Volume 3, Nomor 3, 16 April 2015

UJI AKTIVITAS AMILASEQisty Ahla Dzikry, Angelika Rianti, Muhammad Nur Iqbal, Yulina Saragih, Cyntia GracesellaLaboratorium Biokimia, Jurusan FarmasiFakultas Farmasi Universitas PadjadjaranQistyahla@gmail.comIJPSTVolume 3, Nomor 3, 16 April 2015

10

ABSTRAKSIAmilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Analisis amylase dapat dilakukan dengan metode reaksi Sakaguchi, Metode ini dilakukan untuk menguji aktivitas amilase menggunakan iodin/kalium iodida da diukur dengan menggunakan spektrofotometer untuk mengukur penurunan absorbansi pati dikarenakan kerja amilase yang mendegradasi pati pada ikatan glikosida, Absorbansi adalah besar penyerapan cahaya dari suatu kumpulan atom/molekul. Nilai absorbansi yang didapat dari spektrofotometer suhu 27 fraksi 1: 1.034, fraksi 2: 1.425, fraksi 3 :1.421. suhu 37 fraksi 1 :0.945, Fraksi 2: 1.212, Fraksi 3: 1.229 suhu 57 fraksi 1:1.084, fraksi 2: 1.425, fraksi 3: 1.034. variasi pH 4.5 fraksi 1: 1.317 fraksi 2: 1.712 fraksi 3: 1.667. variasi pH 5.6 0.945, 1.212, 1.229. Suhu optimum pada 37 derajat celcius dan pada variasi pH pada pH 5.6 dan terletak pada fraksi 1, sebab dilihat dari absorbansi yang rendah, mengikuti prinsip metode caraway-somagyi yang bahwa semakin rendah absorbansi maka semakin tinggi aktivitas dari enzim amilaseKata Kunci: Absorbansi, spectrofotometri, Metode Caraway-Somogyi , Amilase

ABSTRACTAmylase (alpha, beta, glucoamylase) is an enzyme that is important in the field of food and biotechnology. Amylase enzyme catalyst refers to a group that works to hydrolyze sugars and starches. Amylase analysis can be done by Sakaguchi reaction method, this method is carried out to test the amylase activity using the iodine / potassium iodide da measured using a spectrophotometer to measure the absorbance of starch due to a decrease in working amylase which degrades starch in the glycoside bond, absorbance of light absorption is larger than a collection of atoms / molecule. Absorbance values obtained from the spectrophotometer temperature of 27 fractions of 1: 1,034, the fraction of 2: 1,425, fractions of 3: 1,421. temperature of 37 fractions of 1: 0945, Fraction 2: 1212, Fraction 3: 1229 temperature 57 fractions of 1: 1,084, the fraction of 2: 1,425, fractionsof 3: 1,034. variations in pH 4.5 fraction 1: 1317 fraction 2: 1712, fractions of 3: 1667. variations in pH 5.6 : 0.945, 1,212, 1,229. Optimal temperature at 37 degrees Celsius and the variation in pH 5.6 and pH lies in fractions 1, because seen from a low absorbance, following the principle of the method caraway - somagyi Yang that the lower the absorbance the higher diagram depicts lc of the enzyme amylase.Keywords: Absorbance , spectrofotometri , Caraway - Somogyi method , Amylase

PENDAHULUANPraktikum kali ini bertujuan Menentukan aktivitas amilase dari fraksi protein, dengan prinsip metode Caraway-Samogyi, absorbansi amylase dan hidrolisis gula.Metode pengujian Biuret berprinsip pada reaksi yang terjadi antara ion tembaga dengan ikatan peptide yang ada pada protein. Reaksi Biuret menggunakan tiga macam reagen,yaitu reagenA, B,dan C.Reagen A mengandung CuSO4 dalam akuades. CuSO4berfungsi sebagai penyediaion Cu2+untuk membentuk kompleks dengan protein. Reagen B mengandung KI dalam akuades. KI berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Reagen C mengandung Na-sitrat, Na2CO3, dan NaOH.Na sitratdan Na2CO3 berfungsisebagaibufferdanNaOHberfungsiuntukmenyediakan seasana basa (Martono et al.2012). Uji inidapat mendeteksikehadiran ikatanpeptida. Uji Biuret didasarkanpada reaksiantara ionCu2+dan ikatan peptida dalam suasana basa. Warna kompleks ungu menunjukkan adanya protein. Intensitas warna ynag dihasilkanmerupakan ukuran jumlah ikatan peptida yang ada dalam protein. Ion Cu2+ daripereaksi Biuretdalam suasanabasa akanbereaksidengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan membentuk senyawa kompleksberwarna ungu atau violet.Reaksiinipositif terhadapdua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau ikatan peptida. Protein melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksipembentukan warnainidapat terjadipadasenyawayang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon. Kelebihan metode pengukuran dengan menggunakan metodeBiuretialahmudahdilakukandanmenggunakan bahan yang murah. Namun, kekurangannya ialah metode ini memerlukan bahan yang cukup karena sensitivitasnya yang rendah (Pamungkas, 2010).Absorbansi adalah besar penyerapan cahaya dari suatu kumpulan atom/molekul. Absorbansi ini berbanding langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung jenis protein karena seluruh protein pada dasrnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat. (Sentrabd,2007).Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi maksimal.Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang maksimal, kepekaan alat terhadap tingkat absorbansi sampel semakin tinggi.Selain itu, pada panjang gelombang maksimal akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi dan tingkat kesalahan pada pengukuran ulang akan semakin kecil (Lowry, 1951).Protein merupakan makromolekul yang penting bagi mahkluk hidup.Protein merupakan suatu polimer atau makromolekul. Satuan monomer pembentukproteinadalah asamamino. Terdapat duapuluhjenisasamaminoyang merupakan penyusun protein pada mahkluk hidup (Campbell et al2002).Banyak peran penting protein dalam mahkluk hidup. Peranan protein dalam mahkluk hidup seperti dapat berperan sebagai biokatalisator (enzim), sistem gerak, sistem imun, dan sebagai penentu ekspresi gen (Yuwono,T 2008).Beberapa protein berisi unsur lain seperti besi yang terdapat dalam hemoglobin, iodium terdapat dalam thiroglobin dan fosfor terdapat dalam kasein.Molekul protein sangat besar,massa molekulnya berkisar antara 10.000-25.000. Oksihemoglobin dengan rumus molekul (C783H1166O208N203S2Fe4)mempunyai massa molekulkurang lebih 65.000.Penyusun proteinadalah asam amino, yaitu asam organik yang mengandung gugus amimo (-NH2) disampinggugus karboksilat (-COOH).Asam amino yang terdapat di alam selalu berupa asam amino alpa ,artinya gugus - NH2selalu terikat pada atom C- alfa, yaitu atom C di dekat gugusCOOH (Lehninger, 1998).Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan secara kuantitatif. Analisis proteinsecara kualitatifterdiri atasreaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksiMillon, reaksiNitroprusida, danreaksi Sakaguchi.Sedangkan analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV (Poedjiadi, 2007).Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromati, penggabungan bersama dinamakan sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan elektronika sifat kimia dan fisiknya dan detektor yang digunakan secara langsung mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi (Ia). Kemampuan ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda. (Khopkar 2007)Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur transmitans atau absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Hukum Beer menyatakan absorbansi cahaya berbanding lurus dengan dengankonsentrasi dan ketebalan bahan/medium (Miller J.N 2000)Larutan yang akan digunakan dalam penggunaan spektrofotometer adalah larutan blanko. Larutan blanko merupakan larutan yang tidak mengandung analat untuk dianalisis (Basset 1994). Larutan blanko digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai nilai 100% transmittans. Kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Terdapat dua metode untuk membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square(Underwood 1990).METODE PENELITIAN Pada percobaan yang dilakukan, dibutuhkan alat seperti beaker glass, botol Vial, gelas ukur 10 mL, labu Ukur 100 mL, mikro pipet 10- 100 L dan Pipet. Dan bahan yang digunakan seperti aquades, CuSO4, K- Na-tartrat, kasein, Na2CO3 dan NaOH 0.1 N.Prosesnya pada penetuan panjang gelombang maksimum, ditimbang 50 mg kasein, dilarutkan dengan aquades dalam labu ukur 100mL dan digenapkan hingga tanda batas sehingga didapat konsentrasi 500 g/mL. Lalu dipipet 5 mL larutan kasein dan dienceran dengan aquades dalam gelas ukur 10 mL sehingga didapat konsentrasi 250 g/mL. Lalu dipipet 1 mL larutan kasein 250g/mL dan dimasukan ke dalam botol vial. Lalu ditambahkan 9 mL pereaksi Biuret, lalu didiamkan selama 10 menit dan didapat konsentrasi 25 g/mL. Lalu ukur absorbansi larutan Kasein dengan HPLC beserta blangko yang berisi 1 mL aquades dan 9 mL pereaksi Biuret. Selanjutnya pembuatan kurva baku larutan kasein, disiapkan larutan kasein dalam 11 botol vial dengan konsentrasi 0 g/mL, 50g/mL, 100 g/mL, 150 g/mL, 200 g/mL, 250 g/mL, 300 g/mL, 350 g/mL, 400 g/mL, 450 g/mL, 500 g/mL. Lalu pada setiap botol vial ditambahkan 9mL pereaksi Biuret dan didiamkan selama 10 menit. Lalu diukur absorbansi tiap botol vial dengan HPLC. Lalu dibuat kurva baku yang menunjukkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi. Lalu tentukan persamaan garis kurva baku. Tahap terakhir adalah pengukuran fraksi protein, yaitu dipipet 0.4 mL fraksi protein dan dimasukkan ke dalam botol vial. Lalu ditambahkan 1.6mL pereaksi Biuret dan didiamkan selama 10 menit. Lalu diukur absorbansi fraksi dengan menggunakan HPLC.PEMBAHASANPengujian kadar protein dengan menggunakan metode spektrofotometri visible ( Biuret ) pada dasarnya adalah pengujian dengan melihat reaksi yang terjadi antara ion Cu2+ dan ikatan peptide protein dalam suasana basa. Keberadaan protein ditunjukkan dengan terbentuknya kompleks warna ungu. Kepekatan warana yang dihasikan sebanding dengan jumlah ikatan peptide yang ada dalam protein tersebut. Reaksi yang terjadi ini hanya positif untuk dua buah ikatan peptide atau lebih. Reaksi menunjukkan hasil yang negatif untuk asam amino atau ikatan peptida. Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah menganalisis adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret kedalam sample yang kemudian di ukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer. Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret ini, penentuan kadar protein didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Hal ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan alkali. Langkah praktikum protein dengan uji biuret hal pertama yang dilakukan yakni tabung reaksi berisi larutan protein buah tomat. Masing masing mempunyai perbandingan larutan 1 : 10. Setelah itu ditambahakan 1 ml larutan NaOH 2,5 N pada masing masing larutan. Langkah terakhir yakni menambahkan beberapa tetes larutan CuSO4 0,1 N sampai terbentuk warna ungu atau violet pada masing masing larutan tersebut.Hal yang pertama sekali dilakukan adalah pereaksi biuret 1000 mL Na2CO3 2% dalam larutan NaOH 0,1 N ditambah 1 mL CuSO4 1% dan 1 mL K Na tartrat 2%, setelah dilakukan pembuatan reaksi biuret dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum dari sampel standar. ditimbang 50 mg kasein, larutkan dengan aquades dalam labu ukur 100 mL dan genapkan hingga tanda batas (konsentrasi = 50 mg/100 mL = 500 g/mL), kemudian dipipet 5 mL larutan kasein dan encerkan dengan aquades dalam labu ukur 10 mL (konsentrasi 250 g/mL), kemudian dipipet 1 mL larutan kasein 250 g/mL dan masukkan ke dalam tabung reaksi tambahkan 9 mL pereaksi Biuret yang telah dibuat, diamkan selama 10 menit (konsentrasi 25 g/mL). Ukur absorbansi larutan kasein pada panjang gelombang 400-800 nm dengan spektrofotometer. Blangko berisi 1 mL aquades dan 9 mL pereaksi Biuret lalu gambarkan spektrum absorbansi terhadap panjang gelombang. Dan tentukan panjang gelombang maksimum kasein, dan panjang gelombang ini lah yang nantinya digunakan dalam penentuan kadar dari protein dengan menggunakan persamaan garis lurus .Kemudian setelah dilakukan penentuan panjang gelombang , selanjutnya adalah membuat kurva baku dari kasein , yaitu disiapkan larutan kasein dalam 22 tabung reaksi sehingga diperoleh konsentrasi bertingkat dari 50-500 g /mL (duplo), pada setiap tabung, tambahkan 9 mL pereaksi biuret,diamkan selama 10 menit, kemudian absorbansi setiap tabung diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum (550 nm). Lalu dibuat kurva baku yang menunjukkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi, tentukan persamaan garis kurva baku.Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama adalah CuSO4 dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah K-Na-Tartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Keuntungan utama dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah. Teknik ini kurang sensitif terhadap jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan pada gugus samping spesifik.Setelah itu dilakukan pengukuran fraksi protein sampel dengan memipet 1 mL fraksi protein protein, masukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 9 mL pereaksi Biuret, diamkan selama 10 menit. Ukur absorbansi fraksi, sehingga konsentrasi protein dalam fraksi protein perlu diperhitungkan dengan pengenceran (1 : 10). Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan buih karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi biuret, sampel didiamkan selama 10 menit. 10menit ini merupakan operating time yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen. Setelah 10 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum untuk warna ungu. Selain itu digunakan juga larutan blanko, larutan blanko merupakan larutan tidak berisi analit. Larutan blanko biasanya digunakan untuk tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko diberi perlakuan yang sama seperti larutan albumin.Dari kurva linear dibawah, didapatkan persamaan garis lurus untuk penentuan konsentrasi sampel dari protein, yaitu : nilai a= 0.002485, dan b= -0.00682Maka persamaan garis kurva baku adalah: y= 0.002485x-0.00682 dengan r= 0.962. Jika r~1 maka rumus persamaan garis kurva baku dapat digunakan. Sehingga,Y (nilai fraksi 0.05)= 0.655 maka, x= 266.325 MY (nilai fraksi 1.999)= 1.064 maka, x= 430.91 MY (nilai fraksi 1.09)= 1.205 maka, x= 487.65 MMenurut hukum Lambert Beer : Y = 0,03982 x + 0,09266

Dari hasil pengukuran pada spektrofotometer, didapatlah harga absorbansi pada masing-masing konsentrasi yaitu 0g/mL absorbansinya 0.016, pada konsentrasi 50 g/mL / 0.024, pada 100/ 0.353, pada 150/ 0.332, pada 200g/mL 0.68, pada 250g/mL 0.415, pada 300g/mL 0.68, pada 350g/mL 0.766, pada 400g/mL 1.107, pada 450g/mL 1.204, pada 500g/mL 1.18. Dalam perhitungan, persaman kurva linearnya harus memiliki nilai R (regresi) 1, sedangkan yang didapat r = 0.962 atau r~1 sehingga nilai kadar dan nilai absorbansi sebanding. Jadi, apabila kadarnya meningkat maka absorbansi juga meningkat, karena R merupakan koefisien relasi yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi/kadar dengan serapan/absorbansi. Grafik diatas bertujuan untuk membandingkan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasinya. Menurut literature, semakin tinggi nilai absorbansinya maka konsentrasinya pun akan semakin tinggi. Hal ini sesuai dengan data yang diperoleh meskipun ada sedikit naik turunya nilai absorbansinya dikarenakan kemungkinan penyebab kesalahan tersebut adalah adanya kesalahan praktikan dalam membaca nilai absorbansinya. Selain itu, kesalahan- kesalahan tersebut mungkin diakibatkan oleh kelemahan dari metode Biuret seperti sifatnya yang kurang sensitive dibandingkan dengan metode Lowry serta NH4+ dalam konsentrasi tinggi dapat mengganggu reaksi antara larutan Biuret dengan sampel.

Grafik diatas bertujuan untuk membandingkan hubungan antara konsentrasi fraksi dengan absorbansi. Yaitu:pada konsentrasi 266.325M/ nilai absorbansi fraksinya 0.655, pada 430.91 M/ 1.064, dan pada 487.650 M 1.205. Menurut literatur, semakin tinggi nilai konsentrasi fraksi nya maka absorbansinya pun akan semakin tinggi.SIMPULANKadar protein total pada fraksi protein dari buah tomat dapat ditentukan, dengan metode biuret. Dan didapat hasil pada fraksi 0,5 panjang gelombang maksimum pada konsentrasi 266,.325M/ nilai absorbansi fraksinya 0.655, pada fraksi 1,999 konsentrasi 430.91 M/ absorbansinya 1.064, dan pada fraksi1,09 konsentrasi 487.650 M, absorbansinya 1.205.

Daftar Pustaka

Khopkar.2007. Konsep Dasar Kimia analitik. Jakarta: UI PressLehninger.1998. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: ErlanggaLowry, O. H., N. J., Rosebrough, A. L., Farr, R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent.J. Biol. Chem.193-265.Miller J.N. 2000.Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4thed. Harlow: Prentice. Hall.Pamungkas KR, Nafwa S. 2010. Kitosan sebagaimatriks pendukungammobilisasi papain. Dalam : Prosiding tugas Akhir Semester Genap.Prosiding. Institut Teknologi Sepuluh Nopember.Poedjiadi, A. 2007. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI PressSentrabd. 2007.Spectrophoto meter AbsorbsiUV/VIS. http://sentrabd.com/main/info/Insight/Spectrophotometer.html (diakses 21 April 2015).

Underwood, A. L. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Erlangga. Jakarta.Yuwono,T. 2007. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga