloroform pertama yang terdapat dalam tabung reaksi untuk selanjutnya dipindahkan ke dalam botol vial dan di uapkan pada suhu 60 - 700C menghilangkan pelarut pelarut organik yang sebelumnya digunakan untuk proses elusi sehingga diperoleh analit murni dari target yang diinginkan.Ekstraksi fase padat adalah suatu teknik preparasi sampel yang mengacu pada peristiwa pelepasan senyawa kimia dari sampel cairan yang mengalir karena adanya retensi pada suatu padatan penyerap, yang kemudian diikuti dengan perolehan kembali analit yang diinginkan melalui proses elusi. Pada praktikum yang dilakukan, ekstraksi fase padat menggunakan fase diam berupa kolom SPE Accubond II Evidex Catridge serta fase gerak berupa pelarut organik yang sesuai. Prinsip pengerjaan ekstraksi fase padat terdiri dari tahapan condition, application, retention, rinse, dan elution. Namun, pada tahap pertama sebelum dilakukan tahapan condition, sampel yang akan dianalisis dipreparasi terlebih dahulu. Karena pada saat praktikum jenis zat narkotika / psikotropika yang akan dianalisis adalah Amfetamin dan Opiat, maka proses ekstraksi fase padat ini dilakukan dengan dua pelarut yang berbeda. Untuk preparasi sampel dengan target analisis Amfetamin, 5 ml urine ditambahkan dengan 3 ml K2HPO4 0,1 M pH 6 untuk mngkondisikan pH sampel urine agar sesuai dengan pH yang baik untuk proses ekstraksi. Sedangkan untuk preparasi sampel dengan target analisis Opiat, 5 ml urine ditambahkan dengan 0,5 ml HCl dalam botol vial yang kemudia ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan pada penangas air dengan suhu 1200C selama 15 menit. Penambahan HCl pada sampel urine dengan proses pemanasan ini dilakukan dengn tujuan untuk mendestruksi protein pengotor yang terdapat pada sampel karena umumnya apabila suatu sampel urine mengandung Opiat, maka dalam sampel urine tersebut akan banyak protein yang mengikat Opiat sehingga untuk mempermudah proses analisis Opiat, protein yang Opiat tersebut harus didestruksi terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 0,75 ml NaOH 10 N yang menyebabkan pH urine menjadi basa (pada saat praktikum pH urine menjadi 13). Untuk mengkondisikan pH urine pada pH yang sesuai untuk proses ekstraksi yaitu berkisar antara 6,5 7,5 maka sampel urine ditambahkan dengan 2,5 ml asam fosfat 0,5 M. Namun pada saat praktikum, ketika ditambahkan 2,5 ml asam fosfat 0,5 M ternyata pH urine menjadi 1. Oleh karenanya, sampel urine ditambahkan kembali dengan NaOH 10 N hingga pH sampel urine berkisar antara 6,5 7,5. Selanjutnya dilakukan tahap SPE condition yang merupakan tahap untuk menyesuaikan kondisi lingkungan kolom yang akan menjadi tempat mengalirnya sampel yang akan diekstraksi. Untuk target analisis Amfetamin dan Opiat, SPE condition dilakukan dengan tahapan yang sama yaitu menambahkan 6 ml metanol dengan 6 ml K2HPO4 0,1 M pH 6, dimana methanol berfungsi sebagai fase gerak yang akan membantu proses elusi sedangkan K2HPO4 0,1 M pH 6 berfungsi untuk menjaga pH kolom agar sama dengan pH sampel yang akan diekstraksi, sehingga perubahan perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Tahapan selanjutnya setelah SPE condition adalah tahapan retention yang merupakan tahapan dimana terjadi suatu proses penghambatan matriks dan analit serta tahapan rinse yang merupakan pencucian matriks dari sampel yang dianalisis. Tahapan retention dan rinse untuk target analisis Amfetamin, dilakukan dengan memasukkan sampel urine sehingga matriks dan Amfetamin akan tertahan pada fase padat kolom. Kemudian ditambahkan 3 ml air yang merupakan tahapan awal untuk menghilangkan matriks yang tertahan pada fase padat. Selanjutnya ditambahkan 3 ml asam asetat 0,1 M sebanyak 3 ml untuk mencuci sisa matriks yang masih tertahan di dalam kolom dimana matriks ini akan dihilangkan dari dalam kolom dengan penambahan 3 ml methanol. Sedangkan untuk target analisis Opiat, tahapan retention dan rinse dilakukan dengan penambahan 3 ml K2HPO4 0,1 M kemudian disusul dengan sampel urine yang dimasukkan ke dalam kolom. Selanjutnya dilakukan penambahan 3 ml air, 3 ml sodium asetat 0,1 M pH 4,5 dan 3 methanol dimana penambahan 3 zat ini ke dalam kolom mempunyai tujuan yang sama seperti pada tahapan rinse untuk Amfetamin sehingga yang tersisa dikolom hanya analit yang diinginkan. Setelah tahapan retention dan rinse, dilakukan proses elusi, dimana proses elusi dilakukan ntuk mengambil analit tersebut dari kolom dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Untuk Amfetamin, ditambahkan ke dalam kolom 3 ml campuran kloroform, isopropyl alkohol dan HCl dengan perbandingan 60:40:1. Sedangkan untuk Opiat, ditambahkan ke dalam kolom 3 ml campuran kloroform, isopropyl alkohol, dan Na4OH dengan perbandingan 78:20:2. Dengan pelarut yang sesuai tersebut, akan diperoleh kembali analit yang diinginkan dari dalam kolom tersebut secara maksimal. Masing masing eluat yang diperoleh kemudian diuapkan pada suhu 650C untuk menghilangkan pelarut pelarut organik yang sebelumnya digunakan untuk proses elusi sehingga diperoleh analit murni dari target yang diinginkan.Analit yang telah diperoleh baik dengan ekstraksi cair cair maupun SPE direkonstitusi dengan methanol sebanyak 25(l dengan tujuan untuk melarutkan analit tersebut sehingga diperoleh dalam bentuk cairan sehingga memudahkan analit untuk selanjutnya dilakukan uji konfirmasi dengan metode KLT Spektrodensitometri.

Setelah diperoleh analit dari sampel urine yang akan dianalisis, kemudian analisis analit tersebut dilanjutkan pada uji konfirmasi. Dalam praktikum yang dilakukan, uji konfirmasi dilakukan dengan menggunakan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis) Spektrofotodensitometri. Hal pertama yang dilakukan dalam uji konfirmasi dengan KLT Spektrodensitometri adalah menyiapkan plat lapis tipis yang akan digunakan untuk menotolkan noda analit yang telah diperoleh sebelumnya. Preparasi plat lapis tipis sangat penting untuk dilakukan karena akan menentukan hasil dari proses selanjutnya dari uji konfirmasi ini. Plat lapis tipis yang digunakan mengandung silika gel yang berperan sebagai fase diam. Plat umumnya berukuran 20X20 cm, namun pada praktikum yang dilakukan, plat yang diperlukan berukuran 10 X 10 cm, sehingga harus dilakukan pemotongan terlebih dahulu sebelum plat tersebut digunakan. Dalam pemotongan plat, ada beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain:

Alas yang digunakan untuk memotong plat harus bersih, halus serta terbuat dari keramik atau kaca.

Alat pemotong yang digunakan harus tajam dan tidak boleh berkarat. Dalam pemotongan plat, tidak harus dipaksakan pemotongan tersebut dilakukan dalam sekali tahap pemotongan. Pengulangan pemotongan boleh dilakukan hingga plat benar benar terputus dengan sempurna.

Hal tersebut dilakukan agar diperoleh plat yang tidak bergerigi, dan bebas dari kontaminasi sebab plat yang bergerigi dapat mengganggu proses elusi sehingga menghasilkan elusi analit yang tidak lurus sempurna (miring), berekor (tailing) serta terbentuk jalur elusi baru. Plat yang telah dipotong dengan baik, harus diberi identitas berupa kode arah elusi dipojok kanan atau kiri atas dengan menggunakan pensil dan tidak boleh menggunakan ballpoint. Walapun pensil dan ballpoint sama sama mengandung bahan kimia, tetapi bahan kimia yang terkandung dalam pensil masih bisa ditoleransi oleh plat dibanding bahan kimia yang terkandung dalam ballpoint. Selain itu, apabila menggunakan ballpoint, saat plat dicuci dengan menggunakan methanol, kemungkinan tinta dari ballpoint tersebut akan luntur dan mengotori plat. Fungsi dari pemberian kode arah elusi adalah agar proses pencucian plat dan proses elusi dapat berjalan kearah yang sama, sebab apabila arah pencucian plat dengan arah elusi berbanding terbalik, akan menyebabkan kotoran plat yang telah dibawa ke bagian atas plat saat pencucian plat dengan methanol akan turun kembali ke daerah uji saat proses elusi yang menyebabkan analit yang dielusikan akan terelusi bersama pengotor pengotor tersebut sehingga mengganggu proses analisis analit. Selain itu, plat yang telah dipotong harus diberi batas atas dengan menggunakan pensil sekitar 1 cm dengan tujuan agar titik akhir elusi dari masing masing noda dapat diamati dengan jelas. Selain itu juga untuk memastikan agar masing masing noda tidak menyentuh pengotor pengotor hasil pencucian plat yang terkumpul dibagian atas plat.Sebelum digunakan, plat yang telah dipotong tersebut dicuci dan diaktivasi. Pencucian harus dilakukan sebab plat kemungkinan mengandung pengotor karena faktor internal maupun eksternal. Faktor internal yang dimaksud adalah pada saat proses pembuatan plat tersebut, sedangkan faktor eksternal adalah pada saat penyimpanan plat itu sendiri. Pencucian dilakukan dengan menggunakan larutan methanol yang merupakan pelarut polar / semi polar yang dapat melarutkan banyak senyawa. Arah proses pencucian harus disesuaikan dengan kode arah elusi yang telah ditetepkan sebelumnya karena methanol itu ikut bermigrasi bersama pengotor kearah pencucian. Sebenarnya larutan yang lebih baik digunakan untuk proses pencucian plat adalah fase geraknya sendiri karena fase geraknya tersebut akan secara langsung membawa zat yang dianggap sebagai pengotor oleh fase gerak itu sendiri sehingga plat tersebut akan terbebas dari semua pengotor yang dapat mengganggu proses elusi. Sedangkan apabila menggunakan methanol, zat yang tidak larut dalam methanol namun merupakan pengotor bagi fase gerak, maka pada saat proses elusi analit dengan fase geraknya tersebut proses elusi akan diganggu oleh pengotor tersebut. Namun, dalam praktikum yang dilakukan, pencucian dilakukan dengan menggunakan methanol mengingat methanol merupakan pelarut yang umum digunakan dan mudah diperoleh dipasaran serta dapat melarukan banyak zat. Tahap selanjutnya dilakukan proses aktivasi plat dengan pemanasan plat pada suhu 600C selama 10 menit di dalam oven. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan uap air dan pengotor yang menempel pada sisi aktif plat karena methanol yang digunakan untuk pencucian plat terdiri atas campuran air dan methanol sehingga kemungkinan air tersebut terjerat dalam silika gel dan menyebabkan silika gel tersebut menjadi jenuh dan harus diaktivasi. Oleh karenanya proses aktivasi dilakukan dengan menghilang air yang terjerat dalam silika gel tersebut sehingga silika gel tersebut tidak jenuh dan agar plat dapat memberikan respon baseline yang lebih baik serta mengurangi ratio gangguan (noise ratio).Setelah aktivasi plat dilakukan, kemudian dilakukan pembuatan larutan pengembang. Larutan pengembang yang digunakan dalam praktikum ini adalah larutan pengembang sistem TB. Larutan pengembang TB dibuat dengan mencampurkan sikloheksana, toluene, dan dietilamin dengan perbandingan 75:15:10 dalam sebuah labu ukur. Selanjutnya, dilakukan pembuatan senyawa standar dengan konsentrasi 50 ng/(l. Karena pada saat praktikum telah tersedia larutan standar dengan konsentrasi 1000 ng/(l, maka larutan standar dengan konsentrasi 1000 ng/(l tersebut diencerkan menjadi konsentrasi 50 ng/(l dengan cara 0,25 ml larutan standar 1000 ng/(l diencerkan dalam labu ukur 5 ml dengan menggunakan methanol hingga tanda batas labu ukur, sehingga diperoleh larutan standar pembanding 5 ng/(l yang diinginkan.

Setelah dilakukan pembuatan larutan standar dengan konsentrasi 50 ng/(l, kemudian dibuat larutan standar pembanding untuk sistem TB. Larutan standar pembanding untuk sistem TB dibuat dari larutan teofilin, papaverin, dekstrometorfan, dan bromheksin yang masing masing larutan tersebut berkonsentrasi 1 mg / ml kecuali larutan dektrometorfan yang memiliki konsentrasi 2 mg/ml. Oleh karenanya sebelum keempat larutan tersebut dicampurkan, larutan dekstrometorfan harus diencerkan terlebih dahulu hingga diperoleh larutan standar pembanding dekstrometorfan 1 ml /ml. Pengenceran larutan dekstrometorfan 2 mg / ml dilakukan dengan memipet 2,5 ml larutan dektrometorfan 2 mg / ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian ditepatkan hingga tanda batas dengan methanol da dihomogenkan hingga diperoleh larutan Dektrometorfan 1 mg / ml. Pembuatan larutan standar pembanding untuk sistem TB dilakukan dengan mencampurkan masing masing 0,5 ml larutan teofilin 1 mg / ml, papaverin 1 mg / ml, dektrometorfan 1 mg / ml, serta bromheksin 1 mg /ml dalam sebuah botol vial dan kemudian dihomogenkan. Tahapan selanjutnya adalah penjenuhan chamber. Sebelum dijenuhkan, dipilih terlebih dahulu chamber yang sesuai dengan ukuran plat. Karena Plat yang digunakan berukuran 10 X 10 cm, maka chamber yang digunakan adalah chamber dengan ukuran 10 X 10. Kemudian penjenuhan chamber dilakukan dengan cara memasukkan 10 ml larutan pengembang TB ke dalam chamber yang telah di berisi sebuah kertas saring kemudian chamber ditutup rapat dengan penutupnya selama kurang lebih 30 menit. Fungsi penambahan kertas saring ke dalam chamber saat proses penjenuhan chamber adalah untuk mengetahui chamber tersebut sudah jenuh atau belum. Apabila chamber telah jenuh, maka kertas saring dalam chamber tersebut akan terbasahi seluruhnya oleh larutan pengembang TB.Bersamaan dengan proses penjenuhan chamber, dilakukan proses penotolan larutan standar, analit sampel yang sebelumnya telah direkonstitusi dengan methanol, serta larutan standar pembanding sistem TB pada plat yang telah dicuci dan diaktivasi dengan menggunakan alat penotolan semi otomatis Linomart. Dikatakan sebagai alat penotolan yang semi otomatis, karena pada proses aspirasi bahan uji ke dalam syringe linomart masih dilakukan secara manual oleh petugas tetapi untuk proses penotolah bahan uji dilakukan secara otomatis oleh linomart itu sendiri melalui proses setting komputerisasi yang sebelumnya telah dilakukan sehingga petugas hanya perlu penempatan plat pada meja linomart. Karena plat yang digunakan berukuran 10 X 10 cm dan jarak penotolan satu senyawa dengan senyawa lainnya adalah 1 cm, maka pada plat tersebut akan terdapat 9 titik penotolan. Titik penotolan 1 sampai 5 diisi dengan larutan standar, titik penotolan 6 sampai 8 diisi dengan analit dari sampel, dan titik penotolan 9 diisi dengan larutan standar pembanding untuk sistem TB. Pada titik penotolan 1 sampai 5, ditotolkan larutan standar dengan konsentrasi yang berbeda beda, yaitu 200 ng/(l, 400 ng/(l, 600 ng/(l, 800 ng/(l, dan 1000 ng/(l. Karena larutan standar yang tersedia memiliki konsentrasi 50 ng/(l, maka tiap titik penotolan (dari titik penotolan 1 sampai 5) memiliki jumlah penotolan yang berbeda beda sesuai konsentrasi larutan standar pada setiap titik penotolan yang telah dipaparkan sebelumnya. Jumlah penotolan pada setiap titik pada titik penotolan 1 sampai 5, antara lain; Titik penotolan 1 : Konsentrasi larutan standar 200 ng/(l, maka penotolan larutan standar 50 ng/(l dilakukan sebanyak 4 kali.

Titik penotolan 2 : Konsentrasi larutan standar 400 ng/(l, maka penotolan larutan standar 50 ng/(l dilakukan sebanyak 8 kali. Titik penotolan 3 : Konsentrasi larutan standar 600 ng/(l, maka penotolan larutan standar 50 ng/(l dilakukan sebanyak 12 kali. Titik penotolan 4 : Konsentrasi larutan standar 800 ng/(l, maka penotolan larutan standar 50 ng/(l dilakukan sebanyak 16 kali. Titik penotolan 5 : Konsentrasi larutan standar 1000 ng/(l, maka penotolan larutan standar 50 ng/(l dilakukan sebanyak 20 kali.

Selanjutnya, pada titik penotolan 6 sampai 8 diisi oleh analit dari sampel yang dianalisis. Pada titik penotolan ke 6 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi SPE dengan target sasaran analisis Amfetamin, pada titik penotolan 7 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi SPE dengan target sasaran analisis Opiat dan titik penotolan 8 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi LLE dengan target sasaran analisis Opiat. Masing masing analit dari sampel tersebut ditotolkan sebanyak 50 (l. Sedangkan pada titik penotolan 9 ditotolkan 2 (l larutan standar pembanding TB.Apbila proses penotolan telah selesai dilakukan, kemudian plat dikeringkan pada oven dengan suhu 6001