UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL

DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE

ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa

CELL LINE)

SKRIPSI

Diajukan Sebagai Tugas Akhir Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far).

OLEH

KIKI ZAKIAH

NIM : 107102001475

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2011/1432 H

ii

LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI

NAMA : KIKI ZAKIAH

NIM : 107102001475

JUDUL : UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA

EUGENOL DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria

gambier, Roxb) DARI FASE ETIL ASETAT TERHADAP

KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa CELL LINE)

Disetujui oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Nurmeilis, M.Si, apt drg. Laifa Annisa H., Ph.D.

NIP:197404302005012003 NIP : 197804022009012003

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt

NIP : 1956010619851010001

iii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi dengan Judul

UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL

DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE

ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa

CELL LINE)

Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan dihadapan tim penguji oleh

Kiki Zakiah

NIM: 107102001475

Menyetujui,

Pembimbing:

1. Pembimbing I Nurmeilis, M.Si, Apt. ........................

2. Pembimbing II drg. Laifa Annisa H., PhD ........................

Penguji:

1. Ketua Penguji Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................

2. Anggota Penguji I Dr. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................

3. Anggota Penguji II Ofa Suzanti Bheta, M.Si, Apt. ........................

4. Anggota Penguji III Drs. Ahmad Musir, M.Sc, Apt. ........................

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Prof. Dr (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And

Tanggal lulus : 16 Desember 2011

iv

LEMBAR PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul:

UJI EFEK ANTIPROLIFERATIF CAMPURAN SENYAWA EUGENOL

DAN ISOLAT KATEKIN GAMBIR (Uncaria gambier, Roxb) DARI FASE

ETIL ASETAT TERHADAP KULTUR SEL KANKER SERVIKS (HeLa

CELL LINE)

Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun

kepada perguruan tiggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari

karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkandari penulis lain telah disebutkan

dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.

Penulis

Kiki Zakiah

107102001475

v

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirrabil ‘alamin, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang

selalu melimpahkan rahmat, karunia, cinta dan kasihNya yang tidak terbatas

kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan

skripsi berjudul “Uji Efek Antiproliferatif Campuran Senyawa Eugenol dan Isolat

Katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dari Fase Etil Asetat Terhadap Kultur

Sel Kanker Serviks (HeLa cell line).

Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bunda Nia Nurhamidah Romli, Ayah Muzimi Effendi, Sis Fetty Fatihatun N,

Syarief Muiz Abdillah dan Putri Khatami yang selalu memberikan kasih

sayang, doa, semangat dan dukungan baik moril maupun materil sehingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2. Bapak Prof. Dr. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Bapak. Dr. M. Yanis Musdja M.Sc, Apt, selaku Ketua Jurusan Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Nurmeilis, M.si, Apt, selaku pembimbing I yang tak bosan mengajarkan

dan membimbing penulis di segala kesempatan.

5. Ibu drg. Laifa Annisa H., Ph.D selaku pembimbing II yang juga telah

membimbing dan berbagi ilmu kepada penulis.

6. Bapak dan Ibu dosen yang tak hanya memberikan ilmu, hingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini, namun juga semangat dan teladan mulia. Semoga

Allah membalas kebaikanmu dengan pahala yang berlipat.

7. Bapak Kusmardi, MSc. yang telah berbaik hati memfasilitasi penulis dalam

pengerjaan penelitian di Laboratorium Patology FKUI-Salemba.

8. Para staf dan karyawan program studi yang telah banyak membantu selama

proses penelitian.

vi

9. Kepada sahabat seperjuangan penelitianku (RESONANSI) , Silfia Windy

Kusumadewi dan Dahlia Sari, Kepada sahabat Farmasi angkatan 2007

khususnya kelas A.

10. Kepada para senior, Ahmed Rizky F, Dea Arditia R, Ahmad Hariri, Raisani

Rusli, Dalilah Qisthina, Purnama Dwi T, dan semua yang tidak bisa

disebutkan satu persatu, terimakasih untuk setiap semangat dan masukan yang

berharga

11. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini sangat jauh dari

sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat

penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil

penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi

mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Jakarta, Desember 2011

vii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL i

LEMBAR PERSETUJUAN ii

LEMBAR PENGESAHAN iii

LEMBAR PERNYATAAN iv

KATA PENGANTAR v

DAFTAR ISI vii

DAFTAR TABEL ix

DAFTAR GAMBAR x

DAFTAR LAMPIRAN xi

ABSTRAK xii

ABSTRACT xiii

BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang 1

1.2. Perumusan Masalah 4

1.3. Hipotesa 4

1.4. Tujuan Penelitian 4

1.5. Manfaat Penelitian 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Eugenol 5

2.1.1. Sifat Fisika dan kimia 5

2.1.2. Sumber Eugenol 6

2.1.3. Pemanfaatan Eugenol 6

2.2. Tanaman Gambir (Uncaria gambir Roxb.) 7

2.2.1. Klasifikasi Gambir (Uncaria gambir Roxb.) 7

2.2.2. Nama daerah 7

2.2.3. Uraiantanaman 8

2.2.4. Kandungan Kimia 8

2.2.5. ManfaatTumbuhan 8

2.2.6. Efekfarmakologis 9

2.2.7. Katekin 9

2.3. Simplisia 11

2.3.1. PengelolaanSimplisia 11

2.4. EkstrakdanEktraksi 14

2.4.1. Pengertian 14

2.4.2. Cara Pembuatan Ekstrak 15

2.4.3. Metode Ekstraksi 16

2.4.4. Parameter Ekstrak 18

2.5. Kanker 19

2.5.1. PengertianKanker 19

2.5.2. KankerServiks 21

2.6. HeLaCell Line 24

2.7. Antikanker 25

viii

2.7.1. Obatantikanker 25

2.7.2. MekanismeKerjaObatAntikanker 25

2.7.3. GolonganObatAntikanker 26

2.8. Cisplatin 30

2.9. KulturSel 32

2.10. UjiAntiproliferatif 35

2.10.1. MetodePengujianAntiproliferatif 35

2.11. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 36

2.12. PotensiPenelitian 37

2.13. KerangkaKonsepPenelitian 40

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 41

3.2. Alat dan Bahan Penelitian 41

3.2.1. AlatPenelitian 41

3.2.2. BahanPenelitian 42

3.3. Prosedur Penelitian 43

3.3.1. PenyiapanSimplisiaUji 43

3.3.2. IdentifikasiGambir 43

3.3.3. IdentifikasiCemaran Urea 43

3.3.4. Isolasi KatekinGambir 44

3.3.5. PenapisanFitokimia 44

3.3.6. PemeriksaanKatekin 48

3.3.7. SterilisasiAlat 50

3.3.8. PembuatanReagen 51

3.3.9. Persiapan LarutanUji 52

3.3.10. PersiapanKulturHeLaCell Line 53

3.3.11. PemeliharaanKulturHeLaCell Line 55

3.3.12. UjiAntiproliferatif 56

3.3.13. PerhitunganPersentaseKematianSel 57

3.4. Analisa Data 57

3.5. AlurPenelitian 58

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian 59

4.1.1. DeterminasidanSertifikasi 59

4.1.2. KarakteristikSimplisia&Senyawaujicampuran 59

4.1.3. JumlahKepadatanSel 60

4.1.4. UjiEfekAntiproliferatif 60

4.2. Pembahasan 66

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan 72

6.1. Saran 72

DAFTAR PUSTAKA 73

LAMPIRAN 82

ix

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Konfigurasi Komponen Katekin ................................................. 10

Tabel 2. Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran .................. 59

Tabel 3. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 24 jam ................ 60

Tabel 4. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 48 jam ................ 61

Tabel 5. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel 72 jam ................ 61

Tabel 6. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 24 jam .............. 61

Tabel 7. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 48 jam .............. 62

Tabel 8. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Cisplatin 72 jam .............. 62

Tabel 9. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia ...................................... 86

Tabel 10. Perhitungan Persentase Kadar Katekin Sampel .......................... 90

Tabel 11. Hasil Perhitungan Konsentrasi Sampel ....................................... 97

Tabel 12. Hasil Perhitungan Konsentrasi Cisplatin .................................... 98

Tabel 13. Pengujian Efek Antiproliferatif Sampel Tiap Interval Waktu .... 102

Tabel 14. PengujianEfekAntiproliferatifCisplatin per Interval Waktu ....... 105

Tabel 15. PersenProbit ................................................................................ 111

x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Kimia Eugenol .......................................................... 5

Gambar 2. Struktur Dasar Katekin dan Galloyl Group......................... ... 10

Gambar 3. MTT direduksimenjadiFormazan ........................................... 36

Gambar 4. Eugenol ................................................................................... 85

Gambar 5. BongkahGambir...................................................................... 85

Gambar 6. SerbukGambir ............................................................... 85

Gambar 7. HasilIdentifikasi...................................................................... 85

Gambar 8. HasilUjiCemaran Urea ........................................................... 85

Gambar 9. SerbukKatekinSampel ............................................................ 85

Gambar 10. SerbukKatekinStandar ............................................................ 85

Gambar 11. Alat Haemocytometer ............................................................. 107

Gambar 12. Pemetaan Haemocytometer .................................................... 107

Gambar 13 Biology Safety Cabinet ........................................................... 108

Gambar 14. Incubator ................................................................................. 108

Gambar 15. Autoklaf .................................................................................. 108

Gambar 16. Microscope inverted .............................................................. 108

Gambar 17. Mikropipet............................................................................... 108

Gambar 18. Sentrifuge................................................................................ 108

Gambar 19. ELISA reader .......................................................................... 108

Gambar 20. T-Flask .................................................................................... 108

Gambar 21. Spektrometer ........................................................................... 108

Gambar 22. Micro well Plate...................................................................... 108

Gambar 23. Medium DMEM ..................................................................... 109

Gambar 24. DMSO ..................................................................................... 109

Gambar 25. Fetal Bovine Serum ................................................................ 109

Gambar 26. MTT ........................................................................................ 109

Gambar 27. Tripan Blue ............................................................................. 109

Gambar 28. Trypsin EDTA ........................................................................ 109

Gambar 29. Phospate Buffer ...................................................................... 109

Gambar 30. SosiumDuodecyl (SDS) .......................................................... 109

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil Determinasi Gambir ...................................................... 82

Lampiran 2. Sertifikasi Eugenol ................................................................. 83

Lampiran 3. Sertifikat Kemurnian Katekin Standar ................................... 84

Lampiran 4. Eugenol, Gambir dan Katekin ............................................... 85

Lampiran 5. Hasil Pengamatan Fitokimia ................................................... 86

Lampiran 6. Hasil Pengujian Karakteristik Katekin ................................... 87

Lampiran 7. Lanjutan (lampiran 6) ............................................................. 88

Lampiran 8. Hasil Penetapan Kadar Katekin .............................................. 89

Lampiran 9. Skema Proses Pembuatan Katekin Gambir ............................ 91

Lampiran 10. Skema Kerja Kultivasi sel HeLa ............................................ 92

Lampiran11.Skema Kerja Subkultivasi Sel HeLa ........................................ 93

Lampiran12.Uji MTT .................................................................................... 94

Lampiran13.PerhitunganKonsentrasiSampel ................................................ 95

Lampiran14.Lanjutan (lampiran 13)............... .............................................. 96

Lampiran15.Lanjutan (lampiran 13)............................. ................................ 97

Lampiran16.Perhitungan Konsentrasi Cisplatin ........................................... 98

Lampiran17.Perhitungan Kepadatan Sel ....................................................... 99

Lampiran 18. Skema Pemetaan Sumuran 96............................................... 100

Lampiran 19. Perhitungan IC50 Sampel........................................................ 102

Lampiran 20. Perhitungan IC50Cisplatin............................. ......................... 105

Lampiran 21. Pemetaan Haemocytometer................................ ................... 107

Lampiran22. Alat dan Bahan yang digunakan dalam penelitian .................. 108

Lampiran 23. Deskripsi Medium DMEM................................................ ..... 110

Lampiran 24. TabelTransformasiPersen-Probit......................................... .. 111

xii

ABSTRAK

Judul : Uji Efek Antiproliferatif Campuran Senyawa Eugenol dan Isolat Katekin

Gambir (Uncaria gambier Roxb) dari Fase Etil Asetat Terhadap Kultur

Sel Kanker Serviks (HeLa Cell Line)

Penelitian dilakukan untuk mengetahui efek antiproliferatif

campuran katekin gambir (Unicaria gambier, Roxb) dan eugenol terhadap

sel kanker HeLa secara in vitro. Katekin dari gambir (Unicaria gambier,

Roxb) dicampur dengan Eugenol menggunakan DMSO. Uji

antiproliferatif dilakukan melalui metode MTT assay, doubling time. Pada

MTT assay dan doubling time sel kanker HeLa dibedakan menjadi lima

kelompok perlakuan yakni sampel (sel+medium kultur+sampel), kontrol

sel (sel+medium kultur), kontrol positif (sel+medium kultur+cisplatin),

kontrol medium (kultur medium) dan kontrol pelarut (sel+medium

kultur+DMSO) masing-masing seri konsentrasi tiga kali ulangan. Hasil

penelitian efek antiproliferatif ini menunjukkan nilai IC50 masing-masing

interval waktu (24, 48 dan 72 jam) sebesar 372.4 µg/mL, 178.24 µg/mL,

dan 73.45 µg/mL. Nilai IC50 pada 72 jam menunjukkan adanya potensi

sampel sebagai agen kemoprevensi.

Kata kunci : Antiproliferatif, Katekin Gambir (Unicaria gambier, Roxb)

dan Eugenol

xiii

ABSTRACT

Tittle : Antiproliferative Effect Test of Mixed Eugenol and Catechin Isolate

of Uncaria gambier Roxb from Ethyl Acetat Phase on Cervix Cancer

Culture Cell (HeLa Cell Line)

The aim of this research is to know in vitro antiproliferative effect

of mixed catechin of Uncaria gambier Roxb and Eugenol on HeLa cancer

cells. The catechin of Uncaria gambier Roxb and Eugenol was mixed by

DMSO. Antiproliferative effect test was performed by MTT assay,

doubling time methods. Cell was determined by five treatment groups on

the MTT assay and doubling time methods. They were the extract group

(cells + culture medium + test material), cell control group (cells + culture

medium), positive control group (cells + culture medium + cisplatin),

medium control group (cells + culture medium), and solvent control group

(cells + culture medium + DMSO), which was every series has three times

repetition. The result showed that IC50 value of antiproliferative effect test

on each time interval (24, 48 and &2 hour) are 372.4 µg/mL, 178.24

µg/mL, and 73.45 µg/mL. IC50 value on 72 hour showed kemopreventive

agent potency.

Keyword : Antiproliferative, catechin of Uncaria gambier Roxb, Eugenol

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Hingga saat ini, kanker serviks merupakan penyebab kematian terbanyak

akibat penyakit kanker di Negara berkembang. Inisiden dan mortalitas kanker

serviks di dunia menempati urutan kedua setelah kanker payudara. Semetara itu,

di Negara berkembang masih menempati urutan pertama sebagai penyebab

kematian akibat kanker pada wanita usia reproduktif. Diperkirakan setiap tahun

dijumpai sekitar 500.000 penderita baru di seluruh dunia dan umumnya terjadi di

negara berkembang (Desen, 2008). Pada tahun 2008, International Agency for

Research on Cancer (IARC) melaporkan inisiden kanker serviks terjadi sebanyak

530.232 jiwa di dunia dengan angka mortalitas 275.008 jiwa. Di tahun yang

sama, inisiden kanker serviks di Indonesia terjadi sebanyak 16.413 jiwa dengan

mortalitas 7.493 jiwa (Globocan,2008).

Dalam 20 tahun terakhir berbagai usaha telah dilakukan untuk

mengobati penyakit kanker dengan cara kemoterapi dan imunologik. Namun

sayang, sampai sekarang cara tersebut belum memberikan hasil yang efektif, baik

yang diberikan secara tunggal, maupun kombinasi. (Aziz, 2006). Terapi kanker

sendiri ada bermacam-macam. Namun pada umumnya terapi yang diberikan pada

penderita kanker ialah cara sequential, yaitu setelah selesai dengan cara terapi

yang satu, bila perlu diikuti dengan cara terapi yang lain. Jarang bermacam-

macam cara terapi tersebut sekaligus diberikan dalam waktu yang bersamaan.

Umumnya penderita tidak mampu menahan pemberian terapi sekaligus.

2

Pemberian terapi baik operasi, radioterapi atau kemoterapi akan menurunkan

imunitas penderita. (Sukardja, 2000)

Dewasa ini, ekstrak tumbuhan telah lama digunakan dalam pengobatan

penyakit kanker. Uji antiproliferatif menyediakan data permulaan yang penting

untuk membantu dalam pemilihan ekstrak-ekstrak tumbuhan yang berpotensi

sebagai agen antineoplasmik (Cardellina et al. 1999). Proliferasi adalah

pertumbuhan sel kanker yang tak terkendali sehingga berhasil membentuk

kelompok.

Gambir (Uncaria gambier Roxb) adalah tumbuhan yang secara empiris

telah dimanfaatkan tidak hanya sebagai komponen menyirih, namun juga sebagai

obat-obatan. Komponen bioaktif utama pada tanaman gambir adalah flavonoid

(terutama gambiriin), katekin (sekitar 51%), zat penyamak (22-50%), serta

sejumlah alkaloid (seperti gambir, tannin dan turunan dihidro- dan okso-nya)

(Hermawan 2009). Katekin merupakan golongan flavanoid dengan aktivitas

antioksidan yang lebih tinggi daripada antioksidan sintetik (Das, 1994) .

Tingginya antioksidan katekin menunjukkan potensi senyawa antiproliferatif

yang bersifat toksik terhadap sel kanker (Wagner,1985).

Navindra P. Seraam (2003) menuliskan dalam jurnalnya bahwa katekin

teh hijau dapat menghambat proliferasi sel kanker. Pada konsentrasi 50µM;

derivat katekin yakni (–)-gallo-catechin, (–)-epigallocatechin gallate, dan (–)-

gallocatechin gallate berturut-turut menunjukkan persentase penghambatan

terhadap sel kanker payudara sebesar 95%, 100%, dan 97%. Dengan konsentrasi

yang sama, yaitu 50µM, (–)-gallo-catechin dan (–)-gallocatechin gallate

merupakan katekin yang paling efektif melawan sel kanker kolon dengan

3

persentase 85% untuk (–)-gallo-catechin dan 93% untuk (–)-gallocatechin gallate.

Sementara persentase penghambatan pada sel kanker paru-paru adalah 87%

untuk (–)-gallo-catechin dan 67% untuk (–)-gallocatechin gallate.

Pada percobaan lain, senyawa epigallocatechin gallate (EGCG) dan

epicatechin gallate (ECG) menunjukkan efek antiproliferasi pada konsentrasi

100µM. Dibandingkan variabel kontrol, besar hambatan terhadap kultur sel

tumor yang ditunjukkan oleh senyawa EGCG pada 24 jam dan 48 jam berturut-

turut adalah 70.2 ± 1.8% dan 85.6 ± 1.0%. sedangkan nilai hambatan yang

ditunjukkan oleh senyawa ECG pada 24 dan 48 jam berturut-turut adalah 34.8 ±

2.2% dan 69.2 ± 1.1%. (Tsuchiya et. al. 2008)

Selain katekin, senyawa yang terbukti dapat mempengaruhi pertumbuhan

sel kanker adalah eugenol. Eugenol dapat menghambat pertumbuhan tumor

sebesar 24.35% dengan dosis 100 mg/kg; i/p. (Jaganathan, 2010). Eugenol juga

terbukti mempengaruhi pertumbuhan sel kanker hati secara sinifikan. Sel HCT 15

dan HT 29 ditekan oleh eugenol dengan nilai IC50 berturut-turut 300 µM untuk

HTC 15 dan 500 µM untuk HT 29 (Jaganathan, 2010).

Beberapa peresepan pengobatan tradisional yang terdiri dari campuran

beberapa bahan mempunyai khasiat saling menguatkan, meskipun ketika bahan

tersebut berdiri sendiri sudah terbukti memiliki khasiat masing-masing. Ternyata,

perpaduan dua ekstrak herbal atau lebih itu memiliki fungsi, antara lain supaya

komponen-komponennya saling mendukung atau saling mengurangi efek

samping (Sukardiman, 1999).

Berdasarkan hal tersebut di atas, penulis merasa perlu untuk melakukan

penelitian lanjutan yang melibatkan senyawa katekin gambir dan senyawa

4

eugenol. Campuran senyawa katekin dari gambir dan eugenol murni diharapkan

dapat memberikan efek atau aktivitas yang lebih baik dalam merusak atau

menghambat proliferasi sel-sel kanker, khususnya sel kanker HeLa.

1.2 Perumusan Masalah

Apakah campuran katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol

memiliki efek antiproliferatif terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line) ?

1.3 Hipotesis

Campuran katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol

memiliki efek antiproliferatif terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line)

1.4 Tujuan penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiproliferatif campuran

katekin Gambir (Uncaria gambir Roxb) dan Eugenol terhadap kultur sel kanker

serviks (HeLa cell line)

1.5 Manfaat penelitian

1. Memberikan pengetahuan dan informasi mengenai komponen bahan alam

yang berkhasiat bagi kesehatan khususnya bagi pengobatan kanker.

2. Memberikan informasi dan pengetahuan mengenai antikanker dari katekin

Gambir (Uncaria gambir Roxb) dan Eugenol sehingga penelitian tekait dapat

dilanjutkan.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1.Eugenol (Eugenolum)

2.1.1.Sifat Fisika dan Kimia (Depkes, 1995)

Rumus Kimia :

Nama IUPAC : 4-Alil-2-metoksifenol [97-53-0]

Rumus Struktur : C10H12O2

Berat Molekul : 164,20

Pemerian : Cairan tidak berwarna atau kuning pucat; bau cenkeh

kuat dan menusuk; rasa pedas; tidak memutar bidang

polarisasi. Bila terpapar udara warna menjadi lebih tua

dan mengental.

Kelarutan : Sukar larut dalam air; bercampur dengan etanol,

dengan kloroform, dengan eter dan dengan minyak

lemak. Kelarutan dalam etanol 70% Satu bagian

volume larut dalam 2 bagian volume etanol.

Bobot Jenis : Antara 1,064 dan 1,070

Indeks Bias : Antara 1,540 dan 1,542 pada suhu 200.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.

6

2.1.2.Sumber Eugenol

Eugenol merupakan komponen terbesar yang terkandung dalam

minyak daun cengkeh (49-87%) yang didistilasi uap dari daun pohon

cengkeh (Eugenia caryophyllata Thunberg, famili Myrtaceae) (Anonim,

2008). Di Indonesia, daerah produksi cengkeh terdapat di sekitar

Padang, Bengkulu dan Lampung (di Pulau Sumatera), dekat Minahasa

(di Pulau Sulawesi) dan Ternate, Tidore, Makian, Ambon, Nusa Laut,

Saparua, Amadina, Seram dan Banda (di Kepulauan Maluku). Sebagai

penghasil cengkeh utama di Indonesia adalah Maluku (Guenther, 1990).

Selain terdapat pada cengkeh, eugenol terdapat pula pada pala, kulit

manis, salam dan daun sirih (Manopo, 2008).

2.1.3.Pemanfaatan Eugenol

Eugenol memiliki aroma yang menyegarkan dan pedas seperti

bunga cengkeh kering, sehingga sering menjadi komponen untuk

menyegarkan mulut. Eugenol dimanfaatkan sebagai pengaroma parfum,

makanan dan pengobatan (antiseptik dan anestetik) (Manopo, 2008).

US Food and Administration (FDA) menyetujui penggunaan

eugenol sebagai bahan perasa, analgesic dan semen gigi, pewangi dan

aromaterapi serta pada obat transdermal delivery system. Eugenol juga

diketahui memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, antivirus, antitumor,

antioksidant dan insektisida (Anonim, 2008).

7

2.2 TANAMAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.)

2.2.1 Klasifikasi Tanaman (Haryanto, 2009)

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledone

Ordo : Rubiales

Famili : Rubiaceae

Genus : Uncaria

Spesies : Uncaria gambir Roxb.

Sinonim : Ourouparia gambir Roxb.

Nauclea gambir

2.2.2 Nama Daerah

Sumatera : Gambe, gani (Aceh), kacu (Gayo), sontang (Batak),

gambe (Nias), gambie (Minangkabau), pengilom,

sepelet (Lampung).

Jawa : Gambir (Jawa), ghambhir (Madura).

Kalimantan : Kelare (Dayak), abi (Kayan).

Sulawesi : Gambere (Sangir), gambele (Gorontalo), gambere

(Makassar), gaber (Majene).

Nusatenggara : Tagambe (Bima), gamur (Sumba), gabi (Sawu),

gambe (Flores), nggame (Roti) (Depkes RI, 1989).

Halmahera : Gabi, gagabere (Hariana, 2004).

8

2.2.3 Uraian Tanaman

Gambir berasal dari tumbuhan perdu yang membelit dan

berbatang keras.Tinggi 1-3 cm. Batang tegak, bulat, percabangan

simpodial warna cokelat pucat.Daun tunggal, berhadapan, bentuk elips,

tepi bergerigi, pangkal bulat, ujung meruncing, panjang 8-13 cm. lebar

4-7 cm, warna hijau. Bunga majemuk, bentuk lonceng, di ketiak daun,

panjang lebih kurang 5 cm, mahkota 5 helai berbentuk lonceng,

tongkol-bulat, terdiri dari bunga kecil-kecil yang berwarna putih. Buah

berbentuk bulat telur, panjang lebih kurang 1,5 cm, warna hitam

(Haryanto, 2009 & Mardisiswojo, 1968).

2.2.4 Kandungan Kimia

Senyawa flavonoid katekin (7-33%), asam katekutanat (20-50%)

(Thorpe dan Whiteley, 1921) ; gambir Sumatera Barat memiliki

kandungan katekin terbanyak (40-80%) (Amos,2010)

2.2.5 Manfaat Tumbuhan

Sejak lama gambir digunakan sebagai komponen menyirih

(Nazir, 2000). Manfaat glain gambir antara lain digunakan sebagai

bahan baku shampo (Shamie et al, 2004), perekat kayu lapis dan papan

partikel (Kasim, 2004). Dalam industry tekstil dan batik, gambir

digunakan sebagai bahan baku pewarna yang tahan terhadap matahari

(Risfaheri et al, 1995). Gambir juga digunakan sebagai penyamak kulit

agar tidak terjadi pembusukan serta membuat kulit menjadi lebih renyah

setelah dikeringkan (Bachtiar, 1991; Suherdi et al, 1991).

9

2.2.6 Efek Farmakologis

Ekstrak gambir memiliki daya hambat terhadap bakteri

Streptococcus mutans yang menyebabkan plak pada gigi (Kozai et al,

1995). Khasiat lainnya sebagai obat diare dan disentri serta obat kumur-

kumur pada sakit kerongkongan. Pada industri farmasi gambir

digunakan sebagai bahan baku obat penyakit hati dengan paten catergen

(Suherdi et al,1991; Nazir, 2000). Bahan infuse dari gambir digunakan

untuk penyembuhan gangguan darah (Sukati dan Kusharyono, 2004),

perangsang system saraf autonom (Kusharyono, 2004), sebagai

antimikroba (Rahayuningsih et al, 2004) dan bahan toksisitas terhadap

organ ginjal, hati, dan jantung (Armenia et al,2004)

2.2.7 Katekin

Katekin termasuk golongan flavonoid, merupakan kerabat

tanin terkondensasi dan memiliki banyak gugus fungsi hidroksil

(Robinson, 1995).Katekin berwarna putih yang memiliki jarak lebur 175-

177oC (WHO, 1998).Katekin dapat larut dalam air hangat dan memiliki

titik didih sebesar 254oC (Alamsyah, 2006). Katekin tidak stabil di udara

terbuka dan mudah terurai oleh cahaya serta teroksidasi pada pH

mendekati netral (pH 6,9) dan lebih stabil pada pH lebih rendah (pH 2,8

dan 4,9) (Lucida, 2006). Umumnya komponen yang terkadung didalam

katekin yaitu (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)-

epigallocatechin (EGC), (+)-catechin dan (-)-epigallocatechin gallate

(EGCG) (Hartoyo, 2003), yang memiliki struktur sebagai berikut:

10

Komponen Katekin Konfigurasi R1 R2

(-)-epicatechin (EC) 2S, 3R OH H

(-)-epicatechin gallate (ECG) 2R, 3R GA H

(-)-epigallocatechin (EGC) 2R, 3R OH OH

(+)-catechin 2R, 3S OH H

(-)-epigallocatechin gallate (EGCG) 2R, 3R GA OH

Tabel 1. Konfigurasi Komponen Katekin

Katekin digunakan sebagai obat tukak lambung (Tika et al,

2004) dan dapat menghambat pertumbuhan tumor mamma pada

mencit dengan rasio penghambatan sebesar 57,14% pada pemberian

dosis 800 mg/kgBB/hari (Gunawijaya et al, 1999). Katekin juga

memiliki aktifitas sebagai antimikroba, antioksidan, antiradiasi,

memperkuat pembuluh darah dan melancarkan sekresi air

seni.(Alamsyah, 2006).

Gambar 2. Struktur dasar Katekin dan Galloyl Grup (Seeram et al, 2003)

11

2.3 Simplisia

Simplisia adalah bentuk jamak dari kata simpleks yang berasal dari kata

simple, berarti satu atau sederhana. Istilah simplisia dipakai untuk menyebut

bahan-bahan obat alam yang masih berada dalam wujud aslinya atau belum

mengalami perubahan bentuk. Departemen kesehatan RI membuat batasan

tentang simplisia bahwa simplisia adalah bahan alami yang digunakan untuk

obat dan belum mengalami perubahan proses apapun, dan kecuali dinyatakan

lain umumnya berupa bahan yang telah dikeringkan. Berdasarkan hal itu

maka simplisia dibagi menjadi tiga golongan, yaitu simplisia nabati, simplisia

hewani, dan simplisia pelikan/mineral (Depkes RI, 1979 & Gunawan, 2004).

2.3.1 Pengelolaan Simplisia

a. Sortasi Basah

Sortasi basah dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran

atau bahan-bahan asing lainnya dari bahan simplisia. Misalnya

simplisia yang dibuat dari akar suatu tanaman obat, bahan-bahan

asing seperti tanah, kerikil, rumput, batang, daun, akar yang telah

rusak, serta pengotoran lainnya harus dibuang. Tanah mengandung

bermacam-macam mikroba dalam jumlah yang tinggi, oleh karena

itu pembersihan simplisia dari tanah yang terikut dapat mengurangi

jumlah mikroba awal (Gunawan, 2004).

b. Pencucian

Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan

pengotoran lainnya yang melekat pada bahan simplisia. Pencucian

dilakukan dengan air bersih, misalnya air dari mata air, air sumur

12

atau air PAM. Bahan simplisia yang mengandung zat yang mudah

larut di dalam air yang mengalir, pencucian hendaknya dilakukan

dalam waktu yang sesingkat mungkin (Gunawan, 2004).

c. Perajangan

Beberapa jenis bahan simplisia perlu mengalami proses

perajangan. Perajangan bahan simplisia dilakukan untuk

mempermudah proses pengeringan, pengepakan dan penggilingan.

Semakin tipis bahan yang akan dikeringkan, semakin cepat

penguapan air, sehingga mempercepat waktu pengeringan

(Gunawan, 2004).

d. Pengeringan

Tujuan pengeringan ialah untuk mendapatkan simplisia yang

tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang

lebih lama. Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi

enzimatik akan dicegah penurunan mutu atau perusakan simplisia.

Air yang masih tersisa dalam simplisia pada kadar tertentu

dapat merupakan media pertumbuhan kapang dan jasad renik

lainnya. Proses pengeringan sudah dapat menghentikan proses

enzimatik dalam sel bila kadar airnya dapat mencapai kurang dari

10 %. Hal-hal yang perlu diperhatikan selama proses pengeringan

adalah suhu pengeringan, kelembapan udara, aliran udara, waktu

pengeringan, dan luas permukaan bahan (Gunawan, 2004).

13

e. Sortasi Kering

Sortasi setelah pengeringan merupakan tahap akhir pembuatan

simplisia. Tujuan sortasi memisahkan benda-benda asing seperti

bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotoran-

pengotoran lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia

kering. Proses ini dilakukan sebelum simplisia dibungkus untuk

kemudian disimpan. Pada simplisia bentuk rimpang, sering jumlah

akar yang melekat pada rimpang terlampau besar dan harus dibuang.

Demikian pula adanya partikel-partikel pasir, besi dan benda-benda

tanah lain yang tertinggal harus dibuang sebelum simplisia

dibungkus (Depkes RI, 1999).

f. Penyimpanan

Setelah tahap pengeringan dan sortasi kering selesai maka

simplisia perlu ditempatkan dalam suatu wadah tersendiri agar tidak

saling bercampur antara simplsia satu dengan lainnya. Selanjutnya,

wadah-wadah yang berisi simpilisia disimpan dalam rak pada

gudang penyimpanan. Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi

pengepakan dan penyimpanan simplisia adalah cahaya, oksigen atau

sirkulasi udara, reaksi kimia yang terjadi antara kandungan aktif

tanarnan dengan wadah, penyerapan air, kemungkinan terjadinya

proses dehidrasi, pengotoran atau pencemaran, baik yang

diakibatkan oleh serangga, kapang atau lainnya (Gunawan, 2004).

Untuk persyaratan wadah yang akan digunakan sebagai

pembungkus simplisia adalah harus inert, artinya tidak mudah

14

bereaksi dengan bahan lain, tidak beracun, mampu melindungi

bahan simplisia dari cemaran mikroba, kotoran, serangga,

penguapan kandungan aktif serta dari pengaruh cahaya, oksigen dan

uap air (Gunawan, 2004).

2.4 Ekstrak dan Ekstraksi

2.4.1 Pengertian Ekstrak dan Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan cair yang diperoleh dengan mengekstraksi

zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan

pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut

diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukakn sedemikian

sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995).

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat

larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut

cair. Simplisia yang akan diekstrak mengandung senyawa aktif yang

dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut dan mempunyai struktur

kimia yang berbeda-beda yang dapat mempengaruhi kelarutan dan

stabilitas senyawa-senyawa tersebut terhadap suhu, udara, cahaya, dan

logam berat (Depkes RI, 2000).

Sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih

berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang

maksimum dari zat aktif dan seminimal mungkin bagi unsur yang

tidak diinginkan.

15

2.4.2 Cara Pembuatan Ekstrak

Proses ekstraksi (pembuatan ekstrak) terdiri atas beberapa tahap, yaitu:

1. Pembuatan serbuk

Proses awal pembuatan ekstrak adalah tahapan pembuatan serbuk

simplisia yang kering (penyerbukan). Dari simplisia dibuat serbuk

simplisia dengan peralatan tertentu sampai derajat kehalusan

tertentu.

2. Cairan pelarut

Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari

adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses

dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, keamanan.

3. Separasi dan pemurnian

Proses-proses pada tahapan ini adalah pengendapan, pemisahan dua

cairan tak campur, sentrifugasi, dekantasi, dan filtrasi.

4. Pemekatan / penguapan (vaporasi dan evaporasi)

Pemekatan berarti peningkatan jumlah partikel solute (senyawa

terlarut) secara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kondisi

kering, ekstrak hanya menjadi kental/pekat.

5. Pengeringan ekstrak

Pengeringan berarti menghilangkan pelarut dari bahan sehingga

menghasilkan serbuk, masa kering-rapuh, tergantung proses dan

peralatan yang digunakan.

16

6. Rendemen

Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang diperoleh

dengan simplisia awal (Depkes RI, 2000).

2.4.3 Metode Ekstraksi

Ada dua cara ekstraksi, yaitu :

a. Cara dingin

1) Cara maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan

menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau

pengadukan pada temperatur ruang (kamar). Remaserasi berarti

dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan

penyaringan maserat pertama, dan seterusnya.

Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol,

air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan

maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang

digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Sedangkan

kerugian dari maserasi adalah pengerjaannya lama dan

penyariannya kurang sempurna.

2) Perkolasi

Perkolasi adalah ekstrak dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruang.

17

b. Cara panas

1) Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik

didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang

relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Biasanya

dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5

kali sehingga terbentuk proses ekstraksi sempurna.

2) Soklet

Soklet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang baru, secara

umum dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi

kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya

pendingin balik.

3) Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinyu)

pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan yaitu

secara umum pada temperature 40-50°C.

4) Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur

penangas air mendidih (96-98°C) selama waktu tertentu (15-20

menit).

5) Dekok

Dekok adalah infuspada waktu yang lebih lama(>30°C) dan

temperatur sampai titik didih air (Depkes RI, 2000).

18

2.4.4 Parameter Ekstrak

Parameter non spesifik ekstrak terdiri dari:

a. Susut pengeringan

Susut pengeringan adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan

pada temperatur 105oC selama 30 menit atau sampai berat konstan,

yang dinyatakan sebagai nilai persen (%). Tujuannya untuk

memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa

yang hilang pada proses pengeringan. Nilai untuk susut pengeringan

jika tidak dinyatakan lain adalah kurang dari 10 %.

b. Kadar air

Kadar air adalah pengukuran kandungan air yang berada di dalam

bahan. Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal (rentang)

tentang besarnya kandungan air di dalam bahan. Nilai untuk kadar

air sesuai dengan yang tertera dalam monografi.

c. Kadar abu

Untuk penentuan kadar abu, bahan dipanaskan pada temperatur

dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap

sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya

adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral

internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai

terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang

tertera dalam monografi (Depkes RI,2000 ).

19

2.5 Kanker

2.5.1 Pengertian Kanker

Kanker atau neoplasma merupakan massa jaringan abnormal

dengan pertumbuhan berlebihan, tidak berkoordinasi dengan

pertumbuhan jaringan normal, dan tetap tumbuh secara berlebihan setelah

stimulus yang menimbulkan perubahan tersebut berhenti (Robbins dan

Kumar, 1995). Sel kanker akan menyusup ke jaringan sekitarnya

(invasif), lalu bermetastasis ke tempat yang lebih jauh melalui pembuluh

darah dan getah bening (Dalimartha, 2001). Sifat umum dari kanker

adalah sebagai berikut :

1. Pertumbuhan berlebihan umumnya membentuk tumor.

2. Gangguan diferensasi dari sel dan jaringan mirip jaringan mudigah.

3. Bersifat invasif, mampu tumbuh di jaringan di dekatnya (perbedaan

pokok dengan jaringan normal)

4. Bersifat metastatik, menyebar ke tempat lain dan menyebabkan

pertumbuhan baru;

5. Memiliki acquired heredity, yaitu keturunan sel kanker juga dapat

menimbulkan kanker.

6. Pergeseran metabolisme ke arah pembentukan makromolekul dari

nukleosida dan asam amino dan peningkatan katabolisme karbohidrat

untuk energi sel. (Farmakologi dan terapi ed. 2 FKUI 1980)

Kanker dibedakan menurut jaringan tempatnya berasal yaitu

adenoma (benjolan maligne pada kelenjar), limfoma (kanker pada

kelenjar limfe), sarkoma (kanker dari pembuluh darah, jaringan ikat, otot

20

atau tulang), leukimia (kanker yang berhubungan dengan produksi

leukosit abnormal), myeloma (kanker pada sumsum tulang), carcinoma

(kanker pada kelenjar) dan melanoma (kanker pada kulit) (Tjay, 2002).

Penyebab yang dapat merangsang pembentukan kanker,

diantaranya (Dalimartha, 2001):

a. Senyawa kimia (karsinogen), seperti zat pewarna, pengawet, merkuri,

dll.

b. Faktor fisika, misalnya radioterapi agresif (radiasi sinar pengion).

c. Virus, contoh: virus hepatitis B dan C penyebab hepatis kronis,

Humam Papilloma Virus (HPV) penyebab kanker serviks, dll.

d. Hormon, pemberian hormon tertentu secara berlebihan dapat

menimbulkan kanker seperti payudara, rahim, indung telur dan

prostat.

e. Faktor genetis, dapat terjadi apabila individu memiliki gen rusak yang

diwariskan secara genetis dari orang tuanya.

Kanker dapat terjadi melalui beberapa tahapan, yaitu (Miller,

2008):

Fase inisiasi, terjadi kerusakan secara langsung dalam bentuk

terjadinya mutasi pada DNA dalam sel. Kerusakan akan terbawa pada

sel anak yang dihasilkan dari pembelahan oleh sel-sel.

Fase promosi, terjadi perkembangbiakan pada sel yang rusak, hal ini

terjadi ketika sel-sel yang mengalami mutasi itu terkena zat

karsinogen yang mendorong terjadinya pembelahan secara cepat.

21

Fase progresi, gen-gen pertumbuhan yang diaktivasi oleh kerusakan

DNA mengakibatkan mitose dipercepat dan pertumbuhan liar dari sel-

sel ganas. Tumor menjadi manifes.

Pengobatan kanker dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu

pembedahan, radioterapi, kemoterapi, imunoterapi, pengobatan dengan

hormon serta tumbuhan obat, simplisia dari binatang dan mineral lainnya

(Dalimartha, 2001).

2.5.2 Kanker Serviks

Penyakit ini berawal dari infeksi virus yang merangsang

perubahan perilaku sel epitel serviks.Sel kanker serviks pada awalnya

berasal dari epitel serviks yang mengalami mutasi genetik sehingga

mengubah perilakunya.Sel yang bermutasi ini melakukan pembelahan

sel yang tidak terkendali, immortal dan menginvasi jaringan stroma di

bawahnya. Keadaan yang menyebabkan mutasi genetik yang tidak

dapat diperbaiki akan menyebabkan terjadinya pertumbuhan kanker

ini. (Desen, 2008)

Faktor risiko yang merupakan pencetus kanker serviks, antara

lain (Rasjidi, 2007):

d. Infeksi Human Papilloma Virus (HPV), yang termasuk

golongan papovavirus yaitu virus DNA bersifat mutagen

memiliki ukuran 55 nm. Tipe HPV antara lain 16, 18, 31, 33,

35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 69, diperkirakan masih banyak

beberapa tipe lain. Di Indonesia tipe virus risiko tinggi

22

penyebab kanker adalah tipe 16, 18 dan 52. Tipe ini

menimbulkan lesi rata dan tidak terlihat sedangkan tipe risiko

rendah menimbulkan pertumbuhan seperti jengger ayam pada

tipe HPV 6 dan 11 (Aziz, 2006).

e. Berganti-ganti mitra seks dan usia saat melakukan hubungan

seks yang pertama dibawah umur 15 tahun.

f. Merokok, asap rokok bersifat karsinogen dan mutagen.

g. Defisiensi terhadap asam folat, vitamin C, E, beta karoten

dihubungkan dengan risiko kanker serviks.

1. Gejala dan Tanda Kanker Serviks (Buku Acuan Nasional

Onkologi Ginekologi, 2006)

Tanda dini kanker serviks tidak spesifik seperti adanya

sekret vagina yang agak banyak dan kadang-kadang dengan

bercak pendarahan.Umumnya tanda yang sangat minimal ini

sering diabaikan oleh penderita.

Tanda yang lebih klasik adalah pendarahan bercak yang

berulang, atau pendarahan bercak setelah bersetubuh atau

membersihkan vagina.Dengan makin tumbuhnya penyakit, tanda

menjadi semakin jelas.Pendarahan menjadi semakin banyak, lebih

sering, dan berlangsung lebih lama. Juga dapat dijumpai sekret

vagina yang berbau terutama dengan massa nekrosis lanjut.

Nekrosis terjadi karena pertumbuhan tumor yang cepat tidak

diimbangi pertumbuhan pembuluh darah (angiogenesis) agar

23

mendapat aliran darah yang cukup.Nekrosis ini menimbulkan bau

yang tidak sedap dan reaksi peradangan non spesifik.

Pada stadium lanjut ketika tumor telah menyebar ke luar

dari serviks dan melibatkan jaringan di rongga pelvis dapat

dijumpai tanda lain seperti nyeri yang menjalar ke pinggul atau

kaki. Hal ini menandakan keterlibatan ureter, dinding panggul,

atau nervus skiatik.Beberapa penderita mengeluhkan nyeri

berkemih, hematuria, perdarahan rektum sampai sulit berkemih

dan buang air besar.Penyebaran ke kelenjar getah bening tungkai

bawah dapat menimbulkan oedema tungkai bawah, atau terjadi

uremia bila telah terjadi penyumbatan kedua ureter.

2.Terapi

Secara umum jenis terapi yang dapat diberikan bergantung

pada usia dan keadaan umum penderita, luasnya penyebaran, dan

komplikasi lain yang menyertai. Untuk ini, diperlukan

pemeriksaan fisik yang seksama.Juga diperlukan kerjasama yang

baik antara ginekologi onkologi dengan radioterapi dan patologi

anatomi.

Pada umumnya kasus stadium lanjut dipilih pengobatan

radiasi yang diberikan secara intrakaviter dan eksternal,

sedangkan stadium awal dapat diobati melalui pembedahan atau

radiasi.

24

Terapi tunggal baik radiasi atau operasi merupakan pilihan

bila kanker serviks dapat didiagnosis dalam stadium dini.

2.6 HeLaCell Line

Sel HeLa ini berasal dari tumor ganas serviks milik Henrietta Lacks. Sel

ini telah digunakan di laboratorium di seluruh dunia tak terhitung

jumlahnya. Sel tersebut telah membantu penemuan beberapa penelitian.

Kutipan ilmiah di US National Library of Medicine menunjukkan bahwa ada

sekitar 61.911 studi yang telah menggunakan sel ini. sel HeLa telah menjadi

komponen berharga dalam memahami penyakit pada tingkat molekul

khususnya model pemahaman kanker invitro. Selain itu, sel ini telah berperan

dalam penyaringan obat anti-kanker. Sebagai contoh, sel ini digunakan untuk

menyebarkan virus polio yang akhirnya mengarah pada penemuan dan

pengembangan vaksin polio. Saat ini strategi tersebut digunakan dalam

berbagai laboratorium di seluruh dunia untuk pengembangan vaksin.

Sel HeLa adalah sel kanker leher rahim akibat infeksi Human

Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan sel

leher rahim normal. Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui

mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 dan E7 terbukti

dapat menyebabkan sifat imortal pada kultur primer keratinosit manusia,

namun sel yang imortal ini tidak bersifat tumorigenik hingga suatu proses

genetik terjadi. Jadi, viral onkogen tersebut tidak secara langsung menginduksi

pembentukan tumor, tetapi menginduksi serangkaian proses yang pada

akhirnya dapat menyebabkan sifat kanker (Goodwin dan DiMaio, 2000).

25

Sel HeLa merupakan kategori cell line atau sel lestari, yaitu kultur sel

yang berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara mekanis dan

atau enzimatis menjadi suspensi sel. Suspensi tersebut kemudian dibiakkan

menjadi satu lapisan jaringan (monolayer) diatas permukaan yang keras (botol,

tabung, cawan) atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh. Monolayer

tersebut kemudian dapat diperbanyak lagi sesudah melalui proses pemisahan

sel secara enzimatis dan diencerkan dengan media penumbuh. Apabila di

subkultur terus menerus maka dihasilkan sel lestari (Malole, 1990).

2.7 Antikanker

2.7.1 Obat Antikanker

Obat antikanker merupakan senyawa kemoterapetik untuk

pengobatan tumor yang membahayakan dan diharapkan memiliki

toksisitas selektif dalam menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel

jaringan normal. Terapi dikatakan berhasil apabila mematikan sel tumor

yang ganas dan tidak mengganggu sel normal yang berproliferasi

(Departemen Farmakologi dan Terapeutik, 2007; Siswandono, 2000)

2.7.2 Mekanisme Kerja Obat Antikanker (Siswandono, 2000; Departemen

Farnakologi dan Terapeutik, 2007)

Antikanker bekerja berdasarkan gangguan pada salah satu proses

sel yang esensial, dengan cara mempengaruhi metabolisme asam nukleat

terutama DNA atau biosintesis protein . Sel memiliki siklus kehidupan

yang terdiri dari beberapa fase, antara lain:

26

1. Fase mitosis (M), terjadi pembelahan sel aktif. Replikasi kromosom

terpisah menjadi dua inti anak sel yang berlangsung selama 1 jam.

Pada fase ini terjadi dua alternatif yaitu:

a. Menuju fase G1 dan memulai proses proliferasi.

b. Masuk ke fase istirahat (Go), kemampuan sel untuk berproliferasi

hilang dan sel meninggalkan siklus secara tidak terpulihkan.

2. Fase post mitotik (G1), terjadi sintesis RNA dan protein. Pada fase

akhir terjadi sintesis RNA yang optimum. Fase ini umumnya terjadi

kurang lebih 5 jam.

3. Fase sintetik (S), terjadi replikasi DNA dengan bantuan DNA-

polimerase yang menghasilkan DNA baru, sehingga rantai tunggal

DNA menjadi rantai ganda. Fase ini terjadi selama 7 jam.

4. Fase post sintetik (G2), terjadi bila sel telah menjadi tetraploid dan

mengandung dua DNA, kemudian sintesis RNA dan protein

dilanjutkan. Fase ini terjadi selama 3 jam. Selanjutnya sel kembali ke

fase mitotik.

2.7.3 Golongan Obat Antikanker

a. Senyawa Pengalkilasi

Senyawa pengalkilasi membentuk senyawa kationik antara

yang tidak stabil, diikuti pemecahan cincin membentuk ion

karbonium reaktif yang akan bereaksi melalui reaksi alkilasi

sehingga terjadi cross-linking (saling mengikat) antara rantai-rantai

DNA di dalam inti sel. Akibatnya proses pembentukan sel terganggu

sehingga pertumbuhan sel kanker terhambat. Senyawa ini untuk

27

pengobatan limfosarkoma, penyakit Hodgkin, leukimia limfositik

dan mieloma. Contoh senyawa pengalkilasi: mekloretamin,

klorambusil, siklosfosfamid, bisulfan, dan karmustin (Tjay, 2002;

Siswandono, 2000).

b. Antimetabolit

Antimetabolit menghambat asam folat, purin, pirimidin dan

asam amino, serta jalur nukleosida pirimidin pada sintesis DNA sel

kanker. Replikasi DNA dapat dihambat secara langsung maupun

tidak langsung yang menyebabkan sel tidak berkembang biak dan

mengalami kematian (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).

Berdasarkan sifat antagonismenya, golongan ini terdiri dari

empat kelompok yaitu (Siswandono, 2000; Tjay, 2002):

1) Antagonis Pirmidin

Obat golongan ini mengalami anabolisme menjadi senyawa

aktif secara in vivo, sehingga dapat mempengaruhi sintesis DNA

pada fase awal yang menyebabkan kekosongan asam timidilat

akibatnya sel mengalami kematian. Contoh: 5-fluorourasil,

sitarabin, tegafur dan floksuridin.

2) Antagonis Purin

Antagonis purin menjadi aktif setelah mengalami

anabolisme menjadi nukleotida dan terkadang menjadi turunan

difosfat atau trifosfat. Contoh: 6-merkaptopurin, azatioprin dan

tioguanin.

28

3) Antagonis Asam Folat

Pada golongan ini obat bekerja tidak khas dengan

menghambat secara bersaing dihidrofolat reduktase (enzim yang

mengkatalisis reduksi asam dihidrofolat menjadi asam

tetrahidrofolat). Antagonis asam folat mengikat enzim tersebut

sehingga terjadi hambatan tak terpulihkan. Penghambatan enzim

dihidrofolat reduktase menyebabkan hambatan sintesis DNA,

RNA dan protein. Antagonis asam folat menghambat timidilat

sintetase sehingga menyebabkan kematian sel karena kekurangan

timin. Contoh: aminopterin, metotreksat dan ketotreksat.

4) Antagonis Asam Amino

Antagonis asam amino menghambat beberapa proses

metabolik yang memerlukan glutamin sebagai kofaktor.

Aktivitas antikanker disebabkan oleh kemampuan menghambat

fosforibosil formilglisinamida ribonukleotida menjadi

fosmilglisinamidin ribonukleotida. Contoh: azaserin dan 6-

diazo-5-okso-L-norleusin (DON).

c. Antikanker Produk Alam

Senyawa antikanker ini dihasilkan dari alam dan memiliki

khasiat sebagai antikanker. Obat antikanker golongan ini terbagi

menjadi (Siswandono, 2000; Tjay, 2002):

1) Antibiotika Antikanker

Efek samping berupa sitotoksik tinggi dari antibiotika yang

dikembangkan sebagai senyawa antibakteri, kemudian dievaluasi

29

dan dikembangkan menjadi obat antikanker. Antibiotika

antikanker sukar diabsorpsi pada saluran cerna sehingga diberikan

melalui parenteral. Contoh: mitomisin, daktinomisin,

doksurubisin, dan bleomisin.

2) Antikanker Produk Tanaman

Obat-obat antikanker golongan ini bekerja dengan mengikat

tubuli dan menghambat pertumbuhan komponen mikrotubuli

pada kumparan mitosis sehiggga metafase berhenti. Alkaloid

vinca bekerja pada fase M, vinkristin memiliki kemampuan

penetrasi ke dalam sel kanker yang lebih baik dibanding

vinblastin. Contoh: vinblastin, vinkristin, dan podophyllotoksin

(seperti etoposida).

3) Antikanker Produk Rekayasa Genetika

Obat yang termasuk dalam golongan ini yaitu interferon α-

2a (Roferon-A) dan interferon α-2b (Intron-A) yang mengandung

165 asam amino, dihasilkan melalui teknologi rekombinan DNA

menggunakan rekayasa genetik pada strain E.coli. contoh lainnya:

antineoplaston dan avaron.

d. Hormon

Hormon androgen, progestin, estrogen dan adrenokortikoid

mengikat secara khas reseptor pada sitoplasma dan mengubah

struktur reseptor. Bentuk kompleks hormon-reseptor menuju inti,

berinteraksi dengan sisi aseptor sehingga mempengaruhi proses

transkripsi (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).

30

e. Golongan Lain-lain

Sitostatika lainnya yang digunakan berupa enzim

asparaginase, senyawa-senyawa platina berupa sisplatin dan

karboplatin, hidroksiurea, procarbazin dan topotecan yang

menghambat enzim topoisimerase-1, yang terlibat pada replikasi

DNA. Kompleksnya dengan DNA distabilkan, menimbulkan cacat

dan matinya sel (Siswandono, 2000; Tjay, 2002).

2.8 Cisplatin (Farmakologi dan terapi 2008)

Cisplatin merupakan obat kanker golongan platinum.Cisplatin juga

merupakan metal inorganik.Karena toksisitas cisplastin yang mempunyai

sitotoksisitas sinergik dengan radiasi dan obat kemoterapi lain (Mary dan

Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).

Obat ini ditemukan secara kebetulan melalui observasi bahwa komplek

platinum menghambat pembelahan Escherichia coli.Golongan obat ini

membunuh sel pada semua siklus pertumbuhannya, menghambat biosintesis

DNA dan berikatan dengan DNA membentuk ikatan silang (cross

linking).Tempat ikatan utama adalah N7 pada guanin, namun juga terbentuk

ikatan kovalen dengan adenin dan sitosin.Cisplatin terutama efektif untuk

tumor padat seperti karsinoma paru (sel sekil dan sel non kecil), kanker

esofagus, gaster, leher dan kepala, genito urinaria (testis, ovarium, buli–

buli).Cisplatin dalam kombinasi dengan vinblastin dan23 bleomisin, atau

etoposid dan bleomisin dapat memberi hasil yang kuratif untuk tumor

testis.(Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).

31

Karena toksisitas cisplastin yang mempunyai sitotoksisitas sinergik

dengan radiasi dan obat kemoterapi lain (Mary dan Pamela, 2001).

1). Mekanisme kerja:

Mekanisme kerja sama dengan alkilator. Golongan obat ini

membunuh sel pada semua siklus pertumbuhannya, menghambat biosintesis

DNA dan berikatan dengan DNA membentuk ikatan silang (cross linking).

Sitotoksisitas dapat terjadi pada setiap tahap pengembangan siklus sel, tetapi

sel yang paling peka adalah fase G1 dan S. Tempat ikatan utama adalah N7

pada guanin, namun juga terbentuk ikatan kovalen dengan adenin dan sitosin.

Pada lingkungan plasma yang tinggi klorida, cisplastin menetapkan

sebagai jenis netral, yang masuk sel dan terikat pada N’ guanine DNA,

membentuk crosslink inter- dan intra- strand. Lesi sitotoksik yang

menghambat sintesis DNA dan RNA (Mary dan Pamela, 2001).

2). Farmakokinetik

Cisplatin dan Karboplatin diberikan IV dalam cairan garam, obat-obat

ini dapat juga diberikan interperitonial untuk kanker ovarium.Lebih dari 90%

cisplatin diikat oleh serum protein.Konsentrasi tertinggi ditemukan dalam

hati, ginjal, usus, sel-sel testis dan ovarium, tetapi sedikit yang dapat masuk

kedalam cairan serebrospinal (CSS).Ginjal merupakan saluran ekstraksi yang

utama. Efek samping dari cisplatin antara lain muntah yang hebat dan

persisten terjadi 1 jam setelah 24 pemberian cisplatin dan dapat berlangsung

sampai 5 hari (Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi,

2008).

32

3). Penggunaan dalam terapi

Cispaltin banyak digunakan untuk pengobatan tumor padat seperti

metastasis karsinoma testis dikombinasikan dengan vinblastin dan bleomisin,

karinoma ovarium kombinasi dengan siklofosfamid, atau tunggal untuk

karsinoma kanndung kemih (Mary dan Pamela, 2001).

4). Efek samping

Muntah yang hebat dan persisten terjadi 1 jam setelah pemberian

cisplatin dan dapat berlangsung sampai 5 hari. Premedikasi dengan

antiemetik biasanya dapat menolong.Toksisitas terbatas yang paling sering

adalah nefrotoksisitas yang tergantung dosis, menyangkut tubulus renalis

kontortus distal dan tubulus renalis rektus.Kedaan ini diperburuk oleh hidrasi

hebat dan diuresis (Mary dan Pamela, 2001).

Efek samping utama cisplat in adalah nefrotoksisitas.Hidrasi yang

cukup dengan garam fisiologis atau manitol penting untuk mengurangi

nefrotoksisitas.Selain itu, cisplatin juga menyebabkan neurotoksisitas perifer

yang irreversibel (Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).

2.9 Kultur Sel (Malole, 1990; Freshney,1992)

Kultur sel berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara

mekanis atau enzimatis menjadi suspensi sel kemudian dibiakan menjadi satu

lapisan jaringan (monolayer) diatas permukaan keras (botol, tabung dan cawan)

atau menjadi suspensi sel dalam media penumbuh.Monolayer dapat

33

diperbanyak dan diencerkan pada media penumbuh disebut teknik subkultur

(pasase). Subkultur yang dilakukan terus-menerus akan dihasilkan sel lestari

dengan sifat meningkatnya jumlah sel, memiliki daya tumbuh tinggi, sel-sel

tersebut seragam dan mengalami perubahan fenotip atau transformasi.

Kultur sel memerlukan adanya pergantian medium secara berkala yang

diikuti subkultur jika sel-sel berproliferasi, intervalnya berbeda-beda sesuai

jenis sel yang tergantung pada kecepatan pertumbuhan dan metabolisme sel.

Sel disimpan dalam inkubator pada lingkungan ber CO2 dengan suhu 37oC.

Persediaan sel manusia dan hewan yang akan dibiakan dalam kultur,

disimpan beku dalam nitrogen cair. Selama proses penyimpanan ini digunakan

larutan dimetil sulfoksida (DMSO) sebagai agen krioprotektan bersama

medium untuk mengawetkan sel pada suhu dibawah -70°C. DMSO juga

memiliki kemampuan untuk berpenetrasi kedalam sel dan membekukan cairan

sel tanpa menyebabkan terbentuknya kristal es.

Subkultur bertujuan untuk memperbanyak kultur sel, selain itu juga

untuk mempertahankan kelangsungan hidup sel karena labu kultur yang telah

penuh dengan sel akan menghambat pertumbuhan sel itu sendiri.Pengaruh

lingkungan kultur meliputi:

1. Kondisi alami substrat yang terdiri dari:

a. Substrat

Kebanyakan sel yang dikultur invitro tumbuh sebagai kultur selapis

pada substrat buatan. Labu ukur kultur jaringan (tissue kultur flask)

34

terbuat dari plastik polistiren yang telah diolah dengan radiasi sinar

gamma, dengan zat kimia atau dengan pengisian muatan listrik untuk

menghasilkan permukaan yang bermuatan sehingga mudah terbasahi.

b. pH

kebanyakan sel turunan akan tumbuh baik pada pH 7,4 walaupun pH

optimum untuk pertumbuhan sel bervariasi antara beberapa jenis sel.

c. Dapar (buffer)

Dapar ditambahkan kedalam medium untuk mempertahankan pH.

Dapar natrium bikarbonat paling sering digunakan karena toksisitasnya

rendah, murah dan memberikan nutrisi bagi kultur sel.

2. Komposisi medium

Komposisi medium sangat beragam, mulai dari asam amino esensial,

vitamin dan garam sampai dengan senyawa yang kompleks

3. Penyusunan fase lag gas (dalam inkubator)

Meliputi oksigen dan karbondioksida.

4. Suhu inkubasi

Suhu yang biasa digunakan untuk kebanyakan sel turunan adalah 37°C,

yang dekat dengan suhu tubuh manusia.

35

2.10 UJI ANTIPROLIFERATIF

Proliferasi adalah pertumbuhan sel kanker yang tak terkendali sehingga

berhasil membentuk kelompok. Aktivitas antiproliferasi terhadap suatu sel dan

harga IC50 ditetapkan melalui uji sitotoksik dan pengamatan kinetika

proliferasi dengan metode MTT (Utami, Dwi. 2007)

Adanya kemampuan bertahan hidup diartikan sebagai tidak hilangnya

kemampuan metabolik atau proliferasi dan dapat diukur dari pertambahan

jumlah sel, peningkatan jumlah protein atau DNA yang disintesis. Uji

antiproliferatif merupakan salah satu metode untuk mengetahui pertumbuhan

sel diukur dari persamaan regresi linear yang dibuat dari slope sehingga

menggambarkan kinetika proliferasi sel. Uji ini didasarkan pada uji

sitotoksisitas. Jumlah sel yang bertahan hidup pada uji sitotoksisitas ditetapkan

dengan beberapa cara yang didasarkan pada parameter kerusakan membran

meliputi perhitungan sel yang mengambil (uptake) atau tidak mengambil bahan

pewarna seperti biru tripan (Freshney, 1987; Malole, 1990).

2.10.1 Metode Pengujian Antiproliferatif

Metode pengujian antiproliferatif dilakukan dengan

mengghunakan metode reduksi pewarna tetrazolium, menggunakan

garam tetrazolium (MTT) yang merupakan singkatan dari (3–[4,5–

dimethylthiazol–2Yi]–2,5–diphenyl tetrazolium bromide) yaitu

metode penghitungan sel hidup dengan pewarnaan (kolorimetri)

untuk menghitung jumlah sel hidup berdasarkan reduksi oleh enzim

suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari garam tetrazolium

(MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal formazan

36

berwarna ungu. Sel didistribusikan ke dalam sumuran dan diinkubasi,

masing-masing sumuran ditambahkan 10 μL MTT. Kemudian

diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37oC. Sel yang hidup akan

bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu (Freimoser et al,

1999, Sieuwerts, 1995).

2.11 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

ELISA merupakan alat uji serologis yang digunakan untuk menemukan

antigen tunggal atau antibodi dalam cairan biologis dan penetapan kadar

imunosorben taut-enzim. Uji ini dibagi menjadi dua jenis yaitu competitive

assay yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim

dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi, antibodi kedua

akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator (Baratawidjaya, 2004).

Gambar 3. MTT direduksi menjadi Formazan

37

2.12 Potensi Penelitian

Penelitian-penelitian terdahulu membuktikan adanya potensi yang

baik dari senyawa katekin maupun eugenol.Baik secara umum, maupun

secara khusus, yang dalam hal ini adalah penghambatan sel-sel kanker.

katekin telah teruji memiliki efek antiinflamasi dengan dosis

pemberian 100 dan 200 mg/KgBB pada marmut (Arundina et al, 2003). Rasio

penghambatan pertumbuhan tumor mamma dicapai katekin hingga 57.14%

dengan dosis 800 mg/kgBB/hari (Gunawijaya e.t al., 1999). Aktivitas katekin

sebagai antioksidan yang diujikan pada suhu 400, 50

0 dan 60

0C masing-

masing menunjukkan rasio penghambatan sebesar 37,55%, 36,51% dan

29,67% (Hukmah, 2007).

Aktivitas katekin sebagai antivirus ditunjukkan oleh derivatisasinya

yaitu epigallokatekin galat (EGCG), epikatekin galat (ECG) dan

epigallokatekin (EGC) yang masing-masing senyawa memiliki nilai EC50

sebesar 22-28 µM, 309-318 µM dan 22-40 µM (Min Song et al, 2005).

Epigalokatekin galat (EGCG) memiliki aktivitas sebagai antifungi yang

diujikan pada Candida albicans dengan persentase penghambatan sebesar

90% pada konsentrasi 2000 mg/L pada pH 6, 500-1000 mg/L pada pH 6,5

dan 15,6-250 mg/L pada pH 7 (Hirasawa and Takada, 2004). Penelitian yang

dilakukan oleh Sadava et. al., (2007) menunjukkan bahwa EGCG mampu

mereduksi aktivitas telomerase SCLC (Small-cell Lung Carcinoma) sebesar

50-60% pada konsentrasi IC50 32,1 ppm. Penelitian lainnya oleh

menunjukkan bahwa katekin hidrat mampu menghambat proliferasi sel MCF-

38

7 (kanker payudara) yang dikultur selama 48 jam pada konsentrasi 300 µg/ml

sebesar 52,95% (Alshatwi, 2010).

Eugenol dilaporkan dapat menginduksi apoptosis pada sel melanoma

manusia (G361) hingga 50% dalam masa inkubasi selama 24 jam dan 100%

dalam masa inkubasi 72 jam (Kim, 2006). Uji antiproliferatif eugenol

terhadap sel melanoma malignant manusia (WM1205Lu) mengindikasikan

bahwa eugenol dapat menginduksi apoptosis sel WM1205Lu, (Ghosh, 2005).

Penelitian aktivitas sitotoksik dari pencampuran beberapa komponen

minyak essensial dengan perbandingan 1:1 dan konsentrasi masing-masing

komponen 50 μg/mLyang diujikan pada sel MCF-7 (sel kanker payudara)

menunjukkan persen kematian sel eugenol ataupun campuran

eugenol:berberapa komponen minyak esensial sebesar < 50%, kecuali pada

campuran eugenol:citral yang menunjukkan persen kematian sebesar 90%

(Wright, 2007)

Efek antioksidant dari eugenol telah dibandingkan dengan beberapa

senyawa fenol lainnya, yaitu 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol; p,p’-biphenol; 2-

allyl-6-methylphenol; honokiol; magnolol; caffeic acid; p-ethylphenol dan

guaiacol. Berdasarkan hubungan struktur-aktivitas, aktivitas antioksidant

senyawa fenol yang dihasilkan 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol p,p’-biphenol

> eugenol > 2-allyl-6-methylphenol > honokiol > magnolol > caffeic acid >

p-ethylphenol > guaiacol. Electron Spin Resonance Spin mendeteksi bahwa

component fenol dengan substitusi alyl pada cincin aromatic mengikat

Superoksida (O2-) dan hanya eugenol yang mengikat hydroxyl radicals

39

sehingga dapat berperan dalam menghentikan reaksi ikatan radikal bebas

(Ogata, 1997). Kemampuan antiradikal dari minyak esensial Cinnamomum

zelanycum, dengan komponen eugenol 89.1% memiliki aktivitas antiradikal

efek dari minyak esensial lebih tinggi dari butylated hydroxyl toluene (BHT)

(SC50= 7 mg/L) (Dongmo, 2007).

Eugenol juga banyak digunakan dalam kepentingan kedokteran gigi.

Salah satu pengujian dilakukan untuk mengetahui pengaruh penambahan

eugenol dalam semen temporer. Evaluasi membuktikan eugenol mengurangi

kekuatan ikatan padasemen temporer (Wazzan, 1997).

40

2.13 KERANGKA KONSEP PENELITIAN

Potensi tanaman gambir

(Unicaria gambier)

Senyawa Katekin

Pemanfaatan secara

empris :

- sebagai komponen

menyirih

- obat luka bakar

(Malaysia)

- obat sakit kepala

(Kalimantan)

- dsb

Potensi katekin sebagai antikanker

ditunjukkan oleh aktivitas derivatnya:

EGCG mereduksi 50-60% aktivitas

telomerase SCLC (Small-cell Lung

Carcinoma) dengan IC50 32.1 ppm (Sadava

et al., 2007), katekin hidrat (300 µg/mL)

menghambat proliferasi sel MCF-7 (kanker

payudara) sebesar 52.95% (Alshatwi,

2010). EGCG memiliki nilai IC50 sebesar

12.51 ppm dan 21.96 ppm untuk

menghambat proliferasi sel kanker serviks

yaitu sel CaSki dan sel HeLa (Qiao et al.,

2009)

Pemanfaatan ilmiah :

- Bahan baku dalam

pembuatan obat-

obatan antihepatitis

B, antidiare (Dharma,

1985).

- penghambat

pembentuk plak gigi

(Kozai et al. 1995;

Nazir 2000)

- antimikroba, dan

antinematoda (Alen,

Bakhtiar, dan

Noviantri 2004)

- dsb

Uji Efek antiproliferatif

Analisa IC50 probit

Senyawa Eugenol

Pemanfaatan senyawa eugenol:

- menghambat pertumbuhan

tumor (Jaganathan, 2010)

- menekan pertumbuhan sel

kanker hati (Jaganathan,

2010)

Perpaduan dua ekstrak herbal

atau lebih memiliki fungsi,

antara lain supaya komponen-

komponennya saling

mendukung atau saling

mengurangi efek samping.

(Sukardiman, 1999)

41

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1Waktu dan Tempat Penelitian

3.1.1Waktu Penelitian

Penelitian ini berlangsung mulai daribulan Mei hingga Oktober 2011.

3.1.2 Tempat Penelitian

Pembuatan sampel uji dan uji antiproliferatif dilakukan di

Laboratorium FKIK UIN dan Laboratorium Departemen Patologi dan

Anatomi FKUI Salemba.

3.2Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Penelitian

T-flask, Biological Safety Cabinet , Microplate 96 sumuran,

Haemocytometer, Inkubator CO2, Mikroskop inverted, ELISA reader,

Timbangan analitik, pisau, spatula, kertas karton, blender, erlenmeyer,

gelas ukur, beker glass, labu ukur, evaporator, kertas saring, kapas,

corong, spatula, kain, corong pisah, cawan penguap, vial, lemari es,

oven, autoklaf, timbangan analitik, , sentrifuge, sentrifuge tube 15 dan

50 ml, Laminer Air Flow cabinet (LAF), tangki nitrogen cair, ,

Cryogenic vials, mikro pipet, pipet tips, pipet tips 5 ml, Syringe 200

CC, syringe filter (Corning), vortex, tabung conocal, , tabung falcon,

hot plate HP-3000 (Lab Companion), kulkas 4 dan -20oC, kulkas -

80oC, pipet tetes, tabung reaksi, ruang asam, hot plate, porselen,

kamera digital.

42

3.2.2 Bahan yang Digunakan

a. Sampel Uji

Sampel uji yang digunakan dalam uji antiproliferasi ini adalah

Eugenol dan Katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dalam fase etil

asetat yang telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Litbang LIPI

Bogor, Cibinong.

b. Sel Uji

Pada uji antiproliferatif ini, sel uji yang digunakan adalah sel

HeLa yang diperoleh dari stok Fakultas Kedokteran Hewan Institut

Pertanian Bogor – Bogor yang merupakan Pasase 3.

c. Bahan Kimia yang Digunakan

Aquadest, kloroform, etil asetat, etanol 70%, HCl, dragendorf,

meyer, serbuk Mg, amil alkohol, FeCl3, pereaksi Stiasny (Formaldehid

30% : HCl pekat = 2 : 1), Na asetat, NaOH, pereaksi Liebermann-

Buchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat), eter,

ammonia (NH4OH) 10%, media sel DMEM (Dulbecco's Modified

Eagle's Medium) (Sigma), Phosphate Buffered Salina (PBS),

Penicillin-streptomisin (Pen-Strep), Fetal Bovine Serum (FBS)

(Sigma), Trypsin EDTA 5% (Sigma), MTT [3-(4,5 dimetiltiazol-2-yI)-

2,5 difenil tetrazolium bromide] (Sigma), Trypan Blue (Sigma),

Sodium Duodecyl Sulphate (SDS) (Sigma), DMSO (Dimetil

Sulfoksida) (Sigma), dan Cisplatin®.

43

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyiapan Simplisia Uji

Penyiapan gambir yaitu dengan cara membersihkannya dari

pengotor, gambir yang digunakan yaitu berupa bongkahan yang

diperoleh dari Payakumbuh Padang Sumatera Barat. Bongkahan gambir

kemudian dihaluskan sampai menjadi serbuk. Serbuk gambir tersebut

diidentifikasi dan dilakukan pemeriksaan kadar urea untuk mengetahui

kadar urea yang terkandung didalamnya.

3.3.2 Identifikasi Gambir

1. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes asam sulfat P warna

coklat merah

2. 2 mg serbuk gambir ditambahkan asam sulfat 10 N warna coklat

muda

3. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes Na hidroksida 5% dalam

etanol warna coklat merah

4. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes ammonia 25% warna

coklat merah

5. 2 mg serbuk gambir ditambahkan 5 tetes larutan FeCl3 5% coklat

kehitaman (Depkes RI, 1989).

3.3.3 Identifikasi Cemaran Urea

100 mg serbuk gambir dilarutkan dalam 1 ml air, ditambahkan 1

ml asam nitrat P terbentuk endapan hablur putih (Sirait, 1995).

44

3.3.4 Isolasi Katekin Gambir

Sebanyak 500 gram serbuk gambir diekstraksi dengan pelarut air

pada temperatur mendidih 90-960C selama 15-20 menit sambil diaduk.

Selanjutnya, infusa disaring dalam keadaan panas menggunakan corong

yang dilapisi dengan kertas saring (DepKes, 1986). Residu dibilas

kembali dengan air panas (900C) dan disaring hingga jernih. Filtrat

dipartisi dengan etil asetat dengan perbandingan filtrat:etil asetat yaitu

1:½ kemudian ditambahkan dengan NaCl hingga jenuh. Fase air

dipartisi kembali dengan etil asetat. Proses ini dilakukan hingga lima

kali, kemudian fase air dibuang dan fase etil asetat yang diperoleh

dikumpulkan untuk dievaporasi hingga kental, kemudian diberi air

dingin, diambil endapannya dan dikeringkan menggunakan oven pada

suhu 70oC, lalu dilakukan penetapan kadar katekin yang dibandingkan

dengan katekin standar, penetapan kadar air dan kadar abu, uji jarak

lebur dan penghitungan rendemen katekin total serta uji penapisan

fitokimia.

3.3.5 Penapisan Fitokimia

Pemeriksaan kandungan golongan senyawa kimia dari serbuk

ekstrak air gambir (Unicaria gambir) yang dilakukan antara lain ialah

ujialkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid, glikosida, steroid,

triterpenoid,dan kumarin.

1) Alkaloid

Sebanyak 2 gram serbuk simplisia kemudian dilembabkan

dengan 5ml ammonia 30%, digerus dalam mortir, selanjutnya

45

ditambahkan 20 mlkloroform dean digerus kembali dengan kuat.

Campuran tersebut disaringdengan menggunakan kertas saring.

Filtrat berupa larutan organik diambil(larutan A). Sebanyak 10 ml

larutan A diambil kemudian diekstraksi dengan10 ml larutan HCl 1 :

10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambillarutan bagian

atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes padakertas

saring dan disemprot atau ditetesi dengan pereaksi

Dragendorf,terbentuk warna merah/jingga pada kertas saring

menunjukkan adanyasenyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam dua

tabung reaksi, kemudianditambahkan masing–masing pereaksi

Dragendorf dan Mayer, terbentukendapan merah bata dengan

pereaksi Dragendorf dan endapan putih denganpereksi Mayer

menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid(Fransworth, 1969).

2) Glikosida

5 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam etanol 80%

demudiandisaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan di atas

hot plate. Filtratkering dicuci dengan n-heksana sampai larutan n-

heksana bening (pigmenhilang). Panaskan residu yang bebas lemak

(untuk menghilangkan sisa n-heksana). Kemudian ditambahkan

FeCl3 sebanyak 3 ml, lalu aduk sampaihomogen. Larutan kemudian

dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudianditambahkan H2SO4

pekat (melalui dinding tabung reaksi), lalu didiamkan37beberapa

saat. Terbentuk warna merah menjadi cuklat kemudian

46

menjadibiru/lembayung menunjukkan adanya glikosida (Guevara et

al, 1985).

3) Saponin

Ditimbang 0,5 gram serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam

tabungreaksi, kemudian ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan

dan kemudiankocok kuat-kuat selama 10 detik. (jika zat yang

diperiksa berupa sediaancair, encerkan 1 mL sediaan yang diperiksa

dengan 10 mL air dan kocok kuat-kuat selama 10 menit); sehingga

terbentuk buih yang mantap selama tidakkurang dari 10 menit,

setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetesasam klorida 2

N, buih tidak hilang (Fransworth, 1969).

4) Flavonoid

2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air panas,

didihkanselama 5 menit. Setelah 5 menit, saring dengan kertas

saring, diperolehfiltrat yang akan digunakan sebagai larutan

percobaan. Kedalam 5 mL larutanpercobaan (dalam tabung reaksi),

ditambahkan serbuk atau lempengmagnesium secukupnya dan 1 mL

HCl pekat, tambahkan 5 mL amilalkohol,dikocok dengan kuat,

biarkan hingga memisah, terbentuk warna dalamlarutan amilalkohol

menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Fransworth,1969).

5) Tanin

2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 mL air, didihkan

selama 15 menit, dinginkan dan disaring dengan kertas saring dan

filtrat dibagi duabagian. Kedalam filtrat pertama ditambahkan Ferri

47

(III) klorida 1%,terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman

menunjukkan adanya senyawa golongan tanin. Kedalam filtrat yang

kedua ditambahkan 15 mlpereaksi Stiasny (Formaldehid 30% : HCl

pekat = 2:1), dipanaskan di ataspenangas air, terbentuk endapan

warna merah muda menunjukkan adanyatanin katekuat. Selanjutnya

endapan disaring, filtrat dijanuhkan dengannatrium asetat,

ditambahkan beberapa tetes larutan Ferri (III) klorida 1%,terbentuk

warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat (Fransworth,1969).

6) Kuinon

2 gram serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas,

didihkanselama 5 menit. Setelah 5 menit, saring dengan kertas

saring, diperolehfiltrat yang akan digunakan sebagai larutan

percobaan. Di dalam tabungreaksi, filtrat ditambahkan dengan

beberapa tetes larutan NaOH 1 N,terbentuk warna merah

menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon (Fransworth, 1969).

7) Steroid dan Triterpenoid

1 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama

2 jam (dalam wadah dengan penutup rapat), disaring dan diambil

filtratnya. 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap

hingga diperolehresidu/sisa. Kedalam residu tersebut ditambahkan 2

tetes asam asetatanhidrat dan 1 tetes asam sufat pekat (pereaksi

Libermann-Buchard),terbentuk warna hijau atau merah menunjukkan

adanya senyawa golongansteroid atau triterpenoid (Fransworth,

1969).

48

8) Kumarin

2 gram simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi (volume 20

mL) ditambahkan 10 mL pelarut kloroform dan pasang corong (yang

diberilapisan kapas yang telah dibasahi air) pada mulut tabung.

Selanjutnyapanaskan selama 20 menit di antas penangas air dan

dinginkan, kemudiansaring dengan kertas saring. Filtrat di dalam

cawan penguap diuapkansampai kering, sisa ditambahkan air panas

sebanyak 10 mL, dinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung

reaksi, kemudian ditambahkan 1,5 mllarutan amonia (NH4OH) 10%,

amati di bawah sinar ultraviolet padapanjang gelombang 365 nm,

maka terjadi fluoresensi warna biru atau hijau,menunjukkan adanya

golongan kumarin (Fransworth, 1969).

3.3.6 Pemeriksaan Katekin

a. Penetapan Kadar Katekin

Sebanyak 50 mg katekin standar ditimbang dan dilarutkan

dalam etil asetat hingga 50 ml (konsentrasi 1 mg/ml). Dari larutan

induk diencerkan hingga menjadi 0,04 mg/ml. Diukur panjang

gelombang 279 nm dengan spektrofotometer UV.

Dari larutan induk diatas dibuat larutan katekin standar dengan

berbagai konsentrasi dalam etil asetat: 0.02 mg/mL, 0,03 mg/mL,

0,04 mg/mL, 0,05 mg/mL dan 0,06 mg/mL. Kemudian diukur

seserapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang

279 nm dan dibuat kurva kalibrasi serta menghitung persamaan

regresi.

49

Penetapan kadar katekin sampel dengan cara sebanyak 50 mg

katekinditimbang dan dilarutkan dalam etil asetat hingga 50 ml, lalu

dibuat larutan katekinmenggunakan etil asetat dengan berbagai

konsentrasi, yaitu 0,02 mg/mL, 0,03 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,05

mg/mL, dan 0,06 mg/mL. Kemudian diukur serapannya dengan

spektrofotometri UV pada panjang gelombang 279 nm. Kadar

katekin dalam larutan dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi

(Lucida et al, 2007).

b. Kadar Abu

Sebanyak 1 gram katekinditimbang dan dimasukkan ke dalam

cawan porselen. Katekin dipijar dengan pembakar bunsen selama

kira-kira 1 jam dan disempurnakan pemijarannya dengan

menempatkan bahan dalam tanur suhu tinggi pada 900o ± 20

oC

sampai diperoleh abu berwarna abu-abu. Didinginkan dalam

desikator, ditimbang serta dicatat pengurangan beratnya. Dihitung

kadar abu dari pengurangan berat yang didapat (DepKes, 2000).

c. Kadar air

Sebanyak 1 gram sample katekin ditimbang, kemudian

ditempatkan didalam cawan porslen yang diketahui beratnya dan

dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 5 jam. Kemudian

didinginkan dalam desikator hingga mencapai suhu kamar dan

ditimbang. Dilakukan pemanasan kembali selama 30 menit dan

didinginkan dalam desikator. Pemanasan selama 30 menit,

pendinginan dan penimbangan dilakukan beberapa kali sampai

50

pengurangan berat antara dua penimbangan berturut-turut lebih kecil

dari 0,001 g. Kadar air dihitung dari pengurangan yang didapat

(Depkes, 2000).

d. Uji Jarak Lebur

Menempatkan sejumlah katekin ke dalam tabung kapiler lalu

dipanaskan dalam tangas udara atau tangas cair kemudian suhu

dicatat pada saat zat melebur dan pada saat semua dimana semua zat

melebur. Dengan demikian jarak lebur dicatat sebagai jarak antara

suhu permulaan dan suhu akhir peleburan yang sempurna. Laju

pemanasan alat diatur sekitar 10oC per menit, ketika mencapai suhu

165-170oC diatur kembali hingga kenaikannya sekitar 1

oC per menit

(DepKes, 1979). Jarak lebur katekin pada literatur ialah 175-177oC

(WHO, 1998).

e. Rendemen Katekin

Rendemen katekin dihitung dengan membandingkan berat

awal serbuk dengan berat akhir katekin yang dihasilkan.

Rendemen = % kemurnian x Bobot serbuk katekin

Bobot serbuk gambir di ekstraksi

3.3.7. Sterilisasi Alat

Bahan-bahan seperti media kultur dan reagen-reagen harus

dalam keadaan steril. Sterilisasi dilakukan secara aseptis di dalam

LAF(Laminar Air Flow) dengan metode filtrasi karena mengandung

komponenyang tidak tahan pemanasan. Sterilisasi ini bertujian untuk

menghindariterjadinya kontaminasi dari bakteri atau pengotor lain

51

seperti debu yangakan merusak validitas hasil penelitian. Filter yang

umumnya digunakanadalah filter MF-Milipore tipe GS dengan ukuran

pori 0,2 µm.

Alat–alat gelas yang akan digunakan dicuci bersih

kemudiandikeringkan, selanjutnya dibungkus dengan kertas dan

disterilkan dalamautoklaf pada suhu 121oC, tekanan 15 lb, selama 15

menit.

3.3.8 Pembuatan Reagen

a. Pembuatan Medium DMEM berserum

Sebanyak 500 ml medium DMEM berserum ditambahkan

50ml FBS 10% dan penstrep (Penisilin-Streptomisin) sebanyak 5

ml, kemudian dihomogenkan. Selanjutnya larutan medium DMEM

berserum disaring dengan syringe filter 0.2 µm membrane non

pyrogenic dan disimpan pada suhu -4oC

b. Pembuatan Larutan PBS (Phosfhat Buffer Saline)

Larutan PBS dibuat dengan cara menimbang dinatrium

hydrogen fosfat (Na2HPO4) sebanyak 1,081 gram, kemudian

ditambahkan 0,106 gram kalium fosfat (KH2PO4); 4,025 gram

natrium klorida (NaCl), dan 0,102 gram kalium klorida (KCl).

Selanjutnya dilarutkan dalam aquadest steril hingga 500 ml.

Stabilkan larutan pada pH 7,2 dengan menggunakan pH meter

kemudian disterilkan dengan autoklaf dan disimpan pada suhu

kamar.

52

c. Pembuatan Larutan SDS (Sodium Dedocyl Sulfat) 10 % b/v

Menimbang SDS sebanyak 10 gram kemudian dilarutkan

dalam 90 mlaquadest steril dan 10 ml HCl 0.01 N, kemudian diaduk

sampai larut.

d. Pembuatan Larutan MTT (3 – [4,5 – dimethylthiazol – 2Yi] – 2,5

– diphenyl tetrazolium bromide)

Untuk pengamatan proliferatif sel secara kolorimetri, 5 mg

MTT dilarutkan dalam 1 ml PBS dan difilter agar steril. Kemudian

MTT diberikan sebanyak 10 µL per 100 µL medium pada tiap-tiap

sumuran (Mosmann, 1983).

Pada penelitian ini, Larutan MTT dibuat dengan cara

melarutkan serbuk MTT sebanyak 1 gram dalam 40 ml PBS steril.

Tiap sumuran diberi larutan MTT tersebut sebanyak 10 µl.

3.3.9 Persiapan Larutan Uji

a. Suspensi Campuran Katekin Gambir (Uncara gambier Roxb.)

dan Eugenol.

Sebanyak masing-masing 125 mgkatekin dan eugenol

ditimbang dan dimasukkan ke dalam mikro tube dan dilarutkan

dalam 5000µl DMSO 99 %, sentrifuge sampai homogen. Larutan ini

dijadikan larutaninduk dengan konsentrasi 50000 µg/mL (larutan

induk 1), diambil 50 μl laluditambahkan media DMEM sebanyak

450 µl untukmemperoleh larutan dengan konsentrasi 5000 µg/mL

(larutan induk 2), kemudian larutan uji dengan seri 3.125; 6.25;

53

17.5; 25; 50; 100; dan 200 µg/mL dibuat dengan mengencerkan

beberapa μl dari larutan induk 2.

b. Kontrol Cisplatin

Sediaan cisplatin 10 mg/20 ml (500 µg/mL) sebagai larutan

indukdimasukkan dalam mikrotube, kemudian dibuat pengenceran

denganmemipet beberapa μl dari larutan induk, agar diperoleh lima

konsentrasiyaitu 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, dan 9 µg/mL.

c. Kontrol DMSO (kontrol negatif)

DMSO yang digunakan merupakan DMSO pro Analysis.

3.3.10 Persiapan Kultur HeLaCell Line

a. Aktivasi sel HeLa (Thawing Kultur Sel)

1. Mengeluarkan tabung yang berisi HeLa cell line dari tangki

wadah berisi dry ice bersuhu -800C , kemudiandicairkan dalam

waterbath 37oC sampai gumpalan di dalam vial mencair.

2. Didalam LAF, HeLacell line diambil seluruhnya dengan

menggunakan pipet dan dimasukkan ke dalam tabungsentrifuge

kemudianditambahkan 7 ml medium DMEM

kemudiandisentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit.

3. Supernatan yangdiperoleh kemudian dipisahkan sedangkan pellet

diresuspensikan denganmenggunakan 5 ml PBS,selanjutnya

disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm.

4.Supernatan kemudian dipisahkan dan pellet yang dihasilkan

diresuspensi dengan 3 ml DMEM berserum, kemudian

dimasukkan ke dalam T-flaskyang telah berisi 7 ml DMEM

54

berserum lalu diinkubasi pada suhu 37oCdalam inkubator CO2

5% selama 24 jam hingga sel menutupi permukaan cell culture

dish dengan tingkat kepadatan 95%.

b. Pembuatan dan Pengembangan sel HeLa (Subkultivasi)

1. T-Flask yang telah diinkubasi selama 1 hari dikeluarkan dari

inkubator.

2. Media di dalam T-Flask dibuang kemudian dicuci dengan 15 ml

PBS sebanyak 2kali. Kemudian PBS dibuang dan ditambahkan

tripsinyang telah diencerkan dengan PBS sebanyak 5,8 ml (400

µl Tripsin + 5400 µlPBS = 5,8 ml).

3. Sel diinkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO2dengan suhu

37oC (selama diinkubasi tutup T-Flask dilonggarkan). Setelah 3

menit, dishdikeluarkan dari inkubator CO2 kemudian diketuk-

ketuk horizontal dindingT-Flaskbagian luar dengan

menggunakan telapak tangan agar sel terlepasdari dinding T-

Flask. Sel kemudian diperiksamenggunakan

mikroskopinverted.

4. T-Flask dipindahkan dalam LAF kabinet kemudian didalam T-

Flaskditambahkan DMEM sebanyak 1000 luntuk

menonaktifkan tripsin, kemudian dihomogenkan.

5. Larutan seldipindahkan ke dalam tabung centrifuge tube, lalu

disentrifuge dengankecepatan 4000 rpm selama 5 menit.

6 .Kemudian supernatan dipisahkan dandiganti dengan medium

DMEM berserum sebanyak 7ml, lalu dihomogenkan kembali

55

dengan pipetsehingga sel menyebar ke seluruh media; untuk

selanjutnya dimasukkan ke dalam T-Flask dan diinkubasi

dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam.

7. 10 µl dari larutan sel tersebut dipipet, kemudian ditambahkan

10 µl Tripan blue. Selanjutnya, jumlah sel dihitung

menggunakan Haemocytometer. Syaratjumlah sel dalam setiap

sumuran adalah 5 x 103.

8. Sel dihitung dari keempat bidang besar pada sudut seluruh

permukaan yang terbagi. Penghitungan dimulai dari sisi kiri

atas kemudian ke kanan, turun ke bawah dan dari kanan ke kiri.

Cara tersebut dilakukan pada keempat bidang besar. Sel yang

menyinggung garis batas sebelah kiri atau atas harus dihitung.

Sebaliknya, sel yang menyinggung garis batas sebelah kanan

atau bawah tidak dihitung. Jumlah sel per ml dapatdihitung

dengan rumus:

Σ 𝑆𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙 = 𝑛

4× 𝑃 × 104

n =Σ sel dalam keempat bidang besar

4 =Σ bilik hemositometer yang dihitung

P =Faktor pengenceran

3.3.11 Pemeliharaan Kultur HeLa cell line

Pemeriksaan sel dilakukan setiap hari dengan

menggunakanmikroskop, pemeriksaan ini bertujuan untuk memeriksa

kemungkinan terjadipencemaran oleh bakteri atau jamur. Apabila

56

medium kultur telah berubahwarna maka diganti dengan medium

DMEMberserum yang baru.

3.3.12 Uji Antiproliferatif

Uji antiproliferatif ini menggunakan plat kultur jaringan 96

sumuran sebagai media uji. Padasetiap sumuran pelat kultur jaringan

dimasukkan suspensi sel dalammedium DMEM sampai 100 µL.

Suspensi tersebutdiinkubasi dalam inkubator CO25% selama 24, 48,

dan 72 jam pada suhu 37oC. Ke dalammasing–masing sumuran

tersebut ditambahkan 100 µl larutan uji (campuran katekin gambir dan

eugenol), kontrol DMSO (kontrol negatif), kontrol Cisplatin®

(kontrol positif) dengan konsentrasi yang berbeda-beda. Pada

sumuran yang berbeda dimasukkan 200µl DMEM sebagai blanko.

lalu diinkubasi dalam inkubator CO2 370C selama 24,48 dan 72 jam.

Sel hasil inkubasi masing-masing interval waktu (24, 48, dan 72 jam)

kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop. Setelah

pengamatan, medium pada masing-masing sumuran tersebut dibuang,

Selanjutnya 100 µl campuran DMEM berserum+MTT ditambahkan

ke dalam tiap-tiap sumur, untuk kemudian diinkubasi selama 4jam

pada suhu 37oC di dalam inkubator CO25%.

Setelah diinkubasi, sel diamati di bawah mikroskop, untuk

dilihat Kristal formazan ungu yang terbentuk. Kemudian ditambahkan

5 µl SDS 10%, dihomogenkan, dan disimpan dalam wadah gelap

selama ± 16 jam pada suhu kamar. Masing-masing sumur pada pelat

57

kultur jaringan tersebutdibaca dengan menggunakan ELISA reader

pada panjang gelombang 630nm.

3.3.13 Perhitungan Persentase Kematian Sel

Pada metode MTT, persentase kematian sel merupakan selisih

absorbansi kontrol dengan absorbansi sampel dibagi absorbansi

kontrol dikalikan 100%. Masing–masing absorbansi telah dikoreksi

dengan absorbansi dari senyawa uji saja tiap kadar. Perhitungan

kematian sel dengan menggunakan metode MTT menggunakan rumus

sebagai berikut :

% kematian sel = Serapan kontrol negatif sel − Serapan uji

Serapan kontrol negatif sel× 100%

3.4 Analisa Data

Hasil perhitungan jumlah sel yang hidup digunakan untuk menentukan

persentase kematian sel yang dipakai untuk menghitung hargaIC50 dengan

analisa probit. Dari data ini dibuat regresi linier hubunganantara logaritma

konsentrasi sebagai X dengan probit sebagai Y. Nilai IC50diperoleh dengan cara

memasukkan nilai 5 sebagai probit ke dalampersamaan regresi linier, kemudian

hasil substitusi, lalu dibuat antilogaritmanya. Persentase kematian yang dibuat

ke dalam angka probitdigambarkan hubungannya dengan logaritma konsentrasi.

Selanjutnyaditarik garis lurus yang paling baik melalui titik–titik yang

ada(berdasarkan penglihatan) dan konsentrasi pada garis ini yang menyatakan50

% kematian (probit -5). Antilog titik ini disebut IC50.

58

Ekstrak air gambir / bongkah

gambir (Unicaria gambir)

Reekstraksi Infusa

(98-100oC)

Partisi dengan Etil

Asetat

Penapisan

fitokimia

Fase air dipartisi

kembali dengan etil

asetat

Fase air

dibuang

Katekin

Uji antiproliferatif

dengan metode MTT % penghambatan

Menghitung kepadatan

sel dengan

Haemocytometer

Subkultivasi

Thawing

Cell line HeLa

Fase etil asetat

dikumpulkan

Eugenol Suspensi campuran

Analisa data IC50

Dibilas dengan air dingin,

endapan diambil

3. 5 Alur penelitian

59

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Determinasi dan Sertifikasi

Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman gambir yang

digunakan dalam penelitian ini adalah Uncaria gambier, Roxb.. yang

tergolong suku Rubiaceae. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

Adapun Eugenol yang digunakan sebagai campuran senyawa uji telah

disertifikasi sebagai Eugenol for synthesis oleh Merck. Sertifikasi Eugenol

dapat dilihat pada lampiran 2.

4.1.2 Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran

Tabel 2. Hasil Karakteristik Simplisia dan Senyawa Uji Campuran

Kar

akte

rist

ik

Serbuk katekin Eugenol Campuran

katekin dan

Eugenol Syarat* Standar

Sampel

Syarat ** Sampel

Pemerian

a. Bentuk Serbuk Serbuk Serbuk Cair Cair Cair

b. Warna Putih-

Kuning

kecoklatan

Kuning Putih

kekuningan

Bening

kekuningan

Bening

kekuningan

Bening

kekuningan

c. Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas

d. Rasa khelat khelat Khelat Pedas Pedas Pedas-pahit

Kelarutan Tidak larut

air

Tidak larut

air

Tidak larut

air

Tidak larut

air, Mudah

larut

dengan

DMSO

Jarak lebur 175-177oC 174-177

oC 174-177

oC - - -

Spektrum

UV 279 nm 292 nm 292 nm

- - -

Kadar Abu Maks 7% 0.053% 0.062% - - -

60

Kadar Air Maks 7 % 0.047% 0.044% - - -

Rendemen Min 40% - 49.30% - - -

Kemurnian 100% 93.32% 79.73% 100% 99.9% -

Berat jenis - - - 1.064 -

1.070

1.065 -

*The Merck Index.2006; WHO.1998; SNI gambir 01-3391-2000

** Farmakope Indonesia Ed. IV

4.1.3 Jumlah Kepadatan Sel

Perhitungan jumlah kepadatan sel dilakukan dengan menggunakan

Haemocytometer. Sel yang telah diinkubasi ditambahkan tripanblue dengan

pengenceran 10x kemudian dilihat di bawah mikroskop. Syarat jumlah

kepadatan sel yang digunakan dalam tiap sumuran dalam penelitian ini adalah

5 x 103 sel/mL. Adapun jumlah kepadatan sel yang diperoleh ialah 1.51 x 10

6

sel/mL. Maka, jumlah suspensi sel yang harus dipipetkan dalam tiap sumuran

adalah sebanyak 3.31 µL/sumuran kemudian ditambahkan medium DMEM

berserum ad 100 µL. Perhitungan kepadatan sel dapat dilihat pada lampiran

17 .

4.1.4 Uji Efek Antiproliferatif

a. Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir (Uncaria

gambier Roxb) dan Eugenol terhadap sel HeLa

Tabel 3. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir

(Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 24 jam

Kons

[µg/

mL]

Rata-

rata

Abs.

DMSO

Std.

dev.

Rata-

rata

Abs.

Sampel

Std.

dev.

%

Hidup

%

Inhibisi

Log

kons.

Probit IC50

3.125 0.463 0.039 0.430 0.104 92.87 7.13 0.495 3.5316

372.4

μg/ mL

6.25 0.472 0.029 0.404 0.015 85.59 14.41 0.796 3.9375

12.5 0.477 0.045 0.440 0.003 84.28 15.72 1.097 3.9931

25 0.466 0.007 0.352 0.043 74.55 25.45 1.398 4.3380

50 0.458 0.025 0.334 0.012 72.93 27.07 1.669 4.3872

100 0.451 0.004 0.314 0.030 69.62 30.38 2 4.4842

200 0.448 0.018 0.242 0.086 54.02 45.98 2.301 4.8970

61

Tabel 4. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir

(Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 48 jam

Kons

[µg/

mL]

Rata-

rata

Abs.

DMSO

Std.

dev.

Rata-

rata

Abs.

Sampel

Std.

dev.

%

Hidup

%

Inhibisi

Log

kons

Probit IC50

3.125 0.358 0.050 0.320 0.097 89.39 10.61 0.495 3.7519

178.24

μg/ mL

6.25 0.444 0.176 0.316 0.031 71.17 28.83 0.796 4.4408

12.5 0.427 0.136 0.295 0.006 70.53 29.47 1.097 4.4583

25 0.365 0.079 0.247 0.095 67.67 32.33 1.398 4.5407

50 0.328 0.003 0.216 0.015 65.85 34.15 1.669 4.5903

100 0.335 0.012 0.186 0.029 55.52 44.48 2 4.8592

200 0.331 0.017 0.164 0.035 49.55 50.45 2.301 5.0100

Tabel 5. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Campuran Katekin Gambir

(Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol 72 jam

Kons

[µg/

mL ]

Rata-

rata

Abs.

DMSO

Std.

dev.

Rata-

rata

Abs.

Sampel

Std.

dev.

%

Hidup

%

Inhibisi

Log

kons

Probit IC50

3.125 0.349 0.119 0.294 0.025 84.24 15.76 0.495 3.9931

73.45

μg/ mL

6.25 0.301 0.037 0.213 0.038 70.76 29.24 0.796 4.4524

12.5 0.281 0.072 0.192 0.060 68.33 31.67 1.097 4.5230

25 0.263 0.011 0.164 0.012 62.36 37.64 1.398 4.6480

50 0.259 0.019 0.141 0.009 54.45 45.55 1.669 4.8870

100 0.251 0.027 0.121 0.070 48.21 51.79 2 5.0426

200 0.247 0.019 0.092 0.047 38.17 61.83 2.301 5.3002

Perhitungan IC menggunakan persamaan: Y = a + bx (lampiran 19 )

b. Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding (Cisplatin) terhadap

sel HeLa

Tabel 6. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding

(Cisplatin) 24 jam

Kons

[µg/ mL

]

Rata-rata

Abs.

sampel

Rata-rata

Abs

Blangko

Std.

dev.

%

Hidup

%

Inhibisi

Log

kons.

Probit IC50

1.5 0.302

0.479

0.073 63.05 36.95 0.176 4.6681

4.305

μg/

mL

3 0.279 0.067 58.25 41.75 0.447 4.7930

4.5 0.387 0.013 51.98 48.02 0.653 4.9408

6 0.225 0.045 46.97 53.03 0.778 5.0753

7.5 0.197 0.058 41.13 58.87 0.875 5.2250

9 0.166 0.079 34.66 65.34 0.954 5.3934

62

Tabel 7. Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding

(Cisplatin) 48 jam

Kons

[µg/ mL

]

Rata-

rata

Abs.

sampel

Rata-rata

Abs

Blangko

Std.

dev.

%

Hidup

%

Inhibisi

Log

konsent

rasi

Probit IC50

1.5 0.296

0.513

0.045 57.70 42.30 0.176 4.8058

2.904

μg/

mL

3 0.257 0.055 50.10 49.90 0.447 4.9975

4.5 0.247 0.046 48.15 51.85 0.653 5.0476

6 0.217 0.002 42.30 57.70 0.778 5.1942

7.5 0.179 0.026 34.88 65.12 0.875 5.3880

9 0.119 0.026 23.2 76.80 0.954 5.7323

Tabel 8.Hasil Pengujian Efek Antiproliferatif Kontrol Pembanding

(Cisplatin) 72 jam

Kons

[µg/

mL]

Rata-

rata

Abs.

sampel

Rata-rata

Abs

Blangko

Std.

dev.

%

Hidup

%

Inhibisi

Log

konsen

trasi

Probit IC50

1.5 0.255

0.542

0.044 47.05 52.95 0.176 5.0753

1.626

μg/

mL

3 0.215 0.051 39.67 60.33 0.447 5.2611

4.5 0.198 0.020 36.53 63.47 0.653 5.3451

6 0.144 0.022 29.89 70.11 0.778 5.5273

7.5 0.101 0.004 18.63 81.37 0.875 5.8927

9 0.087 0.086 16.05 83.95 0.954 5.9945

Perhitungan IC menggunakan persamaan: Y = a + bx (lampiran 20)

63

A. Grafik Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi

1. Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi Sampel

Grafik 1. Hubungan antara % hidup dengan waktu inkubasi sampel

2. Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi Cisplatin

Grafik 2. Hubungan antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

24 jam 48 jam 72 jam

% H

idu

p

Waktu inkubasi

Hubungan Antara % Hidup dengan Waktu Inkubasi

3.125 µg/mL

6.25 µg/mL

12.5 µg/mL

25 µg/mL

50 µg/mL

100 µg/mL

200 µg/mL

linier 3.125 µg/mL

linier 6.25 µg/mL

linier 12.5 µg/mL

linier 25 µg/mL

linier 50 µg/mL

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

24 jam 48 jam 72 jam

%H

idu

p

Hubungan Antara Waktu Inkubasi Terhadap

%Hidup

1.5 µg/mL

3 µg/mL

4.5 µg/mL

6 µg/mL

7.5 µg/mL

9 µg/mL

linier 1.5 µg/mL

linier 3 µg/mL

linier 4.5 µg/mL

64

B. Grafik Hubungan Antara % Hidup dengan IC50

1. Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 Sampel

Grafik 3. Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50

2. Hubungan Antara % Hidup dengan IC50 Cisplatin

Grafik 4. Hubungan Waktu Inkubasi terhadap IC50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

24 jam 48 jam 72 jam

IC5

0(p

pm

)Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50

IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier, Roxb.) dan Eugenol

0

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

24 jam 48 jam 72 jam

IC5

0(p

pm

)

Hubungan Waktu Inkubasi Terhadap IC50

IC50 Cisplatin

65

C. Grafik Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit

1. Hubungan Antara % Hidup dengan Probit Sampel

Grafik 5. Hubungan antara Log Konsentrasi dengan Probit

2. Hubungan Antara % Hidup dengan Probit Cisplatin

Grafik 6. Hubungan antara Log Konsentrasi dengan Probit

-

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

0,796 1,097 1,398 1,699 2 2,301

Pro

bit

Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit

24 Jam

48 Jam

72 Jam

-

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

0,477 0,653 0,778 0,875 0,954

Pro

bit

Hubungan Antara Log Konsentrasi dengan Probit

24 Jam

48 Jam

72 Jam

66

4.2 Pembahasan

Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb) dan Eugenol

digunakan untuk uji antiproliferatif karena masing-masing komponen memiliki

aktivitas sitotoksik berdasarkan penelitian-penelitian sebelumnya. Dikatakan

bahwa derivat katekin yakni senyawa EGCG dan ECG menunjukkan efek

antiproliferasi pada konsentrasi 100µM (Tsuchiya et. al. 2008) dan Eugenol

dapat menghambat pertumbuhan tumor sebesar 24.35% dengan dosis 100 mg/kg;

i/p. (Jaganathan, 2010). Sehingga diharapkan senyawa campuran ini memiliki

hasil yang lebih baik dalam penghambatan sel kanker.

Uji sitotoksistas dan antiproliferatif dengan kultur sel saat ini

digunakan karena berbagai alasan. Diantaranya dengan menggunakanan kultur

sel, mekanisme toksisitas biokimia dapat dikerjakan dengan lebih efektif karena

kondisi lingkungan sel mudah dikontrol. Pengembangan metode invitro sebagai

alternatif pengganti uji dengan menggunakan hewan uji mempunyai relevansi

yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi suatu obat pada

manusia.

Uji efek antiproliferatif pada penelitian ini menggunakan sel HeLa. Sel

ini bersifat immortal dan sangat agresif sehingga mudah untuk dikultivasi tetapi

sel ini mudah menginvasi kultur sel lain (Doyle dan Griffiths, 2000). Dibanding

sel tumor lainnya, proliferasi sel ini sangat cepat dan abnormal. Sifat immortal

yang dimiliki sel ini diduga akibat peran dari enzim telomerase saat proses

pembelahan diri.

67

Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media

yang digunakan adalah media DMEM berserum. Di dalamnya terkandung nutrisi

yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam

anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon

yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein

transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai

kofaktor enzim (Freshney, 1986). Inkubasi sel yang dilakukan pada penelitian ini

menggunakan inkubator CO2 5%. Hal tersebut dikarenakan pada konsentrasi

tersebut, buffer pada medium dapat berinteraksi dengan CO2 sehingga

meningkatkan konsentrasi ion hidroksil yang dapat menstabilkan pH menjadi pH

normal yaitu 7,4. Jika pH di dalam medium terjadi penurunan maka dapat

memperlambat pertumbuhan sel dan memperpanjang proses produksi (Malole,

1990).

Penghitungan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer.

Proses penghitungan ini memakai pewarnaan biru tripan (trypan blue) yang

diencerkan 100x. Jumlah sel dihitung dibawah mikroskop. Sel hidup terlihat

sebagai bulatan bening dengan bintik biru inti sel ditengah bulatan, sedangkan sel

mati terlihat sebagai bercak biru pekat yang bentuknya tidak teratur. Selanjutnya

dihitung persentase penghambatan zat uji terhadap pertumbuhan sel.

Cisplatin dipakai sebagai kontrol positif karena cisplatin merupakan

obat terpilih kanker yang telah banyak digunakan pada pengobatan penyakit ini.

Sitotoksisitas pemberian cisplatin dapat terjadi pada setiap tahap pengembangan

siklus sel, khususnya ketika sel berada pada fase G1 dan S , sedangkan

antikanker produk tanaman bekerja dengan memblokade mitosis. Kromosom

68

akan terpecah-pecah, menyebar atau berkelompok. Kromosom tidak mampu

membagi dan memisah dengan benar akan menyebabkan sel menjadi mati dan

perkembangan berhenti pada stadium metafase (Wahyudi 2009).

Konsentrasi Cisplatin yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1,5

µg/mL; 3 µg/mL; 4,5 µg/mL; 6 µg/mL; 7,5 µg/mL dan 9 µg/mL. Konsentrasi ini

mengacu pada konsentrasi IC50 Cisplatin terhadap HeLa cell line yang

sebelumnya diteliti yakni 0,66 ppm (2.2 µM )-12,6 ppm (42 µM) (Minagawa,

1999).

Pengujian aktivitas ini sel uji atau ekstrak dilarutkan dengan DMSO.

Karena DMSO bersifat bipolar, sehingga dapat melarutkan ekstrak lebih

sempurna bila dibandingkan dengan metanol atau pelarut lain. DMSO juga

diperlukan sel sebagai cryoprotektan dalam proses cryopreservasi (Malole,

1990). Konsentrasi DMSO yang digunakan sama dengan konsentrasi sampel uji.

DMSO digunakan sebagai kontrol dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya

pengaruh DMSO terhadap pertumbuhan sel. Konsentrasi DMSO yang digunakan

harus ≤ 0.5%.

Pengujian antiproliferatif dilakukan dengan mengghunakan metode

reduksi pewarna tetrazolium (MTT) / (3–[4,5–dimethylthiazol–2Yi]–2,5–diphenyl

tetrazolium bromide) . Sel hidup dapat diketahui jumlahnya berdasarkan hasil

reaksi reduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel dari

garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning menjadi produk kristal

formazan berwarna ungu

69

Hasil yang diperoleh dari pembacaan Elisa Reader berupa nilai

absorbansi dari tiap sumuran yang telah diberi bahan uji sesuai kelompok

perlakuan. Nilai absorbansi selanjutnya digunakan untuk mengukur pertumbuhan

sel kanker serviks HeLa pada waktu inkubasi berikutnya.

Uji doubling time merupakan metode untuk mengetahui pertumbuhan

sel diukur dari persamaan regresi linier yang dibuat dari slope sehingga

menggambarkan kinetika proliferasi sel. Langkah kerja uji ini menggunakan

Metode MTT assay dengan waktu inkubasi 24, 48 dan 72 jam.

Hasil pengamatan untuk uji proliferasi doubling time menunjukkan

bahwa persentase kehidupan sel kanker pada inkubasi 24 jam kelompok

perlakuan sampel campuran terendah, yakni 3.125 µg/mL cukup besar;

mencapai angka 92.87 % sel hidup. Selanjutnya pertumbuhan sel tampak terus

mengalami penurunan seiring bertambah besarnya konsentrasi, sampai pada

kadar 200 µg/mL, persentase sel yang hidup mencapai 54.02%.

Pada inkubasi 48 jam terlihat perbedaan yang cukup jelas antara

masing-masing konsentrasi sampel uji. Pada konsentrasi 3.125 µg/mL,

persentase sel hidup turun menjadi 89.39%, lebih rendah 3.48% dari pengamatan

24 jam . Sementara pada konsentrasi 200 µg/mL, persentase kehidupan sel

menjadi 49.55%. Pada inkubasi 72 jam juga terlihat penurunan antar perlakuan

konsentrasi. Adanya kematian sel menunjukkan bahwa sampel (campuran

katekin gambir dengan eugenol) telah berinteraksi untuk menghambat

pertumbuhan sel HeLa.

70

Pengamatan kontrol sel yang menunjukkan adanya penurunan jumlah

sel setelah inkubasi dan perbandingan perlakuan sampel dengan kontrol

menunjukkan bahwa pada kontrol sel, masih ada aktifitas proliferasi pada sel

HeLa karena tidak ada yang menghambat. Sampel campuran katekin gambir

(Uncaria gambier, Roxb) menjadi faktor utama penghambat proliferasi sel

HeLa. Namun, adanya penurunan sel hidup pada kelompok kontrol inkubasi

maing-masing waktu dapat disebabkan karena jumlah sel yang terlalu banyak dan

sumber nutrisi yang tersedia semakin lama semakin menipis. Akibatnya sel

kanker HeLa kekurangan sumber nutrisi dan akhirnya sebagian sel mengalami

kematian.

Data doubling time selanjutnya dibuat profil hubungan antara

prosentase sel hidup dan waktu inkubasi. Slope dari persamaan ini

menggambarkan kinetika pertumbuhan sel HeLa dengan perlakuan sampel uji

(Grafik 1) dan cisplatin (Grafik 2).

Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan

proliferasi sel 50 % dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap

sel. Nilai ini merupakan patokan untuk melakukan uji pengamatan kinetika sel

(Meiyanto, 2002). Nilai IC50 menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai

sitostatik. Semakin besar harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik.

Pada penelitian ini sampel campuran katekin gambir (Uncaria gambier Roxb)

memiliki IC50 73.45 μg/mL (inkubasi 72 jam). Sementara pada sampel katekin

gambir sendiri (tanpa campuran), IC50 yang diperoleh pada inkubasi 72 jam

adalah 73.96 dan bernilai 144,880 µg/mL pada Eugenol.

71

Menurut garis panduan American National Cancer Institute (ANCI)

suatu ekstrak dikatakan mempunyai efek antiproliferasi yang signifikan apabila

nilai IC50 yang diperoleh ≤ 20 μg/mL. Adapun menurut Meiyanto et al. (2008)

Nilai IC50 dibawah 100 μg/mL menunjukkan adanya potensi ekstrak uji sebagai

agen kemoprevensi Dengan demikian campuran katekin gambir (Uncaria

gambier Roxb) dan eugenol dapat dikatakan berpotensi sebagai agen

kemoprevensi.

72

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Perlu dilakukan pemurnian katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dari

sampel.

2. Campuran senyawa eugenol dan isolat katekin gambir (Uncaria gambier

Roxb) dari fase etil asetat mempunyai aktivitas antiproliferatif (mampu

menghambat pertumbuhan sel kanker serviks/ HeLa cell line)

3. IC50 yang diperoleh dari sampel campuran ini pada masing-masing waktu

inkubasi 24, 48, dan 72 jam berturut-turut adalah 372.4 ppm, 178.24 ppm,

dan 73.45 ppm.

4. Pada inkubasi 72 jam dengan IC50 73.45 μg/mL, sampel campuran ini

berpotensi sebagai agen kemoprevensi.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengeni senyawa campuran

katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dengan Eugenol menggunakan sel

kanker lain atau sel yang sama dengan kombinasi senyawa campuran yang

berbeda.

73

DAFTAR PUSTAKA

Agoes, A. 1994. Catatan Kuliah Farmakologi I Laboratorium Farmakologi Fakultas

Kedokteran Universitas Sriwijaya. Jakarta: EGC

Agoes, Goeswin. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung: ITB

Alamsyah, A.N. 2006. Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau. Jakarta : penerbit

Agrimedia Pustaka

Alshatwi, Ali A,. 2010. Catechin Hydrate Suppresses MCF-7 Proliferation Through

TP53/Caspase-Mediated Apoptosis. Journal of experimental and Clinical

Cancer Research, 29:167, doi:10.1186/1756-9966-29-167. Diambil dari:

http://www.jeccr.com/content/29/1/167 diakses pada tanggal 30 Maret 2011

Amos. 2010. Kandungan Katekin Gambir Setra Produksi di Indonesia. Diambil dari:

http://www.bsn.or.id diakses pada tanggal 30 November 2011

Amos, I. Zainuddin., A. Triputranto dan B. Rusmandana. 2000. Peralatan

Pengolahan Gambir. Jakarta: Majalah BPPT

Anonim. Rendang tahan tengik berkat gambir. . Koran Jakarta. . 8 Mei 2011

Ansel, H.C. 1989. Pengatar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi 4. Jakarta: UI Press

Aparicio, Xochitl -Fernandez. 2006. Chemopreventive Activity of Polyphenolics from

Black Jamapa Bean (Phaseolus vulgaris L.) on HeLa and HaCaT Cells.

Journal of agricultural and food chemistry. (J. Agric. Food Chem. 2006, 54,

2116−2122)

Armenia, A., Siregar dan H. Arifin. 2004. Toksisitas Ekstrak Gambir (Uncaria

gambir Roxb) terhadap Organ Ginjal, Hati dan Jantung Mencit. Padang:

Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8

Sepetember 2004

Arundina, Ira., Soebagyo, Retno L., dan Setyari Y, Wisnu. 2003. Efek Antiinflamasi

Catechin Pada Marmut dengan Metode Pembentukan Oedema yang

Diinduksi Suspensi Karagenik. Laporan Penelitian Lembaga Penelitian

Universitas Airlangga.

ATCC. 2011. HeLa Cell. Diambil dari: http://www.atcc.org diakses pada tanggal 30

November 2011

Aziz, M.Farid. 2006. Onkologi Ginekologi Buku Acuan Nasional. Jakarta : Yayasan

Bina Pustaka Sarwana Prawirohardjo

74

Bachtiar, A. 1991. Manfaat Tanaman Gambir. Makalah Penataran Petani dan

Pedagang Pengumpul Gambir di Kecamatan Pangakalan Kab. 50 Kota, 29-

30 November 1991. Padang: FMIPA Unand

Baratawidjaya. 2004. Imunologi Dasar Edisi ke-6. Jakarta : Balai Penerbit Fakultas

Kedokteran Universitas Indonesia.

Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI. 1995. Penapisan Farmakologi, Pengujian

Fitokimia dan Pengujian Klinik Pengembangan dan Pemanfaatan Obat

Bahan Alam. Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI

Burkill, I.H. 1935. Dictionary of The Economic Product of Malay Peninsula. Kuala

Lumpur: Goverment of Malaysia and Singapore, PP 2196-2204

Cardellina II, J.H., Fuller, R.W., Gamble, W.R., Westergaard, C., Boswell, J.,

Munro, M.H.G. ,Currens, M. & Boyd, M.R., 1999. Evolving strategies for the

selection, dereplication and prioritization of antitumor and HIV-inhibitory

natural products extract. Dlm. Bohlin, L. & Bruhn, J.G. (pnyt.). Biossay

methods in natural product research and development. Dordrecht: Kluwer

Academic Publishers.

Cho, S.J, H.L. Valerie, S.H. Wu-Sing, K.Y. Sing, J.P. Pereira, and S.H Goh. 1998.

Novel Cytotoxic Polyprenilaterd Xanthones From Garcinia gaundichaudii

(Guttifeae), Tetrahedron, 54 (10915-10924).

Dalimartha, Setiawan. 2007. Deteksi dini kanker 7 simplisia antikanker. Jakarta :

Dirjen POM. Departemen kesehatan RI.

Dalimartha, Setiawan. 2001. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker.

Jakarta: Penebar Swadaya

Das, D.K. 1994. Naturally Occuring Flavonoids: Structure, Chemistry and High

Performance Chromatography Methods for Seperation and

Characterization. Methods in Enzymology, 234: 410-412

Departemen Kesehatan RI. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta: Dirjen

POM Departemen Kesehatan RI

Departemen Keseharan Repubik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia

Departemen Kesehatan RI. 1986. Sediaan Galenik. Jakarta: Badan Pengawasan Obat

dan Makanan

Departemen Kesehatan RI. 1989. Materia Medika Indonesia Jilid V. Jakarta: DepKes

RI

75

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum

Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan

Makanan. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional.

Departemen Farmakologi dan Terapeutik. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi V.

Jakarta: Fakultas Kedokteran

Desen, wan. 2008. Buku ajar onkologi klinis Edisi 2. Jakarta : Balai penerbit FKUI.

Dongmo, piere M. Jazet, et. Al,. 2007. Chemical Composition, Antiradical and

Antifungal Activities of Essential Oil of the Leaves of Cinnamomum

zelanycum Blume from Cameroon. Natural Product Communications I. 2

(12): 1287-1290

Eskinazi, Daniel. 1999. Botanical Medicine. United States of America : Mary Ann

Liebert Inc. Publisher

Errol, Norwitz dan John Schorge. 2007. At a Glance Obstetri dan Ginekologi.

Jakarta: EGC

Farnsworth, N.R. 1969. Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal

Pharmaceutical Science. 55 (3): 255-276

Fitrya dan Lenny Anwar. 2009. Uji Aktivitas Antikanker Secara In Vitro dengan Sel

Murine P-388 Senyawa Flavonoid dari Fraksi Etilasetat Akar Tumbuhan

Tunjuk Langit (Helmynthostachis zeylanica (Linn) Hook). Jurnal Penelitian

Sains Vol.12, No.1(C), (12106).

Freismoser, Florian M., Claude A. Jakob, Markus Aebi and Urs Tuor. 1999. The

MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide]

Assay Is a Fast and Reliable Method for Colorimetric Determination of

Fungal Cell Densities. Applied and Environmental Microbiology, p.3727-

3729. Vol 65, No.8. Diambil dari: http://aem.asm.org diakses pada tanggal

20 April 2011

Freimoser, Florian M. 1999. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

Diphenyltetrazolium Bromide] Assay Is a Fast and Reliable Method for

Colorimetric Determination of Fungal Cell Densities. American Society for

Microbiology. All Rights Reserved.

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture, A Practical Approach, 1st Ed.

Washington D.C : Oxford University Press.

Freshney, RI.. 1992. Animal cell culture practical approach. Second edition. Oxford

New York : Oxford University Press.

76

Ghosh, Rita et. al., 2005. Eugenol causes melanoma growth suppression through

inhibition of E2F1 activity. JBC Papers in Press. Published on January 18,

2005 as Manuscript M411429200

Globocan. 2008. Diambil dari: http://globocan.iarc.fr diakses pada tanggal 30

November 2011

Goodwin, E.C., DiMaio, D., 2000, Repression of human papillomavirus oncogenes

in Hela cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant

tumor suppressor pathways, Biochemistry, Vol.97, no.23.

Guevara BQ. 1985. Phytocemical microbiological and pharmacology cell screening

of the medicinal plants. Research Center University of Santo Thomas,

Philipines

Gunawan, 2004. Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta : Departemen Kesehatan

Republik Indonesia

Gunawijaya, F.A., Gandasentana R., dan Wahyudi K. 1999. Efek Pemberian Katekin

Teh Hijau Pada Pertumbuhan Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain GR.

Majalah Ilmu Fakultas Kedokteran Usakti Vol.18, No.2. Hal: 61-67

Hadad, E.A., N.R. Ahmadi, M. Herman, H. Supriadi dan A.M Hasibuan. 2007.

Teknologi Budidaya dan Pengolahan Hasil Gambir. Diambil dari:

http://balittri.litbang.go.id diakses pada tanggal 22 April 2011

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Bandung : Penerbit ITB

Hartoyo, A. 2003. Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit

Kanisius

Haryanto, Sugeng. 2009. Ensiklopedi Tanaman Obat Indonesia. Yogyakarta: Pallmal

Hasanah, Uswatun. 2006. Uji sitotoksitas Ekstrak Etanol Biji Mimba (Azadirachta

Indica A. Juss) terhadap sel HeLa secara in vitro. Skripsi. FMIPA.

UHAMKA

Hayani, Eni. 2003. Analisis kadan catechin dari gambir dengan berbagai metode.

Bulletin teknik pertanian Vol. 8 No. 1

Hirasawa, Masatomo., and Takada, Kazuko. 2004. Multiple Effects of Green Tea

Catechin on The Antifungal Activity of Antimycotics Against Candida

Albicans. Journal of Antimicrobial Chemotheraphy 53, 225-229. Diambil

dari: www.jac.oxfordjournals.org diakses pada tanggal 22 Juni 2011.

Hutapea & JR. 1991. Inventaris tanaman obat Indonesia. Jilid I. Jakarta :

Departemen Kesehatan Republik Indonesia

77

Hukmah, Sho’irotul. 2007. Skripsi: Aktivitas Antioksidan Katekin dari Teh Hijau

(Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast))Hasil Ekstraksi dengan

Variasi Pelarut dan Suhu. Malang: Jurusan Kimia Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Islam Negeri Malang.

Jaganathan, 2010. Effect of Honey and Eugenol on Ehrlich Ascites and Solid

Carcinoma. Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2010,

Article ID 989163. Hindawi Publishing Corporation

Jaganathan, Savarana Kumar. 2010. Apoptotic effect of eugenol in human colon

cancer cell lines. Cell Biology International Immediate Publication.

Published on 02 Nov 2010 as manuscript CBI20100118

Karsono. 2009. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: Interna Publishing

Kasim, A. 2004. Peluang dan Tantangan Pemanfaatan Gambir Sebagai Bahan Baku

Perekat Pada Industi Kayu Lapis dan Papan Partikel. Padang: Seminar

Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8

Sepetember 2004

Katzung, Betram G. 2001. Farmakologi Dasar dan Klinik. Buku 3 edisi 8. Jakarta :

Penerbit Salemba Medikamalole, M.B.M. 1990. Kultur sel dan jaringan

hewan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral

Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Institut Pertanian

Bogor

Kim, Gyoo Cheon, dkk. 2006. Caspases-dependent Apoptosis in Human Melanoma

Cell by Eugenol. The Korean Journal Anatomy. Hal 245-253.

Kozai, K., M. Soto, M. Yamaguchi, N. Nagasaka and S. Pradopo. 1995. Potential of

Gambir as an Inhibitor of Dental Plaque Formation. Dent, 5 Vol. 28 No.3,

95-96

Kusharyono. 2004. Efek Infus Gambir (Uncaria gambir Roxb) yang Diperoleh dari

Pasar terhadap Sistem Syaraf Otonom Mencit Jantan. Padang: Seminar

Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI. Tanggal 7-8

Sepetember 2004

Lucida, H. 2006. Determination of The Ionization Constants and The Stability of

Catechin from Gambir (Uncaria gambir Roxb). Padang: ASOPMS 12

International Conference

Lucida, Henny., Amri Bakhtiar dan Wina Astari Putri. 2007. Formulasi Sediaan

Antiseptik Mulut dari Katekin Gambir. Padang: FMIPA Universitas Andalas.

Jurnal Sains Teknogi Farmasi 12 (1). Diambil dari: http://farmasi.unand.acid

diakses pada tanggal 30 november 2011

78

Malole, MBM. 1990. Kultur Sel dan Jaringan Hewan. Bogor: Institut Pertanian

Bogor

Manopo, J. L. 2008. Isolasi Eugenol dari Bunga Cengkeh. Skripsi. Ambon:

Universitas Kristen Ambon.

Mary dan Pamela, 2001; Departemen Farmakologi dan terapi, 2008).

Meiyanto, Edi., Ratna Asmah Susidarti, Sri Handayani dan Fitria Rahmi. 2008.

Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat

Proliferasi dan Memacu Apoptosis Sel MCF-7. Majalah Farmasi Indonesia,

19(1), 12-19.

Miller, Gregg. 2008. Pencegahan dan Pengobatan Penyakit Kanker. Jakarta: PT.

Pustakaraya

Min Song, Jae., Kwang Hee Lee, and Baik Lin Seong. 2005. Antiviral Effect of

Catechins in Green Tea on Influenza Virus. Antiviral Research Vol.68, 66-

74. Diambil dari: www.sciencedirect.com pada tanggal 24 Mei 2011

Minagawa, Yukihisa., Junzo Kigawa, Hiroaki Itamochi, Yasunobu Kanamori,

Muneaki Shimada, Masakuni Takahashi and Naoki Terakawa. 1999.

Cisplatin-resistant HeLa Cells are Resistant to Apoptosis via p53-dependent

and –independent pathways. Jpn. J. Cancer Res. 90. 1373-1379

Mosmann, Tim. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:

Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal

oflmmunologicalMethods, 65 (1983) 55-63 55 Elsevier

Muchtar, Hendri., Yusmeiarti dan Gustri Yeni. 2008. Pengaruh Jenis Absorban

Dalam Proses Isolasi Katechin Gambir. Jurnal Riset Industri Vol.2, No.1:

14-23

Nafrialdi & Gan, Sulistia. 1995. Farmakologi & terapi edisi IV. Jakarta : FKUI

Nazir, M. 2000. Gambir: Budidaya, Pengolahan dan Prospek Diverifikasinya.

Padang: Yayasan Hutanku

Nugroho, Agung Endro. 2009. Efek sitotoksik dan antiproliferasi dari gamavuton-0

pada kultur sel leukemia basofilik tikus. Majalah farmasi Indonesia

Ogata, Masahiro, et. Al. 1997. Antioxidant Activity f Magnolol, Honokiol, and

Related Phenolic Coumpounds. JAOCS. 74: 557-562

P. Seraam, Navindra. 2003. Inhibition of Proliferation of Human Cancer Cells and

Cyclooxygenase Enzymes by Anthocyanidins and Catechins.

79

Parameter Umum Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, 2000; Buku panduan

Teknologi Ekstrak,

Prijono, J. 1988. Pengujian Insektisida. Bogor : Fakultas Pertanian IPB

Qiao, Yanyan., Jinyan cao, Liangqun Xie and Xiaolin Shi. 2009. Cell Growth

Inhibition and Gene Expression Regulation by (-)-Epigallocatechin-3-

Gallate in Human Cervical Cancer Cells. Arch Pharm Res Vol 32, No 9,

Radde, Ingeborg C. 1999. Farmakologi Terapi dan Pediatri Edisi II. Jakarta :

Hipokrates.

Rahayuningsih, C., T.E. Basjir dan Y. Warastuti. 2004. Uji Ekstrak Daun Gambir

(Uncaria gambir Roxb) Awet Radiasi terhadap Kemampuannya Sebagai

Anti Mikroba. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat,

Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004

Rasjidi, Imam. 2007. Panduan Penatalaksanaan Kanker Ginekologi Berdasarkan

Evidence Base. Jakarta : EGC

Risfaheri dan L. Yanti. 1993. Pengaruh Ketuaan dan Penanganan Daun Sebelum

Pengempaan terhadap Rendemen dan Mutu Gambir. Buletin Penelitian

Rempah dan Obat 8 (1): 46-51

Robbins dan Kumar. 1999. Buku Ajar Patologi I Edisi IV. Jakarta

Robinson, T. 1995. Kandungan Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi. Diterjemahkan

oleh Prof. Dr. Kosasih Padmawirata. Bandung: ITB

Ruddon, Raymond W. 2007. Cancer Biology Fourth Edition NewYork : Oxford

University Press

Sadava, David., Elizabeth Whitlock, and Susan E. Kane,. 2007. The Green Tea

Polyphenol, Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Telomerase and Induces

Apoptosis in Drug-Resistant Lung Cancer Cells. Biochemical and

Biophysical Research Communications 360 (2007), 233-237. Diambil dari:

http://www.sciencedirect.com diakses pada tanggal 29 April 2011

Sait, S., A. Sudibyo dan E.H. Loebis. 1987. Penelitian Pengolahan Getah Gambir.

Balai Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian Bogor: Proyek

Penelitian dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian.

Seeram, P. Navindra., Yanjun Zhang and Muraleedharan G. Nair. 2003. Inhibition of

Proliferative of Human Cancer Cell and Cyclooxigenase Enzymes by

Anthocyanidins and Catechins. Nutrition and Cancer, 46 (1): 101-106.

80

Diambil dari: http://www.encognitive.com diakses pada tanggal 29 April

2011

Shanie, M., V. Hosiana dan A. Bakhtiar. 2004. Formulasi Shampo Gambir Murni.

Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan Tanaman Obat Indonesia XXVI.

Tanggal 7-8 Sepetember 2004

Sieuwerts, Anieta M. 1995. The MTT Tetrazolium Salt Assay Scrutinized: How to

Use this Assay Reliably to Measure Metabolic Activity of Cell Cultures in

vitro for the Assessment of Growth Characteristics, IC50-Values and Cell

Survival. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33:813-823

Sigma. 2011. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Formulations. Diambil

dari: http://www.sigmaaldrich.com diakses pada tanggal 01 Oktober 2011

Siswandono dan Bambang Soekarjo. 2000. Kimia Medisinal Edisi II. Surabaya:

Universitas Airlangga press

Sudjarwo, Sri Agus. 2004. Protective Effect of Catechin on Endothelial Cell in

Hypercholesterolemia. Journal kedokteran Trisakti, Vol.23, No. 1: 1-5.

Diambil dari: http://isjd.pdii.lipi.go.id diakses pada tanggal 25 Mei 2011.

Suherdi, A., Denian dan H. Syamsu. 1991. Budidaya dan Pasca Panen Gambir serta

Permasalahannya. Biro Bina Pengembangan. Sarana Perekonomian, Dati I

Sumbar, Padang

Sukati, K., dan Kusharyono. 2004. Efek Infus Gambir (Uncaria gambir Roxb) yang

Diperoleh dari Pasar terhadap Parameter Onset dan Durasi Waktu Tidur

Tiopental Pada Mencit Jantan. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan

Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004

Sukardiman. 1999. Paduan Senyawa Aktif Kunyit dan Sambiloto Sebagai Antikanker.

Surabaya: Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

Sukardja, I Dewa Gede. 2000.Onkologi Klinik edisi 2. Surabaya : Airlangga

University Press

Tedjo, Aryo., Dondin Sajuthi dan Latifah K. Darusman. 2005. Aktivitas

Kemoprevensi Ekstrak Temu Mangga. Jurnal Kesehatan, Vol.9, No.2 : 57-62

The Merck Index. 2006. An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, 14th

ed. Merck and Co Inc, Pathway W.J.USA.

Thorpe, J.F., and Whiteley M.A. 1921. Thorpe’s Dictionary of Applied Chemistry,

Fourth Edition, Vol.II. London: Longman, Green and Co, 434-438

81

Tika, F.H., H. Mukhtar dan A. Bakhtiar. 2004. Efek Katekin dari Gambir terhadap

Tukak Lambung Tikus Putih Betina. Padang: Seminar Nasional, Tumbuhan

Tanaman Obat, Indonesia XXVI. Tanggal 7-8 September 2004

Tjay. 2007. Obat-obat penting. Jakarta : Elex Media Komputindo

Tsuchiya, Hironori., Toshiyuki Tanaka and Motohiko Nagayama. 2008.

Antiproliferative Effects Assosiated with Membrane Lipid Interaction of

Green Tea Catechins. Journal of Health Science 54 (5): 576-580. Diambil

dari: http://jhs.pharm.or.ip diakses pada tanggal 29 April 2011

Utami, Dwi. 2007. Sintesis senyawa Kalkon dan turunannya serta uji antiproliferasi

terhadap sel HeLa. Thesis. Universitas Gadjah Mada

Wagner, H. 1985. Immunostimulants from Medicinal Plants. In Advances in Chines

Medicinal Material Research (Eds.) H.M Chang; H.w. Yeung; W.W. Tso

and A. Koo. World Scintific Publ. Co. Singapura: 159-170

Wazzan, Khalid A. Al, Ali A. Al_ Harbi dan Ihab A. Hammad. 1997. The effect of

Eugenol-Containing Temporary Cemment on The Bond Strength of Two

Resin Composite Core Materials to Dentin. Journal of Prostodhontic. 6 (1):

37-42

Wattemberg LW. 1992. Inhibition of Carcinogenesis by Minor Dietary Constituents.

Cancer Res. 52: 2085-2087

WHO. 1998. Quality Control of Methods for Medicinal Plants Material.

Switzerland: Geneva

Yoshino et al. 1996. Antimicrobial Activity of Tea Extracts on Cariogenic Bacterium

(Streptococcus mutans). J. Food hyg. Soc. Japan Vol. 37, No.2: 104-108.

Diambil dari: http://rms1.agsearch.agropedia.affrc.go diakses pada tanggal

22 Mei 2011.

Zwavelling, A., R.J. Van Zonneveld dan A. Schaberg. 1985. Onkologi. Jakarta: Balai

Pustaka

82

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi Gambir

83

Lampiran2. Sertifikasi Eugenol

84

Lampiran 3. Sertifikat Kemurnian Katekin Standar

85

Gambar 5. Bongkah

Gambir (Uncaria

gambier Roxb)

Gambar 4. Eugenol

Lampiran 4. Eugenol, Gambir(Uncaria gambier Roxb), dan Katekin

Gambar 6.

Serbuk Gambir

Gambar 7.

Hasil Identifikasi

Gambir

Gambar 8. Hasil

Uji Cemaran Urea

Gambar 9.

Serbuk Katekin

Sampel

Gambar 10.

Serbuk Katekin

Standar

86

Lampiran 5. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia

a. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia Serbuk Gambir

Tabel 9. Hasil Pengamatan Penapisan Fitokimia Serbuk Gambir

Golongan Hasil Pengamatan

1. Flavonoid + Filtrat ditambahkan serbuk Zn, HCl P,

amilalkohol,dikocok kuat, didiamkan hingga

memisah. Hasilnya terbentuk warna coklat dalam

amilalkohol.

2. Tanin + Pada filtrat terbentuk warna hijau tua setelah

diteteskan FeCl3 1%.

3. Alkaloid + 1. Pada filtrat terbentuk endapan merah bata setelah

ditambahkan pereaksi Dragendorf.

2. Terbentuk endapan putih pada filtrat setelah

diteteskan pereaksi Meyer.

4. Saponin + Pada filtrat terbentuk buih setelah dikocok kuat dan

buih tetap stabil setelah ditaeteskan HCl 2N

5. Kuinon + Terbentuk warna merah pada filtrat setelah diteteskan

peraksi NaOH 1N

6. Steroid dan

Triterpenoid

- Tidak adanya perubahan warna pada residu setelah

penambahan pereaksi asam asetat anhidrat dan asam

sulfat pekat.

7. Minyak

Atsiri

- Tidak adanya bau aromatis pada residu yang telah

diuapkan.

87

Lampiran 6. Hasil Pengujian Karakteristik Katekin

a. Penetapan Kadar Air

- Berat botol kosong sebelum dikeringkan = 24.5662 gram

- Berat botol kosong setelah dikeringkan = 24.5592 gram

- Berat botol + katekin sebelum dikeringkan (W0) = 25.5644 gram

- Berat botol + katekin setelah dikeringkan (W1) = 25.5532 gram

Susut pengeringan = 𝑊0−𝑊1

𝑊0 𝑥 100%

= 25.5644−25.5532

25.5644 𝑥 100%

= 0.044%

Maka, susut pengeringan katekin adalah sebesar 0.044%

b. Penetapan Kadar Abu

- Berat cawan kosong sebelum dikeringkan = 19.0531 gram

- Berat cawan kosong setelah dikeringkan = 19.0379 gram

- Berat cawan + katekin sebelum dikeringkan (W0) = 20.0400 gram

- Berat cawan + katekin setelah dikeringkan (W1) = 20.0259 gram

Kadar abu = 𝑊0−𝑊1

𝑊0 𝑥 100%

= 20.0400 −20.0259

20.0400 𝑥 100%

= 0.070%

Maka, kadar abu katekin adalah 0.070%

88

Lampiran 7. Lanjutan

c. Penetapan Rendemen

- Bobot serbuk katekin yang diperoleh = 309.37 gram

- Bobot serbuk gambir yang diekstraksi = 500.29 gram

Rendemen = % kemurnian x Bobot serbuk katekin

Bobot serbuk gambir di ekstraksi

= 79.73% x 309.37

500.29 = 49.30 %

Maka, persentase rendemen katekin adalah 49.30 %

89

Lampiran 8. Hasil Penetapan Kadar Katekin

1. Hasil Absorbansi standar katekin

Berdasarkan data absorbansi dan konsentrasi standar katekin di atas, diperoleh

nilai :

A = -0,0274 B = 3,1757R = 0,9514

Perhitungan konsentrasi standar : y = a + bx

1. 0,013 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0127

2. 0,045 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0228

3. 0,088 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0363

4. 0,152 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0565

5. 0,173 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0631

2. Hasil absorbansi katekin sampel

90

Perhitungan konsentrasi sampel : y = a + bx

1. 0,002 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 9,2578 x 10-3

2. 0,035 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0196

3. 0,067 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0297

4. 0,108 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0426

5. 0,138 = -0,0274 + 3,1757 x

x = 0,0521

Tabel 10. Perhitungan Persentase Kadar Katekin Sampel

No Konsentrasi

standar

Konsentrasi

sampel

Persentase kadar (%)

1 0,0127 9,2578 x 10-3

9,2578 x 10-3

/ 0,0127 = 72,90

2 0,0228 0,0196 0,0196 / 0,0228 = 85,96

3 0,0363 0,0297 0,0297 /0,0363 = 81,82

4 0,0565 0,0426 0,0426 / 0,0565 = 75,40

5 0,0631 0,0521 0,0521 / 0,0631 = 82,57

𝑋 = 72.89% + 85.96% + 81.82% + 75.40% + 82.57%

5= 79.73%

91

Lampiran 9. Skema Proses Pembuatan Katekin Gambir (Uncaria gambierRoxb)

Bongkahan Gambir

(Uncaria gambier Roxb)

Di tumbuk halus hingga menjadi serbuk

Serbuk di re-ekstraksi infusa dengan pelarut

aquades pada 90-960C selama 15-20 menit

Ekstrak gambir

Partisi dengan etil asetat (filtrat:etil asetat = 1:½), ditambahkan NaCl hingga

jenuh dilakukan hingga 5 kali

Fase air

dipisahkan

Fase etil asetat

dikumpulkan

Dipekatkan dengan

rotary evaporator

pada suhu 500C

Serbuk

katekin

gambir

Dipartisi kembali dengan etil

asetat (berulang-ulang)

Ekstrak kental dilarutkan

dalam air dingin bagian tidak

larut (Katekin)

Disaring dengan

kertas saring

Dikeringkan

dengan oven

50oC

Penetapan kadar

katekin

Sortasi kering dan

penggilingan

Peyaringan

Fase air

dibuang

Uji efek antiproliferatif

92

Lampiran 10.Skema Kerja Kultivasi Sel HeLa

Thawing di water bath pada suhu 370C

Pindahkan sel ke Flask yang sudah

berisi medium. (Sebelum larutan dalam

cryo vial mencair semua )

Media Kultur + 10% FBS

Inkubasi pada inkubator (suhu 370C,

CO2 5%) hingga sel menempel pada

dasar flask (± 4-24 jam)

Sel diamati jika sel sudah menempel,

buang medium, cuci dengan PBS 1X (1-

2x), lalu ganti dengan medium baru.

Setelah itu sel diamati lagi dengan

mikroskop

Inkubasi pada inkubator (suhu

370C, CO2 5%) hingga sel mencapai

kerapatan 70-80%

Sel disubkultur apabila kerapatan

mencapai 70-80% dari permukaan flask

Sel dalam cryo vial

93

Lampiran 11.Skema Kerja Subkultivasi Sel HeLa

Sel HeLa hasil kultivasi didalam T-flask

Sel diamati , buang medium, cuci dengan PBS 1X

(1-2x), Menambahkan Trypsin EDTA 400 µL +

PBS 5400 µL

Inkubasi dalam inkubator (suhu 370C, CO2 5%)

selama ± 3 menit

Tambahkan medium kultur DMEM berserum

(900 µL)

Centrifuge 1000 rpm ± 5 menit

Endapan disimpan dalam

cryo vial

Endapan

dimasukkan

kedalam cuvet

Endapan dimasukkan ke

T-flask ,dikultur kembali

Kerapatan sel dihitung dengan Haemocytometer dibawah

mikroskop inverted

+ Trypan blue 50 µL

Rasio sel 5x103 sel/100 µL

Didekantasi, endapan diambil

94

Lampiran 12. Uji MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yI]-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide)

Suspensi sel dalam DMEM berserum dimasukkan

ke dalam tiap sumuran sebanyak 100 µL

+ 100 µL perlakuan dimasukkan

ke dalam tiap sumuran

Diinkubasi dalam inkubator CO2 pada

suhu 37oC selama 24, 48 dan 72 jam

Hasil inkubasi sel dalam sumuran

ditambahkan 10 µL MTT

Diinkubasi dalam inkubator CO2

pada suhu 37oC selama 4 jam

Hasil inkubasi sel dalam sumuran

Sel dihitung dengan ELISA

reader pada panjang gelombang

490 dan 630 nm

+ 50 µL SDS 10% ke dalam tiap

sumuran dan diinkubasi dalam

ruang gelap selama 16 jam

95

Lampiran 13.Perhitungan Konsentrasi Sampel (Campuran Katekin dan Eugenol)

- Sebanyak masing-masing 125 mg katekin dan eugenol ditimbang dan

dimasukkan ke dalam mikro tube. (total : 250 mg)

- Ditambahkan 5000 µL DMSO 99.9% disentrifuge

250 𝑚𝑔

5 𝑚𝐿 =

250000 µ𝑔

5000 µ𝐿

= 50 µ𝑔/µ𝐿

= 50000 µ𝑔/𝑚𝐿

= 50000 µg/mL (larutan induk 1)

- Larutan induk 1 diencerkan hingga 10 kali

Rumus pengenceran pada masing-masing konsentrasi

𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2

Keterangan : V1 = Volume yang digunakan (µL)

N1 = Konsentrasi larutan induk (µg/mL)

V2 = Total volume larutan yang dibuat (µL)

N2 = Konsentrasi larutan sampel (µg/mL)

Maka:

𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2

V1 x 50000 µg/mL = 10000 µL x 5000 µg/mL

V1 = 10000 𝜇𝐿×5000 µg /mL

50000 µg /mL

V1 = 1000 µL + aquadest ad 10000 µL

96

Lampiran 14. Lanjutan

Sebanyak 1000 µL larutan induk 1 dipipet lalu diencerkan dengan penambahan

aquadest hingga 10000 µL

Contoh perhitungan pengenceran dari larutan induk 2

- Pembuatan konsentrasi 200 µg/mL

𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2

V1 x 5000 µg/mL = 1500 µL x 200 µg/mL

V1 = 1500 µ𝐿 × 200 µg /mL

5000 µg /mL

V1 = 60 µL

50000 µg/mL (larutan induk

1)

1000 µL larutan induk 1 dipipet

+ aquadest sebanyak 10000 µL

5000 µg/mL (larutan induk 2)

97

Lampiran 15.Lanjutan

Tabel 11. Hasil Perhitungan Konsentrasi Sampel

(*) : Pengenceran dilakukan menggunakan konsentrasi 100 µg/mL sebagai larutan

induk.

Konsentrasi

Larutan Induk

(N1)

( µg/mL )

Konsentrasi

Larutan Sampel

(N2)

( µg/mL )

Volume yang

Digunakan

(V1)

(µL)

Total volume

Larutan yang Dibuat

(V2)

(µL)

5000

200 60

1500

100 30

50 15

25 37.5*

12.5 187.5*

6.25 93.8*

3.125 46.88*

98

Lampiran 16.Perhitungan Konsentrasi Cisplatin

Larutan induk I = 500 µg/mL (10 mg/20 mL)

Larutan induk II (50 µg/mL) =5000 𝜇𝐿 ×50 µg /mL

500 µg /mL = 500 𝜇𝐿 +aq. ad 5000 µL

Volume Cisplatin yang akan dibuat tiap konsentrasi = 1000 µL

Contoh perhitungan konsentrasi Cisplatin:

- Pembuatan konsentrasi 3 µg/mL

𝑉1.𝑁1 = 𝑉2.𝑁2

V1 x 50 µg/mL = 1000 µL x 3 µg/mL

V1 = 1000 𝜇𝐿×3 µg/mL

50 µg/mL

V1 = 60 µL + aquadest ad 1000 µL

Konsentrasi

Larutan Induk

(N1)

(µg/mL)

Konsentrasi

Larutan Sampel

(N2)

(µg/mL)

Volume yang

Digunakan

(V1)

(µL)

Total volume

Larutan yang Dibuat

(V2)

(µL)

50

1.5 30

1000

3 60

4.5 90

6 120

7.5 150

18-9 180

Tabel 12. Hasil Perhitungan Konsentrasi Cisplatin

99

Lampiran 17.Perhitungan Kepadatan Sel

Kepadatan sel dihitung menggunakan Haemocytometer dengan cara

menghitung 25 bilik kecil pada Haemocytometer.

Maka, 151 x 104 = 1.51 x 10

6 sel/mL

Artinya: didalam 1 mL mengandung sel sebanyak 1.51 x 106 sel

Syarat jumlah sel dalam setiap sumuran adalah 5 x 103 sel

Maka: Σ sel x V sel yang diambil = syarat sel/sumuranx V yang dibuat

1.51 x 106 sel/mL x V = 5 x 10

3 sel/sumuran x 1000 µL

V = 5 ×103sel /sumuran ×1000 μL

1.51×106sel /mL

= 3.31 µL sel HeLa/sumuran

Jumlah sumuran yang digunakan adalah sebanyak 90 sumuran

Maka:

Σ sel/sumuran x Σ sumuran yang digunakan = 3.31 µL sel x 90 sumuran

= 297.9 µL sel ≈ 298 µL sel

Jumlah DMEM berserum =100 μL/sumuran x 90 sumuran = 9000 μL = 9 mL

Maka didalam tabung conical steril berisi:

298 µL sel + DMEM berserum ad 9 mL

Kemudian dipipetkan sebanyak 100 μL ke dalam masing-masing sumuran.

100

Lampiran 18.Skema Pemetaan Pada Sumuran 96

Keterangan Gambar:

Kontrol (-)

Sumuran A1, 2, 3 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.4%

Sumuran A4, 5, 6 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.2%

Sumuran A7, 8, 9 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.1%

Sumuran A10, 11, 12 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.05%

Sumuran B1,C1,D1 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.025%

Sumuran E1,F1,G1 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.0125%

Sumuran B12,C12,D12 : suspensi sel + DMSO konsentrasi 0.00625%

Sumuran E12,F12,G12 : 200 µL DMEM berserum

Sumuran H1, 2, 3, 4, 5, 6 : suspensi sel + DMEM berserum (blanko)

Kontrol (+)

Sumuran B9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 1.5 µg/mL

Sumuran C9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 3 µg/mL

Sumuran D9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 4.5 µg/mL

101

Lanjutan

Sumuran E9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 6 µg/mL

Sumuran F9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 7.5 µg/mL

Sumuran G9, 10, 11 : suspensi sel + cisplatin konsentrasi 9 µg/mL

Sampel (Katekin + Eugenol)

Sumuran E2, F2,G2 : suspensi sel+ sampel konsentrasi 3.125 µg/mL

Sumuran E3,F3,G3 : suspensi sel+ sampel konsentrasi 6.25 µg/mL

Sumuran E4, F4,G4 : suspensi sel+ sampel konsentrasi 12.5 µg/mL

Sumuran E5, F5,G5 : suspensi sel + sampel konsentrasi 25 µg/mL

Sumuran E6, F6,G6 : suspensi sel + sampel konsentrasi 50 µg/mL

Sumuran E7, F7,G7 : suspensi sel + sampel konsentrasi 100 µg/mL

Sumuran E8, F8,G8 : suspensi sel + sampel konsentrasi 200 µg/mL

102

Lampiran 19. Perhitungan dan Grafik IC50 campuran katekin gambir dan Eugenol

terhadap HeLa Cell Line

DMSO Campuran Katekin

Gambir dan Eugenol %

Hidup

%

Inhibisi

Log

Kons Probit Kons

(%) Data 𝑥

Kons

(µg/

mL)

Data 𝑥

24 Jam

0.00625 0.497 0.427 0.420 0.463 3.125 0.547 0.397 0.347 0.430 92.87 7.13 0.495 3.5316

0.0125 0.438 0.487 0.491 0.472 6.25 0.420 0.403 0.390 0.404 85.59 14.41 0.796 3.9375

0.025 0.425 0.499 0.507 0.477 12.5 0.442 0.437 0.327 0.402 84.28 15.72 1.097 3.9931

0.05 0.471 0.469 0.457 0.464 25 0.400 0.343 0.314 0.352 74.55 25.45 1.398 4.3380

0.1 0.429 0.467 0.478 0.458 50 0.348 0.324 0.331 0.334 72.93 27.07 1.669 4.3872

0.2 0.446 0.453 0.454 0.451 100 0.346 0.310 0.285 0.314 69.62 30.38 2 4.4842

0.4 0.427 0.461 0.456 0.448 200 0.317 0.262 0.148 0.242 54.02 45.98 2.301 4.8970

4 8 J a m

0.00625 0.366 0.304 0.403 0.358 3.125 0.391 0.360 0.208 0.320 89.39 10.61 0.495 3.7519

0.0125 0.250 0.484 0.597 0.444 6.25 0.350 0.312 0.287 0.316 71.17 28.83 0.796 4.4408

0.025 0.529 0.480 0.272 0.427 12.5 0.300 0.296 0.288 0.295 70.53 29.47 1.097 4.4583

0.05 0.456 0.332 0.307 0.365 25 0.346 0.156 0.239 0.247 67.67 32.33 1.398 4.5407

0.1 0.327 0.332 0.326 0.328 50 0.234 0.209 0.205 0.216 65.85 34.15 1.669 4.5903

0.2 0.343 0.321 0.341 0.335 100 0.218 0.180 0.161 0.186 55.52 44.48 2 4.8592

0.4 0.314 0.349 0.330 0.331 200 0.200 0.162 0.130 0.164 49.55 50.45 2.301 5.0100

7 2 Jam

0.00625 0.285 0.275 0.487 0.349 3.125 0.320 0.293 0.269 0.294 84.24 15.76 0.495 3.9931

0.0125 0.340 0.297 0.266 0.301 6.25 0.257 0.195 0.187 0.213 70.76 29.24 0.796 4.4524

0.025 0.247 0.364 0.232 0.281 12.5 0.260 0.171 0.145 0.192 68.33 31.67 1.097 4.5230

0.05 0.253 0.261 0.275 0.263 25 0.172 0.170 0.150 0.164 62.36 37.64 1.398 4.6840

0.1 0.274 0.246 0.257 0.259 50 0.150 0.141 0.132 0.141 54.45 45.55 1.669 4.8870

0.2 0.282 0.228 0.243 0.251 100 0.201 0.095 0.067 0.121 48.21 51.79 2 5.0426

0.4 0.231 0.242 0.226 0.247 200 0.139 0.092 0.044 0.092 38.17 61.83 2.301 5.3002

Tabel 13. Data Hasil Efek Antiproliferatif Eugenol dengan Katekin

terhadap Sel HeLa dalam Interval Waktu Inkubasi

103

Contoh perhitungan % Inhibisi dan % Hidup Konsentrasi 3.125 µg/mL Pada

24 Jam:

%Inhibisi = AbsDMSO − AbsSampel

AbsDMSO× 100%

= 0.463−0.430

0.463× 100%

= 7.13%

%Hidup = 100% - 7.13% = 92.87%

D. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb)

dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 24 Jam

a = 3.298 Maka: y = a + bx

b = 0.662 y = 3.298 + 0.662x

r = 0.973 5 = 3.298 + 0.662x

x = 2.571

IC50 = Antilog x

= Antilog 2.571

= 372.4 µg/mL

E. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb)

dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 48 Jam

a = 3.735 Maka: y = a + bx

b = 0.562 y = 3.735 + 0.562x

r = 0.914 5 = 3.735 + 0.562x

x = 2.251

IC50 = Antilog x

= Antilog 2.251

= 178.24 µg/mL

104

F. Perhitungan IC50 Campuran Katekin Gambir (Uncaria gambier Roxb)

dan Eugenol Pada Waktu Inkubasi 72 Jam

a = 3.791 Maka: y = a + bx

b = 0.648 y = 3.791 + 0.648x

r = 0.983 5 = 3.791 + 0.648x

x = 1.866

IC50 = Antilog x

= Antilog 1.866

= 73.45 µg/mL

105

Lampiran 20. Perhitungan dan Grafik IC50 Cisplatin terhadap HeLa Cell Line

Medium

dan Sel

Cisplatin %

Hidup

%

Inhibisi

Log

konsentrasi Probit Konsentrasi

(µg/mL) Data 𝑋

24 Jam 1.5 0.387 0.264 0.256 0.302 63.05 36.95 0.176 4.6681

0.423

0.451

0.563

3 0.279 0.373 0.241 0.279 58.25 41.75 0.447 4.7930

4.5 0.234 0.258 0.255 0.378 51.98 48.02 0.653 4.9408

6 0.273 0.182 0.219 0.225 46.97 53.03 0.778 5.0753

𝑥 =

0.479

7.5 0.256 0.194 0.140 0.197 41.13 58.87 0.875 5.2250

9 0.230 0.071 0.159 0.166 34.66 65.34 0.954 5.3934

48 Jam 1.5 0.338 0.303 0.247 0.296 57.70 42.30 0.176 4.8058

0.482

0.521

0.536

3 0.232 0.219 0.321 0.257 50.1 49.90 0.447 4.9975

4.5 0.217 0.224 0.300 0.247 48.15 51.85 0.653 5.0476

6 0.220 0.217 0.215 0.217 42.30 57.70 0.778 5.1942

𝑥 =

0.513

7.5 0.161 0.210 0.166 0.179 34.88 65.12 0.875 5.3880

9 0.128 0.140 0.090 0.119 23.2 76.80 0.954 5.7323

72 Jam 1.5 0.204 0.288 0.272 0.255 47.05 52.95 0.176 5.0753

0.557

0.528

0.541

3 0.261 0.160 0.223 0.215 39.67 60.33 0.447 5.2611

4.5 0.192 0.221 0.181 0.198 36.53 63.47 0.653 5.3451

6 0.167 0.141 0.123 0.144 29.89 70.11 0.778 5.5273

𝑥 =

0.542

7.5 0.105 0.096 0.103 0.101 18.63 81.37 0.875 5.8927

9 0.081 0.085 0.094 0.087 16.05 83.95 0.954 5.9945

Tabel 14. Data Hasil Efek Antiproliferatif Cisplatin terhadap Sel HeLa

dalam Interval Waktu Inkubasi

Contoh perhitungan % Inhibisi dan % Hidup Konsentrasi 1.5 µg/mL Pada 24

Jam:

%Inhibisi = AbsBlanko − AbsCisplatin

AbsBlanko× 100%

= 0.479−0.302

0.479× 100% = 36.95%

%Hidup = 100% - 36.95%= 63.05%

106

G. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 24 Jam

a = 4.429 Maka: y = a + bx

b = 0.900 y = 4.429 + 0.900x

r = 0.957 5 = 4.429 + 0.900x

x = 0.634

IC50 = Antilog x

= Antilog 0.634

= 4.305 µg/mL

H. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 48 Jam

a = 4.525 Maka: y = a + bx

b = 1.026 y = 4.525 + 1.026x

r = 0.900 5 = 4.525 + 1.026x

x = 0.463

IC50 = Antilog x

= Antilog 0.463

= 2.904 µg/mL

I. Perhitungan IC50 Cisplatin Pada Waktu Inkubasi 72 Jam

a = 4.753 Maka: y = a + bx

b = 1.169 y = 4.753 + 1.169x

r = 0.927 5 = 4.753 + 1.169x

x = 0.211

IC50 = Antilog x

= Antilog 0.211

= 1.626 µg/mL

107

Lampiran 21. Haemocytometer

Gambar 11. Alat Haemocytometer

Gambar 12. Pemetaan Haemocytometer

108

Lampiran 22.Alat dan Bahan yang Digunakan Dalam Penelitian

A. Alat

Gambar 13.

Biology Safety

Cabinet

Gambar 14.

Inkubator CO2

Gambar 16.

Mikroskop

Inverteed

Gambar 15.

Autoklaf

Gambar 17.

Micropipet

Gambar 18.

Sentrifuge

Gambar 19.

ELISA reader

Gambar 20.

T-flask

Gambar 22.

Microwell

Plate 96

Gambar 21.

Spektrometer UV

109

B. Bahan

Gambar 23.

Medium DMEM

Gambar 24.

DMSO

Gambar 25.

Fetal Bovine Serum

Gambar 28.

TRYPSIN EDTA

Gambar 26.

MTT

Gambar 27.

Tripan Blue

Gambar 30. Sodium

Dodecyl Sulfate

Gambar 29.

Phosphate Buffer

Saline

110

Lampiran 23. Deskripsi Medium DMEM

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media

PRODUCT DESCRIPTION

A basal medium consisting of vitamins, amino acids, salts, glucose and a pH indicator. It contains no

proteins or growth promoting

agents.

BRANDSIGMA®

Component D5796

[1x] g/L

Inorganic Salts

Calcium Chloride 0.2

Ferric Nitrate • 9H2O 0.0001

Magnesium Sulfate (anhydrous) 0.09767

Potassium Chloride 0.4

Sodium Bicarbonate 3.7

Sodium Chloride 6.4

Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) 0.109

Amino Acids

L-Arginine • HCl 0.084

L-Cystine • 2HCl 0.0626

L-Glutamine 0.584

Glycine 0.03

L-Histidine • HCl • H2O 0.042

L-Isoleucine 0.105

L-Leucine 0.105

L-Lysine • HCl 0.146

L-Methionine 0.03

L-Phenylalanine 0.066

L-Serine 0.042

L-Threonine 0.095

L-Tryptophan 0.016

L-Tyrosine • 2Na • 2H2O 0.10379

L-Valine 0.094

Vitamins

Choline Chloride 0.004

Folic Acid 0.004

myo-Inositol 0.0072

Niacinamide 0.004

D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0.004

Pyridoxal • HCl —

Pyridoxine • HCl 0.004

Riboflavin 0.0004

Thiamine • HCl 0.004

Other

D-Glucose 4.5

HEPES —

Phenol Red • Na 0.0159

Pyruvic Acid • Na —

Add

Glucose —

L-Glutamine —

Sodium Bicarbonate —

111

Lampiran 24.Transformasi Persen – Probit

% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0 0.0 1.0098 2.1218 2.2522 2.3479 2.4242 2.4879 2.5427 2.5914 2.6344

1 2.6737 2.7096 2.7429 2.7738 2.8027 2.8299 2.8556 2.8799 2.3031 2.9251

2 2.9463 2.9665 2.9859 3.0646 3.0226 3.0400 3.0569 3.0732 3.0896 3.1043

3 3.1192 3.1337 3.1478 3.1616 3.1750 3.1881 3.2009 3.2134 3.2256 3.2376

4 3.2493 3.2608 3.2721 3.2831 3.2940 3.3046 3.3151 3.3253 3.3354 3.3454

5 3.3351 3.3648 3.3742 3.3836 3.3028 3.4018 3.4107 3.4105 3.4282 3.4368

6 3.4452 3.4536 3.4618 3.4699 3.4780 3.4850 3.4037 3.5015 3.5091 3.5167

7 3.5242 3.5316 3.5380 3.5462 3.5534 3.5605 3.5675 3.5745 3.5813 3.5882

8 3.5949 3.6016 3.6083 3.6148 3.6213 3.0278 3.0342 3.6405 3.6408 3.0531

9 3.6692 3.6654 3.6715 3.6775 3.6835 3.6894 3.6053 3.7012 3.7070 3.7127

10 3.7184 3.7241 3.7298 3.7354 3.7409 3.7464 3.7519 3.7574 3.7028 3.7681

11 3.7735 3.7784 3.7840 3.7893 3.7945 3.7996 3.8048 3.8099 3.8150 3.8200

12 3.8250 3.8300 3.8350 3.8399 3.8448 3.8497 3.8545 3.8503 3.8641 3.8089

13 3.8736 3.8783 3.8830 3.8877 3.8923 3.8069 3.9015 3.9061 3.9107 3.9152

14 3.9197 3.9242 3.9286 3.9331 3.9375 3.0419 3.9463 3.9506 3.9550 3.9593

15 3.9636 3.9678 3.9721 3.9763 3.8900 3.0848 3.0890 3.9931 3.9973 4.0014

16 4.0055 4.0096 4.0137 4.0178 4.0218 4.0259 4.0299 4.0339 4.0379 4.0410

17 4.0458 4.0408 4.0537 4.0576 4.001 5 4.0654 4.0693 4.0731 4.0770 4.0808

18 4.0846 4.0884 4.0922 4.0960 4.0998 4.1035 4.1073 4.1110 4.1147 4.1184

19 4.1221 4.1258 4.1295 4.1331 4.1367 4.1404 4.1440 4.1476 4.1512 4.1548

20 4.1684 4.1019 4.1035 4.1690 4.1726 4.1761 4.1796 4.1831 4.1866 4.1901

21 4.1936 4 1970 4.2005 4.2039 4.2074 4,2108 4.2142 4.2176 4.2210 4.2244

22 4.2278 4.2312 4.2345 4.2379 4.2412 4.2446 4.2479 4.2512 4.2546 4.2579

23 4.2612 4.2644 4.2677 4.2710 4.2743 4.2775 4.2808 4.2840 4.2872 4.2905

24 4.2937 4.2969 4.3001 4.3033 4.3065 4.3097 4.3129 4.3160 4.3192 4.3224

112

Lampiran 25.Lanjutan

% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

25 4 3255 4.3287 4.3318 4.3349 4.3380 4.3412 4.3443 4.3474 4.3505 4.3536

26 4.3567 4.3597 4.3628 4.3659 4.3689 4.3720 4.3750 4.3781 4.3811 4.3842

27 4.3872 4.3902 4.3932 4.3962 4.3992 4.4022 4.4052 4.4082 4.4112 4.4142

28 4.4172 4.4201 4.4231 4.4260 4.4290 4.4319 4.4349 4.4378 4.4408 4.4437

29 4.4466 4.4405 4.4524 4.4554 4.4583 4.4612 4.4041 4.4670 4.4698 4.4727

30 4.4756 4.4785 4.4813 4.4842 4.4871 4.4899 4.4928 4.4956 4.4985 4.5013

31 4.5041 4.5070 4.5098 4.5126 4.5155 4.5183 4.5211 4.5230 4.5267 4.5295

32 4.5323 4.5351 4.5370 4.5407 4.5435 4.5462 4.5490 4.5518 4.5546 4.5573

33 4 .5601 4.5628 4.5656 4.5684 4.5711 4.5739 4.5766 4.5793 4.5821 4.5848

34 4.5875 4.5903 4.5930 4.5957 4.6984 4.6011 4.6039 4.0066 4.6093 4.6120

35 4.6147 4.6174 4.6201 4.6228 4.6255 4.6281 4.6308 4.6335 4.6362 4.6389

36 4.6415 4.6442 4.6469 4.6495 4.6522 4.6549 4.6575 4.6602 4.6628 4.6655

37 4.6681 4.0708 4.6734 4.6761 4.0787 4.0814 4.0840 4.0806 4.6893 4.6919

38 4.6945 4.6971 4.6998 4.7024 4.7050 4.7078 4.7102 4.7120 4.7155 4.7181

39 4.7207 4.7233 4.7259 4.7285 4.7311 4.7337 4.7363 4.7389 4.7415 4.7441

40 4.7467 4.7402 4.7518 4.7544 4.7570 4.7696 4.7622 4.7647 4.7673 4.7699

41 4.7725 4.7750 4.7776 4.7802 4.7827 4.7853 4.7870 4.7904 4.7930 4.7955

42 4.7981 4.8007 4.8032 4.8058 4.8083 4.8109 4.8134 4.8160 4.8185 4.8211

41 4.8230 4.8202 4.8287 4.8313 4.8338 4.8363 4.8389 4.8414 4.8440 4.8465

44 4.8490 4.8516 4.8541 4.8566 4.8592 4.8617 4.8642 4.8668 4.8093 4.8718

45 4.8743 4.8769 4.8704 4 8819 4.8844 4.8870 4.8805 4.8920 4.8945 4.8970

46 4.8996 4.9021 4.9046 4.9971 4.9996 4.9122 4.9147 4.9172 4.9197 4.0222

47 4.9247 4.9272 4.9298 4.9323 4.9318 4.9373 4.9308 4.9423 4.9448 4.9473

48 4.9408 4.0524 4.9549 4.9574 4.9599 4.9624 4.9649 4.9674 4.9699 4.9724

49 4.9740 4.9774 4.9799 4.9825 4.9850 4.0876 4.9900 4.9925 4.9950 4.9975

113

Lampiran 25.Lanjutan

% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

50 5.0000 5.0025 5.0050 5.0075 5.0100 5.0125 5.1050 5.0175 5.0201 5.0226

51 5.0251 5.0276 5.0301 5.0326 5.0351 5.0376 5.0401 5.0426 5.0451 5.0476

52 5.0502 5.0527 5.0552 5.0577 5.0602 5.0627 5.0652 5.0677 5.0702 5.0728

53 5.0753 5.0778 5.0803 5.0828 5.0853 5.0878 5.0904 5.0929 5.0954 5.0279

54 5.1004 5.1036 5.1055 5.1080 5.1105 5.1196 5.1156 5.1181 5.1206 5.1231

55 5.1257 5.1282 5.1307 5.1332 5.1313 5.1383 5.1408 5.1434 5.1459 5.1484

56 5.1510 5.1535 5.1560 5.1586 5.1614 5.1637 5.1662 5.1687 5.1713 5.1738

57 5.1764 5.1789 5.1815 5.1840 5.1866 5.1801 5.1917 5.1942 5.1968 5.1993

58 5.2019 5.2045 5.2070 5.2096 5.2121 5.2147 5.2173 5.2198 5.2224 5.2250

59 5.2275 5.2301 5.2327 5.2353 5.2378 5.2404 5.2430 5.2468 5.2482 5.2508

60 5.2533 5.3359 5.2585 5.2611 5.2637 5.2663 5.2689 5.2715 5.2741 5.2767

61 5.2793 5.3819 5.2845 5.2871 5.2808 5.2024 5.2050 5.2976 5.3002 5.3029

62 5.3055 5.3081 5.3107 5.3134 5.3160 5.3186 5.3213 5.3239 5.3266 5.3202

63 5.3319 5.3345 5.3372 5.3398 5.3425 5.3451 5.3478 5.3505 5.3531 5.3658

64 5.3585 5.3811 5.3638 5.3665 5.3692 5.3719 5.3745 5.3772 5.3799 5.3826

65 5.3853 5.3880 5.8007 5.3934 5.3961 5.3980 5.4016 5.4043 5.4070 5.4097

66 5.4125 5.4152 5.4170 5.4207 5.4234 5.4261 5.4289 5.4316 5.4344 5.4372

61 5.4399 5.4427 5.4454 5.4482 5.4510 5.4538 5.4565 5.4593 5.4621 5.4649

68 5.4677 5.4705 5.4733 5.4761 5.4780 5.4817 5.4845 5.4874 5.4002 5.4930

69 5.4959 5.4987 5.5015 5.5044 5.5072 5.5101 5.5129 5.5158 5.5187 5.3215

70 5.5244 5.3273 5.5302 5.5830 5.5350 5.5388 5.5417 5.5446 5.5476 5.6505

71 5.5534 5.5503 5.3502 5.5622 5.5651 5.5681 5.5710 5.5740 5.5760 5.5799

72 5.5828 5.5858 5.0888 5.5918 5.5948 5.5978 5.0003 5.0038 5.0008 5.6098

73 5.6128 5.6158 5.0189 5.6219 5.6250 5.6280 5.6311 5.0341 5.6372 5.6403

74 5.6435 5.6464 5.0405 5.6926 5.6557 5.6588 5.6620 5.6651 5.6682 5.6713

114

Lampiran 25.Lanjutan

% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

75 5.6745 5.6776 5.0808 5.6840 5.6871 5.6903 5.6935 5.6967 5.6998 5.7031

76 5.7083 5.7095 5.7128 5.7160 5.7102 5.7225 5.7257 5.7200 5.7323 5.7356

77 5.7388 5.7424 5.7454 5.7488 5.7521 5.7554 5.7508 5.7621 5.7699 5.7688

78 5.7722 5.7756 5.7796 5.7824 5.7858 5.7892 5.7926 5.7961 5.7995 6.8030

79 5.8834 5.8299 5.8134 5.8169 5.8204 5.8239 5.8274 5.8310 5.8215 6.0381

80 5.8416 5.5452 5.8188 5.8524 5.8560 5.8596 5.8633 5.8669 5.8705 6.8742

8I 5.8779 5.8516 5.8853 5.8890 5.8927 5.8905 5.9002 5.9040 5.9078 5.9116

82 5.9154 5.9192 5.9230 5.9269 5.9307 5.9346 5.9386 5.9424 5.9463 5.9502

83 5.9542 5.9581 5.9624 5.9661 5.9701 5.9741 5.9782 5.9822 5.6863 5.9904

84 5.9945 5.9986 6.0027 6.0069 6.0110 6.0152 6.0194 6.0237 6.0279 6.0222

85 6.0364 6.0407 6.0450 6.0494 6.0537 6.0581 6.0625 6.0069 6.0714 6.0758

86 6.0803 6.0818 6.0893 6.0939 6.0985 6.1031 6.1077 6.1123 6.1170 6.1217

87 6.1264 6.1311 6.1359 6.1407 6.1455 6.1503 6.1552 6.1601 6.1050 6.1700

88 6.1750 6.1800 6.1856 6.1101 6.1952 6.2004 6.2055 6.2107 6.2160 6.2212

89 6.2205 6.2319 6.2372 6.2426 6.2481 6.2536 6.2591 6.2646 6.2702 6.2750

90 6.2816 6.2813 6.2936 6.2988 6.3047 6.3106 6.3165 6.3225 6.3285 6.3346

91 6.3408 6.3469 6.8532 6.3595 6.3658 6.3722 6.3787 6.3852 6.3917 6.3984

92 6.4031 6.4118 6.4187 6.4255 6.4325 6.4395 6.4466 6.4538 6.4611 6.4684

93 6.4758 6.4833 6.4909 6.4985 6.5063 6.5141 6.5220 6.5301 6.5382 6.5464

94 6.8548 6.5632 6.5718 6.5805 6.5893 6.5982 6.6078 6.6164 6.6258 6.6352

95 6.6449 6.6546 6.6646 6.6747 6.6849 6.6954 6.7060 6.7169 6.7279 6.7302

97 100 101 102 105 106 109 110 113 116

96 6.7507 6.7624 6.7784 6.7806 6.7991 6.8119 6.8260 6.8084 6.8522 6.8063

117 120 122 125 128 131 134 138 141 145

97 6.8808 6.8957 6.9110 6.9268 6.9431 6.9600 6.9774 6.9254 7.0141 7.0335

140 153 158 103 169 174 180 187 194 202

115

Lampiran 25.Lanjutan

% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

98.0 7.6537 7.0556 7.0579 7.0660 7.0621 7.0612 7.0663 7.0684 7.9706 7.0727

98.1 7.6749 7.0770 7.0792 7.0814 7.0836 7.0858 7.0880 7 0992 7.0924 7.0947

98.2 7.0969 7.0992 7.1015 7.1038 7.1061 7.1084 7.1107 7.1130 7.1154 7.1177

98.3 7.1204 7.1224 7.1248 7.1272 7.1297 7.1321 7.1345 7.1370 7.1364 7.1419

98.4 7.1444 7.1469 7.1494 7.1520 7.1545 7.1571 7.1996 7.1622 7.1648 7.1675

98.5 7.1701 7.1727 7.1754 7.1781 7.1808 7.1835 7.1862 7.1890 7.1917 7.1945

98.6 7.1973 7.2001 7.2029 7.2058 7.2086 7.2115 7.2144 7.2173 7.2203 7.2232

98.7 7.2262 7.2292 7.2322 7.2353 7.2383 7.24 14 7.2445 7.2476 7.2508 7.2539

98.8 7.2374 7.2663 7.2636 7.2668 7.2701 7.2734 7.2768 7.2801 7.2835 7.2869

98.9 7.2904 7.2938 7.2973 7.3009 7.3044 7.3080 7.3116 7.3152 7.3189 7.3226

99.0 7.3263 7.3301 7.3339 7.3378 7.3416 7.3455 7.3495 7.3935 7.3575 7.3615

99.1 7.3656 7.3698 7.3739 7.3781 7.3824 7.3867 7.3911 7.3954 7.3099 7.4044

99.2 7.4059 7.4135 7.4181 7.4228 7.4276 7.4324 7.4372 7.4422 7.5474 7.4522

99.3 7. 4373 7.4624 7.4677 7.4730 7.4783 7.4838 7.4893 7.4040 7.5006 7.5063

99.4 7.5121 7.5181 7.5241 7.5302 7.5364 7.5427 7.5401 7.5550 7.5622 7.5690

99.5 7.5758 7.5828 7.5890 7.5972 7.6045 7.6121 7.6107 7.0276 7.6356 7.6437

99.6 7.6521 7.6606 7.6693 7.6783 7.0874 7.6968 7.7065 7.7104 7.7260 7.7370

99.7 7.7478 7.7589 7.7703 7.7822 7.7944 7.8070 7.8202 7.8338 7.8480 7.8027

99.8 7.8782 7.8043 7.9112 7.9299 7.9478 7.9677 7.9889 8.0115 8.0357 8.0618

99.9 8.0902 8.1214 8.1550 8.1847 8.2380 7.2905 8.3528 8.4316 8.5401 8.7190

Tabel 16. Transformasi Persen – Probit