UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE DENGAN...

UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE

DENGAN EKSTRAK ETANOL BATANG BROTOWALI

(Tinospora crispa L.) Hook. f. & Thomson

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Fetiana Chrismaurin

NIM : 168114168

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE

DENGAN EKSTRAK ETANOL BATANG BROTOWALI

(Tinospora crispa L.) Hook. f. & Thomson

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Fetiana Chrismaurin

NIM : 168114168

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2020


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“I may fall down and get hurt. But, I still run endlessly towards my dreams”

-Epilogue: Young Forever by 방탄소년단, 2016-

Skripsi ini saya persembahkan kepada:

Tuhan Yesus Kristus sebagai sumber kekuatan, harapan dan kebijaksanaan.

Bapak, Ibu dan Gamaliel yang selalu mendukung dan mendoakan saya.

Almamater saya, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.


vii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala

berkat dan kasih-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul ”Uji

Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase dengan Ekstrak Etanol Batang

Brotowali (Tinospora crispa L.) Hook. f. & Thomson secara In Vitro” dengan baik

dan lancar. Skripsi ini disusun sebagai salah satu pemenuhan syarat untuk

mendapatkan gelar sarjana farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

Keberhasilan penulis dalam menyusun naskah skripsi ini juga tidak terlepas

dari bantuan, arahan dan bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung

maupun tidak langsung. Oleh karena hal tersebut penulis ingin mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang senantiasa memberikan

bantuan, arahan, saran dan pendampingan dengan sabar dari awal

penyusunan naskah proposal, penelitian hingga penyusunan naskah skripsi.

2. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang sudah

memberikan arahan dan saran yang sangat berguna dalam penyusunan

skripsi ini menjadi lebih baik lagi.

3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji yang sudah

memberikan arahan dan saran yang sangat berguna dalam penyusunan

skripsi ini menjadi lebih baik lagi.

4. Ibu Dina Christin Ayuning Putri, M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing

Akademik yang sudah memberikan bantuan dan pendampingan sejak awal

memasuki dunia perkuliahan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma.

5. Pak Dwi Priyana dan Pak Sarwanto selaku sekretariat S1 Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang selalu membantu dan memberikan

informasi selama pelaksanaan perkuliahan dari awal hingga akhir.

6. Pak Wagiran, Pak Kayat dan Mas Bimo selaku laboran yang selalu

membantu dan memberikan kemudahan selama pelaksanaan penelitian.


viii

7. Bapak, Ibu dan Gamaliel yang selalu mendoakan, mendukung dan

menyemangati sepanjang jalan kehidupan penulis.

8. Teman-teman penelitian dalam kelompok ‘Alfa Amilase” yang selalu

membantu, mendukung, berbagi ilmu dan memberikan saran selama proses

penelitian.

9. Teman-teman tempat penulis berkeluh kesah dan berbagi cerita Monica

Tiara Dewi, Yasinta Tri Astuti, Stephanus Adven dan lainnya yang selalu

mendukung, menemani dan menyemangati penulis dari awal mengikuti

“TITRASI” hingga saat ini.

10. Tim “98 Liners” Natasya Safetyani, Saffana Iliyuna dan Yuana Dysa yang

selalu saling mendukung dan mendoakan dalam proses penyusunan skripsi.

11. Tim Expo FACTION #2 Tommy Aditya, Maria Yessica, Edward Subastian,

Agista Bangalino dan Eka Yuliana yang selalu memberikan kebahagiaan

dan dukungan selama perkuliahan.

12. 방탄소년단 yang selalu memberikan motivasi, inspirasi dan harapan lewat

lagu dan kata-kata lain selama penulis berada dalam “the most struggle

phase” dalam proses penyusunan skripsi.

13. Teman-teman angkatan 2016 yang saling mendukung selama perkuliahan.

14. Seluruh pihak yang terlibat dalam penyusunan skripsi ini yang tidak dapat

disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

skripsi ini mengingat terbatasnya pengetahuan dan kemampuan penulis dalam

menyusun naskah. Oleh karena itu, penulis ingin meminta maaf apabila terdapat

kesalahan baik dalam penulisan maupun pemilihan kata. Penulis berharap adanya

kritik serta saran yang membangun agar naskah ini menjadi lebih baik. Akhir kata,

semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pihak yang membutuhkan, terutama

dalam perkembangan ilmu pengetahuan khususnya pada bidang kefarmasian.

Yogyakarta, 17 Juli 2020

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ....................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................ vi

PRAKATA ................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL .......................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xii

ABSTRAK .................................................................................................. xiv

ABSTRACT ................................................................................................... xv

PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ............................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 11

KESIMPULAN ............................................................................................ 26

SARAN ........................................................................................................ 26

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 27

LAMPIRAN ................................................................................................. 32

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................. 45


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Identifikasi metabolit sekunder serbuk simplisia........................... 15

Tabel II. Identifikasi metabolit sekunder ekstrak batang brotowali............ 15

Tabel III. Identifikasi metabolit sekunder serbuk simplisia ....................... 17

Tabel IV. Identifikasi metabolit sekunder ekstrak batang brotowali .......... 18

Tabel V. Nilai persentase penghambatan acarbose ..................................... 20

Tabel VI. Nilai persentase penghambatan ekstrak etanol batang

brotowali ...................................................................................................... 21


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil elusi KLT di bawah lampu UV 254 nm (a) Hasil uji KLT serbuk

simplisia daun sambiloto (b) Hasil uji KLT ekstrak batang brotowali ........ 14


simplisia daun sambiloto (b) Hasil uji KLT ekstrak batang brotowali ........ 17

Gambar 3. Struktur Acarbose ..................................................................... 25

Gambar 4. (a) Struktur Borapetosida A; (b) Struktur Borapetosida C ....... 25

Gambar 5. Struktur Amilum ....................................................................... 25

Gambar 6. Serbuk Simplisia Batang Brotowali ......................................... 34

Gambar 7. Ekstrak Etanol Batang Brotowali ............................................. 34

Gambar 8. Penentuan Kadar Air................................................................. 35

Gambar 9. Perolehan Panjang Gelombang Maksimum ............................. 37

Gambar 10. Grafik Perolehan Panjang Gelombang Maksimum ................ 37


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Determinasi Serbuk Simplisia Batang Brotowali (Tinospora

crispa L.) Hook. f. & Thomson ................................................................... 32

Lampiran 2. Certificate of Alpha Amylase Enzyme .................................... 33

Lampiran 3. Serbuk Simplisia Batang Brotowali dan Ekstrak Etanol Batang

Brotowali ...................................................................................................... 34

Lampiran 4. Penentuan Kadar Air Serbuk Simplisia Batang Brotowali .... 35

Lampiran 5. Perhitungan Uji Kadar Air Serbuk Simplisia ........................ 35

Lampiran 6. Perhitungan Rendemen Simplisia .......................................... 35

Lampiran 7. Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Serbuk Simplisia Batang

Brotowali dan Ekstrak Batang Brotowali dengan Metode KLT .................. 36

Lampiran 8. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum .......................... 37

Lampiran 9. Penentuan Operating Time (OT) ........................................... 38

Lampiran 10. Perhitungan Larutan Buffer Phosphate pH 6,9 .................... 38

Lampiran 11. Data dan Perhitungan Nilai Absorbansi .............................. 38

Lampiran 12. Uji Shapiro Wilk Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol

Batang Brotowali ......................................................................................... 40

Lampiran 13. Uji Levene Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol Batang

Brotowali ...................................................................................................... 41

Lampiran 14. Uji ANOVA Satu Arah Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak

Etanol Batang Brotowali .............................................................................. 41

Lampiran 15. Uji Post-Hoc Tukey Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol

Batang Brotowali dalam Tiap Konsentrasi .................................................. 41

Lampiran 16. Uji Shapiro Wilk Nilai Persentase Penghambatan Acarbose42

Lampiran 17. Uji Levene Nilai Persentase Penghambatan Acarbose ........ 43

Lampiran 18. Uji ANOVA Satu Arah Nilai Persentase Penghambatan

Acarbose ....................................................................................................... 43

Lampiran 19. Uji Post-Hoc Tukey Nilai Persentase Penghambatan Acarbose dalam

Tiap Konsentrasi .......................................................................................... 43


xiii

Lampiran 20. Uji T Perbandingan Nilai IC50 Ekstrak Etanol Batang Brotowali dan

Acarbose ....................................................................................................... 44


xiv

ABSTRAK

Diabetes melitus merupakan kelompok penyakit metabolik yang

dikarakterisasi dengan kondisi hiperglikemia kronis yang muncul dari kerusakan

pada sekresi insulin, kerja insulin atau keduanya. Komplikasi jangka panjang dari

diabetes melitus meliputi retinopati, nefropati, neuropati, mikroangiopati dan

peningkatan risiko penyakit kardiovaskular. Salah satu cara untuk mengatasi

kondisi hiperglikemia pada individu dengan diabetes melitus adalah dengan

menggunakan bahan obat alternatif atau bahan alam. Salah satu tanaman yang

memiliki efek antihiperglikemia adalah brotowali (Tinospora crispa L.) Hook. f. &

Thomson. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi dari ekstrak etanol

batang brotowali dalam menghambat enzim alfa amilase secara in-vitro. Hasil

pengujian yang dilakukan diperoleh nilai persentase penghambatan berturut-turut

pada konsentrasi 4; 8; 15 dan 20 mg/ml sebesar 41.87%; 60.47%; 77.90% dan

87.16% dengan nilai r berturut-turut dari replikasi pertama hingga replikasi ketiga

sebesar 0.981; 0.990 dan 0.980. Sementara itu untuk nilai IC50 ekstrak etanol batang

brotowali yang diperoleh berturut-turut dari replikasi pertama hingga replikasi

ketiga sebesar 11.84; 11.83 dan 11.30 mg/ml dengan rata-rata nilai IC50 sebesar

11.66 mg/ml ± 0.31 dan nilai CV sebesar 2.66%. Berdasarkan analisis statistika

yang membandingkan nilai IC50 acarbose dengan ekstrak etanol batang brotowali

diperoleh nilai p<0.05 bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada aktivitas

penghambatan terhadap enzim alfa amilase antara acarbose dengan ekstrak etanol

batang brotowali.

Kata Kunci: Diabetes melitus, hiperglikemia, batang brotowali, ekstrak etanol,

enzim alfa amilase, borapetosida, spektrofotometer uv-vis


xv

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by the condition of a

chronic hyperglycemia resulting from a deficiency in insulin secretion, insulin

action or both. Long terms complications of diabetes mellitus include retinopathy,

nephropathy, neuropathy, microangiopathy and risk factor of cardiovascular

disease. One of the ways to overcome the condition of hyperglycemia in individuals

with diabetes mellitus is by using alternative medicine ingredients or natural

ingredients. One of the herbals that has an antihyperglycemic effect is brotowali

(Tinospora crispa L.) Hook. f. & Thomson. The aim of this study was to find out

whether the potential of ethanolic extract of brotowali stem is capable to inhibit

alpha amylase enzyme as in vitro. The result shows the inhibition percentage at the

concentration 4; 8; 15 and 20 mg/ml is 41.87%; 60.47%; 77.90% and 87.16%

consecutively with the r value from the first replication to the third replication

consecutively is 0.981; 0.990 and 0.980. Meanwhile, for the IC50 value of ethanolic

extract of brotowali stem, we obtained from the first replication to the third

replication consecutively is 11.84; 11.83 dan 11.30 mg/ml with the average of IC50

value is 11.66 mg/ml ± 0.31 and CV value is 2.66%. Based on statistical analysis

comparing the IC50 value of acarbose with ethanolic extract of brotowali stem, we

obtained that p<0.05 showed a significant difference in the inhibitory activity of the

alpha amylase enzyme in between acarbose and ethanolic extract of brotowali stem.

Keyword: diabetes mellitus, hyperglycemia, brotowali stem, ethanolic extract,

alpha amylase enzyme, borapetoside, spectrophotometer uv-vis


1

PENDAHULUAN

Diabetes melitus merupakan kelompok penyakit metabolik yang dicirikan

dengan kondisi hiperglikemia kronis yang muncul dari kerusakan pada sekresi

insulin, kerja insulin atau keduanya. Abnormalitas metabolik pada karbohidrat,

lemak, dan protein merupakan hasil dari pentingnya insulin sebagai hormon

anabolik (Kharroubi, 2015). Diabetes melitus dapat menyebabkan komplikasi

jangka panjang yang meliputi retinopati, nefropati, neuropati, mikroangiopati dan

peningkatan risiko penyakit kardiovaskular (de Sales et al., 2012).

Salah satu cara untuk mengatasi kondisi hiperglikemia pada pasien diabetes

melitus khususnya diabetes melitus tipe dua adalah menurunkan kadar gula darah

post-prandial dengan mekanisme memperlambat absorbsi glukosa dengan

menghambat enzim yang menghidrolisis karbohidrat yaitu alfa glukosidase dan alfa

amilase yang bertanggung jawab terhadap pemecahan oligosakarida dan disakarida

menjadi monosakarida yang cocok untuk diabsorbsi (de Sales et al., 2012). Enzim

pankreatik alfa amilase berperan sebagai katalis pada reaksi hidrolisis dengan

memutus ikatan alfa-1,4 glikosidik yang berhubungan dengan pati, amilose,

glikogen dan beberapa maltodekstrin serta bertanggung jawab terhadap pencernaan

pati (Agarwal and Gupta, 2016; de Sales et al., 2012). Penghambatan dari kedua

enzim tersebut secara signifikan dapat menurunkan peningkatan kadar glukosa

darah post-prandial dengan mekanisme menunda pencernaan karbohidrat dan

memperpanjang waktu pencernaan karbohidrat sehingga menyebabkan reduksi

absorbsi glukosa. Lebih lanjut hal tersebut dapat digunakan sebagai salah satu

strategi penting dalam manajemen terapi pada pasien diabetes melitus tipe dua

(Tundis, Loizzo and Menichini, 2010; Elya et al., 2015).

Senyawa yang diketahui dan digunakan secara luas untuk terapi

antihiperglikemia pada pasien diabetes melitus tipe dua adalah acarbose. Acarbose

dikenal sebagai agen antidiabetik oral noninsulintropik dan merupakan inhibitor

enzim alfa amilase dan alfa glukosidase yang memiliki mekanisme mereduksi dan

memperlambat absorpsi glukosa pada intestinal (Rosak and Mertes, 2012; Oboh et

al., 2016).


2

Brotowali (Tinospora crispa L.) Hook. f. & Thomson merupakan tanaman

herbal yang sering dijumpai di Indonesia. Banyak yang meggunakan akar, batang

dan daun untuk dibuat jamu yang diyakini dapat menyembuhkan berbagai penyakit.

Brotowali diketahui mengandung senyawa metabolit sekunder seperti flavonoid,

terpenoid, alkaloid, lignan, nukleosida, dan sterol (Ahmad, Jantan and Bukhari,

2016). Lebih lanjut pada skrining fitokimia yang dilakukan oleh Elya et al., (2015)

menurut prosedur Materia Medika Indonesia dan Harborne (MoH., 1995; Harborne,

1987) ekstrak etanol batang brotowali mengandung alkaloid, flavonoid, glikosida

dan terpenoid. Sejumlah terpenoid diklasifikasikan sebagai triterpenoid dan

diterpenoid (Ahmad, Jantan and Bukhari, 2016).

Menurut penelitian yang dilakukan oleh Lam et al., (2012) telah diisolasi tiga

diterpenoid yang baru yaitu 2-O-lactoylborapetoside B, 6’-O-lactoylborapetoside

dan tinocrispol A bersamaan dengan sembilan diterpenoid yang sudah diketahui

dan diidentifikasi sebagai borapetosida A-F, borapetol A dan B dan columbin dari

ekstrak etanol tanaman brotowali. Diterpenoid dan glikosida merupakan terpenoid

utama dalam tanaman brotowali dan yang paling umum adalah clerodane-type

furanoditerpenoids (Koay and Amir, 2013). Clerodane-type furanoditerpenoids

terdiri atas borapetosida A, B dan C (Ruan et al., 2013).

Lebih lanjut dikemukakan bahwa menurut penelitian yang dilakukan oleh

Lam et al., (2012) ekstrak etanol batang brotowali yang dibuat dengan metode

pengadukan dan dilanjutkan dengan sentrifugasi diketahui mengandung senyawa

borapetosida A dan C dapat menurunkan kadar plasma glukosa pada tikus keadaan

normal dan pada tikus yang diinduksi streptozocin dengan diabetes melitus tipe satu

di bawah pemeriksaan aktivitas antihiperglikemia secara in vivo. Senyawa

borapetosida C dikatakan mampu menstimulasi sekresi insulin pada tikus normal

dan tikus dengan diabetes melitus tipe 2. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan

oleh Ruan et al., (2013) yang menunjukkan bahwa borapetosida C dan senyawa

analognya merupakan inhibitor enzim dengan efek antihiperglikemia. Pada

penelitian yang dilakukan oleh Lokman et al., (2013) ketika sel-sel pulau

Langerhans pankreas dari tikus Wistar and Goto-Kakizaki diisolasi dengan diberi

borapetol B yang diisolasi dari ekstrak heksan batang brotowali yang dibuat dengan


3

metode sonifikasi menyatakan bahwa terjadi peningkatan sekresi insulin dari sel-

sel pulau Langerhans. Hal tersebut terjadi tanpa menyebabkan kebocoran insulin

dari rusaknya sel beta pulau Langerhans.

Terkait dengan adanya kandungan senyawa diterpenoid khususnya

borapetosida A dan C pada batang brotowali yang mampu menurunkan kadar

glukosa darah, maka diharapkan dengan adanya sediaan ekstrak etanol batang

brotowali dapat digunakan sebagai terapi antihiperglikemia. Berdasarkan hal

tersebut peneliti ingin mengetahui pengaruh efek antihiperglikemia dengan uji

aktivitas penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak etanol batang brotowali

yang dilakukan secara in vitro.

Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi dengan

pelarut etanol 70%. Menurut Farmakope Herbal Indonesia (2008) pembuatan

ekstrak dari serbuk simplisia kering dibuat dengan menggunakan metode maserasi

dengan pelarut yang sesuai. Alasan digunakan metode maserasi dalam proses

ekstraksi adalah karena borapetosida A dan C yang termasuk dalam golongan

terpenoid memiliki karakteristik tidak tahan panas atau thermolabile. Pemilihan

pelarut yang digunakan yaitu etanol 70% karena terpenoid larut dalam pelarut

organik dan biasanya sukar larut dalam air (Yadav, Yadav and Goyal, 2014).

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain oven, timbangan

analitik (Mettler Toledo®), rotary evaporator (BUCHI®), seperangkat alat

penyulingan untuk penetapan kadar air (MTOPS®), alat-alat gelas (gelas beaker,

gelas ukur, tabung reaksi, batang pengaduk, erlenmeyer, labu tentukur, pipet

volume, pipet ukur, pipet tetes, corong, kaca arloji), cawan porselen, sendok,

penangas air, hot plate, vortex, lemari asam, corong buchner, shaker (Innova®

2100), kertas saring Whatman nomor satu, mikropipet (SOCOREX), yellow tips,

white tips, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), kuvet, pompa vakum (GAST®),


4

plat silika gel untuk kromatografi lapis tipis (KLT) GF254, bejana, lampu UV

(CAGMA®), glass firn, mortir dan stamper.

Bahan-bahan yang digunakan meliputi serbuk batang brotowali yang

diperoleh dari PT. HRL Internasional di Kabupaten Gresik, Jawa Timur, enzim alfa

amilase (SIGMA Aldrich), reagen iodin, dimetil sulfoksida (E. Merck), tablet

acarbose, etanol 70%, potato starch, HCL 1M, aquabidest, toluena pro-analisis (E.

Merck), baku kuersetin, kloroform pro-analisis (E. Merck), metanol pro-analisis (E.

Merck).

Tata Cara Penelitian

Pengumpulan Bahan Uji dan Identifikasi Serbuk Simplisia Batang Brotowali

Bahan uji berupa serbuk simplisia diperoleh dari PT. HRL Internasional di

Kabupaten Gresik, Jawa Timur dan dilakukan identifikasi di Departemen Biologi

Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Penetapan Kadar Air pada Serbuk Simplisia Batang Brotowali

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode distilasi toluena. Dimasukkan

10 gram simplisia kering batang brotowali dan 200 ml toluena jenuh air yang sudah

dibuat tadi ke dalam labu. Toluena jenuh air dimasukkan ke tabung penerima

melalui pendingin sampai batas leher alat penampung dan dipanaskan selama 15

menit. Setelah toluena mulai mendidih, penyulingan diatur dengan kecepatan lebih

kurang dua tetes per detik hingga sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan

penyulingan dinaikkan hingga empat tetes tiap detik selama lima menit. Setelah

selesai, tabung penerima didinginkan hingga suhu ruang dan kemudian volume air

dibaca setelah air dan toluena terpisah (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan

Alat Kesehatan RI, 2013). Kadar air dihitung dengan rumus:

% Kadar air = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑖𝑟 (𝑚𝑙)

𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 (𝑔) x 100%

(Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2013)


5

Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Brotowali

Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan cara ditimbang secara

saksama lebih kurang 10 gram serbuk simplisia kering dan dilarutkan ke dalam 100

ml etanol 70%, ditutup terlindung dari cahaya matahari, lalu dibiarkan selama 24

jam sambil diaduk menggunakan shaker pada suhu ruang dan kecepatan

pengadukan 200 rpm. Hasil maserat disaring menggunakan corong buchner yang

dilapisi kertas saring whatman nomor satu sambil dilakukan vakum. Residu hasil

penyarian dimaserasi kembali dengan pelarut yang baru selama 24 jam. Proses

maserasi dilakukan sebanyak tiga kali. Hasil filtrat diuapkan menggunakan rotary

evaporator pada suhu 60̊ C untuk menguapkan pelarut yang terdapat dalam ekstrak

dan dipekatkan di atas penangas air hingga ekstrak benar-benar pekat untuk

menghilangkan pelarut yang masih tersisa di dalam ekstrak (Atmajani et al., 2018;

Harwoko and Choironi, 2016; Mun’im et al., 2013; Parimelazhagan, 2016). Hasil

ekstrak kemudian dihitung nilai rendemennya dengan rumus:

% Rendemen = (𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡)

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑎𝑤𝑎𝑙 x 100%

(Rezki, Anggoro and MZ, 2015)

Uji Kandungan Metabolit Sekunder dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis

(KLT)

Dilakukan uji kandungan terpenoid pada serbuk simplisia dan ekstrak etanol

batang brotowali. Untuk serbuk simplisia dengan membuat larutan uji dengan cara

timbang saksama lebih kurang 1 gram sebuk simplisia rendam sambil diaduk di atas

penangas air dengan 10 ml pelarut metanol P selama 10 menit. Masukkan filtrat ke

dalam labu tentukur 10 ml tambahkan pelarut hingga batas tanda. Sementara itu

untuk ekstrak dilakukan dengan cara timbang saksama lebih kurang 20 mg ekstrak,

dilarutkan dengan 5 ml metanol P dan diaduk di atas penangas air selama 10 menit.

Masukkan filtrat ke dalam labu tentukur 5 ml tambahkan pelarut hingga batas tanda.

Dibuat larutan pembanding yaitu kuersetin 1% dengan cara timbang saksama lebih

kurang 0,05 mg senyawa pembanding kuersetin kemudian dilarutkan dalam 5 ml

metanol P. Lempeng silika yang akan digunakan dilakukan aktivasi terlebih dahulu

dengan memanaskan lempeng silika dalam oven pada suhu 100̊C selama 5-10 menit


6

untuk mengurangi kadar air dalam lempeng. Totolkan larutan uji dan larutan

pembanding pada plat KLT menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1,5 – 2 cm dari

tepi bawah lempeng dan biarkan mengering. Keluarkan plat KLT dan keringkan di

udara. Amati bercak dengan sinar tampak UV gelombang pendek (254 nm) dan UV

gelombang panjang (366 nm). Ukur dan catat jarak tiap bercak dari titik penotolan

serta catat panjang gelombang untuk tiap bercak diamati (Direktorat Jendral Bina

Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2013). Harga Rf (faktor retensi) dapat

ditentukan dengan rumus:

Rf = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡

(Kumar, Jyotirmayee and Sarangi, 2013)

Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase

Uji aktivitas penghambatan enzim alfa amilase dilakukan berdasar pada

penelitian Hamid et al., 2015; Ononamadu et al., 2020; dan Pramitasari, Pujiyanto

and Suprihadi, 2017 dengan dilakukan modifikasi.

Pembuatan Larutan Uji

Pembuatan larutan uji meliputi pembuatan larutan soluble starch (0,5%)

dengan cara melarutkan 0,25 gram amilum ke dalam 50 ml aquabidest. Dibuat

larutan DMSO 1% dengan cara melarutkan 1 ml DMSO dalam 100 ml aquabidest.

Dibuat larutan seri konsentrasi ekstrak etanol batang brotowali dengan konsentrasi

4; 8; 15 dan 20 mg/ml. Sebanyak 200 mg ekstrak etanol batang brotowali dilarutkan

dengan DMSO 1% dalam labu tentukur 10 ml dan ditambahkan DMSO 1% hingga

batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 20 mg/ml (labu 1). Diambil sebanyak

7,5 ml dari labu 1 dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dan ditambah DMSO 1%

hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 15 mg/ml (labu 2). Diambil

sebanyak 5.34 ml dari labu 2 dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dan ditambah

DMSO 1% hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 8 mg/ml (labu 3).

Diambil sebanyak 5 ml dari labu 3 dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dan

ditambahkan DMSO 1% hingga batas tanda sehingga diperoleh 4 mg/ml (labu 4).

Dibuat larutan buffer phosphate pH 6,9 dengan melarutkan 3280 mg natrium fosfat

(Na3PO4) dengan aquabidest dan 391,95 mg natrium klorida (NaCl) dengan


7

aquabidest dimasukkan dalam labu tentukur 100 ml dan ditambahkan aquabidest

hingga batas tanda. Dibuat larutan enzim alfa amilase dengan cara diambil

sebanyak 0,15 ml dan ditambahkan dalam 100 ml larutan buffer phosphate pH 6,9.

Dibuat larutan seri konsentrasi acarbose sebagai kontrol positif dengan konsentrasi

4; 8; 15 dan 20 mg/ml. Sebanyak empat tablet acarbose dengan kandungan 50 mg

per tablet digerus dilarutkan dengan aquabidest dalam labu tentukur 10 ml dan

ditambahkan aquabidest hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 20

mg/ml (labu 1). Diambil sebanyak 7,5 ml dari labu 1 dimasukkan dalam labu

tentukur 10 ml dan ditambah aquabidest hingga batas tanda sehingga diperoleh

konsentrasi 15 mg/ml (labu 2). Diambil sebanyak 5.34 ml dari labu 2 dimasukkan

dalam labu tentukur 10 ml dan ditambah aquabidest hingga batas tanda sehingga

diperoleh konsentrasi 8 mg/ml (labu 3). Diambil sebanyak 5 ml dari labu 3

dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml dan ditambahkan aquabidest hingga batas

tanda sehingga diperoleh 4 mg/ml (labu 4).

Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan sebelum dilakukan uji

aktivitas penghambatan enzim alfa amilase. Diambil larutan potato starch 0,5%

sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml ekstrak

etanol batang brotowali konsentrasi terkecil yang dipakai dalam uji aktivitas

penghambatan enzim alfa amilase yaitu 4 mg/ml. Kemudian ditambahkan 1 ml

enzim alfa amilase dalam buffer phosphate pH 6,9, 1 ml buffer phosphate pH 6,9

dan 1 ml DMSO 1%. Larutan dikocok menggunakan vortex hingga homogen

kemudian diinkubasi selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan HCl

1M sebanyak 1 ml dan reagen iodin sebanyak 0,01 ml kemudian dikocok

menggunakan vortex lagi hingga homogen. Serapan diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis pada rentang panjang gelombang 400-800 nm.

Penentuan Operating Time (OT)

Penentuan operating time (OT) dilakukan sebelum dilakukan uji aktivitas

penghambatan enzim alfa amilase. Diambil larutan potato starch 0,5% sebanyak 1

ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 ml ekstrak etanol batang

brotowali konsentrasi terkecil yang dipakai dalam uji aktivitas penghambatan


8

enzim alfa amilase yaitu 4 mg/ml. Kemudian ditambahkan 1 ml enzim alfa amilase

dalam buffer phosphate pH 6,9, 1 ml buffer phosphate pH 6,9 dan 1 ml DMSO 1%.

Larutan dikocok menggunakan vortex hingga homogen kemudian diinkubasi

selama 5; 10; 15 dan 30 menit untuk menentukan waktu optimum enzim tersebut

dapat bereaksi. Reaksi dihentikan dengan penambahan HCl 1M sebanyak 1 ml dan

reagen iodin sebanyak 0,01 ml kemudian dikocok menggunakan vortex lagi hingga

homogen. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada

panjang gelombang yang sudah diperoleh sebelumnya.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Blanko Acarbose dan Kontrol Blanko

Acarbose

Pengukuran efek penghambatan larutan blanko acarbose dilakukan dengan

cara diambil larutan potato starch 0,5% sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam

tabung reaksi, ditambahkan 1 ml aquabidest kemudian ditambahkan 1 ml enzim

alfa amilase dalam buffer phosphate pH 6,9 dan 2 ml buffer phosphate pH 6,9.

Larutan dikocok menggunakan vortex hingga homogen dan diinkubasi selama 5

menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan HCl 1M sebanyak 1 ml dan reagen

iodin sebanyak 0,01 ml kemudian dikocok menggunakan vortex lagi hingga

homogen. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada

panjang gelombang 536 nm. Sementara itu pengukuran efek penghambatan larutan

kontrol blanko acarbose memiliki langkah yang sama hanya saja tidak

menggunakan enzim alfa amilase dan menggunakan buffer phosphate pH 6,9

sebanyak 3 ml.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Acarbose dan Kontrol Acarbose

Pengukuran efek penghambatan larutan blanko acarbose dilakukan dengan

cara diambil larutan potato starch 0,5% sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam

tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan acarbose dalam masing-masing tabung

reaksi dengan konsentrasi 4; 8; 15 dan 20 ml dan 1 ml aquabidest kemudian

ditambahkan 1 ml enzim alfa amilase dalam buffer phosphate pH 6,9 dan 2 ml

buffer phosphate pH 6,9. Larutan dikocok menggunakan vortex hingga homogen

dan diinkubasi selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan HCl 1M

sebanyak 1 ml dan reagen iodin sebanyak 0,01 ml kemudian dikocok menggunakan


9

vortex lagi hingga homogen. Serapan diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 536 nm. Sementara itu

pengukuran efek penghambatan larutan kontrol acarbose memiliki langkah yang

sama hanya saja tidak menggunakan enzim alfa amilase dan menggunakan buffer

phosphate pH 6,9 sebanyak 3 ml. Pembuatan larutan acarbose dan kontrol acarbose

dilakukan sebanyak tiga kali replikasi.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Blanko Sampel dan Kontrol Blanko Sampel

Pengukuran efek penghambatan larutan blanko sampel dilakukan dengan cara

diambil larutan potato starch 0,5% sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung

reaksi, ditambahkan 1 ml DMSO 1% kemudian ditambahkan 1 ml enzim alfa

amilase dalam buffer phosphate pH 6,9 dan 2 ml buffer phosphate pH 6,9. Larutan

dikocok menggunakan vortex hingga homogen dan diinkubasi selama 5 menit.

Reaksi dihentikan dengan penambahan HCl 1M sebanyak 1 ml dan reagen iodin

sebanyak 0,01 ml kemudian dikocok menggunakan vortex lagi hingga homogen.

Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 536 nm. Sementara itu pengukuran efek penghambatan larutan kontrol

blanko sampel memiliki langkah yang sama hanya saja tidak menggunakan enzim

alfa amilase dan menggunakan buffer phosphate pH 6,9 sebanyak 3 ml.

Pengujian Efek Penghambatan Larutan Sampel dan Kontrol Sampel

Pengukuran efek penghambatan larutan blanko sampel dilakukan dengan cara

diambil larutan potato starch 0,5% sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung

reaksi, ditambahkan 1 ml larutan acarbose dalam masing-masing tabung reaksi

dengan konsentrasi 4; 8; 15 dan 20 ml dan ditambahkan 1 ml DMSO 1% kemudian

ditambahkan 1 ml enzim alfa amilase dalam buffer phosphate pH 6,9 dan 2 ml

buffer phosphate pH 6,9. Larutan dikocok menggunakan vortex hingga homogen

dan diinkubasi selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan HCl 1M

sebanyak 1 ml dan reagen iodin sebanyak 0,01 ml kemudian dikocok menggunakan

vortex lagi hingga homogen. Serapan diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 536 nm. Sementara itu

pengukuran efek penghambatan larutan kontrol blanko sampel memiliki langkah

yang sama hanya saja tidak menggunakan enzim alfa amilase dan menggunakan


10

buffer phosphate pH 6,9 sebanyak 3 ml. Pembuatan larutan acarbose dan kontrol

acarbose dilakukan sebanyak tiga kali replikasi.

Perhitungan Nilai Persentase Penghambatan dan Nilai IC50

Hasil absorbansi seluruh larutan uji yang sudah diukur dihitung dengan

mengggunakan rumus:

% Penghambatan = (𝐴1−𝐴2)

𝐴1 x 100%

Keterangan:

A1 : Absorbansi blanko(B*) – absorbansi kontrol dari blanko(KB**)

A2 : Absorbansi sampel(S) – absorbansi kontrol dari sampel(KS***)

B* : Blanko berisi potato starch, DMSO 1%, enzim alfa amilase, buffer

phosphate, HCl 1M dan reagen iodin

KB** : Kontrol dari blanko berisi potato starch, DMSO 1%, buffer phosphate,

HCl 1M dan reagen iodin

S : Sampel berisi potato starch, ekstrak, DMSO 1%, enzim alfa amilase, buffer


KS*** : Kontrol dari sampel berisi potato starch, ekstrak, DMSO 1%, buffer


(Elya et al., 2015)

Sementara itu perhitungan nilai IC50 dilakukan dengan menggunakan

regresi linear dengan ketentuan konsentrasi sampel ekstrak batang brotowali pada

sumbu x dan persen penghambatan yang diperoleh pada sumbu y. Dengan

menggunakan persamaan y = a+bx maka nilai IC50 dapat dihitungan menggunakan

rumus:

IC50 = 50−𝑎

𝑏

(Elya et al., 2015)

Analisis Statistik

Pengukuran efek antihiperglikemia ekstrak etanol batang brotowali

dilakukan sebanyak tiga kali replikasi dan dihitung rerata dan standar deviasi (SD).


11

Data yang diperoleh yaitu persentase penghambatan enzim alfa amilase oleh

ekstrak etanol batang brotowali.

Analisis data pengukuran efek antihiperglikemia ekstrak etanol batang

brotowali diukur secara statistik yang diawali dengan menguji distribusi normalitas

dengan uji Shapiro-Wilk dan menguji homogenitas dengan uji Levene. Apabila

didapatkan data terdistribusi normal (nilai P >0,05), maka dilanjutkan dengan uji

ANOVA satu arah, dan apabila ditemukan perbedaan, maka dilanjutkan dengan uji

Post-Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%; namun apabila didapatkan data

terdistribusi tidak normal (nilai P <0,05), maka dilanjutkan dengan uji Kurskal-

Wallis, dan apabila ditemukan perbedaan, maka dilanjutkan dengan uji Mann-

Whitney dengan taraf kepercayaan 95%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etanol batang

brotowali yang dibuat dengan metode maserasi dalam menghambat enzim alfa

amilase secara in vitro. Hasil dari penelitian ini dilihat dari nilai persentase

penghambatan dan nilai IC50. Senyawa yang dituju dalam penelitian ini adalah

borapetosida A dan C yang termasuk dalam golongan terpenoid. Senyawa tersebut

diduga dapat menghambat enzim alfa amilase sehingga tidak terjadi hidrolisis pati.

Penelitian ini menggunakan batang brotowali yang diperoleh sudah dalam

bentuk serbuk simplisia dari PT. HRL Internasional yang terletak di Kabupaten

Gresik, Jawa Timur. Serbuk simplisia yang digunakan telah diidentifikasi dan

dilakukan determinasi di Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi,

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan nomor referensi No.

32.16.12/UN1/FFA/BF/PT/2019 (Lampiran 1). Hasil identifikasi menunjukkan

bahwa serbuk simplisia yang digunakan berasal dari batang brotowali dengan nama

latin (Tinospora crispa L.) Hook. f. & Thomson.

Dilakukan penetapan kadar air pada serbuk simplisia dengan metode

distilasi toluena dan diperoleh hasil 8.99% (Lampiran 4 dan 5). Menurut

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia (2014), tentang persyaratan obat


12

tradisional mengatakan bahwa kadar air pada serbuk simplisia tidak boleh lebih dari

10% maka dalam hal ini kadar air pada serbuk simplisia batang brotowali telah

sesuai dengan persyaratan yang ada. Penetapan kadar air bertujuan untuk memberi

batasan minimal besarnya kandungan air dalam bahan uji yaitu serbuk simplisia.

Semakin tinggi kadar air maka bahan uji akan semakin mudah untuk ditumbuhi

jamur dan kapang sehingga dapat menurunkan aktivitas biologi simplisia dalam

masa penyimpanan (Salim et al., 2017).

Pembuatan ekstrak etanol dilakukan dengan metode maserasi yaitu metode

yang dilakukan dengan merendam bahan tanaman baik dalam bentuk simplisia

kasar atau serbuk simplisia pada suatu wadah tertutup dengan pelarut didalamnya.

Dibiarkan pada suhu kamar selama suatu periode tertentu sambil terus dikocok.

Proses tersebut bertujuan untuk melunakkan dan menghancurkan dinding sel

tanaman agar dapat melepas zat fitokimia yang dapat terlarut (Nn, 2015). Prinsip

metode maserasi adalah cairan penyari akan menembus dinding sel maka zat aktif

akan terlarut karena ada perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel

dan di luar sel, sehingga larutan dengan konsentrasi tinggi akan terdesak ke luar sel

(Salamah, M.Sc, Apt., Rozak and Al Abror, 2017). Maserasi dilakukan selama 24

jam karena semakin lama waktu maserasi maka kuantitas bahan yang terekstrak

juga akan semakin meningkat karena waktu kontak antara bahan dengan pelarut

makin lama sehingga hasil akan bertambah sampai titik jenuh larutan (Pujiyanto

dkk., 2019).

Penelitian ini melakukan tiga kali proses maserasi dengan pelarut dan

jumlah pelarut yang sama agar penyarian senyawa yang dituju yaitu borapetosida

A dan C dapat memberikan hasil yang optimal. Maserat yang diperoleh kemudian

diuapkan menggunakan alat rotary evaporator pada suhu 60̊C setelah itu

dipekatkan lagi di atas penangas air pada suhu 60̊C. Pembuatan ekstrak etanol

batang brotowali dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Dihitung bobot tetap

ekstrak yang diperoleh. Bobot tetap diperoleh apabila dalam dua kali penimbangan

secara berturut-turut setelah dipijarkan selama satu jam tidak lebih dari 0.25% atau

perbedaan dalam penimbangan tidak lebih dari 0.5 mg (Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, 2008). Setelah diperoleh bobot tetap lalu dilanjutkan dengan


13

menghitung rendemen ekstrak. Rendemen ekstrak adalah perbandingan antara

ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal. Rendemen menggunakan satuan

persen (%), semakin tinggi nilai rendemen yang dihasilkan menandakan nilai

ekstrak yang dihasilkan semakin banyak (Wijaya, Novitasari and Jubaidah, 2018).

Pada replikasi pertama diperoleh bobot ekstrak sebanyak 1.4352 g dari 10.0013 g

serbuk simplisia sehingga diperoleh rendemen ekstrak sebesar 14.35%. Pada

replikasi kedua diperoleh bobot ekstrak sebanyak 2.9281 g dari 10.0005 g serbuk

simplisia sehingga diperoleh rendemen ekstrak sebesar 29.28%. Pada replikasi

ketiga diperoleh bobot ekstrak sebanyak 2.3419 g dari 10.0080 g serbuk simplisia

sehingga diperoleh rendemen ekstrak sebesar 23.40% (Lampiran 6).

Pada skrining fitokimia yang dilakukan oleh Elya et al., (2015) ekstrak

etanol batang brotowali mengandung alkaloid, flavonoid, glikosida dan terpenoid.

Senyawa metabolit sekunder yang diduga memiliki efek antihiperglikemia pada

brotowali adalah borapetosida A dan C yang termasuk dalam golongan terpenoid.

Pada penelitian ini juga dilakukan uji yang bertujuan untuk mengetahui kandungan

metabolit sekunder dalam serbuk simplisia dan ekstrak etanol batang brotowali

dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Uji tersebut dilakukan

membandingkan nilai Rf larutan uji dengan senyawa baku standar. Metode KLT

merupakan metode yang relatif mudah dilakukan, pemisahan senyawa berlangsung

cepat, banyak digunakan serta dapat memisahkan sampel uji dalam jumlah kecil.

Bejana yang digunakan terlebih dahulu dijenuhkan dengan fase gerak yaitu

kloroform-P dan metanol-P dengan perbandingan volume 9:1. Bejana yang sudah

jenuh ditandai dengan kertas saring yang terbasahi oleh fase gerak. Penjenuhan

bejana bertujuan agar elusi dapat berjalan dengan baik sementara itu penggunaan

kertas saring bertujuan agar penjenuhan uap oleh fase gerak merata dalam bejana.

Selama proses elusi, bejana harus ditutup dengan rapat agar proses pemisahan

senyawa dalam ekstrak berjalan dengan baik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Fase diam yang digunakan adalah plat silika gel GF254. Plat silika dipotong

menjadi berukuran 5 cm x 15 cm. Pada plat diberi jarak 2 cm dari tepi bawah, 3 cm

dari tepi atas dan masing-masing 1,5 cm dari tepi kanan dan kiri serta jarak antar

totolan sebesar 1 cm. Dari penandaan plat silika tersebut diperoleh jarak elusi


14

sebesar 10 cm. Sebelum dilakukan penotolan plat silika harus diaktivasi terlebih

dahulu. Aktivasi plat silika bertujuan untuk menghilangkan kelembaban air

atmosfer yang teradsorbsi dalam plat silika. Aktivasi plat silika dapat dilakukan

dalam oven pada suhu 120̊C selama kurang lebih 30 menit (Wulandari, 2011).

Ketika plat silika sudah dimasukkan ke dalam bejana yang berisi fase gerak

dan sudah terjenuhkan, fase gerak akan naik secara perlahan. Dalam proses naiknya

fase gerak, komponen-komponen berbeda dari campuran berjalan pada tingkat yang

berbeda sesuai kepolarannya. Setelah fase gerak mencapai batas atas, plat KLT

diangkat dan dibiarkan kering di luar. Hal ini bertujuan untuk menguapkan sisa

pelarut yang masih terdapat pada plat silika untuk menjamin penguapan telah

sempurna dan agar noda jelas terlihat (Samosir, Bialangi and Iyabu, 2018). Hasil

elusi yang diperoleh dilihat di bawah sinar lampu ultraviolet (UV). Deteksi

dilakukan pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Pada metode KLT

identifikasi awal suatu senyawa didasarkan pada perbandingan nilai Rf larutan uji

dibandingkan dengan nilai Rf standar. Nilai Rf diperoleh dari jarak migrasi analit

dibagi dengan jarak migrasi eluen (Wulandari, 2011).

(a) (b)


simplisia batang brotowali (b) Hasil uji KLT ekstrak batang brotowali


15

Keterangan:

(a): A= Baku kuersetin; B = Serbuk simplisia batang brotowali (replikasi I); C =

Serbuk simplisia batang brotowali (replikasi II)

(b): A= Baku kuersetin; B = Ekstrak air batang brotowali; C = Ekstrak etanol

batang brotowali

Tabel I. Identifikasi metabolit sekunder serbuk simplisia

Sampel Nilai Rf Warna Bercak Selisih Rf

Kuersetin (baku

pembanding) 0.57 Kuning -

Sampel serbuk

I 0.62

Kuning-

kecoklatan 0.05

Sampel serbuk

II 0.65

Kuning-

kecoklatan 0.08

Tabel II. Identifikasi metabolit sekunder ekstrak batang brotowali


Kuersetin (baku


Ekstrak air

batang

brotowali

0.18 Kuning-

kecoklatan 0.04

Ekstrak etanol

batang

brotowali

0.16 Kuning-

kecoklatan 0.06

Hasil pengujian flavonoid yang diperoleh menggunakan metode KLT

dengan pembanding kuersetin dan dideteksi dengan lampu UV 254 nm (Gambar

1). Kuersetin termasuk dalam kelas flavonol yang tidak dapat diproduksi dalam

tubuh manusia. Berwarna kuning dan sukar larut dalam air panas, agak mudah larut


16

dalam alkohol dan lipid dan tidak larut dalam air dingin (Anand David, Arulmoli

and Parasuraman, 2016). Volume penotolan untuk baku kuersetin sebesar 5 µL dan

untuk sampel masing-masing 10 µL. Pada pengujian kandungan metabolit sekunder

serbuk simplisia batang brotowali yang dilihat di bawah lampu UV 254 nm dengan

senyawa pembanding kuersetin diperoleh nilai Rf 0.57 untuk baku pembanding

kuersetin, 0.62 untuk nilai Rf serbuk simplisia batang brotowali replikasi pertama

dan 0.65 untuk replikasi kedua (Tabel I). Menurut Direktorat Jenderal Bina

Kefarmasian dan Alat Kesehatan Republik Indonesia (2013) tentang deteksi

metabolit sekunder pada serbuk simplisia batang brotowali nilai Rf baku

pembanding kuersetin adalah 0.72. Selisih nilai Rf berturut-turut pada sampel

serbuk simplisia replikasi pertama dan kedua adalah 0.05 dan 0.08. Hasil pengujian

menunjukkan bahwa warna bercak antara sampel dan baku sama. Nilai Rf antara

sampel dan baku saling mendekati dengan selisih ≤0.2 (Samosir, Bialangi and

Iyabu, 2018). Pada pengujian kandungan metabolit sekunder pada ekstrak etanol

batang brotowali diperoleh nilai Rf 0.22 untuk baku pembanding kuersetin dan 0.16

untuk nilai Rf ekstrak etanol batang brotowali. Selisih nilai Rf berturut-turut pada

sampel ekstrak air dan ekstrak etanol batang brotowali adalah 0.04 dan 0.06. Nilai

Rf antara sampel dan baku saling mendekati dengan selisih ≤0.2 (Samosir, Bialangi

and Iyabu, 2018). Maka dapat dikatakan bahwa sampel baik serbuk simplisia,

ekstrak air maupun ekstrak etanol batang brotowali mengandung senyawa metabolit

sekunder flavonoid.

Pada penelitian ini senyawa metabolit sekunder yang ditargetkan

sebenarnya adalah terpenoid. Berdasarkan hasil yang diperoleh setelah dilihat di

bawah lampu UV 366 nm (Gambar 2), terdapat bercak berwarna biru-kehijauan

yang menandakan bahwa terdapat senyawa metabolit sekunder terpenoid (Jiang,

Kempinski and Chappell, 2017).


17

(a) (b)


simplisia daun sambiloto (b) Hasil uji KLT ekstrak batang brotowali

Keterangan:

(a): A= Baku kuersetin; B = Serbuk simplisia batang brotowali (replikasi I); C =

Serbuk simplisia batang brotowali (replikasi II)

(b): A= Baku kuersetin; B = Ekstrak air batang brotowali; C = Ekstrak etanol

batang brotowali

Tabel III. Identifikasi metabolit sekunder serbuk simplisia


Kuersetin (baku


Sampel serbuk

I 0.73 Biru-kehijauan 0.16

Sampel serbuk

II 0.74 Biru-kehijauan 0.17


18

Tabel IV. Identifikasi metabolit sekunder ekstrak batang brotowali


Kuersetin (baku


Ekstrak air

batang

brotowali

0.57 Biru-kehijauan 0.35

Ekstrak etanol

batang

brotowali

0.55 Biru-kehijauan 0.33

Pada pengujian kandungan metabolit sekunder serbuk simplisia batang

brotowali yang dilihat di bawah lampu UV 366 nm dengan senyawa pembanding

kuersetin diperoleh nilai Rf 0.57 untuk baku pembanding kuersetin, 0.73 untuk nilai

Rf serbuk simplisia batang brotowali replikasi pertama dan 0.74 untuk replikasi

kedua (Tabel III). Selisih nilai Rf berturut-turut pada sampel serbuk simplisia

replikasi pertama dan kedua adalah 0.16 dan 0.17. Pada pengujian kandungan

metabolit sekunder pada ekstrak etanol batang brotowali diperoleh nilai Rf 0.22

untuk baku pembanding kuersetin dan 0.55 untuk nilai Rf ekstrak etanol batang

brotowali (Tabel IV). Selisih nilai Rf ekstrak etanol batang brotowali dengan baku

pembanding kuersetin adalah adalah 0.33. Selisih nilai Rf yang diperoleh antara

baku pembanding dengan sampel >0.2 sehingga dapat dikatakan bahwa terdapat

senyawa lain ekstrak etanol senyawa batang brotowali mengandung senyawa

metabolit sekunder lain selain kuersetin.

Hasil pengujian kandungan metabolit sekunder menunjukkan bahwa ketika

plat diletakkan di bawah lampu UV dengan panjang gelombang yang berbeda

terdapat perbedaan dan variasi kandungan senyawa metabolit sekunder. Hal

tersebut dilihat dari perbedaan letak bercak, warna bercak dan perbedaan nilai Rf

yang diperoleh.

Pengujian aktivitas penghambatan enzim alfa amilase dilihat berdasarkan

penurunan intensitas warna biru pada kompleks iodin-pati karena berkurangnya


19

substrat pati akibat hidrolisis yag dilakukan oleh enzim (Ononamadu et al., 2020).

Sebelum dilakukan pengujian perlu dilakukan optimasi panjang gelombang

maksimum dan optimasi operating time (OT). Tujuan penentuan panjang

gelombang maksimum agar mengetahui daerah serapan dalam kondisi optimum

yang dihasilkan dari nilai absorbansi yang diukur menggunakan alat

spektrofotometer UV-Vis (Sudewi and Pontoh, 2018). Optimasi dilakukan pada

rentang panjang gelombang 400-800 nm dan diperoleh panjang gelombang

maksimum 536 nm (Lampiran 8).

Penentuan OT ditentukan dengan mengukur absorbansi pada panjang

gelombang maksimum yang sudah ditentukan sebelumnya yaitu 536 nm dengan

konsentrasi yang digunakan adalah 4 mg/ml dan dalam rentang waktu 5; 10; 20;

dan 30 menit. Diperoleh OT selama 5 menit (Lampiran 9). OT yang diperoleh

digunakan sebagai waktu inkubasi dari larutan yang akan diuji.

Pengujian aktivitas penghambatan enzim alfa amilase dilakukan pada

larutan blanko acarbose, kontrol blanko acarbose, sampel berisi acarbose, kontrol

sampel acarbose, blanko sampel uji, kontrol blanko sampel uji, sampel uji berisi

ekstrak etanol batang brotowali dan kontrol sampel uji. Pengujian larutan blanko

dan kontrol blanko bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim alfa amilase

sehingga larutan uji yang digunakan tanpa adanya penambahan larutan acarbose

dan larutan sampel uji berupa ekstrak etanol batang brotowali. Sementara itu

pengujian larutan sampel berisi acarbose digunakan sebagai pembanding dengan

pengujian larutan sampel berisi ekstrak etanol batang brotowali. Keduanya

dilakukan untuk melihat aktivitas penghambatan terhadap enzim alfa amilase.

Penggunaan potato-starch dalam penelitian ini bertujuan sebagai substrat

dari enzim alfa amilase. Penggunaan DMSO dipilih sebagai pelarut karena bersifat

tidak mudah menguap (non-volatile solvents). Selain itu DMSO merupakan pelarut

organik paling kuat yang dapat melarutkan berbagai macam bahan organik secara

efektif (Jacob and de la Torre, 2015). HCl dipilih dan digunakan untuk menghentika

reaksi enzimatik hal ini karena pH merupakan suatu faktor yang mempengaruhi

aktivitas dan stabilitas enzim. Pada suatu reaksi enzimatik yang melibatkan

pelepasan atau penyerapan proton hal tersebut penting untuk memantau pH untuk


20

memastikan efisiensi kontrol proses dan untuk meminimalkan perubahan pada

proses dan kualitas produk akhir (Gruber et al., 2017). Berdasarkan penjelasan

tersebut maka HCl dapat digunakan untuk menghentikan reaksi karena HCl

merupakan golongan asam kuat sehingga ketika ditambahkan pada larutan uji maka

pH larutan uji yang berisi enzim alfa amilase akan berubah dan dapat terjadi

denaturasi enzim. Enzim alfa amilase sendiri bekerja optimal pada pH 7.0

(Sundarram and Murthy, 2014). Larutan buffer phosphate pH 6.9 (Lampiran 10)

digunakan untuk mempertahankan pH enzim alfa amilase sehingga selama proses

berlangsungnya reaksi, enzim alfa amilase tetap bekerja secara optimal. Reagen

iodin digunakan sebagai indikator warna karena pati bereaksi dengan reagen iodin

membentuk warna biru (Louis and Gabriel, 2014). Warna biru yang terbentuk akan

dibaca serapannya menggunakan metode spektrofotometri.

Sampel berisi acarbose maupun ekstrak etanol batang brotowali masing-

masing dibagi menjadi empat tingkat konsentrasi yaitu 4; 8; 15 dan 20 mg/ml.

Pengujian sampel dilakukan dengan berbagai varian konsentrasi yang bertujuan

untuk melihat pengaruh konsentrasi sampel terhadap peningkatan daya hambat.

Seluruh larutan uji akan diukur serapannya menggunakan metode spektrofotometri

hingga diperoleh nilai absorbansi (Lampiran 11). Nilai absorbansi yang diperoleh

pada setiap larutan uji akan digunakan untuk menghitung nilai persentase

penghambatan dan nilai IC50. Nilai persentase penghambatan digunakan untuk

menentukan persentase hambatan dari suatu bahan yang dilakukan terhadap

aktivitas enzim alfa amilase.

Tabel V. Nilai persentase penghambatan acarbose

Konsentrasi

(mg/ml)

Replikasi I

(%)

Replikasi II

(%)

Replikasi III

(%)

4 42.89 40.48 42.23

8 61.93 60.18 59.30

15 77.68 77.90 78.12

20 87.31 89.50 84.68


21

Tabel VI. Nilai persentase penghambatan ekstrak etanol batang brotowali

Konsentrasi

(mg/ml)

Replikasi I

(%)

Replikasi II

(%)

Replikasi III

(%)

4 23.16 27.89 21.84

8 38.68 38.95 37.37

15 53.16 54.21 69.47

20 83.42 78.16 77.89

Berdasarkan nilai persentase penghambatan aktivitas enzim alfa amilase

oleh acarbose (Tabel V) diperoleh nilai r berturut-turut dari replikasi pertama

hingga replikasi ketiga sebesar 0.981; 0.990 dan 0.980 dengan rata-rata nilai

persentase penghambatan berturut-turut dari konsentrasi terkecil hingga terbesar

sebagai berikut 41.87% ± 1.25; 60.47% ± 1.34; 77.90% ± 0.22 dan 87.16% ± 2.41.

Sementara itu untuk nilai persentase penghambatan aktivitas enzim alfa amilase

oleh ekstrak etanol batang brotowali (Tabel VI) diperoleh nilai r berturut-turut dari

replikasi pertama hingga replikasi ketiga sebesar 0.977; 0.985 dan 0.987 dengan

rata-rata nilai persentase penghambatan berturut-turut dari konsentrasi terkecil

hingga terbesar sebagai berikut 24.30% ± 3.18; 38.33% ± 0.85; 58.95% ± 9.13 dan

79.82% ± 3.12. Selisih nilai persentase penghambatan antar replikasi pada

konsentrasi yang sama khususnya pada konsentrasi 4; 15 dan 20 mg/ml cukup besar

karena tiap replikasi konsentrasi tersebut menggunakan replikasi ekstrak yang sama

dari awal. Maka dari itu dapat dikatakan bahwa kandungan senyawa metabolit

sekunder pada ekstrak khususnya senyawa borapetosida A dan C pada replikasi I,

II dan III terdapat perbedaan dilihat dari hasil rendemen ekstrak yang bervariasi

sehingga dapat berpengaruh pada hasil nilai persentase penghambatan uji aktivitas

penghambatan enzim alfa amilase.

Pada penelitian yang dilakukan oleh Pujiyanto dkk., (2019) uji aktivitas

penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak etanol batang brotowali diperoleh

nilai persentase penghambatan berturut-turut dari konsentrasi 125; 250; 500; dan

1000 μg/ml sebesar 47.08%; 92.84%; 94.41% dan 95.06%. Ekstrak etanol dibuat

dengan metode maserasi dengan pelarut etanol 96% dan penghentian reaksi


22

dilakukan dengan menambah reagen dinitrosalisilat (DNS). Hasil yang diperoleh

lebih baik apabila dibandingkan denga hasil penelitian milik penulis. Hal tersebut

dapat dipengaruhi oleh beberapa hal diantaranya perbedaan pelarut dan reagen yang

digunakan dalam pengujian aktivitas penghambatan enzim alfa amilase. Namun

kedua hasil penelitian menyatakan bahwa seiring dengan meningkatnya konsentrasi

ekstrak maka nilai persentase penghambatan juga akan semakin meningkat.

Nilai r merupakan nilai yang menggambarkan hubungan antara peningkatan

konsentrasi dengan nilai peningkatan persentase penghambatan. Apabila nilai r

mendekati 1 maka semakin menggambarkan korelasi yang sempurna (Gandjar dan

Rohman, 2017). Pada ketiga replikasi diperoleh nilai r yang hampir mendekati 1

hal ini berarti dapat dikatakan bahwa terdapat hubungan antara peningkatan

konsentrasi dengan peningkatan nilai persentase penghambatan ekstrak etanol

batang brotowali.

Setelah dilakukan perhitungan persentase penghambatan sampel uji maka

selanjutnya dilakukan perhitungan nilai IC50. Nilai IC50 merupakan parameter

aktivitas penghambatan pada suatu senyawa atau ekstrak. Nilai IC50 merupakan

konsentrasi sampel uji berupa ekstrak etanol batang brotowali yang memiliki

aktivitas penghambatan enzim alfa amilase sebesar 50%. Perhitungan nilai IC50

dilakukan dengan menggunakan regresi linear dengan ketentuan konsentrasi

sampel ekstrak etanol batang brotowali sebagai sumbu x dan persentase

penghambatan sebagai sumbu y (Elya et al., 2015).

Nilai IC50 ekstrak etanol batang brotowali yang diperoleh berturut-turut dari

replikasi pertama hingga replikasi ketiga sebesar 11.84; 11.83 dan 11.30 mg/ml

dengan rata-rata nilai IC50 sebesar 11.66 mg/ml ± 0.31 dan CV = 2.66%. Sementara

itu nilai IC50 acarbose diperoleh berturut-turut dari replikasi pertama hingga

replikasi ketiga sebesar 5.22; 6.00 dan 5.65 mg/ml dengan rata-rata nilai IC50

sebesar 5.62 mg/ml ± 0.39 dan CV = 6.94%. Nilai IC50 ekstrak etanol batang

brotowali lebih besar dari nilai IC50 acarbose. Berdasarkan hal tersebut dapat

dikatakan bahwa kemampuan ekstrak etanol batang brotowali dalam menghambat

enzim alfa amilase tidak sebaik acarbose, hal ini disebabkan karena dalam ekstrak

etanol batang brotowali banyak terdapat senyawa lain yang kemungkinan dapat


23

menurunkan aktivitas dalam menghambat enzim alfa amilase. Selain itu nilai IC50

acarbose sebagai pembanding terlalu tinggi karena acarbose yang digunakan

merupakan sediaan tablet dengan kekuatan 50 mg bukan senyawa acarbose murni.

Pada sediaan tablet acarbose sudah terdapat bahan tambahan lain seperti bahan

pengisi, bahan pengikat dan lain-lain. Bahan-bahan tersebut dapat memengaruhi

hasil pengujian aktivitas penghambatan enzim alfa amilase.

Dilakukan uji statistik untuk melihat kebermaknaan nilai persentase

penghambatan antar konsentrasi. Uji statistik yang dilakukan pertama kali adalah

uji normalitas dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Uji normalitas digunakan

untuk melihat apakah data yang diperoleh terdistribusi normal atau tidak.

Berdasarkan hasil uji tersebut diperoleh nilai p>0.05 (Lampiran 12), hal ini

menunjukkan bahwa data nilai persentase antar konsentrasi terdistribusi secara

normal. Lalu dilanjutkan dengan uji homogenitas dengan menggunakan uji Levene.

Uji homogenitas dilakukan dengan tujuan melihat homogenitas atau kesamaan

beberapa bagian sampel atau seragam tidaknya variansi sampel (Naibaho, 2018).

Berdasarkan hasil uji tersebut diperoleh nilai p<0.05 (Lampiran 13), hal ini

menunjukkan bahwa data nilai persentase antar konsentrasi tidak homogen. Hasil

uji normalitas menunjukkan bahwa data terdistribusi dengan normal maka

dilanjutkan dengan uji ANOVA satu arah. Berdasarkan hasil uji tersebut diperoleh

nilai p<0.05 (Lampiran 14), hal ini menunjukkan bahwa data nilai persentase dari

keempat kelompok konsentrasi memiliki perbedaan. Kemudian dilanjutkan dengan

uji Post-Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%. Berdasarkan hasil uji tersebut

diperoleh nilai p<0.05 (Lampiran 15), hal ini menunjukkan bahwa setiap

konsentrasi yang diujikan terdapat perbedaan yang bermakna. Sehingga dapat

dikatakan bahwa peningkatan konsentrasi mempengaruhi peningkatan aktivitas

penghambatan enzim alfa amilase oleh ekstrak etanol batang brotowali.

Uji statistik juga dilakukan pada nilai persentase penghambatan acarbose.

Berdasarkan uji normalitas diperoleh nilai p>0.05 (Lampiran 16), hal ini

menunjukkan bahwa data nilai persentase antar konsentrasi terdistribusi secara

normal. Sementara itu untuk uji homogenitas diperoleh nilai p>0.05 (Lampiran 17),

hal ini menunjukkan bahwa data nilai persentase antar konsentrasi homogen. Hasil


24

uji normalitas menunjukkan bahwa data terdistribusi dengan normal maka

dilanjutkan dengan uji ANOVA satu arah. Berdasarkan hasil uji tersebut diperoleh

nilai p<0.05 (Lampiran 18), hal ini menunjukkan bahwa data nilai persentase dari

keempat kelompok konsentrasi memiliki perbedaan. Kemudian dilanjutkan dengan

uji Post-Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%. Berdasarkan hasil uji tersebut

diperoleh nilai p<0.05 (Lampiran 19), hal ini menunjukkan bahwa setiap

konsentrasi yang diujikan terdapat perbedaan yang bermakna. Menurut penelitian

yang dilakukan Ibrahim et al., (2017) diperoleh nilai IC50 acarbose sebesar 200.19

mg/ml ± 7.29 sedangkan pada penelitian ini diperoleh sebesar 5.62 mg/ml ± 0.39.

Perbedaan nilai IC50 yang sangat jauh tersebut dapat disebabkan oleh beberapa hal

seperti perbedaan acarbose yang digunakan dan perbedaan substrat enzim yang

digunakan. Pada penelitian ini menggunakan potato starch sedangkan pada

penelitian Ibrahim et al., (2017) yang sudah mengalami modifikasi menggunakan

maltopentoglikosida. Selain itu dapat disebabkan oleh perbedaan pelarut dan

konsentrasi pelarut yang digunakan serta yang paling utama perbedaan metode

penelitian yang digunakan.

Kemudian dilakukan juga analisis statistik berupa uji T antara nilai IC50

acarbose dengan ekstrak etanol batang brotowali. Uji T digunakan karena hanya

terdapat dua kelompok yang dibandingkan. Berdasarkan uji tersebut diperoleh nilai

p<0.05 (Lampiran 20), hal tersebut menyatakan bahwa terdapat perbedaan yang

signifikan sehingga dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan aktivitas

penghambatan terhadap enzim alfa amilase antara acarbose dengan ekstrak etanol

batang brotowali.

Menurut penelitian yang dilakukan Hamid et al., (2015) menyatakan bahwa

senyawa borapetosida C merupakan senyawa yang paling banyak ditemukan dalam

tanaman brotowali dan dapat menghambat enzim alfa amilase secara in vitro

dengan nilai IC50 sebesar 0.775 ± 0.005 mg/ml. Senyawa borapetosida diperoleh

dari ekstrak heksan batang brotowali yang dibuat dengan metode perkolasi. Maka

dapat dikatakan bahwa hasil dari penelitian ini ekstrak etanol batang brotowali

dengan metode maserasi memiliki aktivitas menghambat enzim alfa amilase.


25

Gambar 3. Struktur Acarbose

(PubChem, 2019)

(a) (b)

Gambar 4. (a) Struktur Borapetosida A; (b) Struktur Borapetosida C

(PubChem, 2019)

Gambar 5. Struktur Amilum

(PubChem, 2019)


26

KESIMPULAN

Berdasarkan pengujian ekstrak etanol batang brotowali memiliki aktivitas

penghambatan enzim alfa amilase. Hasil analisis statistik yang membandingkan

nilai persentase penghambatan diperoleh nilai p<0.05 yang menyatakan bahwa

terdapat perbedaan yang bermakna antar konsentrasi ekstrak etanol batang

brotowali yang digunakan. Selain itu analisis statistik yang membandingkan nilai

IC50 acarbose dengan ekstrak etanol batang brotowali diperoleh nilai p<0.05 bahwa

terdapat perbedaan yang signifikan pada aktivitas penghambatan terhadap enzim

alfa amilase antara acarbose dengan ekstrak etanol batang brotowali dengan nilai

IC50 berturut-turut 5.62 mg/ml ± 0.39 dan 11.66 mg/ml ± 0.31.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap aktivitas ekstrak etanol

brotowali terutama dalam uji kualitatif dengan menggunakan senyawa borapetosida

A dan C murni untuk mengetahui kandungan senyawa borapetosida A dan C pada

sampel. Selain itu perlu dilakukan pula uji lanjutan secara in-vivo untuk

membuktikan bahwa ekstrak etanol batang brotowali mampu menurunkan kadar

gula darah pada hewan uji.


27

DAFTAR PUSTAKA

Agarwal, P. and Gupta, R. 2016 Alpha-amylase inhibition can treat diabetes

mellitus. Research & Reviews: Journal of Medical and Health Sciences, 5(4),

pp. 1–8.

Ahmad, W., Jantan, I. and Bukhari, S. N. A. 2016. Tinospora crispa (L.) Hook. f.

& Thomson: A review of its ethnobotanical, phytochemical, and

pharmacological aspects. Frontiers in Pharmacology, 7(MAR), pp. 1–19.

Anand David, A. V., Arulmoli, R. and Parasuraman, S. 2016. Overviews of

biological importance of quercetin: A bioactive flavonoid. Pharmacognosy

Reviews, 10(20), pp. 84–89.

Atmajani, W. et al. 2018. α-Glucosidase Inhibitory Activity of In Vitro

Combination of 96% Ethanolic Extract of Brotowali Stem (Tinospora

cordifolia) and Cashew Apple (Anacardium occidentale L.). Journal of

Tropical Pharmacy and Chemistry, pp. 175–181.

de Sales, P. M. et al. 2012. α-amylase inhibitors: A review of raw material and

isolated compounds from plant source. Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, pp. 141–183.

Direktorat Jendral Bina Kefarmasian Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2008.

Farmakope Herbal. Suplemen II. Edisi I, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI,

100-111.

Direktorat Jendral Bina Kefarmasian Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2013.

Farmakope Herbal. Suplemen II. Edisi I, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI,

100-111.

Elya, B. et al. 2015. Antidiabetic activity and phytochemical screening of extracts

from indonesian plants by inhibition of alpha amylase, alpha glucosidase and

dipeptidyl peptidase IV. Pakistan Journal of Biological Sciences, 18(6), pp.

273-278.

Gandjar, I. G., dan Rohman, A., 2017. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar,Yogyakarta, pp.253-254, 466-467.

Gruber, P. et al. 2017. Real-time pH monitoring of industrially relevant enzymatic


28

reactions in a microfluidic side-entry reactor (μSER) shows potential for pH

control. Biotechnology Journal, 12(6), pp. 1–28.

Hamid, H.A., et al., 2015. α-Glucosidase and α-amylase inhibitory constituents of

Tinospora crispa: Isolation and chemical profile confirmation by ultra-high

performance liquid chromatography-quadrupole t ime-of-flight/mass

spectrometry. Journal of Functional Foods I6, 74-80.

Ibrahim, A. et al. 2017. HPLC profile, in vitro alpha-amylase, alpha-glucosidase

inhibitory and antioxidant activities of Gymnema sylvestre ethyl acetate leaf

extract. Bayero Journal of Pure and Applied Sciences, 10(1), p. 72.

Jacob, S. W. dan de la Torre J.C. 2015. Dimethyl Sulfoxide in Trauma and Disease.

CRC Press, Florida.

Jiang, Z., Kempinski, C. and Chappell, J. 2017. Extraction and analysis of

terpenes/terpenoids. Curr Protoc Plant Biol. 2016(1), p. 345-358.

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2014. Farmakope Indonesia V.

Kharroubi, A. T. 2015. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World

Journal of Diabetes, 6(6), p. 850.

Koay, Y. C. Y. C. and Amir, F. 2013. A review of the secondary metabolites and

biological activities of Tinospora crispa (Menispermaceae). Tropical Journal

of Pharmaceutical Research, 12(4), pp. 641–649.

Kumar, S., Jyotirmayee, K. and Sarangi, M. 2013. Thin layer chromatography: A

tool of biotechnology for isolation of bioactive compounds from medicinal

plants. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and

Research, 18(1), pp. 126–132.

Lam, S. H. et al. 2012. Hypoglycemic diterpenoids from Tinospora crispa. Journal

of Natural Products, 75(2), pp. 153–159.

Lokman, F. E. et al. 2013. Antidiabetic effect of oral borapetol B compound,

isolated from the plant tinospora crispa, by stimulating insulin release.

Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2013.

Louis, M. N. and Gabriel, B. O. 2014. Colour of starch-iodine complex as index of

retrogradability of starch pastes. African Journal of Pure and Applied

Chemistry, 8(5), pp. 89–93.


29

Mun’im, A. et al. 2013. Screening of α- Glucosidase Inhibitory Activity of Some

Indonesian Medicinal Plants. International J. Med. Arom. Plants, pp. 144–

150.

Naibaho, Agus Junsion, 2018. Perbedaan Peningkatan Kemampuan Pemecahan

Masalah Matematika dengan Pendekatan Contextual Teaching and Learning

di Kelas X. Jurnal EduMatSains, 3(1), pp. 69-86.

Nn, A. 2015. A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants,

Principle, Strength and Limitation. Medicinal & Aromatic Plants, 04(03), pp.

3–8.

Oboh, G. et al. 2016. Influence of gallic acid on α-amylase and α-glucosidase

inhibitory properties of acarbose. Journal of Food and Drug Analysis, 24(3),

pp. 627–634.

Ononamadu, C. J. et al. 2020. Starch-iodine assay method underestimates α-

amylase inhibitory potential of antioxidative compounds and extracts.

Biotechnologia, pp. 45–54.

Parimelazhagan, T. 2016. Pharmacological Assays of Plant-Based Natural

Products, Internasional Publishing, Switzerland.

Pramitasari, M. D., Pujiyanto, S. and Suprihadi, A. 2017. AKTIVITAS

INHIBITOR Α-AMILASE ISOLAT KHAMIR ENDOFIT DARI

TUMBUHAN BROTOWALI (Tinospora crispa L.). Jurnal Biologi, pp. 76–

84.

PubChem, 2019. Compound Summary: Acarbose.

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Acarbose, diakses tanggal 18

Mei 2020.

PubChem, 2019. Compound Summary: Borapetoside A.

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Borapetoside, diakses tanggal

7 Juni 2020.

PubChem, 2019. Compound Summary: Borapetoside C.

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Tinocrisposide, diakses

tanggal 7 Juni 2020.

PubChem, 2019. Compound Summary: Starch


30

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Starch, diakses tanggal 21 Mei

2020.

Pujiyanto, S., Wijanarka, Raharja, B., dan Anggraeni, Via, 2019. Aktivitas Inhibitor

α-Amilase Eekstrak Etanol Tanaman Brotowali (Tinospora crispa L.).

Bioma, 21(2), pp. 91-99.

Rezki, R. S., Anggoro, D. and MZ, S. 2015. Ekstraksi Multi Tahap Kurkumin Dari

Kunyit (Curcumadomestica Valet) Menggunakan Pelarut Etanol. Jurnal

Teknik Kimia USU, 29, pp. 29–34.

Rosak, C. and Mertes, G. 2012. Critical evaluation of the role of acarbose in the

treatment of diabetes: Patient considerations. Diabetes, Metabolic Syndrome

and Obesity: Targets and Therapy, 5, pp. 357–367.

Ruan, C. T. et al. 2013. Hypoglycemic action of borapetoside A from the plant

Tinospora crispa in mice. Phytomedicine. Elsevier GmbH., 20(8–9), pp. 667–

675.

Salamah, M.Sc, Apt., N., Rozak, M. and Al Abror, M. 2017. Pengaruh metode

penyarian terhadap kadar alkaloid total daun jembirit (Tabernaemontana

sphaerocarpa. BL) dengan metode spektrofotometri visibel. Pharmaciana,

7(1), p. 113.

Salim, M. et al. 2017. Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak Kulit Buah Duku

(Lansium domesticum Corr) dari Provinsi Sumatera Selatan dan Jambi.

Jurnal Kefarmasian Indonesia, 6(2), pp. 117–128.

Samosir, S. A., Bialangi, N. and Iyabu, H. 2018. Analisis Kandungan Rhodamin B

pada Saos Tomat Yang Beredar di Pasar Sentral Kota Gorontalo Dengan

Menggunakan Metode Kromatografi Lapis Tipis ( KLT ). Jurnal Entropi,

13(1), pp. 45–49.

Sudewi, S. and Pontoh, J. 2018. Optimasi dan Validasi Metode Analisis Dalam

Penentuan Kandungan Total Flavonoid Pada Ekstrak Daun Gedi Hijau

(Abelmoscus Manihot L.) yang Diukur Menggunakan Spektrofotometer Uv-

Vis. Pharmacon, 7(3), pp. 32–41.

Sundarram, A. and Murthy, T. P. K., 2014. α-amylase production and applications:

a review. Journal of Applied and Environtmental Microbiology, 2(4), pp. 166-


31

175.

Tundis, R., Loizzo, M. R. and Menichini, F. 2010. Natural Products as α-

Amylase and α-Glucosidase Inhibitors and their Hypoglycaemic

Potential in the Treatment of Diabetes: An Update. Mini-Reviews in

Medicinal Chemistry, 10(4), pp. 315–331.

Wijaya, H., Novitasari and Jubaidah, S. 2018. RENDEMEN EKSTRAK DAUN

RAMBAI LAUT (Sonneratia caseolaris L. Engl). Jurnal Ilmiah Manuntung,

4(1), pp. 79–83.

Wulandari, L. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Taman kampus.

Yadav, N., Yadav, R. and Goyal, A. 2014. Chemistry of terpenoids. International

Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 27(2), pp. 272–

278.


32

Lampiran 1. Surat Determinasi Serbuk Simplisia Batang Brotowali (Tinospora

crispa L.) Hook. f. & Thomson


33

Lampiran 2. Certificate of Alpha Amylase Enzyme


34

Lampiran 3. Serbuk Simplisia Batang Brotowali dan Ekstrak Etanol Batang

Brotowali

Gambar 6. Serbuk Simplisia Batang Brotowali

Gambar 7. Ekstrak Etanol Batang Brotowali


35

Lampiran 4. Penentuan Kadar Air Serbuk Simplisia Batang Brotowali

Gambar 8. Penentuan Kadar Air

Lampiran 5. Perhitungan Hasil Uji Kadar Air Serbuk Simplisia

Data penimbangan:

Berat wadah 62.3841 g

Berat wadah + isi 72.3908 g

Berat wadah sisa 62.3841 g

Berat isi 10.0067 g

Volume air yang diperoleh = 0.9 mL

% Kadar air = 0.9

10.0067 x 100% = 8.99%

Lampiran 6. Perhitungan Rendemen Simplisia

Data Penimbangan Serbuk Simplisia

Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g)

Berat wadah 0.2487 0.2469 0.2476

Berat wadah + isi 10.2500 10.2414 10.2414

Berat isi 10.0013 10.0005 10.0080


36

Data Penimbangan Ekstrak Etanol Batang Brotowali

Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g)

Berat wadah 53.6283 59.2818 73.1842

Berat wadah + isi 55.0635 62.2099 75.5456

Berat isi 1.4352 2.9281 2.3419

Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Batang Brotowali

a. Replikasi I

% Rendemen = 1.4352 𝑔

10.0013 x 100% = 14.35%

b. Replikasi II


10.0005 𝑔 x 100% = 29.28%

c. Replikasi III


10.0080 𝑔 x 100% = 23.40%

Lampiran 7. Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Serbuk Simplisia Batang

Brotowali dan Ekstrak Batang Brotowali dengan Metode KLT

Data Penimbangan Serbuk Simplisia Batang Brotowali

Replikasi I (g) Replikasi II (g)

Berat wadah 0.2461 0.2474

Berat wadah + isi 1.2466 1.2485

Berat isi 1.0005 1.0011

Data Penimbangan Ekstrak Air dan Etanol Batang Brotowali

Ekstrak Air (g) Ekstrak Etanol (g)

Berat wadah 12.6662 13.6622

Berat wadah + isi 12.6889 13.7146

Berat isi 0.0227 0.0524


37

Lampiran 8. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Replikasi Abscis Absorbansi

I 536.0 0.600

II 533.0 0.598

III 535.0 0.589

Gambar 9. Perolehan Panjang Gelombang Maksimum

Gambar 10. Grafik Perolehan Panjang Gelombang Maksimum


38

Lampiran 9. Penentuan Operating Time (OT)

Waktu (menit) Absorbansi

5 0.576

10 0.525

20 0.472

30 0.411

Lampiran 10. Perhitungan Larutan Buffer Phosphate pH 6,9

a. Natrium fosfat (Na3PO4)

Diketahui: Mr = 164; 20 mM

mol = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔)

𝑀𝑟

0.02 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔)

164

massa (g) = 3.28 g

b. Natrium klorida (NaCl)

Diketahui: Mr = 58.5; 6.7 mM

mol = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔)

𝑀𝑟

0.0067 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔)

58.5

massa (g) = 0.39195 g

Lampiran 11. Data dan Perhitungan Nilai Absorbansi

a. Nilai absorbansi larutan blanko dan kontrol blanko acarbose

Replikasi Absorbansi

blanko (B)

Absorbansi

kontrol

blanko (KB)

B - KB Rata-rata

I 0.039 0.421 -0.382

-0.457 II 0.042 0.598 -0.556

III 0.038 0.472 -0.434


39

b. Nilai absorbansi larutan sampel dan kontrol sampel acarbose

Konsentrasi

(mg/mL)

Repli-

kasi

Absorbansi

sampel (S)

Absorbansi

kontrol

sampel (KS)

S - KS %

inhibisi

4

I 0.129 0.390 -0.261 42.89%

II 0.189 0.461 -0.272 40.48%

III 0.114 0.378 -0.264 42.23%

8

I 0.330 0.504 -0.174 61.93%

II 0.398 0.580 -0.182 60.18%

III 0.383 0.569 -0.186 59.30%

15

I 0.449 0.551 -0.102 77.68%

II 0.425 0.526 -0.101 77.90%

III 0.478 0.578 -0.100 78.12%

20

I 0.690 0.748 -0.058 87.31%

II 0.694 0.742 -0.048 89.50%

III 0.656 0.726 -0.070 84.68%

c. Nilai absorbansi larutan blanko dan kontrol blanko sampel uji

Replikasi Absorbansi

blanko (B)

Absorbansi

kontrol

blanko (KB)

B - KB Rata-rata

I 0.071 0.434 -0.363

-0.380 II 0.062 0.471 -0.409

III 0.068 0.435 -0.367


40

d. Nilai absorbansi larutan sampel dan kontrol sampel uji

Konsentrasi

(mg/mL)

Repli-

kasi

Absorbansi

sampel (S)

Absorbansi

kontrol

sampel (KS)

S - KS %

inhibisi

4

I 0.077 0.369 -0.292 23.16%

II 0.072 0.346 -0.274 27.89%

III 0.097 0.394 -0.297 21.84%

8

I 0.385 0.618 -0.233 38.68%

II 0.371 0.603 -0.232 38.95%

III 0.363 0.601 -0.238 37.37%

15

I 0.451 1.033 -0.582 53.16%

II 0.490 1.076 -0.586 54.21%

III 0.440 1.084 -0.644 69.47%

20

I 0.699 1.396 -0.697 83.42%

II 0.685 1.362 -0.677 78.16%

III 0.695 1.371 -0.676 77.89%

Lampiran 12. Uji Shapiro Wilk Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol

Batang Brotowali


41

Lampiran 13. Uji Levene Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol Batang

Brotowali

Lampiran 14. Uji ANOVA Satu Arah Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak

Etanol Batang Brotowali

Lampiran 15. Uji Post-Hoc Tukey Nilai Persentase Penghambatan Ekstrak Etanol

Batang Brotowali dalam Tiap Konsentrasi

a. Konsentrasi 4 mg/ml


42

b. Konsentrasi 8 mg/ml

c. Konsentrasi 15 mg/ml

d. Konsentrasi 20 mg/ml

Lampiran 16. Uji Shapiro Wilk Nilai Persentase Penghambatan Acarbose


43

Lampiran 17. Uji Levene Nilai Persentase Penghambatan Acarbose

Lampiran 18. Uji ANOVA Satu Arah Nilai Persentase Penghambatan Acarbose

Lampiran 19. Uji Post-Hoc Tukey Nilai Persentase Penghambatan Acarbose dalam

Tiap Konsentrasi

a. Konsentrasi 4 mg/ml


44

b. Konsentrasi 8 mg/ml

c. Konsentrasi 15 mg/ml

d. Konsentrasi 20 mg/ml

Lampiran 20. Uji T Perbandingan Nilai IC50 Ekstrak Etanol Batang Brotowali dan

Acarbose


45

BIOGRAFI PENULIS

Penulis naskah skripsi dengan judul “Uji Aktivitas

Penghambatan Enzim Alfa Amilase dengan Ekstrak

Etanol Batang Brotowali (Tinospora crispa L.) Hook. f.

& Thomson secara In Vitro” yang memiliki nama

lengkap Fetiana Chrismaurin, lahir di Surakarta, 29

Januari 1998. Penulis merupakan anak sulung dari dua

bersaudara pasangan Bapak Y. Sartono dengan Ibu Rini

Yuliarti. Pendidikan formal yang ditempuh oleh penulis

yaitu pendidikan sekolah dasar di SDN 1 Legokkalong

(2004-2010), pendidikan sekolah menengah pertama di SMPN 1 Kajen (2010-

2013), pendidikan sekolah menengah atas di SMAN 1 Pekalongan (2013-2016).

Penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Semasa menempuh masa pendidikan sarjana

penulis aktif mengikuti kegiatan kepanitiaan antara lain sebagai koordinator divisi

expo FACTION #2 (2017), koordinator divisi hubungan masyarakat TITRASI

(2018) dan koordinator divisi lomba puncak FACTION #3 (2018). Selain itu

penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler (2018),

Biokimia (2018), Komunikasi Farmasi (2019), Pelayanan Informasi Obat (2020)

dan Farmakognosi Fitokimia (2020).


UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE DENGAN...

Documents

Transcript of UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA AMILASE DENGAN...