UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH EKSTRAK AIR DAUN ... · EKSTRAK AIR DAUN SALAM...

UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA-AMILASE OLEH

EKSTRAK AIR DAUN SALAM (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.)

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh:

Ayu Priscilla Dewanti

NIM: 168114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA-AMILASE OLEH

EKSTRAK AIR DAUN SALAM (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.)

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Farmasi

Diajukan oleh:

Ayu Priscilla Dewanti

NIM: 168114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Janganlah takut, sebab Aku menyertai engkau, janganlah bimbang, sebab Aku ini

Allahmu; Aku akan meneguhkan, bahkan menolong engkau; Aku akan memegang

engkau dengan tangan kanan-Ku yang membawa kemenangan.

(Yesaya 41:10)


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat

dan kasih karuniaNya penulis memberikan kelancaran dari awal penyusunan hingga

akhir dari penelitian, sehingga dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji

Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase Ekstrak Air Daun Salam (Syzygium

polyanthum (Wight) Walp.) secara In Vitro dengan baik dan lancar. Skripsi ini

disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar sarjana

farmasi (S.Farm) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

Penyusunan naskah skripsi ini tidak akan berjalan dengan lancer tanpa

adanya dukungan baik itu berupa moril dan meteril dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada:

1. Tuhan Yesus yang telah memberikan jalan terbaik dan kekuatan pada

saat masa-masa sulit dalam proses penyusunan skripsi.

2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing skripsi yang selalu

sabar dalam memberikan arahan serta nasihat dalam proses penelitian

hingga penyusunan naskah skripsi ini.

3. Ibu Christine Patramurti, Apt. selaku Kepala Program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma.

4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S,Si., M.Sc. selaku Kepala

Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

5. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah

memberikan saran, bantuan, dan kritik membangun untuk

menyelesaikan skripsi ini.

6. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji skripsi yang

telah memberikan saran, bantuan, dan kritik membangun untuk

menyelesaikan skripsi ini.

7. Ibu Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

telah dengan sabar membimbing selama perkuliahan di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma.

8. Pak Dwi Priyana dan Pak Sarwanto selaku secretariat S1 Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah sabar selalu membantu

dalam pemberian segala macam bentuk informasi dari awal perkuliahan

hingga akhir.

9. Pak Wagiran, Pak Bimo, dan Pak Beye selaku laboran dan karyawan

yang telah membantu selama proses penelitian skripsi.


viii

10. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang telah membantu dan memberikan saran selama masa

perkuliaha di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

11. Keluarga tercinta, Ibu Sri Dewi dan adik terkasih Devieska Amiani yang

selalu memberikan doa dan dukungan moril maupun materil dalam

proses perjalanan hidup hingga saat ini.

12. Yohana Trisnawati Ardiyanti selaku rekan satu tim “daun salam” yang

telah dengan sabar memberikan dukungan, teman dalam bertukar

pikiran, dan selalu memberikan segala macam informasi.

13. Teman-teman seperjuangan skripsi lainnya yaitu Fetiana Chrismaurin,

Fila Delfia, Maria Carolina, Agustinus Nara, dan Oskar Samuel Howay

yang telah memberikan saran dan dukungan selama proses penelitian

hingga penyusunan naskah skripsi ini.

14. Sobat yang saya anggap seperti saudara yang telah menghabiskan waktu

bersama-sama, berbagi kisah suka dan duka, memberikan bantuan,

saran, dan “kritik” selama proses perkuliahan dari awal semester hingga

saat ini, Luciana Astelia Indah Puspa Gery, Wiwy, Katharina Agnes F.B

Langkeru, dan Agatha Ati Maia.

15. Sahabat sejak masa sekolah, Elismanore Ahini, Elisa Yusefheni, dan

Resha Handriani yang selalu mendengarkan keluh kesah, memberikan

dukungan dan doa selama proses pembuatan skripsi.

16. Teman-teman FSMA 2016 yang telah memberikan pengalaman yang

luar biasa selama masa perkuliahan.

Penuis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan

dan jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu, penulis meminta maaf sebesar-

besarnya apabila terdapat kesalahan dalam penulisan. Penulis mengharapkan

adanya kritik dan saran yang membangun dari seluruh pihak agar hasil karya

ini menjadi lebih baik dan bermanfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan

terutama di bidang kefarmasian. Akhir kata penulis mengucapkan terimakasih.

Yogyakarta, 10 Agustus 2020

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................ vi

PRAKATA ........................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ............................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xii

ABSTRAK ....................................................................................................... xiii

ABSTRACT ....................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ............................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 8

KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 18

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 19

LAMPIRAN ...................................................................................................... 24

BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 38

x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Perhitungan Nilai Rf ............................................................................. 11

Tabel II. Persen Penghambatan Enzim Alfa-amilase Oleh Acarbose .................. 13

Tabel III. Nilai IC50 Acarbose ............................................................................ 13

Tabel IV. Persen Penghambatan Enzim Alfa-amilase Oleh Ekstrak Air Daun

Salam ................................................................................................. 14

Tabel V. Nilai IC50 Ekstrak Air Daun Salam ...................................................... 14


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Plat KLT serbuk simplisia daun salam dan ekstrak air daunsalam dengan

fase gerak n-butanol: air: asam asam asetat (4:5:1) dan fase diam silika

gel GF254, bercak (A) pada UV 254 nm dan bercak (B) pada UV 366

nm............................................................................... 10

Gambar 2. Struktur Kuersetin............................................................................ 18

Gambar 3. Serbuk Simplisia Daun Salam .......................................................... 25

Gambar 4. Ekstrak Air Daun Salam .................................................................. 25


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar Serbuk Simplisia Daun Salam dan Ekstrak Air Daun

Salam................................................................................................. 25

Lampiran 2. Surat Keterangan Merapi Farma Herbal ......................................... 26

Lampiran 3. Surat Keterangan Hasil Identifikasi Serbuk .................................... 27

Lampiran 4. Data Penimbangan Serbuk Simplisia Daun Salam dan Perhitungan

Rendemen....................................................................................... 28

Lampiran 5. Hasil Uji Kadar Air Serbuk Simplisia Daun Salam ......................... 29

Lampiran 6. Data Penimbangan Serbuk Simplisia Daun Salam dan Ekstrak Air

Daun Salam untuk KLT .................................................................. 29

Lampiran 7. Data Perhitungan Persen Penghambatan dan Nilai IC50 Acarbose dan

Esktrak Air Daun Salam ................................................................. 30

Lampiran 8. Surat Keterangan Analisa Data Statistik ......................................... 32

Lampiran 9. Hasil Pengujian Statistik ................................................................ 33


xiii

ABSTRAK

Diabetes melitus merupakan salah satu penyakit gangguan fungsi

metabolik, terjadi akibat pankreas tidak dapat memproduksi insulin yang cukup

untuk tubuh atau tubuh tidak dapat menggunakan insulin secara efektif. Indonesia

menempati posisi ke enam negara dengan penderita diabetes terbanyak, yaitu

sebesar 10,3 juta orang. Peningkatan kadar gula didalam darah salah satu

penyebabnya adalah aktivitas pemecahan pati dari enzim alfa-amilase yang

merupakan produk dari kelenjar pankreas dan saliva. Enzim ini dapat memecah

molekul besar polisakarida yang tidak terlarut menjadi molekul yang dapat diserap

tubuh seperti maltosa, dekstrin, dan glukosa. Tanaman herbal yang dilaporkan

memiliki khasiat sebagai antidiabetes adalah daun salam. Daun salam memiki

senyawa aktif yaitu kuersetin dipercaya dapat menghambat enzim alfa-amilse

dalam proses pemecahan karbohidrat. Metode ekstraksi yang digunakan adalah

metode infusa dengan menggunakan pelarut air. Metode spektrofotometri dipilih

untuk melakukan pengujian terhadap aktivitas enzim alfa-amilase dengan cara

mengukur absorbansi sisa substrat yang membentuk kompleks warna biru dengan

iodine-iodida. Hasil nilai rata-rata persen penghambatan ekstrak air daun salam

pada konsentrasi 5mg/mL (15,83%), konsentrasi 10mg/mL (30,21%), konsentrasi

15mg/mL (38,55%), konsentrasi 20mg/mL (40,10%), konsentrasi 25mg/mL

(46,88%). Nilai rata-rata IC50 kontrol positif acarbose sebesar 17,62 mg/mL,

sedangkan nilai rata-rata IC50 ekstrak air daun salam sebesar 26,206 mg/mL. Hasil

pengolahan data secara statistik didapatkan adanya perbedaan penghambatan yang

bermakna antar konsentrasi dengan nilai p-value <0,05. Melalui uji T ditemukan

hasil yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara IC50

acarbose dan IC50 ekstrak air daun salam dengan nilai p-value <0,05.

Kata kunci: ekstrak air daun salam, metode infusa, daun salam, enzim alfa-amilase,

spektrofotometer UV-VIS, in vitro


xiv

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a metabolic disease that occurred when the pancreas

could not secrete sufficient insulin or when the human body unable to utilize insulin

effectively. Indonesia is in the 6th place being the country with the most diabetes

cases, which is about 10,3 million people. One of the causes of the rising of the

blood glucose is activity of enzyme alpha-amylase, an enzyme produced in the

pancreas and saliva glands. The enzyme break downs the undissolved

polysaccharide into smaller species such as maltose, dextrin, and glucose. A species

of herbal plants, bay leaf (Syzygium polyanthum (Wight) Walp.) had been reported

to have an anti-diabetic effect. Syzygium polyanthum (Wight) Walp.) contains

quercetin as the active compound which is responsible for the inhibitory effect of

alpha-amylase in the carbohydrate break down process. The extraction method

chosen was water extraction. The method to examine the activity of alpha-amylase

was spectrophotometry. This method measured the absorbance of the remained

substrate that formed the blue complex with the iodine-iodide. The result of the

inhibitory percent value for each concentration was 15,83% (5mg/mL), 30,21%

(10mg/mL), 38,55% (15 mg/mL), 40,10% (20mg/mL), and 46,88% (25mg/mL).

The IC50 value of the positive control (acarbose) was 17,62 mg/mL, while the value

of the extract was 26,206 mg/mL. The statistic result showed that there is a

significant difference between concentrations (p-value <0,05). The result of the T-

test showed the difference between the IC50 of the acarbose and the water extract

of Syzygium polyanthum (Wight) Walp.) (p-value <0,05).

Keywords: Syzygium polyanthum (Wight) Walp. water extract, infusion method,

bay leaf, alpha amylase, spectrophotometer UV-VIS, in vitro


1

PENDAHULUAN

Diabetes melitus merupakan salah satu penyakit gangguan fungsi metabolik.

Gangguan ini terjadi akibat pankreas tidak dapat memproduksi insulin yang cukup

untuk tubuh atau tubuh tidak dapat menggunakan insulin secara efektif

(Perkumpulan Endokrinologi Indonesia, 2015). Hampir setengah juta orang hidup

dengan diabetes. Angka ini diperkirakan meningkat melebihi 592 juta dalam kurun

waktu kurang dari 25 tahun. Sekitar 80% penderita diabetes berasal dari negara-

negara berpendapatan rendah sampai menengah. Indonesia menempati posisi ke

enam negara dengan penderita diabetes terbanyak, yaitu sebesar 10,3 juta orang.

Jumlah ini diperkirakan akan meningkat 1,5 kali lipat dalam kurun waktu 28 tahun

yaitu mencapai 16,7 juta orang pada tahun 2045 (International Diabetes Federation,

2017).

Terapi yang diberikan pada penderita diabetes melitus salah satunya

menggunakan strategi menghambat penyerapan gula ke dalam tubuh dengan

melibatkan enzim pencernaan. Salah satu enzim yang berperan adalah enzim alfa

amilase. Enzim ini merupakan produk yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas dan

saliva, memecah molekul besar polisakarida yang tidak terlarut menjadi molekul

yang dapat diserap tubuh seperti maltosa, dekstrin, dan glukosa (Ariandi, 2016).

Pengobatan herbal merupakan salah satu alternatif yang diminati oleh

masyarakat Indonesia karena dianggap memiliki beberapa kelebihan, yaitu mudah

didapatkan, mudah diramu sendiri dan harganya yang terjangkau. Salah satu

tanaman herbal yang berkhasiat sebagai antidiabetes adalah daun salam. Penelitian

secara in vivo menggunakan ekstrak air daun salam diberikan pada tikus

menunjukkan efek yang tinggi dalam menurunkan kadar gula darah yaitu sebesar

53,45% pada hari ke 21 saat perlakuan, disusul pada dosis 300 mg/kgBB dengan

42,4% dan dosis 200 mg/kgBB sebesar 34,5% (Lelono dan Tachibana, 2013). Pada

penelitian lain secara in vivo menggunakan ekstrak air daun salam yang telah

melelui proes filtrasi dan penguapan pada vakum (50-60mmHg), kemudian

dikeringkan dengan teknologi spray drying. Rasio tanaman dan air yang digunakan

adalah 1:4, menunjukkan hasil bahwa ekstrak air daun salam memiliki aktivitas

sebagai antidiabetes dengan memberikan dosis ekstrak air daun salam sebanyak 200


2

mg/kgBB pada tikus jantan dengan berat badan antara 100-150 g (Widharna et al,

2015). Elya et al (2015) melakukan penelitian aktivitas antidiabetes ekstrak etanol

daun salam secara in vitro terhadap enzim alfa amilase. Didapatkan hasil bahwa

ekstrak etanol daun salam memiliki aktivitas penghambatan enzim alfa amilase.

Pada penelitian ini menggunakan daun salam sebagai bahan uji, daun ini

merupakan salah satu jenis tanaman yang mudah diperoleh sehingga sering

dimanfaatkan masyarakat untuk pengobatan alternatif. Salah satu senyawa yang

terdapat pada daun salam adalah flavonoid. Senyawa ini dilaporkan memiliki

aktivitas sebagai antidiabetes melalui penghambatan aktivitas enzim alfa amilase

melalui pembentukan ikatan hidrogen dengan gugus polar pada sisi alosterik enzim

yang berdekatan dengan sisi katalitik enzim. Hasil dari interaksi tersebut dapat

mengubah konfigurasi molekul enzim sehingga menyebabkan penurunan aktivitas

enzim, flavonoid yang terkandung dalam daun salam yaitu kuersetin (Prahastuti et

al, 2011; Rivai et al, 2019). Melalui sebuah penelitian yang dilakukan oleh Rivai et

al (2019) melaporkan bahwa ekstrak air daun salam dengan metode infusa memiliki

kadar flavonoid sebanyak 0.486%. Kemudian dari penelitian lain melakukan

pengujian terhadap aktivitas penghambatan enzim dengan menggunakan kuersetin

secara in vitro didapatkan hasil kuersetin memiliki aktivitas dalam menghambat

enzim alfa amilase dilihat dari nilai IC50 507.61 μg/L (Oboh et al, 2014).

Pengobatan tanaman herbal pada awalnya dikenal dengan istilah jamu

godog yaitu rebusan simplisia segar dan kering menggunakan pelarut air. Perebusan

ini berguna untuk memindahkan zat-zat berkhasiat ke dalam air. Jamu godog juga

dapat diseduh langsung dengan air panas tanpa proses perebusan, biasanya

menggunakan simplisia yang berasal dari bunga atau daun (Sudradjat, 2016). Pada

penelitian ini melakukan ekstraksi senyawa kuersetin dengan metode infusa,

dimana simplisia kering akan dilakukan perebusan menggunakan air. Metode ini

digunakan untuk bahan lunak seperti daun dan bunga (BPOM RI, 2012). Metode

ini dipilih karena memiliki cara kerja yang sama seperti yang dilakukan masyarakat

dalam pengolahan obat tradisional. Meskipun senyawa kuersetin memiliki

kelarutan dalam air panas rendah, menurut Owczarek et al (2016) apabila

melakukan ekstraksi menggunakan pelarut air komponen lain dari tanaman tersebut


3

akan membantu kelarutan dari kuersetin dalam air, disebut dengan natural deep

eutectic solvents (NADES).

Melihat dari semakin meningkatnya angka kejadian diabetes melitus di

Indonesia menjadi masalah serius dalam bidang kesehatan, pengobatan herbal yang

dipercayai masyarakat sebagai salah satu alternatif pengobatan, dan daun salam

berkhasiat dipercayai dapat berkhasiat sebagai pengobatan antidiabetes. Maka

penelitian ini perlu dilakukan untuk menambah informasi dalam pengembangan

ilmu kefarmasian mengenai pengobatan tradisional. Selain itu, penelitian ini juga

bertujuan untuk mengetahui seberapa besar persen penghambatan ekstrak air daun

salam dalam menghambat aktivitas enzim alfa-amilase seta nilai IC50 yang

dihasilkan.

METODE PENELITIAN

Alat

Gelas beaker, tabung reaksi, batang pengaduk, labu takar, gelas ukur, cawan

porselen, pipet ukur, pipet tetes, mikropipet, timbangan analitik, hot plate, panci

infusa, spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, plat silika gel GF254, bejana

kromatografi, kertas saring.

Bahan

Serbuk daun salam, enzim alfa amilase Sigma-Aldrich, tablet acarbose 50

mg, pati kentang, larutan iodine-iodine Merck, DMSO (dimethyl sulfoxide), n-

butanol, asam asetat, aquadest, aquabidest.

Tata Cara Penelitian

Pengumpulan Bahan dan Identifikasi Serbuk Daun Salam

Serbuk daun salam diperoleh dari Merapi Farma Herbal, Yogyakarta. Daun

salam yang digunakan ditanam pada daerah Hargobinangun, Pakem, Sleman,

Yogyakarta. Identifikasi serbuk daun salam dilakukan secara mikroskopis pada

Laboratorium Departemen Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.


4

Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan menggunakan metode destilasi toluena

(Departemen Kesehatan RI, 2010). Pereaksi toluena jenuh air dibuat dengan

mencampur toluene P dengan sedikit air kemudian dipisah menggunakan corong

pisah. 10g serbuk simplisia daun salam dan 200ml toluene jenuh air dimasukkan ke

dalam labu. Toluene jenuh air dimasukkan ke dalam tabung penerima melalui

pendingin sampai batas alat penampung dipanaskan selama 15 menit. Setelah

toluena mendidih, penyuling diatur dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes per detik.

Kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik selama 5 menit. Setelah

itu, tabung penerima didinginkan hingga suhu ruang dan volume air dibaca setelah

air dan toluena terpisah. Kadar air dihitung dengan rumus:

% Kadar air : volume air (ml)

berat simplisia yang ditimbang (g)×100%

Pembuatan Ekstrak Air Daun Salam

Infusa dibuat dengan menimbang serbuk 10g dan ditambahkan 100 mL

aquadest. Kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 15 menit terhitung

mulai suhu 90oC sambil sesekali diaduk. Kemudian disaring menggunakan kertas

saring dan ditambahkan air panas secukupnya hingga diperoleh volume 100mL.

Filtrat diuapkan diatas penangas air hingga diperoleh ekstrak kental dengan berat

yang konstan (BPOM RI, 2012). Kemudian menentukan rendemen dengen

menggunakan rumus:

Rendemen: bobot ekstrak

bobot serbuk simplisia daun salam ×100%

Uji Kualitatif Kuersetin

Uji kualitatif kuersetin dilakukan mengikuti metode uji yang tercantum pada

Farmakope Herbal Indonesia. Metode yang digunakan yaitu kromatografi lapis tipis

(KLT). Sebelum melakukan pengujian bejana kromatografi dijenuhkan terlebih

dahulu dengan menempatkan kertas saring ke dalam bejana yang telah berisi fase

gerak n-butanol; air; asam asetat (4:5:1) tinggi dan lebar kertas saring disesuaikan


5

dengan ukuran bejana kromatografi. Kemudian ditutup dan kertas saring dibiarkan

basah seluruhnya.

Pembuatan larutan uji dilakukan dengan cara menimbang serbuk daun

salam sebanyak 1g, diaduk di atas penangas air dengan 10 mL etanol selama 10

menit dicampurkan ke dalam labu ukur 10 mL. Fase gerak n-butanol; air; asam

asetat dengan perbandingan 4:5:1. Fase diam yang digunakan adalah silica gel

GF254. Larutan pembanding yaitu kuersetin dibuat 0,1%. Larutan uji ekstrak dibuat

dengan konsentrasi 5 mg/mL dengan cara menimbang 50 mg ekstrak air daun salam

dilarutkan dalam 10 mL etanol.

Plat silika dipanaskan terlebih dahulu menggunakan oven pada suhu 120oC

selama 30 menit sebelum melakukan penotolan larutan uji dan larutan pembanding.

Masing-masing ditotolkan sebanyak 10µL pada lempeng dengan jarak 1,5-2 cm

dari tepi bawah plat yang berukuran panjang 15 cm dan lebar 5 cm biarkan hingga

mengering. Plat yang telah kering kemudian dimasukkan ke dalam bejana

kromatografi dan tunggu fase gerak merambat sampai batas jarak rambat. Plat

dikeluarkan dan dikeringkan, bercak diamati dengan sinar tampak ultraviolet

gelombang pendek 254 nm dan ultraviolet gelombang panjang 366 nm. Jarak tiap

bercak dari titik penotolan diukur serta catat panjang gelombang tiap bercak yang

diamati. Tentukan nilai Rf dari setiap totolan (Departemen Kesehatan RI, 2008).

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase

Pada tahap awal pengujian aktivitas ekstrak perlu dilakukan optimasi

metode yaitu dengan melakukan penentuan operating time (OT) dan panjang

gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum dilakukan dengan

membuat campuran 1 mL pati, 1 mL ekstrak konsentrasi 5 mg/mL, 1 mL enzim alfa

amilase, 2 mL buffer fosfat ditunggu selama 30 menit, untuk menghentikan reaksi

ditambahkan 1 mL HCL 1M dan 0,5 mL larutan iodine-iodida sebagai reagen

pewarna, setelah itu serapan panjang gelombang dibaca dengan spektrofotometer

UV- VIS pada panjang gelombang 400-800 nm. Operating time (OT) dilakukan

dengan mencampurkan 1 mL pati, 1 mL ekstrak konsentrasi 5 mg/mL, 1 mL enzim

alfa amilase, 2 mL buffer fosfat. Hal ini dilakukan untuk 6 waktu pengukuran yaitu


6

5 menit, 10 menit, 15 menit, 20 menit, 25 menit. Kemudian reaksi dihentikan

dengan menambahkan 1 mL HCL 1M dan 0,5 mL larutan iodine-iodida sebagai

reagen pewarna, serapan panjang gelombang maksimum dibaca pada

spektrofotometer UV- VIS.

Pengujian terhadap penghambatan enzim diadopsi dari penelitian Berawi et

al (2017) dan Kamtekar et al (2014) yang telah dimodifikasi. Larutan buffer fosfat

pH 6,9 dibuat dengan cara menimbang 240 mg Na Fosfat dan 39,15 mg NaCl

dilarutkan dengan aquabidest sampai 100 mL. Larutan pati kentang 1% dibuat

dengan melarutkan 250 mg ke dalam 25 mL aquabidest. Larutan enzim alfa amilase

dibuat dengan 1 mL enzim alfa amilase ditambahkan pelarut buffer fosfat pH 6,9

pada labu ukur 100 mL hingga batas tanda. Ekstrak air daun salam sebagai sampel

dibuat dalam lima konsentrasi yaitu 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL,

25 mg/mL dilarutkan menggunakan DMSO 1% dalam labu ukur 10 mL. Larutan

uji sampel dibuat dengan mencampurkan 1 mL larutan pati kentang, 1 mL larutan

sampel, 2 mL larutan buffer fosfat, 1 mL larutan enzim ke dalam tabung reaksi dan

waktu OT selama 10 menit segera dimulai. Setelah waktu OT berhenti untuk

menghentikan reaksi ditambahkan 1 mL HCL 1M, reagen pewarna yaitu iodine-

iodida sebanyak 0,5 mL ditambahkan dan absorbansi dibaca pada panjang

gelombang 662, 5 nm.

Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 1 mL pati kentang, 1 mL

DMSO, 1 mL larutan enzim, dan 2 mL buffer fosfat. Untuk kontrol blanko dibuat

dengan mencampurkan 1 mL pati kentang, 1 mL DMSO, dan 3 mL buffer fosfat.

Kedua larutan ini di tunggu 10 menit, kemudian ditambahkan 1 mL HCL 1M dan

iodine-iodida sebanyak 0,5 mL, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 662, 5

nm. Larutan kontrol sampel dibuat dengan mencampurkan 1 mL pati kentang, 1 mL

dari masing-masing konsentrasi ekstrak, dan 3 mL larutan buffer fosfat. Seluruh

larutan di tunggu 10 menit, kemudian ditambahkan 1 mL HCL 1M dan iodine-

iodida sebanyak 0,5 mL, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 662, 5 nm.

Kontrol positif pada penelitian ini menggunakan tablet acarbose 50 mg

dengan lima konsentrasi yaitu 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25

mg/mL dilarutkan menggunakan DMSO 1%. Larutan acarbose dibuat dengan


7

mencampur 1 mL larutan pati kentang, 1 mL dari masing-masing konsentrasi

larutan acarbose, 1 mL larutan enzim, dan 2 mL larutan buffer fosfat. Larutan

kontrol acarbose dibuat dengan mencampur 1 mL larutan pati kentang, 1 mL dari

masing-masing konsentrasi larutan acarbose, dan 3 mL buffer fosfat. Larutan

acarbose dan kontrol acarbose ditunggu selama 10 menit. Kemudian ditambahkan

1 mL HCL 1M untuk menghentikan reaksi dan 0,5 mL iodeine-iodida, absorbansi

dibaca pada panjang gelombang 662, 5 nm.

Persen inhibitor di hitung menggunakan rumus:

% Inhibitor: (Ac'-Ac'')-(As-Ab)

(Ac'-Ac'') x 100

Dimana:

Ac’ : absorbansi blanko

Ac’’ : absorbansi kontrol blanko

As : absorbansi sampel

Ab : absorbansi kontrol sampel

Nilai IC50 merupakan nilai dari konsentrasi sampel yang dapat menghambat

aktivitas enzim sebesar 50%. Perhitungan nilai IC50 menggunakan regresi linear

yaitu y= bx+a dimana konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan persen

penghambatan sumbu y. Nilai IC50 dihitung dengan rumus (Elya et al, 2015):

IC50: 50-a

b

Analisis Data

Pengukuran aktivitas penghamatan enzim oleh ekstrak air daun salam

dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Data yang diperoleh berupa persen

penghambatan enzim oleh ekstrak air daun salam. Analisis data penghambatan

enzim oleh ekstrak air daun salam diukur secara statistik diawali dengan menguji

distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila didapatkan data terdistribusi

normal (nilai P > 0,05) maka dilanjutkan dengan ANOVA satu arah dan jika

ditemuka perbedaan maka dilanjutkan dengan uji Post-Hoc dengan taraf


8

kepercayaan 95%. Jika ditemukan perbedaan data tidak terdistribusi normal (nilai

P <0,05), maka dilanjukan dengan uji Kruskal-Wallis. Apabila ditemukan

perbedaan maka dapat dilanjutkan menggunakan uji Mann-Whitney pada taraf

kepercayaan 95%. Pengukuran dua kelompok uji menggunakan uji-T tidak

berpasangan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak air daun

salam dalam menghambat enzim alfa amilase secara in vitro serta mengetahui

persen penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak air daun salam. Serbuk

simplisia daun salam pada penelitian ini didapatkan dari Merapi Farma Herbal,

Yogyakarta (Lampiran 2). Identifikasi terhadap sebuk tersebut dilakukan pada

Laboratorium Departemen Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

hasil dari identifikasi tersebut menunjukan bahwa serbuk yang digunakan berasal

dari daun salam dengan nama latin Syzygium polyanthum (Wight) Walp. suku

Myrtaceae (Lampiran 3).

Penetapan Kadar Air

Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar air dari serbuk simplisia daun

salam menggunakan metode destilasi toluen. Metode ini dipilih mengukuti panduan

Farmakope Herbal Indonesia. Volume air yang didapatkan dari penetapan kadar air

simplisia yang ditimbang sebanyak 10 g adalah 0,5 mL, setelah dihitung

menggunakan rumus persen kadar air diketahui bahwa kadar air simplisia yaitu 5%.

Hal ini menandakan bahwa kadar air telah memenuhi persyaratan Farmakope

Herbal Indonesia (2008) yaitu <10%. Penentuan kadar air berkaitan dengan

kemurnian ekstrak, apabila terlalu tinggi (>10%) akan menyebabkan timbulnya

cemaran mikroba yang menyebabkan kerusakan pada ekstrak (Saifudin et al, 2011).

Ekstraksi Daun Salam dengan Pelarut Air

Proses ekstraksi serbuk simplisia daun salam pada penelitian menggunakan

metode infusa yang bertujuan untuk mengekstraksi senyawa aktif dari daun salam


9

yaitu kuersetin. Metode infusa merupakan teknik ekstraksi sederhana menggunakan

pelarut air pada suhu 90oC selama 15 menit, bahan yang digunakan dalam teknik

esktrasi infusa pada umumnya dari bahan lunak seperti daun dan bunga (BPOM RI,

2012). Waktu 15 menit terhitung ketika suhu mencapai 90oC, setelah 15 menit hasil

infusa disaring menggunakan kertas saring hingga diperoleh volume 100mL. Filtrat

yang dihasilkan kemudian diuapkan pada penangas air sampai terbentuk ekstrak

kental. Meskipun kuersetin akan mengalami degradasi pada suhu 100°C, namun

pada penelitian yang dilakukan oleh Loncaric et al (2017) mengatakan bahwa

dibawah 100°C degradasi yang dilami oleh kuersetin tidak signifikan sehingga

metode ini digunakan pada tahap ekstrasi.

Setelah itu ekstrak ditimbang dan ditentukan rendemen ekstrak tersebut.

Rendemen merupakan rasio jumlah ekstrak yang didapatkan dari berat simplisia

yang digunakan dalam proses ekstraksi dengan menggunakan satuan persen (%),

semakin tinggi nilai rendemen yang dihasilkan menandakan jumlah ekstrak yang

dihasilkan semakin banyak. Hasil rendemen yang didapatkan dari tiga replikasi

ekstrak replikasi 1 adalah 16,24%, replikasi 2 adalah 41,01%, dan replikasi 3 adalah

14,81%. Pada Famakope Herbal Indonesia (2010) tertulis bahwa nilai rendemen

ekstrak kental daun salam tidak kurang dari 12,2%, dilihat dari hasil rendemen yang

didapatkan ekstrak daun salam pada penelitian ini sudah memenuhi persyaratan

yang ditetapkan pada Farmakope Herbal Indonesia.

Uji Kualitatif Kuersetin

Pada penelitian ini melakukan uji kualitatif terhadap senyawa aktif

kuersetin menggunakan teknik analisis kromatografi lapis tipis (KLT). Secara

umum KLT didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses

migrasi dalam sistem yang terdiri dari dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase

diam berfungsi sebagai zat penyerap atau bertindak dalam melarutkan zat terlarut

sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Sedangkan fase gerak

berfungsi sebagai pembawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat

terlarut lainnya. Pada KLT hasil dari pengujian diidentifikasi dari pengamatan

bercak dengan nilai Retardation factor (Rf) yang merupakan perbandingan antara


10

jarak senyawa dari titik awal dan jarak palarut dari titik awal. Nilai Rf memiliki

kemiripan dan ukuran yang hampir sama antara larutan uji dan pembanding pada

lempeng yang sama (Depkes RI, 2010). Nilai Rf yang menunjukan keterpisahan

yang baik berkisar 0,2-0,8 (Srivastava., 2011).

(A) (B)

Gambar 1. Plat KLT serbuk simplisia daun salam dan ekstrak air

daunsalam dengan fase gerak n-butanol: air: asam asam

asetat (4:5:1) dan fase diam silika gel GF254, bercak (A)

pada UV 254 nm dan bercak (B) pada UV 366 nm

Keterangan gambar: A. Pembanding Kuersetin, B. Serbuk Simplisia Daun

Salam, C. Ekstrak Air Daun Salam

Tabel I. Perhitungan Nilai Rf

Titik Jarak Bercak

(cm)

Jarak

Elusi

Nilai Rf Warna bercak

254 nm 366 nm

A 7,2 10 0,72 Kuning

kecoklatan Kebiruan

B

7 10 0,7 Kuning

kecoklatan Kebiruan

8,9 10 0,89 - Merah muda


11

C 7 10 0,7 Kuning

kecoklatan Kebiruan

Berdasarkan hasil KLT yang disajika pada Gambar 1 nilai Rf yang

didapatkan dari pembanding adalah 0,72, serbuk simplisia daun salam 0,7, dan

ekstrak air daun salam adalah 0,7. Nilai Rf yang didapatkan mendekati nilai Rf

pembanding. Hal ini menandakan bahwa pada serbuk simplisia daun salam dan

ekstrak air daun salam ditemukan adanya kuersetin. Temuan ini diperkuat dengan

penelitian yang dilakukan oleh Loncaric et al (2017) mengatakan bahwa kelarutan

kuersetin didalam air dapat ditingkatkan dengan meningkatkan suhu pemanasan

dan waktu proses pembuatan, berkaitan dengan proses ekstraksi infusa dimana

suhu yang digunakan adalah 90°C selama 15 menit. Hal ini juga didukung oleh teori

Natural Deep Eutectic Solvents (NADES). NADES merupakan campuran dari dua

atau lebih komponen yang terdapat dalam tumbuhan (misalnya amina, glukosa,

alkohol, dan asam karboksilat) yang dapat membantu kelarutan senyawa didalam

pelarut polar (air) (Owczarek et al., 2016). Pada ekstrak air daun salam ditemukan

beberapa senyawa yaitu glikosida, terpenoid, alkaloid, flavonoid, dan tanin

(Widjajakusuma et al., 2019). Umumnya flavonoid yang ditemukan pada tanaman

aglikonnya berikatan dengan glukosa yang disebut dengan flavonoid glikosida,

senyawa ini mudah larut dalam air. Turunan dari flavonol yaitu kuersetin

merupakan salah satu golongan dari flavonoid glikosida, dimana glukosa berikatan

pada 3,7-OH dalam kuersetin. Glikosida yang ditemukan pada ekstrak air dapat

berperan sebagai NADES dengan berikatan pada kuersetin, sehingga membantu

kelarutan kuersetin dalam air.

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase

Pengujian aktivitas enzim dilakukan secara in vitro. Pengujian ini didasari

oleh pemecahan substrat untuk menghasilkan produk berwarna yang diukur

absorbansinya pada panjang gelombang yang telah ditentukan (Pujiyanto et al,

2019). Sebelum melakukan pengujian optimasi metode dilakukan terlebih dahulu

dengan menentukan panjang gelombang maksimum yang bertujuan untuk melihat

serapan maksimum dari hasil reaksi larutan uji. Pengukuran panjang gelombag


12

maksimum perlu dilakukan karena pada tahap ini memiliki kepekaan yang tinggi,

sehingga perubahan absorbansi untuk setiap konsentrasi adalah paling besar,

absorbansi dibaca pada panjang gelombang 400-800 nm. Kemudian dilanjutkan

dengan penentuan operating time (OT) bertujuan untuk mengetahui waktu

pengukuran yang stabil (Gandjar dan Rohman, 2007). Didapatkan hasil panjang

gelombang maksimum 662,5 nm dengan nilai absorbansi 0,660 dan OT 10 menit

dengan nilai absorbansi 0,601.

Pati kentang pada penelitian ini berfungsi sebagai substrat dari enzim.

Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah DMSO 1%. Pelarut ini dipilih

karena memiliki kemampuan melarutkan senyawa polar maupun non polar

(Andayani et al, 2016). Pemilihan HCL asam kuat untuk menghentikan reaksi

enzimatis didasarkan oleh perubahan pH yang ekstrim akan menyebabkan enzim

mengalami denaturasi sehingga aktivitas enzim akan mengalami penurunan hingga

tidak ada lagi aktivitas (Hames et al, 2000). Enzim memiliki stabilitas yang baik

berada pada pH 4-8 (Kishore et al, 2012). Oleh karena itu, pada penelitian ini

menggunakan buffer fosfat dengan pH 6,9 untuk menjaga kestabilan enzim selama

proses pengujian agar enzim tetap bekerja secara optimal. Reagen pewarna pada

penelitian ini menggunakan iodine-iodida, dimana reagen ini akan berikatan ikatan

dengan substrat membentuk warna biru, sehingga absorbansinya dapat dibaca pada

spektrofotometer UV- Vis dengan panjang gelombang yang telah ditentukan.

Pada pengujian aktivitas penghambatan enzim terdapat beberapa kelompok

uji yang akan diberikan perlakukan. Kelompok tersebut adalah kelompok blanko,

kontrol blanko, sampel, dan kontrol sampel. Kelompok ini memiliki tujuannya

masing-maisng yaitu kelompok blanko bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim

dalam memecah substrat yaitu pati kentang tanpa dihambat oleh ekstrak, kelompok

kontrol blanko untuk mengetahui apakah pelarut memiliki aktivitas tanpa

menambahkan ekstrak dan enzim, kelompok sampel bertujuan untuk mengetahaui

aktivitas penghambatan oleh sampel salam terhadap enzim alfa amilase, dan

kelompok kontrol sampel bertujuan untuk mengetahaui aktivitas sampel tanpa

ditambahkan enzim.

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa-Amilase oleh Acarbose


13

Pada penelitian ini menggunakan acarbose sebagai kontrol positif dalam

pengujian aktivitas penghambatan enzim. Larutan acarbose dibuat dengan berbagai

variasi konsentrasi yaitu 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL.

Selain larutan uji acarbose dilakukan juga pengujian pada kelompok lain yaitu

kelompok blanko, kontrol blanko, dan kontrol acarbose.

Tabel II. Persen penghambatan alfa-amilse oleh acarbose

Konsentrasi

(mg/mL)

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata

5 24,87 % 30,57% 26,42% 27,28%

10 33,68% 39,90% 38,34% 37,30%

15 46,11% 47,15% 49,74% 47,66%

20 51,30% 52,33% 55,44% 53,02%

25 62,18% 60,10% 64,77% 62,35%

Tabel III. Nilai IC50 acarbose

Replikasi IC50 (mg/mL) Rata-rata

1 18,45

17,62 mg/mL 2 17,79

3 16,63

Pada Tabel II menunjukkan nilai persen penghambatan acarbose terhadap

enzim alfa-amilase. Persamaan regresi linear yang didapatkan tabel penghambatan

oleh acarbose replikasi 1 adalah y = 1,8448x + 15, 956 dengan nilai r = 0,995 dan

nilai IC50 sebesar 18,45 mg/mL. Pada replikasi 2 adalah y = 1,4298x + 24,563

dengan nilai r = 0,996 dan nilai IC50 sebesar 17,79 mg/mL. Pada replikasi 3 adalah

y = 1,876x + 18,802 dengan nilai r = 0,993 dan nilai IC50 sebesar 16,63 mg/mL.

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase oleh Ekstrak Air Daun

Salam

Ekstrak daun salam yang telah didapatkan dari proses ekstraksi dengan

menggunakan pelarut air dimanfaatkan sebagai larutan uji yang bertujuan untuk

mengetahaui aktivitas penghambatan oleh ekstrak air daun salam terhadap enzim

alfa-amilase dengan variasi konsentrasi 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20

mg/mL, 25 mg/mL. Pada pengujian aktivitas penghamabatan enzim oleh ekstrak

tidak hanya melakukan pengujian terhadap larutan uji tetapi kelompok lain juga


14

mendapat perlakukan. Kelompok tersebut adalah kelompok blanko, kontrol blanko,

dan kontrol sampel.

Tabel IV. Persen penghambatan enzim alfa-amilase oleh ekstrak air

daun salam

Konsentrasi

(mg/mL)

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Rata-rata

5 13,18% 17,03% 17,30% 15,83%

10 27,88% 32,82% 29,94% 30,21%

15 41,75% 37,5% 36,40% 38,55%

20 42,17% 40,38% 37,77% 40,10%

25 48,62% 43,13% 48,90% 46,88%

Tabel V. Nilai IC50 Ekstrak Air Daun Salam

Replikasi IC50 (mg/mL) Rata-rata

1 24,34

26,206 mg/mL 2 28,24

3 26,04

Pada Tabel IV menunjukkan nilai persen penghamabatan ekstrak air daun

salam terhadap enzim alfa-amilase. Persamaan regresi linear yang didapatkan tabel

penghambatan oleh ekstrak air replikasi 1 adalah y = 1,905x + 3,615 dengan nilai r

= 0,960 dan nilai IC50 sebesar 24,34 mg/mL. Pada replikasi 2 adalah y = 1,195x +

16,244 dengan nilai r = 0,916 dan nilai IC50 sebesar 28,24 mg/mL. Pada replikasi 3

adalah y = 1,43x + 12,753 dengan nilai r = 0,993 dan nilai IC50 sebesar 26,04

mg/mL.

Perbedaan nilai persen penghambatan antar replikasi pada konsentrasi

5mg/mL acarbose dan antar replikasi pada konsentrasi 5, 10, 15, 20mg/mL ekstrak

air daun salam disebabkan karena adanya endapan pada larutan setelah penambahan

HCL pada saat melakukan proses penghentian reaksi enzimatik. Hal ini

menyebabkan hasil pembacaan yang bias pada instrumen spektrofotometer UV-

Vis. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis yaitu cahaya monokromatik akan

melalui suatu larutan, sebagian cahaya tersebut akan diserap, sebagian lagi

dipantulkan, dan sebagiannya lagi dihamburkan. Apabila suatu larutan masih

terdapat partikel-partikel akan terjadi hambatan cahaya, sehingga menyebabkan

absorbansi yang dibaca oleh instrumen menjadi bias. Oleh karena itu, larutan yang

digunakan dalam analisis harus dipastikan benar-benar jernih (USP., 2011).


15

Selanjutnya melakukan pengujian statistik (Lampiran 9) untuk memastikan

nilai yang telah didapatkan memiliki kebermaknaan antara persen penghambatan

dengan masing-masing konsentrasi. Tahapan pertama yaitu melakukan uji

distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk, apabila didapatkan nilai p-value

>0,05 maka nilai tersebut terdistribusi normal. Hasil yang didapatkan untuk persen

penghambatan ekstrak air daun salam dan acarbose menunjukkan nilai p-value

>0,05. Hal ini dapat dikatakan bahwa nilai dari kedua sampel tersebut terdistribusi

normal. Tahapan selanjutnya yaitu uji ANOVA satu arah untuk mengetahui

perbedaan antar kelompok. Secara deskriptif rata-rata aktivitas tertinggi dari

ekstrak air daun salam dan acarbose terdapat pada konsentrasi 25 mg/mL. Pada uji

homogenitas terhadap ekstrak air daun salam didapatkan nilai signifikansi sebesar

0,828 dan acarbose sebesar 0,758 menunjukkan bahwa kedua kelompok tersebut

memiliki nilai yang homogen ditandai dengan nilai siginifikansi >0,05. Untuk uji

ANOVA satu arah apabila nilai signifikansi <0,05 menunjukkan nilai rata-rata antar

kelompok memiliki perbedaan yang bermakna. Hasil yang didapatkan dari ekstrak

air daun salam adalah 0,00 dan acarbose adalah 0,00, sehingga disimpulkan bahwa

kedua kelompok tersebut memiliki perbedaan yang bermakna. Pengujian

selanjutnya yang dilakukan yaitu uji lanjutan Post Hoc dan dianalisis menggunakan

uji Sheffe taraf kepercayaan 95% untuk melihat apakah terdapat perbedaan yang

bermakna pada setiap kelompok konsentrasi. Nilai persen penghambatan antar

konsentrasi dibandingkan satu dengan yang lain. Setelah dibandingkan didapatkan

hasil p-value <0,05. Namun pada konsentrasi 15 mg/mL vs 20 mg/mL dari ekstrak

air daun salam memiliki p-value >0,05, serta konsentrasi 15 mg/mL vs 20 mg/mL

acarbose memiliki p-value >0,05. Secara statistik perbandingan konsentrasi yang

telah disebutkan tidak memiliki perbedaan yang bermakna antar konsentrasi.

Nilai IC50 merupakan nilai dari konsentrasi sampel yang dapat menghambat

aktivitas enzim sebesar 50%. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang

menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak sebagai variable x dengan persen

penghambatan sebagai variabel y. Hasil yang didapatkan dari pengujian

menunjukkan bahwa ekstrak air daun salam memiliki aktivitas penghambatan

enzim alfa-amilase dengan rata-rata nilai IC50 sebesar 26,206 mg/mL dan acarbose


16

dengan rata-rata sebesar 17,62 mg/mL. Semakin kecil nilai IC50 menandakan bahwa

semakin besar aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa-amilase. Berdasarkan

nilai IC50 yang didapatkan dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 ekstrak air daun

salam lebih besar dibandingkan dengan nilai IC50 acarbose. Hal ini menandakan

bahwa aktivitas pengambatan dari ekstrak air daun salam lebih rendah

dibandingkan dengan acarbose. Untuk memastikan IC50 esktrak air daun salam dan

acarbose memiliki perbedaan, maka dilakukan analisis statistik dengan uji T tidak

berpasangan. Hasil pengujian normalitas didapatkan bahwa kelompok IC50 ekstrak

air daun salam dan IC50 acarbose terdistribusi normal dengan nilai p-value >0,05.

Hasil uji T tidak berpasangan didapatkan hasil p-value <0,05 yang menandakan

bahwa kedua kelompok uji memiliki perbedaan yang bermakna secara statistik.

Penelitian yang dilakukan oleh Laoufi et al (2017) nilai IC50 acarbose yang

didapatkan yaitu 0,044±0,01 mg/mL menggunakan buffer sodium fosfat pH 6,9

sebagai pelarut enzim, DNSA sebagai pelarut larutan sampel, dan dipanaskan pada

water bath selama 7 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Penelitian lain

yang dilakukan oleh Riaz et al (2020) mendapatkan hasil nilai IC50 acarbose sebesar

0,83mg/mL menggunakan HCL 1M untuk menghentikan reaksi enzimatik dan

iodine sebagai reagen pewarna, absorbansi diukur menggunakan microplate reader.

Mumtaz et al (2018) juga melakukan penelitian uji aktivitas penghambatan enzim

alfa-amilase menggunakan acarbose sebagai kontrol positif dan mendapatkan nilai

IC50 sebesar 152,66±7,32 µg/mL dengan buffer fosfat pH 6,9 sebagai pelarut enzim,

diinkubasi pada suhu 25°C selama 10 menit dan diberikan DNS sebagai reagen

pewarna, absorbansi diukur menggunakan Elisa 96-ell micro-plate. Sedangkan

pada penelitian ini didapatkan nilai IC50 sebesar 17,62 mg/mL. Perbedaan yang

cukup jauh dengan penelitian sebelumnya disebabkan karena penggunaan bahan

yang berbeda yaitu pada penelitian ini menggunakan reagen pewarna iodine dan

untuk menghentikan reaksi enzimatis menggunakan HCL 1 M serta pada penelitian

ini menggunakan instrumen yang berbeda yaitu menggunakan spektrofotometer

UV-Vis.

Berawi et al (2017) melekukan penelitian secara in vitro menggunakan dua

metode ekstraksi yaitu menggunakan air dengan suhu lebih dari 90°C dan metode


17

maserasi terhadap daun salam, didapatkan hasil nilai rata-rata IC50 sebesar 0,431

mg/mL. Buffer fosfat pH 6,9 sebagai pelarut, pati sebagai substrat, iodine sebagai

reagen pewarna, dan HCL 1M sebagai katalis dalam menghentikan reaksi

enzimatik, absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer. Elya et al (2015)

juga melakukan penelitian secara in vitro menggunakan ekstrak etanol daun salam

dan didapatkan hasil nilai IC50 sebesar 90,34±1,43 µg/mL menggunakan pati

sebagai substrat dan DNS sebagai reagen pewarna serta untuk menghentikan reaksi

enzimatik, kemudian dilakukan pemanasan selama 15 menit. Sedangkan pada

penelitian ini didapatkan nilai IC50 sebesar26,206 mg/mL. Perbedaan nilai IC50 yang

cukup jauh disebabkan karena bahan yang digunakan berbeda terutama pada pelarut

yang digunakan yaitu menggunakan pelarut DMSO 1%, metode ektsraksi terhadap

daun salam yaitu metode infusa, dan pada saat proses pengukuran menggunakan

spektrofotometer UV-Vis ditemukan adanya partikel-partikel yang membuat nilai

absorbansi menjadi bias.

Enzim pencernaan (alfa-amilase) bertanggung jawab dalam memecah

molekul besar pati dari makanan yang dikonsumsi menjadi molekul kecil yang

dapat diserap ke dalam tubuh. Pengujian aktivitas enzim dapat dilakukan secara in

vitro dengan mengukur hasil pemecahan substrat oleh enzim yang telah diberikan

reagen pewarna biru yaitu iodin. Intensitas warna biru pada sampel uji berbanding

lurus dengan aktivitas penghambatan enzim, dengan kata lain penurunan intensitas

warna biru yang didapatkan menunjukkan terjadinya penghambatan terhadap

aktivias enzim dalam memecah substrat (Thangaraj., 2016).

Gambar 2. Struktur Kuersetin (Megar et al., 2020)


18

Temuan aktivitas penghambatan enzim pada ekstrak air daun salam diduga

karena adanya kandungan flavonoid. Flavonoid berperan sebagai inhibitor non

kompetitif pada enzim sehingga menurunkan efektivitas enzim pada proses

enzimatik. Kuersetin sebagai senyawa yang dipercayai memiliki aktivitas

penghambatan enzim merupakan salah satu jenis flavonol turunan dari grup

flavonoid. Interaksi yang terjadi pada penghambatan enzim berkaitan dengan gugus

hidroksil yang dimiliki oleh kuersetin. Melalui proses tersebut menyebabkan

penyerapan glukosa ke dalam darah dapat dikontrol, sehingga peningkatan kadar

gula darah pada penderita diabetes melitus dapat dicegah (Yuan et al., 2014).

Menurut Martinez-Gonzalesz et al (2019) kuersetin menunjukkan ikatan hidrogen

dengan residu asam amino Glutamin63, Arginin195, Aspartat197 serta ikatan Van der

Waals dengan residu asam amino Leusin165 dan Triptofan59 pada sisi aktif enzim

sehingga enzim mengalami penurunan aktivitas.

KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN

Ekstrak air daun salam memiliki aktivitas dalam menghambat enzim alfa-

amilase secara in vitro dengan nilai rata-rata persen penghambatan pada konsentrasi

5mg/mL yaitu 15,83%, konsentrasi 10mg/mL yaitu 30,21%, konsentrasi 15mg/mL

yaitu 38,55%, konsentrasi 20mg/mL yaitu 40,10%, konsentrasi 25mg/mL 46,88%.

Serta nilai rata-rata IC50 kontrol positif acarbose sebesar 17,62 mg/mL, sedangkan

nilai rata-rata IC50 ekstrak air daun salam sebesar 26,206 mg/mL. Hasil analisa

statistik yang dilakukan pada nilai IC50 ditemukan bahwa ekstrak air daun salam

dan acarbose memiliki perbedaan yang bermakna secara statistik dengan p-value

<0,05.

SARAN

Untuk penelitian selanjutnya dapat melakukan isolasi senyawa aktif daun

salam yang selektif dalam menghambat enzim alfa-amilase. Pengujian secara in

vitro juga dapat dilakukan untuk melihat efek ekstrak air daun salam dalam

menurunkan kadar gula darah dengan menghambat pemecahan molekul besar pati

menjadi molekul yang dapat diserap oleh tubuh. Untuk metode lain yang memiliki


19

sensitivitas lebih tinggi dapat digunakan dalam melakukan pengukuran persen

penghambatan ekstrak air daun salam terhadap enzim alfa-amilase. Perhitungan

IC50 dapat menggunakan persamaan polinomial terutama untuk penelitian yang

melibatkan enzim secara in vitro.

DAFTAR PUSTAKA

Andayani, R., Mubarak, Z., Rinanda, D.R., 2016. Aktivitas Antibakteri Tepung

Cacing Tanah (Lumbricus rubellus) Terhadap Enterococus faecalis Secara

In Vitro. Journal of Syiah Kuala Dentistry Society. 1 (2), 201-210.

Ariandi, 2016. Pengenalan Enzim Amilase (Alpha-Amylase) dan Reaksi

Enzimatisnya Menghidrolisis Amilosa Pati Menjadi Glukosa. 7 (1),

74–82.

Badan Pengawas Obat dan Makanan., 2012. Acuan Sediaan Herbal. Volume 7.


20

Edisi 1. Jakarta: Direktorat Obat Asli Indonesia Badan Pengawas Obat dan

Makanan RI.

Berawi, K.N., Shidarti, L., Nurdin, S.U., Lipoeto, N.I., Wahid, I., Jamsari.,

Nurcahyani, E., 2017. Comparison Effectiviness od Antidiabetic Activity

Extract Herbal Mixture of Soursop Leaves (Annona muricata), Bay Leave

(Syzygium polyanthum) and Peganggang Leaves (Centella asiatica).

Biomedical and Pharmacology Journal, 10 (3), 1481-1488.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia., 2008. Farmakope Herbal Indonesia

Edisi I. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Depaetemen Kesehatan Republik Indonesia., 2010. Suplemen I Farmakope

Herbal Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Elya, B., Handayani, R., Sauriasari, R., Azizahwati, Hasyyati, U.S., Permana, I.T.,

and Permatasari, Y.I., 2015. Antidiabetic Activity and Phytochemical

Screening of Extracts from Indonesian Plants by Inhibition of Alpha

Amylase, Alpha Glucosidase and Dipeptidyl Peptidase IV. Pakistan

Journal of Biological Sciences, 18 (6), 279–284.

Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi AnalisisI, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta.

Hames, B.D., Hooper, N.M., 2000. Biochemistry: The Instant Notes. 2nd edition,

Hongkong: Spinger-verlag.

International Diabetes Federation, 2017. IDF Diabetes Atlas. 8th ed. Intternational

Diabetes Federation.

Kamtekal, S., Keer, V., Patil, V., 2014. Estimation of Phenolic Content, Flavonoid

Content, Antioxidant and Alpha Amylase Inhibitory Activity of Marketed

Polyherbal Formulation. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(9),

61-65.

Kishore. D., Kundu, S., Kayastha, A.M., 2012. Thermal, Chemical and pH

Induced Denaturation of a Multimeric β-Galactosidase Reveals Multiple

Unfolding Pathways. Plos One, 7 (11), 1-9.

Laoufi, H., Benariba, N., Adjdir, A., Djaziri, R., 2017. In Vitro α-amylase and α-

glucodidase Inhibitory Activity of Ononis angustissima Extracts. Journal


21

of Applied Pharmaceutical Science, 7(2), 191-198.

Lelono, R.A.A. and Tachibana, S., 2013. Preliminary Studies of Indonesian

Eugenia polyantha Leaf Extracts as Inhibitors of Key Enzymes for Type 2

Diabetes. Journal of Medical Sciences, 13 (2), 103–110.

Loncaric, A., Pablo. L. J., Maria. G.E., Marta. L., 2017. Increasing water solubility

of Quercetin by increasing the temperature, Juan Pablo Lamas Castro, 89-

89.

Magar, T.R., Sohng, J.K., 2020. A Review on Structure, Modification and

Structure-Activity Relation of Quercetin and Its Derivatives, J. Microbiol.

Biotechnol, 30(1), 11-20.

Martinez-Gonzalesz, A.I., Diaz-Sanchez, A.G., de la Rosa, L.A., Bustos-Jaimes, I.,

Alvarez-Parrilla, E., 2019. Inhibition of α-amylase by Flavonoids: Structure

Activity Relationship (SAR), Spectrochimica Acta Part A: Molecular and

Biomolecular Spectroscopy, 206, 437-447.

Mumtaz, M.W, Al-Zuaidy, Hamid, A.A., Danish, M., Akhtar, M.T. Mukhtar, H.,

2018. Metabolite Profiling and Inhibitory Properties of Leaf Extracts of

Ficus benjamina Towards α-glucosidase and α-amylase. International

Journal of Food Properties, 21(1), 1560-1574.

Oboh, G., Ademosun, A.O., Ayeni, P.O., Omojokun, O.S., Bello, F., 2014.

Comparative Effect of Quercetin and Rutin on α-amylase, α-glucosidase,

and Some Pro-oxidant-induce Lipid Peroxidation in Rat Pancreas.

Comparative Clinical Pathology, 24 (5).

Owczarek, K. et al., 2016. Natural Deep Eutectic Solvents in Extraction Process.

Chemistry and Chemical Technology, 10 (4), 601.

Perkumpulan Endokrinologi Indonesia, 2015. Konsensus Pengelolaan dan

pencegahan diabetes melitus tipe 2 di indonesia 2015. PB. Perkeni.

Prahastuti, S., Tjahjani, S., Hartini, E., 2011. The Effect of Bay Leaf Infusion

(Sygyzium polyanthum) to Decrease Blood Total Cholesterol Level in

Dyslipidemia Model Wistar Rats. Jurnal Medika Planta, 1(4).

Pujiyanto, S., Wijanarka., Raharja, B., Anggreini, V., 2019. Aktivitas Inhibitor α-

Amilase Ekstrak Etanol Tanaman Brotowali (Tinaspora crispa L.). Bioma:


22

Berkala Ilmiah Biologi, 21 (2), 91-99.

Riaz, Z., Ali, M.N., Quershi, Z., Mohsin, M., 2020. In Vitro Investigation and

Evaluation of Novel Drug Based on Polyherbal Extract against Type 2

Diabetes. Journal of Diabetes Research, article ID 7357462.

Rivai, H., Yulianti, S., Chandra, B., 2019. Qualitative and Quantitative Analysis of

Hexan, Acetone, Ethanol, and Water Extract from Bay Leaves (Sygyzium

polyanthum (Weight) Walp.). The Pharmaceutical and Chemical Journal,

6(3), 13-20.

Saifudin, A., Rahayu, V., Taruna., Hilwan, Y., 2011. Standarisasi Bahan Obat

Alam. Edisi Pertama. Yogyakarta: Graha Ilmu.

Srivastava, M.M., 2011. High-Performance Thin-Layer Chromatography

(HPTLC). Springer, Berlin.

Sudradjat, S.E., 2016. Mengemal Berbagai Obat Herbal dan Penggunaanya.

Jurnal Kedokteran Meditek, 22(60), 62-71.

USP., 2011. <851> Spectrophotometry and Light-Scattering. The United States

Pharmacopeial Convention, 410-415.

Tangaraj, P., 2016. Pharmacological Assays of Plant-Based Natural Products.

Springer, India.

Widharna, R.M., Tamayanti, W.D., Hendriati, L., Hamid, I.S., Widjajakusuma,

E.C., 2015. Antidiabetic effect of the aqueous extract mixture of

Andrographis paniculata and Syzygium polyanthum Leaf. Europan Journal

of Medicinal Plants, 6(2), 82-91.

Widjajakusuma, E.C., Jonosewojo, A., Hendriati, L., Wijaya, S., Ferawati.,

Surjadhana, A., Sastrowardoyo, W., Monita, N., Muna, N. M., Fajarwati, R.

P., Ervina, M., Esar, S.Y., Soegianto, L., Lang, T., Heriyanti, C., 2019.

Phytochemical Screening and Preliminary Clinical Trial of The Aqueous

Extract Mixture of Andrographis paniculata (Burm. f.) Wall. ex Nees and

Syzygium polyanthum (Wight.) Walp Leaves in Metformin Treated Patients

With Type 2 Diabetes. Phytomedicine, 55, 137-147.


23

Yuan, E., Liu, B., Wei, Q., Yang, J., Chen, L., Li, Q., 2014. Structure Activity

Relationship of Flavonoids as Potent α-Amylase Inhibitors. Natural

Product Communications. 9(8); 1174-1176.


24

LAMPIRAN


25

Lampiran 1. Gambar Serbuk Simplisia Daun Salam dan Ekstrak Air Daun Salam

Gambar 3. Serbuk Simplisia Daun Salam

Gambar 4. Esktrak Air Daun Salam


26

Lampiran 2. Surat Keterangan Merapi Farma Herbal


27

Lampiran 3. Surat Keterangan Identifikasi Serbuk


28

Lampiran 4. Data penimbangan Serbuk Simplisia Daun Salam dan Perhitungan

Rendemen Ekstrak

- Data penimbangan serbuk simplisia

Setiap replikasi pembuatan ekstrak ditimbang 10 g serbuk simplisia

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Wadah 82,9841 44,8848 60,4566

Wadah + Isi 72,9836 54,8857 70,4569

Isi 10,0005 10,0009 10,0003

- Data penimbangan ekstrak

Replikasi 1 (g) Replikasi 3 (g) Replikasi 3 (g)

Wadah 52,0613 55,1317 52,4859

Wadah + Isi 53,6857 51,0303 51,0042

Isi 1,6244 4,41014 1,4817

- Perhitungan rendemen

Replikasi 1

% Rendemen: 1,6244

10,0005 × 100% = 16,24%

Replikasi 2

% Rendemen: 4,1014

10,0009 × 100% = 41, 01%

Replikasi 3

% Rendemen: 1,4817

10,0003 × 100% = 14,81%


29

Lampiran 5. Hasil Uji Kadar Air Serbuk Simplisia Daun Salam

- Penimbangan

Wadah 63,9128 g

Wadah + Isi 73,9128 g

Isi 10,0000 g

- Volume yang didapatkan 0,5 mL

- % Kadar Air = 0,5 mL

10,0000 g x 100% = 5%

Lampiran 6. Penimbangan Serbuk Simplisia dan Ekstrak Air Daun Salam untuk

KLT

- Serbuk simplisia Daun Salam

Wadah 62,6620 g


Isi 1,0000 g

- Ekstrak Air Daun Salam

Wadah 62,6555 g


Isi 1,0000 g


38

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Penghambatan

Enzim Alfa-Amilase oleh Ekstrak Air Daun Salam

Syzygium polyanthum (Wight) Walp. Secara In Vitro”

memiliki nama lengkap Ayu Priscilla Dewanti, lahir di

Jaar, 2 November 1998. Penulis merupakan anak pertama

dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Oktavianus

Triwibowo dengan Ibu Sri Dewi. Riwayat pendidikan

formal yang ditempuh penulis yaitu Sekolah Dasar di SDN

1 Jaar (2004-2010), Sekolah Menengah Pertama di SMPN

1 Tamiang Layang (2010-2013), dan Sekolah Menengah

Atas di SMAN 1 Tamiang Layang (2013-2016). Pada

tahun 2016 penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma. Selama masa perkuliahan penulis mengikuti berbagai macam

kegiatan di fakultas antara lain sebagai bendahara Desa Mitra 2 (2017), sebagai

sekertaris Live In PMK Apostolos (2018), sebagai anggota divisi dana dan usaha

Pharmacy Performance (2017), sebagai anggota divisi pendaftaran Seminar

Nasional Sadhar Entrepreneurship (2018), sebagai anggota divisi P3K TITRASI

(2018), sebagai peserta dalam Latihan Kepemimpinan Managerial Mahasiswa

Farmasi (2016), serta pernah mengikuti Seminar Nasional Faction 2018 “Healthy

Skin Makes a Dazzing New You”. Selain itu penulis pernah menjadi asisten

praktikum Farmakognosi Fitokimia (2018).


UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH EKSTRAK AIR DAUN ... · EKSTRAK AIR DAUN SALAM...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH EKSTRAK AIR DAUN ... · EKSTRAK AIR DAUN SALAM...