UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH … · 2020. 5. 12. · berjudul “Uji...

UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH

EKSTRAK ETANOL DAUN SAMBILOTO (Andrographis paniculata Nees.)

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Maria Cyrilla Iglesia Adi Nugrahanti

NIM : 168114091

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

https://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=ANPA2

i



SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :


NIM : 168114091

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020



ii

Persetujuan Pembimbing



SECARA IN VITRO

Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 168114091

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

(Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.) tanggal, 12 Februari 2020



iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Sebab Tuhan, Dia sendiri akan berjalan di depanmu, Dia sendiri akan menyertai

engkau, Dia tidak akan membiarkan engkau dan tidak akan meninggalkan

engkau; janganlah takut dan janganlah patah hati.

(Ulangan 31:8)


viii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana

layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 12 Februari 2020

Penulis,


v


viii

LEMBAR PERNYATAAN PESETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Maria Cyrilla Iglesia Adi Nugrahanti

Nomor Mahasiswa : 168114091

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah yang berjudul:



SECARA IN VITRO

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya

maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya,

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 12 Februari 2020

Yang menyatakan

(Maria Cyrilla Iglesia Adi Nugrahanti)

vi



viii

PRAKATA

Puji dan Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

segala berkat, pernyertaan serta kasih dan karunia-Nya dari awal penyusunan

sampai akhir penelitiaan, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase oleh Ekstrak Etanol

Daun Sambiloto (Andrographis Paniculata Nees.) secara In Vitro” dengan baik

dan lancar.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk

memperoleh gelar sarjana Strasta Satu Program Studi Farmasi (S.Farm.) Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa

selama proses penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, bimbingan dan

pengarahan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung.

Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan banyak terimakasih kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang telah senantiasa

memberikan arahan, masukan, serta pendampingan dengan sabar selama

proses awal penyusunan sampai akhir penelitian.

2. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku dosen penguji pada skripsi ini yang

telah memberikan bantuan serta saran untuk kesempurnaan skripsi ini.

3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji pada skripsi ini yang

telah memberikan saran serta bantuan untuk kesempurnaan skripsi ini.

4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik

yang selalu memberikan pendampingan sejak awal memasuki dunia

perkuliahaan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

5. Pak Yohanes Wagiran yang telah membantu kelancaran penelitian penulis.

6. Mas Antonius Dwi Priyana dan Mas Sarwanto selaku Sekretariat S1 Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah memberikan

informasi selama perkuliahan.

7. Bapak, Ibu, dan Adek yang selalu memberikan dukungan baik secara

psikologis maupun material sejak aku lahir

vii



viii

8. Rekan penelitian atas segala kerja sama, solidaritas, serta seluruh suka duka

sedari awal penyusunan hingga akhir penelitian.

9. Albertus Magnus Arya Abisatya selaku partner yang senantiasa memberikan

motivasi, nasihat, serta dukungan.

10. Teman-teman FSMB 2016 yang telah hadir sejak awal masuk dunia

perkuliahan hingga saat ini.

11. Teman-teman oscaranger yang selalu menjadi support system sejak awal

memasuki dunia perkuliahan hingga kapanpun.

12. Serta seluruh pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Selama proses penyusunan skripsi, penulis menyadari bahwa masih terdapat

banyak kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan

adanya kritik, saran, dan masukan yang membangun agar naskah kripsi ini dapat

menjadi lebih baik lagi dan dapat bermanfaat untuk pengembangan ilmu

pengetahuan. Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat

bagi semua pembaca.

Yogyakarta, 12 Februari 2020

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..................................... vi

PRAKATA ................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ............................................................................................ ix

DAFTAR TABEL ..................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xii

ABSTRAK ................................................................................................ xiii

ABSTRACT ................................................................................................ xiv

PENDAHULUAN ................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ......................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................. 13

KESIMPULAN ........................................................................................ 24

SARAN .................................................................................................... 24

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 25

LAMPIRAN ............................................................................................. 27

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................. 30


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai Rf dan warna hasil uji KLT serbuk simplisia dan

ekstrak etanol daun sambiloto .....................................................................

17

Tabel II. Persen penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh

ekstrak etanol daun sambiloto…………………………….

19

Tabel III. Persen penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh

ekstrak etanol daun sambiloto…………………………….

19

Tabel IV. Tabel hasil analisis uji Mann-Whitney pada persen

penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh ekstrak

etanol daun sambiloto .................................................................................

21

Tabel V. Nilai IC50 larutan acarbose…………………………………. 22

Tabel VI. Nilai IC50 larutan sampel uji ....................................................................... 22


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil elusi KLT ......................................................................................... 16

Gambar 2. Serbuk Simplisia Daun Sambiloto ............................................................ 27

Gambar 3. Ekstrak Etanol Daun Sambiloto ................................................................ 27


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar Serbuk Simplisia Daun Sambiloto dan Ekstrak

Etanol Daun Sambiloto ................................................................................

Lampiran 2. Surat Keterangan Hasil Determinasi Tanaman

Andrographis paniculata Nees. Oleh Fakultas Farmasi

UGM .........................................................................................................

Lampiran 3. Surat Legalitas Analisis Data oleh Pusat Kajian

CE&BU Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat,

dan Keperawatan UGM ............................................................................

28

27

29


xiii

ABSTRAK

Diabetes melitus merupakan penyakit metabolik dengan

karakteristik hiperglikemi, kondisi ini disebabkan oleh ketidakmampuan

tubuh untuk memproduksi cukup insulin atau ketidakmampuan untuk

menggunakan insulin. Salah satu tanaman Indonesia yang banyak

digunakan secara tradisional di masyarakat sebagai obat penyakit diabetes

mellitus adalah sambiloto. Berdasarkan aktivitas antihiperglikemi dari

tanaman sambiloto, maka dilakukan penelitian mengenahi efek

penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak etanol daun sambiloto

secara invitro. Berdasarkan hasil pengujian yang dilakukan, didapatkan

hasil bahwa terdapat aktivitas penghambatan aktivitas enzim alfa amilase

oleh ekstrak etanol daun sambiloto, dilihat dari nilai % penghambatan dan

nilai IC50. Berdasarkan analisis statistika dari nilai persen penghambatan,

didapatkan hasil bahwa seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak

etanol daun sambiloto, maka persen (%) penghambatan yang dihasilkan

semakin baik hal ini dapat dilihat dari bentuk kurva yang linier serta hasil

yang berbeda bermakna antar konsentrasi (p-value<0,05). Nilai IC50 rata-

rata acarbose sebesar 0,972 ± 0,044 mg/ml dan nilai IC50 rata-rata ekstrak

etanol daun sambiloto adalah 9,253 ± 0,116 mg/ml. Berdasarkan hasil

statistika antara dua kelompok didapatkan hasil yang berbeda bermakna

(p-value < 0,05), sehingga dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan

daya hambat antara acarbose dengan ekstrak etanol daun sambiloto

terhadap aktivitas enzim alfa amilase.

Kata kunci: diabetes, daun sambiloto, ekstrak etanol, remaserasi,

antidiabetes, spektrofotometri, enzim alfa amilase


xiv

ABSTRACT

Diabetes is a metabolic disease with hyperglycemic characteristic,

this condition is caused of inability to produce enough insulin or inability

of the body to use it. One of many plants in Indonesia that has been used

traditionally to cure diabetes such as sambiloto. Based on it is anti-

hyperglycemic activity from sambiloto, so the research of it’s alpha

amylase enzyme inhibition from sambiloto ethanol extract as in vitro.

Based on the results of tests, it was found that there was an inhibitory

activity of the alpha amylase enzyme activity by the ethanol extract of the

sambiloto leaf, seen from %inhibitory and IC50 value. Based on statistical

analysis of the value of %inhibition, it was found that along with the

increase in the concentration of ethanol extract of sambiloto leaf, the

%inhibition produced the better this can be seen from the linear curve

shape and the significantly different results between concentrations.

Acarbose IC50 mean value is 0,972±0,044 mg/ml and sambiloto ethanol

extract IC50 mean value is 9,253±0,116 mg/ml. Based on statistic result of

these two groups it can be concluded that the result has a significant

different (p-value<0,05), so it can be concluded that there is a different

inhibition ability between acarbose and sambiloto ethanol extract toward

alpha amylase enzyme activity.

Keyword: diabetes, sambiloto leave, ethanol extract, re-maceration, anti-

diabetic, spectrophotometry, alpha amylase enzyme


1

PENDAHULUAN

Diabetes melitus (DM) merupakan penyakit metabolik dengan

karakteristik hiperglikemi, kondisi ini disebabkan oleh ketidakmampuan tubuh

untuk memproduksi cukup insulin atau ketidakmampuan untuk menggunakan

insulin (International Diabetes Federation, 2015). Tingkat prevalensi penderita

diabetes di dunia pada tahun 2017 terdapat sebanyak 425 juta penduduk menderita

diabetes, diperkirakan pada tahun 2045 jumlah tersebut akan meningkat sebesar

48% menjadi 629 juta penduduk. Sedangkan tingkat prevalensi di Indonesia pada

tahun 2017, terdapat sebanyak 10 juta penduduk Indonesia menderita diabetes,

dan dengan angka tersebut Indonesia menduduki urutan ke enam dengan jumlah

penderita diabetes terbanyak di Dunia (International Diabetes Federation, 2017).

Pemberian penghambat enzim alfa amilase merupakan salah satu talaksana

keadaan hiperglikemi pada pasien penderita diabetes melitus. Pemberian

penghambat enzim alfa amilase ini dapat membantu menurunkan kadar glukosa

darah postprandial dengan mekanisme kerja menghambat pemecahan karbohidrat

sehingga dapat mengurangi absorbsi glukosa (Ali, Houghton, and Soumyanath,

2006). World Health Organization (WHO) menyebutkan bahwa hingga saat ini

sebanyak 65% dari penduduk negara-negara maju telah menggunakan pengobatan

tradisional, termasuk penggunaan obat-obat dari bahan alam (Departemen

Kesehatan RI, 2007). Selain itu, menurut hasil penelitian Supardi dan Susyanty

(2010), dalam kurun waktu tujuh tahun, presentase penduduk Indonesia yang

menggunakan obat tradisional dalam pengobata sendiri terus meningkat. Salah

satu tanaman Indonesia yang banyak digunakan secara tradisional di masyarakat

sebagai obat penyakit diabetes mellitus adalah sambiloto

(Andrographis paniculata Nees.).

Menurut penelitian Chao and Lin (2010), tanaman sambiloto mengandung

beberapa senyawa utama seperti diterpen lakton dan flavonoid. Andrografolid

merupakan salah satu senyawa yang masuk ke dalam golongan diterpen lakton

dan banyak terdapat pada tanaman sambiloto terutama pada bagian daun. Ekstrak

daun dari tanaman sambiloto mengandung 0,5 - 6% senyawa. Menurut


2

Subramanian et al (2008), andrografolid dilaporkan memiliki bebagai macam

aktivitas biologis salah satunya adalah antidiabetes. Kandungan senyawa

andrografolid dapat membantu menurunkan kadar glukosa darah dengan

membantu menghambat penyerapan glukosa melalui penghambatan enzim alfa

glukosidase dan alfa amilase. Pada penelitian ini ektraksi dilakukan dengan

menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol. Menurut Farmakope Herbal

Indonesia (2008), pembuatan ekstrak dari serbuk kering simplisia dibuat dengan

menggunakan metode maserasi dengan pelarut yang sesuai, pelarut yang sesuai

untuk pembuatan ekstrak tanaman sambiloto adalah etanol.

Sampai saat ini sudah terdapat banyak penelitian mengenahi ekstrak etanol

daun sambiloto yang mampu menghambat penyerapan glukosa melalui

penghambatan enzim alfa amilase. Menurut penelitian Subramanian, Asmawi, dan

Sadikun (2008), ekstrak etanol daun sambiloto mampu menghambat aktivitas

enzim alfa amilase secara in vitro. Penelitian ini dilakukan menggunakan metode

maserasi dengan pelarut etanol 20% dan dilakukan dengan metode microplate.

Penelitian ini dilakukan padaa enam tingkat konsentrasi yakni 1,95 ; 3,9 ; 7,8 ;

15,6 ; 31,25 ; 62,5 mg/mL, dari enam konsentrasi tersebut dihasilkan nilai persen

penghambatan berkisar antara 12,5 hingga 52,5%. Selain itu menurut penelitian

Rais dkk (2013), pemberian isolate andrografolide memiliki aktivitas

penghambatan terhadap enzim alfa amilase. Konsentrasi paling rendah

menunjukan aktivitas penghambatan sebesar 16%, sedangkan aktivitas tertinggi

daya hambat enzim alfa amilase ditunjukkan pada dosis 5 mg/mL dengan persen

penghambatan 28%. Pada penelitian dilakukan dengan menggunakan metode

microplate. Oleh karena itu peneliti tertarik untuk melakukan penelitian terhadap

potensi dari ekstrak etanol daun sambiloto dalam menghambat aktivitas enzim

alfa amilase, sehingga nantinya dapat digunakan sebagai pengobatan alternatif

untuk penderita diabetes.


3

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi senyawa baku

andrografolide (SIGMA), etanol teknis 70%, etanol pro analysis (E.Merck),

toluene pro analysis (E.Merck), kloroform pro analysis (E.Merck), methanol pro

analysis (E.Merck), aqua bidestilata, dimethylsulfoxide pro analysis (E.Merck),

enzim alfa amilase (SIGMA), tablet acarbose, amilum, natrium fosfat, dan

natrium klorida. Seluruh bahan yang digunakan diperoleh dari laboratorium

Farmakognosi dan Fitokimia Universitas Sanata Dharma. Serta serbuk simplisia

daun sambiloto yang diperoleh dari PT. HRL Internasional, Jawa Timur.

Alat Penelitian

Alat yang digunakan untuk penelitian ini adalah timbangan analitik

(Mettler Toledo®), seperangkat alat penyulingan untuk penetapan kadar air

(MTOPS®), alumunium foil, shaker (Innova® 2100), corong buchner, kertas

saring whatman no. 1, pompa vakum (GAST®), waterbath, hot plate, vortex,

spektrofotometer (Shimadzu), rotary evaporator (BUCHI ®), mikropipet, corong

pisah, glass firn, cawan porselin, sendok sagu, mortir, stamper serta alat-alat

gelas (Pyrex®).

Tata Cara Penelitian

Pengumpulan Bahan Uji dan Identifikasi Serbuk Simplisia Daun Sambiloto

Bahan uji yang digunakan adalah serbuk simplisia daun sambiloto yang

diperoleh dari PT. HRL Internasional, Jawa Timur. Kemudian dilakukan

identifikasi serbuk simplisia daun sambiloto di Laboratorium Biologi Farmasi,

Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Uji Kualitatif Serbuk Simplisia Daun Sambiloto

Uji kualitatif kandungan andrografolid dalam penelitian ini menggunakan

metode KLT sesuai yang tertera dalam Farmakope Herbal Indonesia (2008).


4

Sebelum melakukan pengujian, terlebih dahulu dilakukan penjenuhan bejana

dengan menggunakan kertas saring yang telah disesuaikan tinggi dan lebarnya

dengan bejana yang digunakan. Pengujian secara kualitatif dengan KLT dilakukan

dengan menyiapkan 1 g serbuk simplisia dalam 10 ml etanol pa yang kemudian

dikocok diatas penangas air selama 10 menit dan 0,01 g pembanding

andrografolid dalam 10 mL etanol pa. Fase gerak yang digunakan adalah

kloroform : methanol dengan perbandingan 9 : 1, sedangkan fase diam yang

digunakan adalah plat KLT silica gel 60 GF245. Volume penotolan larutan uji dan

larutan senyawa pembanding sebanyak 4 µL. Pengamatan noda dilakukan pada

UV254. Parameter yang diukur dalam identifikasi senyawa aktif adalah warna

bercak yang dibandingkan dengan senyawa pembanding dan nilai Rf dari bercak

yang terelusi (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2008).

Adapun plat KLT yang digunakan dengan rancangan : tinggi plat 15 cm lebar plat

5 cm, batas tepi bawah sebesar 1,5 cm, jarak elusi senyawa 10 cm, jarak antar

totolan perlakuan 1 cm.

Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto

Penetapan kadar air dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Menurut Farmakope

Herbal Indonesia (2008) penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan

metode destilasi toluen. Pertama tama terlebih dahulu dibuat pereaksi toluen jenuh

air dengan cara mengocok toluen P dengan sedikit air dengan menggunakan

corong pisah kemudian dibiarkan terpisah dan lapisan air dibuang. Setelah itu, 10

gram simplisia kering daun sambiloto dan 200 ml toluen jenuh air dimasukan

kedalam labu. Kemudian labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah

toluen mulai mulai mendidih, penyulingan diatur dengan kecepatan lebih kurang 2

tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan

penyulingan dinaikan hingga 4 tetes tiap detik, dan penyulingan dilanjutkan

selama 5 menit. Setelah selesai, tabung didinginkan hingga suhu ruang dan


5

kemudian volume air dibaca setelah toluen dan air terpisah. Kadar air dapat

dihitung dengan menggunakan rumus:

adar olume air

erat simplisia yang ditimbang g

Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sambiloto

Pembuatan ekstrak etanol daun sambiloto dilakukan dengan metode

maserasi sesuai dengan Thangraj (2016) dan Farmakope Herbal Indonesia (2008).

Sebanyak 10 gram serbuk simplisia ditimbang dan dilarutkan ke dalam 100 mL

pelarut etanol 70% , ditutup, kemudian dibiarkan selama 24 jam, terlindung dari

cahaya matahari, dan sambil terus diaduk dengan menggunakan alat shaker

dengan kecepatan 200 rpm. Hasil maserat kemudian disaring dengan

menggunakan corong Buchner yang telah dilapisi kertas saring Whatman No. 1

sambil di vakum. Serbuk hasil penyarian dimaserasi kembali dengan pelarut

etanol yang baru sebanyak 100 mL selama 24 jam, proses maserasi ini dilakukan

sebanyak 3 kali untuk mengoptimalkan penyarian senyawa andrografolid pada

serbuk simplisia daun sambiloto.

Hasil maserat pertama, kedua, dan ketiga kemudian dimasukkan ke

dalam rotary evaporator pada suhu 60 oC untuk menguapkan pelarut etanol yang

terdapat pada ekstrak. Kemudian, ekstrak diletakkan pada cawan petri dan

diuapkan kembali dengan menggunakan waterbath pada suhu 60-75 oC untuk

menghilangkan pelarut yang masih terdapat dalam ekstrak. Ekstrak yang

didapatkan merupakan ekstrak kental dengan bobot tetap sesuai dengan syarat

yang ada. Selanjutnya, rendemen dihitung dengan menggunakan rumus:

endeman obot ekstrak g

obot simplisia yang hitung g

(Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2008).


6

Uji Kualitatif Ekstrak Etanol Daun Sambiloto

Uji kualitatif kandungan andrografolid yang terdapat pada ekstrak etanol

daun sambiloto dilakukan dengan menggunakan metode KLT. Sebelum

melakukan pengujian, terlebih dahulu dilakukan penjenuhan bejana dengan

menggunakan kertas saring yang telah disesuaikan tinggi dan lebarnya dengan

bejana yang digunakan. Larutan uji yang masih berupa ekstrak kental ekstrak

etanol daun sambiloto, diencerkan dengan menggunakan pelarut DMSO 1%

sesuai dengan perlakuan ekstrak pada uji penghambatan aktivitas enzim alfa

amilase. Konsentrasi larutan uji yang digunakan merupakan konsentrasi terkecil

pada uji penghambatan aktivitas enzim alfa amilase yakni sebesar 2,5 mg/ml.

Senyawa pembanding yang digunakan yaitu andrografolid 0,1%.

Fase gerak yang digunakan adalah kloroform : methanol dengan

perbandingan 9 : 1, sedangkan fase diam yang digunakan adalah plat KLT silica

gel 60 GF245. Adapun plat KLT yang digunakan dengan rancangan : tinggi plat

15 cm lebar plat 5 cm, batas tepi bawah sebesar 1,5 cm, jarak elusi senyawa 10

cm, jarak antar totolan perlakuan 1 cm. Volume penotolan larutan uji dan larutan

senyawa pembanding sebanyak 4 µL. Pengamatan noda dilakukan pada UV254.

Parameter yang diukur dalam identifikasi senyawa aktif adalah warna bercak

yang dibandingkan dengan senyawa pembanding dan nilai Rf dari bercak yang

terleusi (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2008).

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase

Uji aktivitas penghambatan enzim alfa amilase merujuk pada modifikasi

penelitian milik Bhutkar et al. (2018).

Pembuatan Larutan Dapar Fosfat pH 6,9

Natrium fosfat (NaOH) sebanyak 328 mg dilarutkan ke dalam 40 mL aqua

bidestilata dan dimasukan kedalam labu ukur 100 mL. Ditambahkan 39,195 mg

natrium klorida (NaCl) yang telah diencerkan dengan aqua bidestilata sebanyak

10 mL, kemudian larutan buffer diencerkan dengan aqua bidestilata hingga 100

mL.


7

Pembuatan Larutan Enzim Alfa Amilase

Pembuatan larutan enzim alfa amilase dilakukan dengan mengambil

sebanyak 2,5 µL enzim alfa amilase SIGMA, kemudian diencerkan dengan

menggunakan buffer fosfat pH 6,9 hingga 50 mL.

Pembuatan Larutan DMSO 1%

Dimethylsulfoxide pro analysis (DMSO) 1 ml diencerkan dengan aqua

bidestilata hingga 100 ml.

Pembuatan Larutan Pati 1%

Pembuatan larutan pati 1% dilakukan dengan melarutkan serbuk pati

sebanyak 0,5 gram ke dalam 50 mL aqua bidestilata.

Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sambiloto

Seri konsentrasi Ekstrak dibuat dalam konsentrasi 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10

mg/mL. Sebanyak 100 mg ekstrak kental daun sambiloto dilarutkan kedalam labu

ukur 10 mL dengan menggunakan DMSO 1%, dihasilkan konsentrasi ekstrak 10

mg/mL (labu 1). Diambil sebanyak 7,5 mL dari labu pertama, dan dimasukan

kedalam labu ukur kedua, kemudian ditambah DMSO 1% hingga tanda batas, dan

dihasilkan konsentrasi ekstrak 7,5 mg/mL (labu 2). Diambil 6,67 mL larutan dari

labu kedua, dan dimasukan ke dalam labu ukur ketiga, kemudian ditambah

DMSO 1% hingga tanda batas dan dihasilkan konsentrasi ekstrak 5 mg/mL (labu

3). Konsentrasi 2,5 mg/mL dibuat dengan mengambil sebanyak 5 mL larutan dari

labu ketiga dan dimasukan ke dalam labu ukur keempat, kemudian ditambah

DMSO 1% hingga tanda batas.

Pembuatan Seri Konsentrasi Acarbose

Seri konsentrasi acarbose dibuat dalam konsentrasi 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10

mg/mL. Sebanyak 2 tablet acarbose digerus kemudian dilarutkan kedalam labu

ukur 10 mL dengan menggunakan aqua bidestilata, dihasilkan konsentrasi

acarbose 10 mg/mL (labu 1). Diambil sebanyak 7,5 mL dari labu pertama, dan

dimasukan kedalam labu ukur kedua, kemudian ditambah aqua bidestilata hingga

tanda batas, dan dihasilkan konsentrasi acarbose 7,5 mg/mL (labu 2). Diambil


8

6,67 mL larutan dari labu kedua, dan dimasukan ke dalam labu ukur ketiga,

kemudian ditambah aqua bidestilata hingga tanda batas dan dihasilkan

konsentrasi acarbose 5 mg/mL (labu 3). Konsentrasi 2,5 mg/mL dibuat dengan

mengambil sebanyak 5 mL larutan dari labu ketiga dan dimasukan ke dalam labu

ukur keempat, kemudian ditambah aqua bidestilata hingga tanda batas.

Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang dilakukan sebelum dilakukan pengujian

untuk menentukan kondisi optimum. Larutan pati 1% diambil sebanyak 1 mL dan

dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan sebanyak 1 mL ekstrak

dengan konsentrasi terkecil yang digunakan dalam pengujian efek penghambatan,

yakni 2,5 mg/ml . Setelah itu, ditambahkan 1 mL enzim alfa amilase dan 2 mL

buffer fosfat pH 6,9, kemudian larutan digojog hingga homogen dengan

menggunakan vortex kemudian diinkubasi selama 30 menit. Reaksinya dihentikan

dengan penambahan 1 mL HCL 1 N, kemudian ditambahkan 0,1 ml indikator

iodine-iodide. Dilakukan pengukuran dengan menggunakan spektrofotometer

pada panjang gelombang 400-800 nm. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali.

Penentuan Optimization Time

Penentuan optimization time dilakukan sebelum dilakukan pengujian untuk

menentukan waktu optimum yang dibutuhkan oleh enzim untuk bereaksi. Larutan

pati 1% diambil sebanyak 1 mL dan dimasukan kedalam tabung reaksi dan

ditambahkan sebanyak 1 mL ekstrak dengan konsentrasi terkecil yang digunakan

dalam pengujian efek penghambatan, yakni 2,5 mg/ml . Setelah itu, ditambahkan

1 mL enzim alfa amilase dan 2 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian larutan

digojog hingga homogen dengan menggunakan vortex kemudian diinkubasi

selama 5 ; 10 ; 15 ; 30 menit untuk menentukan waktu optimum enzim untuk

beraksi. Reaksinya dihentikan dengan penambahan 1 mL HCL 1 N, kemudian

ditambahkan 0,1 ml indikator iodine-iodide. Serapan diukur dengan

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum

yang telah dicari sebelumnya

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Blanko Acarbose


9

Larutan pati 1% diambil sebanyak 1 mL dan dimasukan kedalam tabung

reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 mL aqua bidestilata. Setelah itu,

ditambahkan 1 mL enzim alfa amilase dan 2 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian

larutan digojog hingga homogen dengan menggunakan vortex kemudian

diinkubasi selama 10 menit. Reaksinya dihentikan dengan penambahan 1 mL

HCL 1 N, kemudian ditambahkan 0,1 ml indikator iodine-iodide. Serapan diukur

dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang

maksimum yang telah dicari sebelumnya dan dilakukan pengujian sebanyak 3

kali.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Kontrol Blanko Acarbose


reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 mL aqua bidestilata. Setelah itu,

ditambahkan sebanyak 3 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian larutan digojog

hingga homogen dengan menggunakan vortex kemudian diinkubasi selama 10

menit. Reaksinya dihentikan dengan penambahan 1 mL HCL 1 N, kemudian

ditambahkan 0,1 ml indikator iodine-iodide. Serapan diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum yang telah dicari

sebelumnya dan dilakukan pengujian sebanyak 3 kali.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Acarbose


reaksi, kemudian larutan acarbose dengan konsentrasi 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/ml

diambil masing masing 1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu,

ditambahkan 1 mL enzim alfa amilase dan 2 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian






kali.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Kontrol Acarbose


10


reaksi, kemudian larutan acarbose dengan konsentrasi 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/ml

diambil masing masing 1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu,

ditambahkan 3 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian larutan digojog hingga

homogen dengan menggunakan vortex kemudian diinkubasi selama 10 menit.

Reaksinya dihentikan dengan penambahan 1 mL HCL 1 N, kemudian




Pengujian Efek Penghambatan Larutan Blanko Sampel


reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 mL DMSO 1%. Setelah itu, ditambahkan

1 mL enzim alfa amilase dan 2 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian larutan digojog

hingga homogen dengan menggunakan vortex kemudian diinkubasi selama 10

menit. Reaksinya dihentikan dengan penambahan 1 mL HCL 1 N. , kemudian




Pengujian Efek Penghambatan Larutan Kontrol Blanko Sampel


reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 mL DMSO 1%. Setelah itu, ditambahkan

3 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian larutan digojog hingga homogen dengan

menggunakan vortex kemudian diinkubasi selama 10 menit. Reaksinya dihentikan

dengan penambahan 1 mL HCL 1 N, kemudian ditambahkan 0,1 ml indikator

iodine-iodide. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis

pada panjang gelombang maksimum yang telah dicari sebelumnya dan dilakukan

pengujian sebanyak 3 kali.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Sampel


reaksi, kemudian larutan uji ekstrak etanol daun sambiloto dengan konsentrasi 2,5


11

; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/ml diambil masing masing 1 ml dan dimasukan ke dalam

tabung reaksi. Setelah itu, ditambahkan 1 mL enzim alfa amilase dan 2 mL buffer

fosfat pH 6,9, kemudian larutan digojog hingga homogen dengan menggunakan

vortex kemudian diinkubasi selama 10 menit. Reaksinya dihentikan dengan

penambahan 1 mL HCL 1 N, kemudian ditambahkan 0,1 ml indikator iodine-

iodide. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada

panjang gelombang maksimum yang telah dicari sebelumnya dan dilakukan

pengujian sebanyak 3 kali.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Kontrol Sampel


reaksi, kemudian larutan uji ekstrak etanol daun sambiloto dengan konsentrasi 2,5

; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/ml diambil masing masing 1 ml dan dimasukan ke dalam

tabung reaksi. Setelah itu, ditambahkan 3 mL buffer fosfat pH 6,9, kemudian






kali.

Perhitungan Nilai IC50

Perhitungan % aktivitas penghambatan enzim alfa amilase dapat dihitung

dengan menggunakan rumus:

nhibisi As

Ac

(Bhutkar et al. 2018)

Keterangan:

Ac : Perubahan absorbansi larutan uji tanpa ekstrak etanol daun sambiloto

(Blanko (abs dengan enzim) – Kontrol blanko (abs tanpa enzim))

As : Perubahan absorbansi larutan uji dengan ekstrak etanol daun sambiloto

(Sampel (abs dengan enzim) – Kontrol Sampel (abs tanpa enzim))


12

Nilai IC50 dihitung dengan menggunakan rumus persamaan regresi linier

untuk menentukan persaman y = bx + a. Aktivitas penghambatan dinyatakan

dengan Inhibition Concentration 50% (IC50) yaitu konsentrasi dari sampel yang

dapat menghambat aktivitas enzim sebesar 50% (Subramanian et al, 2008). Nilai

konsentrasi sampel sebagai variable x sedangkan % inhibisi sebagai variable y.

Nilai IC50 didapatkan dari nilai x setelah mengganti y = 50. Atau dihitung dengan

menggunakan rumus:

a

b

Analisis Hasil

Data uji KLT dibuat dalam bentuk tabel dan grafik, selanjutnya hasil di

deskripsikan. Data uji aktivitas penghambatan enzim alfa amilase dihitung dari

nilai absorbansi dan persen penghambatan yang di dapatkan, kemudian

menghitung nilai IC50 dengan menggunakan regresi linier.

Analisis data persen penghambatan diukur secara statistik yang diawali

dengan menguji distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Apabila data yang

didapatkan terdistribusi normal (nilai P > 0,05), maka dilanjutkan dengan uji One

Way ANOVA, dan apabila ditemukan perbedaan maka dilanjutkan dengan Post-

Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%. Sedangkan apabila didapatkan data yang

tidak terdistribusi normal (nilai P < 0,05), maka dilanjutkan dengan uji Kruskal-

Wallis, dan apabila ditemukan perbedaan maka dilanjutkan dengan uji Mann-

Whitney pada taraf kepercayaan 95%. Sedangkan analisis data nilai IC50 dilakukan

dengan menguji distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk, yang kemudian

dlanjutkkan dengan uji T tidak berpasangan.


13

HASIL DAN PEMBAHASAN

Serbuk simplisia daun sambiloto yang digunakan dalam penelitian ini

didapatkan dari PT. HRL Internasional, Jawa Timur. Serbuk simplisia tersebut

diidentifikasi dengan menggunakan metode mikroskopis. Hasil Identifikasi serbuk

menunjukan bahwa serbuk simplisia yang digunakan adalah daun sambiloto

dengan nama latin Andrographis paniculata Nees. yang ditunjukan pada surat

keterangan (Lampiran 2) sehingga serbuk simplisia yang digunakan dalam

penelitian ini sudah tepat.

Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar air pada serbuk simplisia

daun sambiloto dengan menggunakan metode destilasi toluen sesuai yang tertera

dalam Farmakope Herbal Indonesia. Prinsip dari penetapan kadar air dalam

simplisia adalah pengukuran kandungan air yang berada di dalam bahan, yang

dilakukan dengan cara yang tepat diantara cara titrasi, destilasi, atau gravimetri,

sedangkan tujuan dari penetapan kadar air adalah memberikan batasan minimal

atau rentang tentang besarnya kandungan air di dalam bahan (Badan Pengawas

Obat dan Makanan, 2000). Persyaratan kadar air untuk serbuk simplisia yang

dapat diterima adalah ≤ 1 adan Pengawas Obat dan Makanan, 2 14 ;

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2008). Kelebihan air di dalam serbuk

simplisia dapat menyebabkan memudahkan pertumbuhan mikroba, jamur, dan

mikroorganisme lainnya. Dalam penetapan kadar air serbuk simplisia daun

sambiloto didapatkan volume air sebesar 0,7 ml dan berat serbuk simplisia yang

ditimbang adalah 10 gram sehingga kadar air serbuk simplisia daun sambiloto

yang didapatkan dalam penelitian ini sebesar 7%. Dari hasil penelitian tersebut,

menunjukan bahwa kadar air serbuk simplisia daun sambiloto telah memenuhi

persyaratan kadar air yang telah ditetapkan yaitu ≤ 1 .

Ekstraksi serbuk simplisia daun sambiloto dilakukan dengan

menggunakan metode maserasi. Metode maserasi merupakan suatu metode

ekstraksi cara dingin dengan cara perendaman dengan menggunakan pelarut

dengan sesekali pengocokan atau pengadukan dengan temperatur kamar


14

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000). Prinsip dari metode maserasi

adalah pelarut masuk ke dalam rongga sel yang mengandung suatu zat aktif,

sehingga zat aktif akan larut ke dalam cairan penyari. Perbedaan konsentrasi

antara larutan zat aktif di dalam sel dengan larutan zat aktif di luar sel, akan

menyebabkan terjadinya distribusi zat aktif ke luar sel. Peristiwa tersebut terjadi

secara berulang, sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi zat aktif antara

larutan di dalam sel dengan di luar sel (Sulistyani, 2018).

Proses maserasi dalam penelitian ini dilakukan sebanyak 3 kali dengan

menggunakan pelarut dan jumlah pelarut yang sama untuk mengoptimalkan

penyarian senyawa andrografolid pada serbuk simplisia daun sambiloto. Setelah

dilakukan proses maserasi berulang (remaserasi) sebanyak 3 kali, kemudian

maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan dengan Rotary evaporator pada suhu

60oC sesuai informasi yang tertera dalam layar Rotary evaporator. Kemudian

filtrat yang sudah dipekatkan diupkan kembali diatas waterbath dengan suhu

78oC untuk menghilangkan pelarut yang masih terdapat dalam ekstrak. Ekstrak

yang di dapatkan merupakan ekstrak kental dengan bobot tetap. Menurut

Departemen Kesehatan Republik Indonesia (2008), bobot tetap diperoleh apabila

2 kali penimbangan secara berturut-turut setelah dipijarkan selama 1 jam tidak

lebih dari 0,25% atau perbedaan penimbanagn tidak melebihi 0,5 mg.

Dilakukan 3 kali replikasi dalam pembuatan ekstrak kental daun

sambiloto. Bobot ekstrak kental yang didapatkan pada replikasi pertama adalah

2,1242 dan serbuk yang ditimbang adalah 10,0011 gram sehingga didapatkan %

rendeman sebesar 21,2397%. Pada replikasi kedua, bobot ekstrak kental yang

didapatkan adalah 1,5404 dan serbuk yang ditimbang adalah 10,0052 gram

sehingga didapatkan % rendeman sebesar 15,3960%. Sedangan pada replikasi

ketiga, bobot ekstrak kental yang didapatkan adalah 2,0406 dan serbuk yang

ditimbang adalah 10,0048 gram sehingga didapatkan % rendeman sebesar

20,3962%. Hasil dari % rendemen menunjukan besarnya nilai ekstrak yang

dihasilkan, semakin tinggi nilai rendemen yang didapatkan menendakan nilai

ekstrak yang dihasilkan semakin banyak (Wijaya, 2018).


15

Pada penelitian ini dilakukan uji kandungan kimia pada serbuk simplisia

dan ekstrak secara kualitatif sesuai yang tertera dalam Farmakope Herbal

Indonesia dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Tujuan

dari uji kualitatif adalah untuk mengetahui ada atau tidaknya kandungan senyawa

andrografolid pada serbuk simplisia daun sambiloto dan ekstrak etanol daun

sambiloto. Uji kualitatif dilakukan dengan membandingkan nilai Rf larutan uji

dengan senyawa standar andrografolid. Penetuan kandungan kimia dalam ekstrak

dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) karena metode ini

merupakan metode kromatografi yang paling mudah dilakukan, pemisahan

berlangsung cepat, banyak digunakan, serta dapat memisahkan sampel uji dalam

jumlah yang kecil. Bejana yang digunakan dalam penelitian harus berada dalam

posisi yang rata dan terlebih dahulu dilakukan penjenuhan bejana, supaya elusi

dapat berjalan dengan baik. Bejana yang telah jenuh, ditandai dengan kertas saring

yang telah terbasahi seluruhnya oleh fase gerak yang digunakan (kloroform :

metanol). Penggunaan kertas saring bertujuan untuk meratakan penjenuhan uap di

dalam bejana yang digunakan. Selama proses elusi, bejana kromatografi harus

ditutup dengan rapat agar proses pemisahan senyawa dalam ekstrak berjalan

dengan baik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Fase diam yang digunakan dalam penelitian ini adalah silica gel GF254.

Lempeng silica yang digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu dengan

memanaskan di dalam oven untuk menghilangkan kelembaban air yang terdapat

pada lempeng karena jika silica masih dalam keadaan basah maka akan sulit

untuk menyerap senyawa yang akan dipisahkan. Lempengan silica dipanaskan

terlebih dahulu di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 120oC (Wulandari,

2011). Penelitian yang dilakukan menggunakan sampel berupa serbuk simplisia

daun sambiloto dan ekstrak etanol daun sambiloto.

Elusi yang dihasilkan dideteksi dibawah sinar Ultraviolet (UV). Deteksi

dapat dilakukan dengan pemeriksaan dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Pada

metode KLT, identifikasi awal suatu senyawa didasarkan pada perbandingan nilai

Rf larutan uji dibandingkan dengan nilai Rf standar (Gandjar dan Rohman, 2007).


16

(Wulandari, 2011).

(a) (b)

Gambar 1. Hasil elusi KLT dengan lampu UV 254 (a) Hasil uji KLT serbuk

simplisia daun sambiloto; (b) Hasil uji KLT ekstrak etanol daun

sambiloto

Keterangan :

A = Baku Andrografolid; B = Replikasi Ekstrak dan serbuk simplisia 1; C =

Replikasi Ekstrak dan serbuk simplisia 2; D = Replikasi Ekstrak dan serbuk

simplisia 3.

A B

C

D

A B

C D


17

Tabel I. Nilai Rf dan warna hasil uji KLT serbuk simplisia dan ekstrak

etanol daun sambiloto dengan lampu UV 254

No Sampel Serbuk simplisia daun

sambiloto

Ekstrak etanol daun

sambiloto

Rf Warna Rf Warna

1 Standar

Andrografolid

0,50 Kuning kecoklatan 0,40 Kuning kecoklatan

2

Replikasi 1


0,72 Coklat 0,57 Kuning kecoklatan

0,96 Coklat kehitaman 0,77 Hijau kecoklatan

3

Replikasi 2




4

Replikai 3




Gambar 2 merupakan hasil elusi dari serbuk simplisia daun sambiloto

dan ekstrak etanol daun sambiloto. Pengujian KLT pada penelitian ini dilakukan

dengan menggunakan fase gerak kloroform : methanol dengan perbandingan 9 : 1,

sedangkan fase diam yang digunakan adalah plat KLT silica gel 60 GF245.

Volume penotolan larutan uji dan larutan senyawa pembanding sebanyak 4 µL

dan dilakukan pengamatan dibawah sinar ultraviolet 254 nm sesuai yang tertera

dalam Farmakope Herbal Indonesia (2008). Senyawa andrografolid dijadikan

standar pada pengujian kromatografi untuk membandingkan bercak yang didapat

oleh sampel dengan bercak yang dihasilkan oleh standar setelah keduanya

dielusikan dengan menggunakan fase gerak. Berdasarkan hasil yang didapat pada

pengujian KLT serbuk simplisia, nilai Rf standar andrografolid adalah 0,5

sedangkan nilai Rf serbuk simplisia daun sambiloto replikasi satu hingga tiga


18

secara berturut turut adalah 0,48 ; 0,48 ; 0,5. Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam

mengidentifikasikan senyawa. Berdasarkan nilai Rf yang didapatkan, uji KLT ini

sudah cukup membuktikan bahwa terdapat kandungan senyawa andrografolid

pada serbuk simplisia daun sambiloto. Sedangkan berdasar hasil yang didapatkan

pada pengujian KLT ekstrak, nilai Rf standar andrografolid adalah 0,40

sedangkan nilai Rf pada ekstrak etanol daun sambiloto replikasi satu hingga tiga

secara berturut turut adalah 0,37 ; 0,37 ; 0,33. Dalam penelitian ini, nilai Rf pada

ekstrak hampir mirip dengan standar andrografolid, hal ini dapat disebabkan

karena volume totolan terlalu kecil, kadar sampel yang terlalu kecil serta sampel

belum murni, sehingga terdapat senyawa lain dalam sampel. Warna bercak

standar andrografolid dibawah sinar UV 254 nm adalah kuning kecoklatan,

sedangkan warna bercak ekstrak etanol daun sambiloto adalah kuning kecoklatan.

Berdasarkan warna bercak dan nilai Rf yang dihasilkan, uji KLT ini sudah cukup

membuktikan adanya senyawa andrografolid pada ekstrak etanol daun sambiloto.

Selain itu, perbedaan nilai Rf larutan pembanding pada pengujian serbuk dengan

pengujian ekstrak berbeda, dapat dikarenakan akhibat dari penyimpanan larutan

yang cukup lama.

Ekstrak etanol daun sambiloto diuji secara in vitro. Prinsip dasar dari

pengujian ini adalah mengetahui aktivitas penghambatan enzim alfa amilase

dengan mengamati penurunan intensitas warna biru pada kompleks iodin-pati

karena berkurangnya substrat pati akibat hidrolisis yang dilakukan oleh enzim alfa

amilase (Wardani, 2017). Pengukuran penurunan intensitas warna dilakukan

dengan menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu) pada panjang

gelombang 568,5 nm yang sebelumnya telah dilakukan inkubasi selama 10 menit.

Panjang gelombang yang digunakan diperoleh dari penentuan panjang gelombang

maksimum larutan enzim alfa amilase dengan tujuan untuk menentukan panjang

gelombang yang menghasilkan serapan maksimum dari larutan uji. Sedangkan

waktu inkubasi yang digunakan diperoleh dari penentuan Optimization Time. Uji

aktivitas penghambatan dilakukan pada larutan blanko acarbose, kontrol blanko


19

acarbose, blanko sampel uji, kontrol blanko sampel uji, larutan acarbose, kontrol

acarbose, larutan sampel uji, kontrol sampel uji.

Pengujian larutan blanko dan kontrol blanko bertujuan untuk mengetahui

aktivitas dari enzim alfa amilase tanpa penambahan larutan sampel uji dan larutan

acarbose. Pengujian kontrol sampel uji dan kontrol acarbose dilakukan sebagai

faktor koreksi terhadap larutan sampel uji dan larutan acarbose. Sedangkan

pengujian larutan sampel uji dan larutan acarbose dilakukan untuk mengetahui

aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa amilae.

Pengujian sampel ekstrak etanol daun sambiloto dan acarbose dibagi

menjadi empat peringkat konsentrasi, yaitu 2,5 ; 5 ; 7,5 ; dan 10 mg/ml dengan

kondisi pengujian yang sama. Pengujian dilakukan pada beberapa konsentrasi

yang berbeda untuk melihat pengaruh penambahan konsentrasi pada peningkatan

kemampuan dalam menghambat enzim alfa amilase. Hasil yang didapatkan pada

penelitian adalah nilai absorbansi larutan. Nilai absorbansi tersebut digunakan

untuk mendapatkan nilai persen (%) penghambatan dan nilai IC50.

Tabel II. Persen penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh ekstrak

etanol daun sambiloto

Tabel III. Persen penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh acarbose

Konsentrasi

(mg/ml)

Replikasi 1

(%)

Replikasi 2

(%)

Replikasi 3

(%)

2,5 41,98 41,88 42,07

5 45,01 45,01 44,87

7,5 48,09 48,13 47,53

10 50,89 50,47 51,31

Konsentrasi

(mg/ml)

Replikasi 1

(%)

Replikasi 2

(%)

Replikasi 3

(%)

2,5 52,21 52,16 52,16


20

Berdasarkan nilai persen penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh

ekstrak etanol daun sambiloto (Tabel II) didapatkan nilai r secara berurutan dari

replikasi 1 hingga replikasi 3 sebesar 0,999 ; 0,998 ; dan 0,997 dengan rata rata

nilai persen penghambatan secara berurutan konsentrasi terendah hingga tertinggi

sebesar 41,98% ; 44,96% ; 47,92% ; dan 50,89%. Sedangkan nilai r yang

dihasikan pada larutan acarbose secara berurutan dari replikasi 1 hingga replikasi

3 sebesar 0,998 ; 0,997 ; dan 0,998 dengan nilai rata rata persen penghambatan

aktivitas enzim alfa amilase oleh acarbose (Tabel III) secara berurutan dari

konsentrasi terendah hingga tertinggi sebesar 52,18% ; 55,12% ; 59,15% ; dan

62,11%.

Selanjutnya dilakukan uji statistik untuk memastikan kebermaknaan nilai

persen penghambatan antar konsentrasi. Uji pertama yang dilakukan adalah uji

normalitas. Uji normalitas data digunakan untuk melihat apakah data tersebut

terdistribusi secara normal atau tidak. Jika data <50 maka digunakan uji

normalitas Shapiro-Wilk yang hasilnya dapat menentukan jenis uji yang

digunakan selanjutnya.Hasil uji yang didapatkan menunjukan nilai p-value < 0,05,

sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai persen penghambatan antar konsentrasi

tidak terdistribusi secara normal. Pengujian statistik kemudian dilanjutkan dengan

uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan data antar konsentrasi, dan di

dapatkan nilai p-value < 0,05 sehingga disimpulkan bahwa terdapat perbedaan

persen penghambatan antar konsentrasi (Dahlan, 2014).

5 55,28 54,95 55,14

7,5 59,23 59 59,23

10 62,20 61,92 62,20


21

Tabel IV. Tabel hasil analisis uji Mann-Whitney pada persen penghambatan

aktivitas enzim alfa amilase oleh ekstrak etanol daun sambiloto

EDS

2,5

mg/ml

EDS

5

mg/ml

EDS

7,5

mg/ml

EDS

10

mg/ml

EDS

2,5

mg/ml

BB

BB

BB

EDS

5

mg/ml

BB

BB

BB

EDS

7,5

mg/ml

BB

BB

BB

EDS

10

mg/ml

BB

BB

BB

Keterangan : BB = Berbeda Bermakna (p < 0,05)

EDS = Ekstrak Etanol Daun Sambiloto

Selanjutnya, nilai persen penghambatan yang didapatkan pada empat

peringkat konsentrasi kemudian dibandingkan satu dengan yang lainnya dengan

menggunakan uji Mann-Whitney, dan didapatkan hasil yang berbeda bermakna

antar semua konsentrasi, baik pada ekstrak etanol daun sambiloto maupun pada

acarbose, hal ini kemungkinan terjadi karena semakin besar konsentrasi yang

digunakan maka kandungan senyawa yang berperan semakin banyak pula,

sehingga nilai persen penghambatan semakin tinggi. Kemudian selain itu,

berdasarkan kurva yang dihasilkan dari replikasi 1 hingga replikasi 3, baik pada

ekstrak etanol daun sambiloto maupun acarbose dihasilkan nilai r yang baik, yakni

mendekati angka 1, sehingga pada hasil pengujian tersebut dapat dikatakan bahwa

seiring dengan peningkatan konsentrasi, maka persen (%) penghambatan yang

dihasilkan semakin baik.

Parameter aktivitas penghambatan pada suatu senyawa atau ekstrak

dinyatakan dalam IC50. IC50 merupakan konsentrasi dari senyawa atau ekstrak

yang memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa amilase sebesar 50%.


22

Nilai IC50 diperoleh dari suatu persamaan regresi linier yang menyatakan

hubungan antara konsentrasi senyawa atau ekstrak sebagai variabel x dengan %

nilai penghambatan sebagai variabel y. Semakin kecil konsentrasi yang

menimbulkan IC50, maka aktivitas penghambatan senyawa atau ekstrak semakin

baik.

Tabel V. Nilai IC50 larutan acarbose

Acarbose

Replikasi IC50 (mg/ml) Rata-rata (mg/ml)

1 0,921

0,972 ± 0,044 2 0,994

3 1,001

Persamaan linier dari kurva acarbose pada 3 replikasi berturut turut

adalah y = 1,357x + 48,750; y = 1,333x + 48,675; dan y = 1,368x + 48,63,

dengan nilai r secara berturut turut adalah 0,998; 0,997; dan 0,998. Berdasarkan

tabel V, hasil replikasi pengujian menunjukan bahwa larutan uji acarbose

memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa amilase dengan nilai IC50

sebesar 0,921 ; 0,994 ; dan 1,001 mg/ml dengan rata rata IC50 sebesar 0,972 ±

0,044 mg/ml.

Tabel VI. Nilai IC50 larutan sampel uji

Ekstrak etanol daun sambiloto

Replikasi IC50 (mg/ml) Rata-rata (mg/ml)

1 9,195

9,253 ± 0,116 2 9,386

3 9,177

Persamaan linier dari kurva sampel uji ekstrak etanol daun sambiloto

pada 3 replikasi berturut turut adalah y = 1,192x + 39,040 ; y = 1,156x + 39,150 ;

dan y = 1,215x + 38,850. dengan nilai r secara berturut turut adalah 0,999 ; 0,998 ;


23

dan 0,997. Berdasarkan tabel VI, hasil pengujian menunjukan bahwa ekstrak

etanol daun sambiloto memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa

amilase dengan nilai IC50 sebesar 9,195 ; 9,386 ; 9,177 mg/mL dengan rata rata

IC50 sebesar 9,253 ± 0,116 mg/ml.

Nilai IC50 yang kecil disebabkan oleh persen penghambatan yang besar

dari beberapa variasi konsentrasi sampel ekstrak, sedangkan nilai IC50 yang besar

disebabkan oleh kandungan senyawa memiliki efek yang kecil dalam

menghambat aktivitas enzim alfa amilase. Berdasarkan nilai rata rata IC50 sampel

ekstrak dan acarbose, menunjukan bahwa acarbose memiliki nilai IC50 yang lebih

kecil dibandingkan dengan sampel ekstrak. Berdasarkan dengan hasil tersebut

dapat dikatakan bahwa persen penghambatan aktivitas enzim alfa amilase oleh

ekstrak etanol daun sambiloto lebih rendah dibandingkan dengan acarbose.

Data IC50 acarbose dan ekstrak etanol daun sambiloto dibandingkan

dengan melakukan uji statistik dengan menggunakan program SPSS (Lampiran

10) dengan tujuan untuk membandingkan antara kedua kelompok tersebut.

Berdasarkan hasil statistika, didapatkan hasil yang berbeda bermakna, dilihat dari

nilai p yang dihasilkan yakni p < 0,05, sehingga dapat disimpulkan bahwa

terdapat perbedaan efek penghambatan terhadap aktivitas enzim alfa amilase

antara ekstrak etanol daun sambiloto dengan acarbose.

Apabila dibandingkan dengan penelitian Subramanian, et al (2008), nilai

% penghambatan dan nilai IC50 dari ekstrak etanol daun sambiloto berbeda

dengan yang didapatkan pada penelitian ini. Konsentrasi terkecil ekstrak etanol

daun sambiloto (7,8 mg/ml) pada penelitian Subramanian menghasilkan nilai %

penghambatan sebesar 12,5% sedangkan pada konsentrasi terbesar (62,5 mg/ml)

menghasilkan nilai % penghambatan sebesar 52,5%. Sedangkan untuk nilai IC50

yang dihasilkan pada penelitian Subramanian sebesar 50,9 ± 0,17. Perbedaan hasil

penelitian tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan konsentarsi pelarut yang

digunakan, metode penelitian yang digunakan, serta perbedaan asal bahan baku

daun tanaman sambiloto yang digunakan dalam penelitian.


24

Senyawa pada daun tanaman sambiloto yang diduga memiliki aktivitas

penghambatan terhadap enzim alfa amilase adalah andrografolide. Andrografolid

merupakan salah satu senyawa yang masuk ke dalam golongan diterpenoid,.

Berdasarkan penelitian Al-Asri (2014), sampai saat ini belum diketaui makanisme

aksi struktur diterpenoid dalam menghambat aktivitas enzim alfa amilase. Namun

berdasarkan hasil permodelan molekuler, didapatkan hasil yang menunjukan

penghambatan secara kompetitif dari enzim alfa amilase oleh senyawa

diterpenoid. Penghambatan secara kompetitif ini, diduga karena adanya kesamaan

struktur cincin benzene dan gugus hidroksil pada senyawa diterpenoid.

KESIMPULAN

Berdasarkan uji aktivitas penghambatan yang telah dilakukan,

menunjukan hasil bahwa seiring dengan peningkatan konsentrasi ekstrak etanol

daun sambiloto, maka nilai persen (%) penghambatan yang dihasilkan semakin

tinggi, dengan nilai presisi (r) yang baik yakni mendekati angka 1 dan hasil

statistik yang berbeda bermakna antar konsentrasi (p > 0,05). Berdasarkan hasil

statistika dari nilai rata rata IC50 acarbose dan ekstrak etanol daun sambiloto,

didapatkan hasil berbeda bermakna (p > 0,05). Sehingga dapat disimpulkan bahwa

terdapat aktivitas penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak etanol daun

sambiloto dan terdapat perbedaan efek antara daya hambat acarbose dengan

ekstrak etanol daun sambiloto.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan mengukur kadar

andrografolid yang terdapat dalam ekstrak etanol daun sambiloto. Selain itu, perlu

juga dilakukan uji lanjut secara in vivo dalam membuktikan bahwa ekstrak etanol

daun sambiloto dapat menurunkan kadar gula darah pada hewan uji.


25

DAFTAR PUSTAKA

Ali, H., Houghton, P.J., dan Soumyanath, A., 2 6. α-Amylase Inhibitory Activity

of Some Malaysian Plants Used to Treat Diabetes; with Particular

Reference to Phyllanthus Amarus. Journal of Ethnopharmacology.,

107(2006), 449-455.

Al-Asri, J., 2014. Controlling Hyperglycemia: Discovery of Novel Small α-

Amylase Inhibitors Using Structure-Based Virtual Screening. Freien

Universität Berlin, Berlin.

Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2014. Peraturan Kepala

Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12

Tahun 2014 Tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional. Badan

Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta

Bhutkar, M. A., Bhinge, S.D., Randive, D.S., Wadkar, G.H., and Todkar, S.S.,

2018. In Vitro Studies on Alpha Amylase Inhibitory Activity of Some

Indigenous Plants. Modern Applications in Pharmacy and

Pharmacology., 1 (4), 1-5.

Chao, W.W. and Lin, B.F., 2010. Isolation and Identification of Bioactive

Compounds in Andrographis paniculata (Chuanxinlian). Chinese

Medicine., 5 (17), 1-15.

Dahlan, M. S., 2014. Statistika untuk Kedokteran dan Kesehatan, edisi 6.

Epidemiologi Indonesia, Jakarta, pp. 92-99, 110-127.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000. Parameter Standar Umum

Ekstrak Tumbuhan Obat. Badan POM Republik Indonesia, Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2007. Kebijakan Obat Tradisional

Nasional. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Farmakope Herbal Indonesia.

Edisi 1. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis.Pustaka Pelajar.

Yogyakarta, pp. 353-361.

International Diabetes Federation, 2015. IDF Diabetes Atlas. Ed. 7.

International Diabetes Federation, 2017. IDF Diabetes Atlas. Ed. 8.

Rais, I.R., Samudra, A.G., Widyarini, S., dan Nugroho, A. E., 2013. Penentuan

Aktivitas solat Andrografolid terhadap α-Amilase dan α- Glukosidase

menggunakan Metode Apostolidis dan Mayur. Traditional Medicine

Journal., 18(3), 162-166.


26

S GMA Aldrich. 2 19. Product Specification of α-Amylase, heat-stable-solution,

for use in Total Dietary Fiber Assay, TDF-100A. URL

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3306?lang=en&reg

ion= ID (accessed 09.10.19).

Subramanian, ., Asmawi, M. Z., and Sadikun, A., 2 8. n itro α-Glucosidase

and α-Amylase Enzyme Inhibitory Effects of Andrographis paniculata

Extract and Andrographolide. Acta Biochimica Polonica., 55 (2), 391-398.

Sulistyani, N., 2018. Modul 006: Pengembangan Sediaan Obat Tradisional.

Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, Jakarta.

Supardi, S., dan Susyanty, A. L., 2010. Penggunaan Obat Tradisional dalam

Upaya Pengobatan Sendiri di Indonesia (Analisis Data Susenas Tahun

2007). Pusat Penelitian dan Pengembangan Sistem dan Kebijakan

Kesehatan Jakarta., 38 (2), 80-89.

Thangaraj, P., 2016. Pharmacological Assays of Plant Based Natural Products.

Springer, United Kingdom, pp. 20, 139-140

Wardani, N. A. K., 2017. Enzim Alfa Amilase Inhibutor pada Ekstrak Air Kacang

Merah (Phaseolus vulgaris L.) untuk penanggulangan Diabetes Melitus.

Jurnal Ilmu Pangan dan Hasil Pertanian.1 (2), 50-59.

Wijaya, H., Novitasari, Jubaidah, S., 2018. Perbandingan Metode Ekstraksi

terhadap Rendemen Ekstrak Daun Rambai Laut (Sonneratia caseolaris L.

Engl). Jurnal Ilmiah Manuntung. 4 (1), 79-83.

Wulandari, L., 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Taman Kampus Presindo.

Jember, pp. 17-18, 26-27, 33, 54-55.


https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3306?lang=en&reg%09ion=%09ID

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3306?lang=en&reg%09ion=%09ID

27

LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar Serbuk Simplisia Daun Sambiloto dan Ekstrak Etanol

Daun Sambiloto

Gambar 2. Serbuk Simplisia Daun Sambiloto

Gambar 3. Ekstrak Etanol Daun Sambiloto


28

Lampiran 2. Surat Keterangan Hasil Determinasi Tanaman

Andrographis paniculata Nees. Oleh Fakultas Farmasi UGM


29

Lampiran 3. Surat Legalitas Analisis Data oleh Pusat Kajian CE&BU

Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat, dan Keperawatan UGM


30

BIOGRAFI PENULIS

Penulis naskah skripsi dengan judul “Uji Aktivitas

Penghambatan Enzim Alfa Amilase oleh Ekstrak Etanol

Daun Sambiloto (Andrographis Paniculata Nees.)

secara In Vitro” yang memiliki nama lengkap Maria

Cyrilla Iglesia Adi Nugrahanti, lahir di Yogyakarta, 28

Oktober 1997. Penulis merupakan putri pertama dari dua

bersaudara pasangan Bapak Nicansius Esmu Wardoyo

dengan Ibu Seraphine Neni Trianawati. Pendidikan

formal yang tempuh oleh penulis yaitu pendidikan

Sekolah Dasar di SD Kanisius Demangan Baru (2004-2010), pendidikan Sekolah

Menengah Pertama di SMP Negeri 8 Yogyakarta (2010-2013), dan pendidikan

Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 2 Yogyakarta (2013-2016). Penulis

melanjutkan pendidiikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta pada tahun 2016. Semasa menempuh pendidikan sarjana, penulis aktif

dalam berbagai kepanitiaan dan organisasi atara lain menjadi angota divisi

Pengabdian Masyarakat Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi

(2018/2019), anggota divisi konsumsi Pharmacy performance (2016), dan sebagai

koordinator divisi konsumsi TITRASI (2018). Selain itu penulis pernah menjadi

asisten praktikum Percikan obat (2018), FTSF (2019), dan Botani Farmasi (2019).



UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH … · 2020. 5. 12. · berjudul “Uji...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE OLEH … · 2020. 5. 12. · berjudul “Uji...