UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Deteksi DNA Babi dan DNA...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode

Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

SKRIPSI

EVIRA VIVIKANANDA

NIM. 109102000029

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JANUARI 2014

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode

Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

EVIRA VIVIKANANDA

NIM. 109102000029

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JANUARI 2014

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip,

maupun dirujuk telah saya nyatakan benar

Nama : Evira Vivikananda

NIM : 109102000029

Tanda Tangan :

Tanggal : Januari 2014

vi

ABSTRAK

JUDUL : DETEKSI DNA BABI DAN DNA SAPI DENGAN

MENGGUNAKAN METODE INSULATED ISOTHERMAL POLYMERASE

CHAIN REACTION (ii-PCR)

Kasus cemaran daging babi pada suatu produk makanan bertambah seiring

dengan meningkatnya persaingan pasar. Banyak metode yang telah dikembangkan

untuk mendeteksi babi dalam campuran daging. Penelitian ini dilakukan untuk

mengembangkan metode baru untuk mendeteksi babi dan sapi yaitu Insulated

Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

Primer sapi dan babi yang digunakan berasal dari daerah cytochrome b dan

masing-masing mempunyai suhu annealing 63oC dan 53

oC. Kedua primer telah diuji

kespesifitasannya dengan PCR. Primer babi mampu mengamplifikasi DNA babi

sampai konsentrasi 0,2 ng / 25 µl, sedangkan primer sapi mampu mengamplifikasi

DNA sapi sampai dengan konsentrasi 2 ng / 25 µl. PCR. Amplifikasi DNA babi dan

DNA sapi dengan ii-PCR menggunakan variasi konsentrasi template, primer dan

probe spesifik, buffer menunjukkan hasil positif pada elektroforesis akan tetapi rasio

intensitas fluoresens sesudah reaksi dan sebelum reaksi di bawah 1.3 yang

memberikan hasil negatif pada mesin ii-PCR. Belum ditemukan komposisi optimal

untuk dapat mendeteksi DNA babi dan DNA sapi dan perlu dilakukan desain ulang

probe agar amplifikasi dapat terdeteksi oleh mesin ii-PCR.

Kata kunci: Halal, babi, ii-PCR, probe

vii

ABSTRACT

TITLE: DETECTION OF PORK DNA AND BEEF DNA USING INSULATED

ISOTHERMAL POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD

The cases of pig adulteration on food increase as market competitions rise.

There are many methods that have been developed to detect pork in mixed meats.

This research was conducted to develop a new method for beef and pork detection

which is Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR).

Primers for beef and pork DNA were designed on the cytochrome b area and

each had an annealing temperature of 63oC and 53

oC. Both primers had their specifity

tested by PCR. Primers for pork DNA could amplify pork DNA until the

concentration of 0,2 ng/ 25 µl, whereas primers for beef DNA could amplify beef

DNA until the concentration of 2 ng / 25 µl. Amplification of pork DNA and beef

DNA with ii-PCR using variation of template, specific primers, specific probes,

buffer concentrations showed a positive result on electrophoresis, but the ratios of

signal intensity after and before reaction were under 1.3 which gave a negative result

on the ii-PCR machine. Optimum reagents composition has yet to be found to detect

pork DNA and beef DNA, and probe has to be redesigned in order for amplification

to be detected by ii-PCR machine.

Key words: Halal, pork, ii-PCR, probe

viii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan rahmat dan

ridhaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitan dan penulisan skripsi

dengan judul. Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada junjungan Nabi

Muhammad SAW, serta keluarga, para sahabatnya, dan para pengikutnya yang

senantiasa bershalawat atas dirinya.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana

Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Keberhasilan dalam penulisan ini tidak lepas dari orang-orang yang membantu

dan memberikan dukungan dan dorongan. Untuk itu, pada kesempatan ini penulis

mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada;

1. Bapak Prof. Dr. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt, selaku Ketua Program studi Farmasi FKIK

UIN Syarif Hidayatullah yang kerap memberikan arahan dan dorongan untuk

semua mahasiswa untuk menyelesaikan tugas akhir sebagai mahasiswa Farmasi.

3. Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt, selaku pembimbing I yang telah memberikan waktu,

semangat, dan bimbingan selama penulisan skripsi ini.

4. Bapak Dr. Wahyu Purbowasito, selaku pembimbing II yang telah sangat baik

membimbing, berbagi ilmu, dan memberikan saran-saran yang bijak kepada

penulis.

5. Kedua orang tua tersayang, Juwono Jan Hariyanto dan Alfabeti Rosita, yang

selalu memberikan kasih sayang, doa tak terputus, dan dukungan baik moril

maupun materi.

6. Untuk kakak-kakak dan kakak-kakak iparku, Kak Yudhi, Kak Yogi dan Kak Riri,

Kak Bobby dan Kak Rika, yang walaupun tidak memberikan bantuan secara

langsung dalam penyelesaian skripsi ini, namun semangat, dorongan, dan canda

yang kalian berikan memotivasi penulis untuk selalu bersemangat.

7. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu pengetahuan hingga penulis

dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

8. Staf peniliti Bioteknologi-BPPT Serpong (Bu Rahma dan teh Leha), terima kasih

atas semua saran, ilmu, dan dukungan yang membantu dalam penelitian ini.

ix

9. Teman-teman seperjuangan di BPPT, Sonia Zulfa, Sofiana Fajriah Rahmah,

Rahmat, Angel, terima kasih atas waktu yang kita toreh bersama. Semangat,

dorongan, dan kepercayaan yang kalian berikan sangat membantu penulis untuk

teguh perjuang.

10. Kepada teman-teman angkatan Farmasi 2009 yang telah bersama-sama mengukir

garis hidup di dunia perkuliahan.

11. Teman-teman yang dengan senang hati menemani, memberi semangat,

mendengar cerita suka dan duka selama penelitian, Hani, Mila, Fandy, Bella,

Mbak Ily.

12. Segenap pihak yang telah membantu dalam penulisan skripsi ini, yang tidak bisa

penulis sebutkan satu per satu.

Semoga apa yang kalian berikan dapat bermanfaat dan dibalas oleh Allah

SWT, aamiin. Penulis berharap bahwa skripsi ini dapat bermanfaat baik bagi

kalangan akademis, masyarakat pada umumnya, dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Jakarta, Januari 2014

Penulis

x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Evira Vivikananda

NIM : 109102000029

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya ilmiah

saya dengan judul :

Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated

Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau suatu media lain yaitu

Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak

Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal : 29 Januari 2014

Yang Menyatakan,

( Evira Vivikananda )

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... v

ABSTRAK………. ............................................................................................... vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR ......................... x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................. 3

1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................................. 3

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................................ 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 4

2.1 Babi……………………………………………………………………. ......... 4

2.1.1 Hukum Babi Menurut Syariah Islam ....................................................... 4

2.2 Sel ………… ................................................................................................... 5

2.3 Asam Nukleat ................................................................................................. 6

2.3.1 Struktur DNA ........................................................................................... 7

2.3.2 DNA Mitokondria .................................................................................... 8

2.3.3 Isolasi DNA ............................................................................................ 11

2.4 PCR………………………………………………………………………... 12

2.4.1 Komponen PCR ..................................................................................... 13

2.4.2 Tahapan PCR ......................................................................................... 15

2.5 Elektroforesis Gel............................................................................................ 17

xii

2.5 Insulated Isothermal PCR (ii-PCR) ................................................................ 19

BAB 3 METODE PENELITIAN ....................................................................... 21

3.1 Waktu dan Tempat .......................................................................................... 21

3.2 Alat dan Bahan ................................................................................................ 21

3.2.1 Alat ......................................................................................................... 21

3.2.2 Bahan ..................................................................................................... 21

3.3 Tahapan Penelitian .......................................................................................... 22

3.4 Prosedur Kerja ................................................................................................. 22

3.4.1 Isolasi dan Purifikasi DNA pada Daging Segar .................................... 22

3.4.2 Elektroforesis ........................................................................................ 23

3.4.3 Dokumentasi Gel .................................................................................... 23

3.4.4 Optimasi Suhu Annealing dengan menggunakan metode Gradien PCR 24

3.4.5 Uji Spesifikasi Primer ............................................................................ 24

3.4.6 Uji Sensitivitas Primer DNA Babi ........................................................ 24

3.4.7 Insulated Isothermal PCR ...................................................................... 24

3.5 Alur Penelitian ................................................................................................ 25

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 26

4.1 Isolasi Genom ................................................................................................. 26

4.2 PCR………. ................................................................................................. 29

4.3 ii-PCR…… ..................................................................................................... 35

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 41

5.1 Kesimpulan ..................................................................................................... 41

5.2 Saran…… ...................................................................................................... 41

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 42

LAMPIRAN ......................................................................................................... 46

xiii

DAFTAR TABEL

JUDUL HALAMAN

Tabel 1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik ..................................... 6

Tabel 2. Intesistas sinyal yang diemisi oleh probe sebelum reaksi dan sesudah

reaksi ....................................................................................................... 38

Tabel 3. Konsentrasi dan Kemurnian hasil isolasi genom ................................... 46

Tabel 4. Campuran reaksi master mix untuk PCR konvensional ......................... 46

Tabel 5. Variasi komposisi untuk optimasi reaksi ii-PCR ................................... 49

xiv

DAFTAR GAMBAR

JUDUL HALAMAN

Gambar 1. Perbedaan DNA dan RNA ................................................................ 7

Gambar 2. Struktur DNA Mitokondria .............................................................. 10

Gambar 3. Siklus PCR ....................................................................................... 17

Gambar 4. Elektroforesis hasil isolasi genom daging sapi dan daging babi ...... 28

Gambar 5. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer

babi pada untai DNA daging babi dengan menggunakan metode

gradien PCR .................................................................................... 30

Gambar 6. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer

sapi pada untai DNA daging sapi dengan menggunakan metode

gradien PCR ..................................................................................... 31

Gambar 7a. Elektroforesis uji spesifitas primer babi dengan DNA daging babi

dan DNA daging sapi pada suhu annealing 51oC ............................ 32

Gambar 7b. Elektroforesis uji spesifitas primer babi dengan DNA daging babi

dan DNA daging sapi pada suhu annealling 51oC ........................... 33

Gambar 8a. Elektroforesis uji spesifitas primer sapi dengan DNA daging sapi dan

DNA daging babi pada suhu annealing 56oC

................................... 33

Gambar 8b. Elektroforesis uji spesifitas primer sapi dengan DNA daging sapi dan


................................... 33

Gambar 8c. Elektroforesis uji spesifitas primer sapi dengan DNA daging sapi dan


................................... 34

Gambar 9. Elektroforesis produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan primer

babi dan primer sapi ......................................................................... 35

Gambar 10. Elektroforesis produk ii-PCR hasil optimasi reaksi ii-PCR dengan

variasi komposisi untuk deteksi DNA babi dan DNA sapi .............. 37

Gambar 11. Hasil ii-PCR DNA daging babi dan DNA daging sapi .................... 50

xv

DAFTAR LAMPIRAN

JUDUL HALAMAN

Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Isolasi Genom ..................................... 46

Lampiran 2. Campuran reaksi master mix untuk PCR konvensional ................... 46

Lampiran 3. Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging babi dengan primer

babi dan DNA daging sapi dengan primer sapi .............................. 47

Lampiran 4. Membuat larutan induk primer dan probe ....................................... 48

Lampiran 5. Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR ...................................... 49

Lampiran 6. Hasil ii-PCR DNA daging babi dan DNA daging sapi .................... 50

xvi

DAFTAR ISTILAH

Bp : Base pairs

DNA : Deoxyribose-Nucleic Acid

dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate

dATP : Deoxyadenoise Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

ii-PCR : Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction

PCR : Polymerase Chain Reaction

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA : Ribose-Nucleic Acid

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

TAE : TrisAcetate EDTA

TE : Tris - EDTA

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kehidupan seorang muslim berkaitan erat dengan konsep halal dan haram.

Konsep ini bersifat menyeluruh karena tidak hanya diaplikasikan pada makanan

dan minuman, namun juga untuk memperoleh nafkah, tata cara berpakaian, dan

berkomunikasi dengan makhluk hidup lainnya (Riaz dan Chaudry, 2004).

Makanan merupakan salah satu poin yang sangat diperhatikan dalam agama

Islam. Pada dasarnya segala sesuatu di dunia diperbolehkan untuk dikonsumsi

kecuali yang dilarang, dan diantara yang diharamkan adalah babi dan derivatnya

(Al Baqarah : 173, Al An’am : 145, Al Maidah : 3, dan An Nahl : 115).

Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah, daging

babi, dan binatang yang (ketika) disembelih (disebut nama) untuk selain Allah.

Tetapi barang siapa dalam keadaan terpaksa (memakannya) sedang ia tidak

menginginkannya dan tidak (pula) melampaui batas, maka tidak ada dosa

baginya. Sesungguhnya Allah Maha Pengampun lagi Maha Penyayang. (Al

Baqoroh (2) : 173)

Menurut hasil sensus penduduk tahun 2010 oleh Badan Pusat Stastitik,

Indonesia merupakan negara dengan jumlah penduduk muslim terbesar di dunia.

Sekitar 85% dari jumlah penduduk beragama Islam. Jaminan atas kehalalan suatu

produk makanan atau minuman merupakan sesuatu yang harus ditegakkan untuk

memberikan rasa aman dan kepercayaan kepada konsumen. Namun, seiring

dengan berkembangnya era globalisasi, persaingan pasar semakin meningkat.

Produk-produk makanan olahan yang berasal dari luar dapat masuk dengan

mudahnya, selain itu produsen lokal juga harus bersaing dengan produsen lokal

lainnya, sehingga timbul kecurangan-kecurangan yang merugikan baik bagi pihak

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

konsumen, produsen, maupun distributor. Bentuk kecurangan itu berupa

pengalihan asal hewan dari suatu produk makanan olahan seperti pencampuran

daging babi pada produk sapi olahan. Tujuan pencampuran tersebut untuk

menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif lebih murah dibandingkan

jika menggunakan bahan aslinya, mengingat harga daging sapi terus meningkat

(Margawati, 2010).

Dewasa ini, teknologi untuk pengujian keaslian suatu produk mengalami

kemajuan.yang pesat. Banyak metode analisa yang telah dikembangkan dan

menawarkan hasil yang cepat dan otentik, salah satunya adalah metode berbasis

DNA. Metode analisa dengan menggunakan DNA memiliki beberapa keuntungan,

yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada suatu individu dengan

informasi genetik yang identik, DNA merupakan molekul yang stabil dalam

proses ekstraksi, dan analisa DNA sangat mungkin dikerjakan dari beberapa tipe

sampel yang berbeda (Jain, 2004).

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode berbasis DNA yang

paling umum digunakan untuk mengidentifikasi pemalsuan sumber hewan pada

suatu produk makanan. Margawati (2010) telah berhasil menganalisa cemaran

babi pada produk bakso dengan menggunakan PCR. Begitu juga Rohman et al.,

(2012) yang mengidentifikasi kandungan daging babi dalam produk bakso dengan

menggunakan metode PCR RLFP. Kumari (2007) telah melakukan identifikasi

spesies pada daging dengan menggunakan real-time PCR dan Jain (2004) telah

menggunakan metode multiplex assay untuk melakukan identifkasi spesies pada

daging dengan menggunakan primer cytochrome b.

Walaupun PCR memberikan hasil yang cukup sensitif dan akurat, metode

ini membutuhkan pemisahan produk pasca PCR dengan menggunakan gel

elektroforesis yang memakan waktu dan hanya semi-kuantitaf (Kumari, 2007).

Kelemahan ini dapat diatasi dengan real-time PCR yang menggunakan sistem

fluoresensi sehingga hasil amplifikasi dapat dilihat secara langsung. Identifikasi

genom babi dalam ekstrak daging komersial dengan menggunakan metode real-

time PCR telah dilakukan oleh Farrokhi dan Joozani (2011).

Pada penelitian ini metode pemeriksaan kehalalan suatu produk yang akan

dikembangkan adalah metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction

3


(ii-PCR). Ii-PCR bekerja dengan menggunakan suatu tube yang dirancang khusus

untuk dapat melakukan amplikasi DNA dengan memanfaatkan fenomena

konveksi termal alami, yang lebih sederhana dan efektif daripada sistem

pemanasan dan pendinginan secara mekanik yang digunakan dalam PCR

konvensional dan real-time PCR. Alat ini mempunyai sistem operasi yang

mengumpulkan, mengkalkulasi, dan memantau proses sistem optikal sebelum dan

sesudah reaksi, mengubah fluoresens menjadi hasil “+” atau “-” yang tampil

dalam layar sehingga analisa lanjutan tidak perlu dilakukan (Anonima, 2012).

1.2 Rumusan Masalah

Apakah metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

dapat digunakan untuk mendeteksi DNA babi dan DNA sapi?

1.3 Tujuan Penelitian

Mengetahui metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-

PCR) dapat digunakan untuk mendeteksi DNA babi dan DNA sapi.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan metode alternatif berbasis

DNA yang lebih sederhana untuk pengujian kehalalan suatu produk makanan.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Babi

Babi adalah sejenis hewan ungulate yang bermancung panjang dan

berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuhan-tumbuhan dan merupakan

hewan yang berasal dari Eurasia (Wijaya, 2009).

Menurut penelitan kesehatan, lemak hewan pada babi lebih banyak dari

lemak daging hewan lainnya dan lebih sulit untuk dicerna. Banyak penyakit yang

dibawa dari babi ke manusia, terutama infestasi parasit. Jumlah pasien yang

menderita penyakit cacing pita tertinggi ditemukan di negara yang mengkonsumsi

babi (Kazim, 1981).

2.1.1. Hukum Babi menurut Syariah Islam

Jauh sebelum penelitian mengenai babi dan penyakit yang dibawanya

dilakukan, Allah swt telah melarang manusia untuk mengkonsumsi babi. Hal ini

dijelaskan di dalam QS. Al-Baqarah ayat 173:

“Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah, daging

babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain Allah. Tetapi

barang siapa dalam keadaan terpaksa (memakannya) sedang ia tidak

menginginkannya dan tidak (pula) melampaui batas, maka tidak ada dosa baginya.

Sesungguhnya Allah Maha Pengampun lagi Maha Penyayang.”

Keharaman babi juga dijelaskan di dalam surat Al Maidah ayat 3, An Nahl

ayat 115, dan Al An’am ayat 145.

5


2.2 . Sel

Semua makhluk hidup terdiri dari satu atau lebih unit sederhana bernama

sel. Sel merupakan unit yang dibatasi membran yang mengandung DNA dan

sitoplasma. (Cain, 2002; Raven dan Johnson, 2002; Purves et al., 2003). Sel

mampu melakukan semua aktivitas kehidupan dan sebagian besar reaksi kimia

untuk mempertahankan kehidupan berlangsung di dalam sel. Sebagian besar sel

berdiameter antara 1 sampai 100 µm sehingga hanya bisa dilihat dengan

menggunakan mikroskop, ukuran sel dibatasi agar tidak tumbuh terlalu besar

karena sel harus mempertahankan suatu area permukaan (membran plasma) yang

memadai untuk menampung pergantian antar nutrisi dan sampah (Sloane, 2003).

Setiap organisme tersusun dari salah satu dari dua jenis sel yang secara

struktural berbeda: sel prokariotik atau sel eukariotik. Sel prokariotik umumnya

berukuran lebih kecil dan mempunyai struktur lebih sederhana daripada sel

eukariotik. Perbedaan utama antara kedua jenis sel itu adalah bahwa materi

genetik (DNA) sel prokariotik tidak terletak dalam suatu struktur membran ganda

yang disebut nukleus, sedangkan pada eukariotik, semua materi genetiknya

terdapat pada molekul DNA yang terdapat sebagai kromosom yang terletak di

dalam nukleus (Purves et al., 2003; Stone, 2004; Stansfield et al., 2006).

6


Tabel 1. Perbandingan Sel Eukariotik dan Prokariotik (Koolman et al, 1994)

2.3. Asam Nukleat

Asam nukleat adalah suatu polimer nukleotida yang berperan dalam

penyimpanan serta pemindahan informasi genetik. Satu nukleotida terdiri dari atas

tiga bagian yaitu (Yuwono, 2009):

1. Cincin purin atau pirimidin, yaitu basa nitrogen yang terikat pada atom C

nomor 1 suatu molekul gula (ribosa atau deoksiribosa) melalui ikatan N-

glukosidik. Ada dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat,

yaitu basa purin yang terdiri atas adenin (A) dan guanin (G), serta basa

pirimidin yang terdiri atas timin (T), sitosin (C), dan urasil (U). Baik DNA

(deoxyribonucleic acid) maupun RNA (ribonucleic acid) tersusun atas A, G,

C, tetapi T hanya ada pada DNA sedangkan U hanya pada RNA.

Prokariotik Eukariotik

Bentuk organisasi :

Bersel satu Bersel satu atau banyak

Organel, sitoskelet, alat pembelahan sel :

Ada Ada namun rumit dan terspesialisasi

DNA :

Kecil, sirkular, tidak ada intron Besar, dalam inti sel, banyak intron

RNA : sintesis dan pematangan :

Mudah, di dalam sitoplasma Rumit, di dalam inti sel

Protein: sintesis dan pematangan :

Sederhana, terangkai dengan

sintesis RNA

Rumit, dalam sitoplasma dan

reticulum endoplasma berbintil

Metabolisme :

Anaerobik atau aerobik, sangat

mampu menyesuaikan diri

Kebanyakan aerobik

Endositosi dan eksositosis :

Tidak Ya

7


2. Molekul gula dengan 5 atom C (pentosa). Pada RNA gulanya adalah ribosa,

sedangkan pada DNA gulanya adalah deoksiribosa. Perbedaan antara kedua

bentuk gula tersebut terletak pada atom C nomor 2. Pada RNA, atom C

nomor 2 berikatan dengan gugus hidroksil (OH) sedangkan pada DNA atom

C nomor 2 berikatan dengan atom hidrogen (H).

3. Gugus fosfat yang terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan fosfoester.

Gugus fosfat inilah yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat.

Suatu basa yang terikat pada satu gugus gula disebut nukleosida, sedangkan

nukleotida adalah nukleosida yang berikatan dengan gugus fosfat. Di dalam

molekul DNA atau RNA, nukleotida berikatan dengan nukleotida yang lain

melalui ikatan fosfodiester.

Gambar 1. Perbedaan DNA dan RNA

2.3.1. Struktur DNA

Pada tahun 1953, Watson dan Crick mengemukakan bahwa struktur

molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang mempunyai diameter yang

sama dan memutar ke kanan berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat

oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins (Gaffar, 2007; Yuwono, 2009).

8


Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkai nukleotida yang tersusun

secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali

berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helix (heliks ganda).

Pada tahun 1950, Chargaff dan koleganya mengemukakan bahwa di dalam

hampir semua DNA, terdapat aturan dimana jumlah adenin sama dengan jumlah

timin (A=T), dan jumlah sitosin sama dengan jumlah guanin (C=G). Hasilnya,

jumlah keseluruhan purin (A+G) sama dengan jumlah keseluruhan pirimidin

(T+C) (Purves et al., 2003; Raven dan Johnson, 2002). Basa A dari satu

nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan

basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua

ikatan hidrogen, sedangkan pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh

karena itu pasangan G dan C lebih stabil daripada pasangan A dan T (Purves et

al., 2003; Yuwono, 2009; Muladno, 2011).

Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3’,

gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula.

Nukleotida satu dengan lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara

gugus 5’ fosfat dengan 3’ hidroksil (Gaffar, 2007; Raven dan Johnson, 2002).

2.3.2. DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel berbentuk tubular atau seperti sosis dengan

ukuran hampir sama dengan bakteri dan ditemukan di semua sel eukariotik

(Raven dan Johnson, 2002). Fungsi utama mitokondria adalah mengkonversi

suatu potensi energi kimia menjadi bentuk energi yang dapat digunakan oleh sel:

molekul berenergi tinggi ATP (Purves et al., 2003). Mitokondria merupakan

organel yang terdapat di dalam sitoplasma yang mempunyai DNA sendiri, yang

disebut DNA mitokondria atau disingkat menjadi mtDNA. Ukuran mtDNA sangat

pendek, biasanya kurang dari 17.000 bp dan tersusun atas gen yang mengontrol

metabolisme selular. Jika setengah dari DNA inti diperoleh dari garis maternal

dan setengah lagi diperoleh dari garis paternal, maka mtDNA seluruhnya berasal

dari garis maternal. Berdasarkan kandungan basa guaninnya, mtDNA dibagi

menjadi dua untai yaitu untai yang kaya G disebut untai berat (heavy strand) dan

yang mengandung sedikit G disebut untai ringan (light strand) (Reyes et al.,

1998).

9


Berdasarkan jenis gennya, genom mitokondria dibagi menjadi dua bagian,

yaitu daerah penyandi (coding) dan daerah bukan penyandi (non coding region).

Daerah penyandi terdiri dari 37 gen yaitu 13 gen penyandi protein yang berperan

penting di dalam transpor elektron dan fosfolirasi oksidatif, dua gen penyandi

rRNA (ribosomal Ribonucleic Acid), dan 22 gen penyandi tRNA (transfer RNA).

Gen tersebar secara asimetris pada kedua untai DNA. Untai berat mtDNA

mengandung 28 gen yaitu dua gen penyandi rRNA (12S rRNA dan 16S rRNA),

12 gen penyandi protein yang terdiri dari enam NADH Dehidrogenase (ND1,

ND2, ND3, ND4, ND5,), Cytochrome c Oxydase (COX1, COX2, COX3), sebuah

Cytochrome b (Cyt. B), dua ATPase (ATP6, ATP8), dan 14 gen penyandi tRNA

yang terdiri dari fenilanalin (tRNAPhe

), leusin (tRNALeu

), valin (tRNAVal

),

isoleusin (tRNAIle

), metionin (tRNAmet

), triptofan (tRNATrp

), asam aspartat

(tRNAAsp

), lisin (tRNALys

), glisin (tRNAGly

), arginin (tRNAArg

), histidin

(tRNAHis

), serin (tRNASer

), leusin (tRNALeu

), dan treonin (tRNAThr

). Sedangkan

untai ringan mtDNA mengandung sisanya (sembilan gen) yaitu, satu gen

penyandi protein yaitu NADH Dehidrogense 6 (ND6) dan delapan gen penyandi

tRNA yang terdiri dari asam glutamat (tRNAGlu

), prolin (tRNAPro

), serin

(tRNASer

), tirosin (tRNATyr

), sistin (tRNACys

), asparagin (tRNAAsn

), alanin

(tRNAAla

), dan glutamin (tRNAGlu

). Daerah bukan penyandi genom mitokondria

hanya terdiri dari daerah kontrol (control region) atau d-loop (displacement loop)

(Reyes et al., 1998).

10


Gambar 2. Struktur DNA Mitokondria (Passarge, 2007)

DNA mitokondria bersifat khusus yang diturunkan melalui induk betina

tanpa mengalami rekombinasi. Adanya sifat tersebut dapat digunakan untuk suatu

rekonstitusi historik dari genealogi matrilinier suatu spesies maupun antar

populasi yang ada. Beberapa hal yang mendukung penggunaan mtDNA sebagai

penanda dalam studi keragaman genetik dan studi biologi populasi pada hewan

yaitu (Solihin, 1994):

1. DNA mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah kopi yang

tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk berbagai

keperluan analisis genom.

2. Ukuran DNA mitokondria relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat dipelajari

sebagai satu kesatuan yang utuh.

3. Bagian-bagian dari genom mitokondria berevolusi dengan kecepatan yang

berbeda. Tingkat evolusi dari suatu bagian DNA merupakan faktor penting

yang menentukan penggunaan penanda DNA dalam studi sistematika dan

biogeografi. Gen-gen yang terkonservasi dengan baik dapat dijadikan sebagai

dasar penulusuran kesamaan asal muasal sedangkan bagian yang berubah

11


cepat digunakan untuk mengetahui seberapa cepat divergensi dalam spesies

tersebut terjadi.

4. Genom mitokondria berukuran kecil karena mtDNA hewan tidak memiliki

intron ataupun spacer yang berukuran besar antar gennya.

5. Penyusunan mtDNA sangat polimorf, baik untuk intrapopulasi maupun

interspesies.

2.3.3. Isolasi DNA

Sampai saat ini, banyak metode dan teknologi yang tersedia untuk isolasi

genom. Secara umum, semua metode mencakup penghancuran sel dan jaringan,

penghilangan protein dan RNA (purifikasi), dan presipitasi DNA (Muladno,

2010). Penghilangan protein dilakukan dengan digesti menggunakan proteinase K,

dilanjutkan dengan salting-out dan ekstraksi organik. DNA dipresipitasi dengan

menggunakan etanol atau isopropanol.

Secara umum, kualitas DNA dapat ditentukan oleh keberadaan kontaminasi

RNA, protein, lipid, dan konstituen sel lainnya yang berhubungan dengan enzim

restriksi, ligase, dan DNA termostabil. Yang lebih penting adalah preparasi harus

terbebas dari polymerase DNAse yang dapat merusak DNA (Merante et al.,

1998).

Selain analisis DNA, berkembang pesatnya kebutuhan di bidang diagnostik

molelular dan filogeni molekular yang menuntut kecepatan, prosedur yang

sederhana, hasil yang akurat dalam ekstraksi DNA dari berbagai jenis sampel,

menciptakan pengembangan teknologi baru untuk pengektraksian DNA yang

mudah dan lebih cepat dari sebelumnya.

Salah satu pengembangan teknik purifikasi DNA adalah dengan

menggunakan seperangkat mesin dengan reagen kit di dalamnya. Pemurnian DNA

dapat dilakukan secara otomatis, singkat dan efisien. Pemurnian DNA dapat

dilakukan pada sampel cair maupun padat, seperti darah, sel-sel dan sampel

jaringan. Instrumen dapat memproses sampai dengan 16 sampel dalam 30-40

menit. Mesin purifikasi DNA memurnikan sampel dengan bantuan partikel

paramagnetik (PMPs) instrumen ini dilengkapi dengan cartridge yang berisi lysis

buffer, magnesilr pmps, wash buffer dan dielusi dengan elution buffer

12


menggunakan bantuan magnesilr pmps (Promega 2007). Hasil DNA yang telah

dimurnikan dapat langsung diaplikasikan pada proses restriksi oleh enzim

endonuklease, PCR, dan elektroforesis gel agarosa.

2.4. PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik amplifikasi

asam nukleat in vitro yang paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas.

Dalam waktu sembilan tahun sejak pertama kali dikemukakan oleh ilmuan dari

Cetus Corporation, PCR telah berkembang menjadi teknik utama dalam

laboratorium biologi molekuler, antara lain untuk transkripsi in vitro dari PCR

template, PCR rekombinan, DNAse I footprinting, sequencing dengan bantuan

phage promoters, dan sebagainya (Putra, 1999).

PCR digunakan untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target

tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan

molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai

primer dalam suatu thermocycle. Panjang target DNA berkisar antara puluhan

sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang

berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah

daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak

rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase. Untuk

dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs

yang mencakup dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP (Muladno, 2010).

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap

berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA template, penempelan

(annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension)

primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase (Gaffar,

2007).

Pada akhir siklus pertama, suatu molekul DNA untai ganda dilipatgandakan

jumlahnya menjadi dua molekul DNA untai ganda. Dua molekul DNA untai

ganda hasil amplifikasi pada siklus pertama menjadi DNA target dan

dilipatgandakan menjadi empat molekul DNA, dan selanjutnya empat molekul

13


baru ini dilipatgandakan lagi jumlahnya menjadi delapan dan seterusnya

(Muladno, 2010).

2.4.1. Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah

DNA template, sepasang primer oligonukleotida, DNA polymerase,

deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan larutan buffer (Muladno, 2010; Gaffar,

2007; Sulistyaningsih, 2007):

1. DNA Template

DNA Template adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung

sekuen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan faktor

utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya jika tidak mengandung sekuen

yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses suatu PCR, namun sebaliknya

jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tapi mengandung sekuen yang diinginkan

maka PCR akan berhasil.

Konsentrasi DNA juga dapat mempengaruhi keberhasilan PCR. Jika

konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan

target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan

mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena akan

mempengaruhi hasil reaksi.

2. Primer

Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR. Pasangan

primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 18- 28 nukleotida dan

mempunyai 40-60% GC content. Sekuen primer yang lebih pendek akan memicu

amplifikasi produk PCR non spesifik. Ujung 3' primer penting dalam menentukan

spesifisitas dan sensitivitas PCR. Ujung ini tidak boleh mempunyai 3 atau lebih

basa G atau C, karena dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik.

Disamping itu ujung 3' kedua primer tidak boleh komplementer satu dengan yang

lain, karena hal ini akan mengakibatkan pembentukan primer-dimer yang akan

menurunkan hasil produk yang diinginkan. Ujung 5' primer tidak terlalu penting

untuk annealing primer, sehingga memungkinkan untuk menambahkan sekuen

14


tertentu misalnya sisi restriksi enzim, start codon ATG atau sekuen promoter.

Konsentrasi primer biasanya optimal pada 0,1-0,5 μM.

Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming

(penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik

serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila

konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga

hasilnya rendah.

3. DNA polymerase

DNA polymerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA.

Dalam perkembangannya, kini banyak digunakan enzim Taq DNA polymerase

yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi sehingga penambahan enzim tidak perlu

dilakukan disetiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin

(Gaffar, 2007).

Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim alami

yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang

disintesis didalam sel bakteri Escherichia coli (Muladno, 2010). Enzim ini masih

mempunyai aktivitas eksonuklease dari 5' ke 3' tetapi tidak mempunyai aktivitas

eksonuklease dari 3' ke 5'. Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR

biasanya 0,5-2,5 unit. Kelebihan jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk

non spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produkyang

diinginkan (Sulistyaningsih, 2007).

4. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)

Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk sintesis

DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP.

Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 μM dapat menghasilkan

keseimbangan optimal antara hasil, spesifisitas dan ketepatan PCR. Konsentrasi

masing-masing dNTP harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan

penggabungan.

Deoxynucleotide Triphosphate akan menurunkan Mg2+

bebas sehingga

mempengaruhi aktivitas polimerase dan menurunkan annealing primer.

Konsentrasi dNTP yang rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non

target dan menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Oleh

15


karena itu spesifisitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dNTP yang

lebih rendah (Sulistyaningsih, 2007).

5. Larutan buffer

Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung 10

mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, dan 1,5 mM MgCl2. Optimalisasi konsentrasi

ion Mg2+

merupakan hal yang penting (Sulistyaningsih, 2007).

6. Kofaktor Ion Metal

Magnesium klorida merupakan kofaktor esensial untuk DNA polymerase

yang digunakan di dalam PCR dan konsentrasinya harus dioptimasi untuk setiap

sistem primer:template. Keberadaan ion magnesium yang bebas penting sebagai

kofaktor enzim dalam PCR. . Konsentrasi ion ini mempengaruhi beberapa hal

yaitu annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk PCR,

spesifisitas produk, pembentukan primer-dimer serta aktivitas dan ketepatan

enzim Taq Polymerase. Konsentrasi ion magnesium harus melebihi total

konsentrasi dNTP. Biasanya, untuk memulai proses optimasi, sebanyak 1.5 mM

MgCl2 ditambahkan ke dalam PCR yang didalamnya terdapat 0.8 mM dNTP,

sehingga terdapat sekitar 0.7 mM magnesium bebas untuk DNA polymerase.

Secara umum, ion magnesium harus divariasikan dalam seri konsentrasi dari 1.5 -

4.0 mM (Kolmodin dan Birch, 2002)

2.4.2. Tahapan PCR

Berikut ini merupakan tahapan yang terjadi pada proses PCR (Muladno,

2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007):

1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua

untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi

menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.

Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan (Gaffar, 2007). Denaturasi

biasanya dilakukan antara suhu 90-95 0C selama 3 menit untuk meyakinkan

bahwa molekul DNA yang ditargetkan ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-

benar telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya,

16


waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95 0C atau 15 detik pada suhu 97

0C (Muladno, 2010).

Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen target. Jika sekuen target kaya

akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Suhu denaturasi yang terlalu

tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama mengakibatkan hilangnya atau

berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase. Waktu paruh aktivitas enzim

tersebut adalah >2 jam pada suhu 92,5 0C, 40 menit pada 95

0C dan 5 menit pada

97,5 0C (Muladno, 2010 dan Sulistyaningsih, 2007).

2. Annealing

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah

yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini,

ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada

template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60 0C. Spesifisitas PCR

sangat tergantung pada suhu melting (Tm) primer, yaitu suhu dimana separuh

jumlah primer menempel pada template. Temperatur penempelan yang digunakan

biasanya 5 0C di bawah Tm, dimana formula untuk menghitung Tm = 4

0C (G+C)

+ 2 0C (A+T). Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya

(Muladno, 2010). Selanjutnya, DNA polimerase akan berikatan sehingga ikatan

hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila

dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya (Gaffar, 2007). Suhu dan lamanya

waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer juga tergantung pada komposisi

basa, panjang, dan konsentrasi primer (Sulistyaningsih, 2007).

3. Reaksi polimerisasi

Umumnya reaksi polimerisasi (extension) atau perpanjangan rantai, terjadi

pada suhu 72 0C karena merupakan suhu optimum Taq polymerase. Primer yang

telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3'nya dengan

penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polymerase

(Gaffar, 2007).

Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72 0C

diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer,

pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Dengan demikian, untuk produk

PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk

17


tahap pemanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR, waktu yang

digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit, sehingga seluruh produk

PCR diharapkan berbentuk DNA untai ganda (Muladno, 2010).

Gambar 3. Siklus PCR (Gaffar, 2007)

2.5. Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam

media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik. Media yang

umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa

digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100

bp dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis akrilamid dapat

memisahkan 1 bp dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid

biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA atau sekuensing (Gaffar,

2007).

Sebelum proses elektroforesis, dilakukan pencampuran antara DNA dengan

loading dye. Loading dye terdiri dari glycerol, bromphenol blue, dan xylene

cyanol FF. Glycerol berfungsi sebagai pemberat sehingga DNA berada di bawah

sumuran, sedangkan bromphenol blue dan xylene cyanol FF berfungsi sebagai

visualisasi pada gel sehingga proses migrasi DNA pada saat berlangsungnya

elektroforesis tidak melebih batas gel (Carson, 2006).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan kedalam sumur-sumur

yang terdapat dalam gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri

arus listrik dengan menggunkan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan

bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding

terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran

panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi

18


lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu

memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya.

Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya

(Muladno, 2010):

1. Ukuran molekul DNA

Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi

molekul berukuran kecil.

2. Konsentrasi agarosa

Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat

daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Oleh

karena itu, penentuan konsentrasi agarosa dalam membuat gel harus

memperhatikan ukuran molekul DNA yang akan dianalisis.

3. Konformasi DNA

Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan

bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda.

4. Voltase yang digunakan

Dalam voltase, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya

voltase yang digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan voltase dinaikkan,

mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Ini mengakibatkan pemisahan

molekul DNA di dalam gel menurun dengan meningkatnya voltase yang

digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul

DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm.

5. Keberadaan etidium bromida di dalam gel

Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul

DNA linear sebesar 15%.

6. `Komposisi larutan buffer

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik akan

sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan buffer

berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas, sehingga aliran listrik menjadi

sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami

denaturasi.

19


Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan

masuk di antara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan

terlihat di bawah lampu UV (Gaffar, 2007). Larutan etidium bromida sangat

berbahaya dan bersifat karsinogen. Semua larutan yang mengandung etidium

bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang (Muladno, 2010). Untuk

menghindari bahaya yang ditimbulkan oleh etidium bromida, maka dapat

menggunakan larutan SYBR safe sebagai penggantinya. Menurut Sambrook dan

Russel (2001) pewarna SYBR safe membuat DNA berpendar di bawah sinar UV.

Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa

terdapat DNA pada setiap lajur.

2.6. Insulated Isothermal PCR

Insulated isothermal PCR merupakan suatu teknik berbasis PCR yang

memanfaatkan fenomena konveksi termal alami untuk menggandakan jumlah

molekul DNA pada target tertentu. Reaksi ii-PCR dilakukan di dalam sebuah tube

kapiler yang telah didesain secara khusus di dalam sebuah chamber POCKIT.

Ketika pemanasan dengan suhu 95oC diaplikasikan pada bagian bawah dari R-

tube, larutan yang panas menjadi ringan dan berpindah ke atas, dan larutan yang

dingin yang lebih berat dan berpindah ke bawah. Reaksi PCR dapat terjadi karena

adanya gradien temperatur di dalam tube dimana, secara teori, proses denaturasi

akan terjadi di bagian bawah, annealing di bagian atas, dan elongasi terjadi di

bagian tengah R-tube.

Karena reaksi PCR dijalankan dalam temperatur gradien dengan konveksi

termal tanpa harus menaikkan dan menurunkan suhu secara berulang, maka satu

siklus PCR hanya berlangsung selama 15-20 detik, dan lebih efektif dari PCR

konvensional.

Reagen yang digunakan di dalam alat POCKIT hampir sama dengan yang

digunakan dalam reaksi PCR, termasuk primer, dNTP, buffer, DNA polymerase,

dan template. Untuk meningkatkan spesifitas reaksi, POCKIT dilengkapi dengan

dua perekam fluorosens yang mendeteksi sinyal fluoresens dari target asam

nukleat. Jadi, seperti system real-time PCR, probe flurogenik juga dibutuhkan.

20


Beberapa komponen insulated isothermal PCR yang perlu diperhatikan

yaitu:

1. Buffer

Insulated isothermal PCR menggunakan Buffer Uni-II yang mengandung

reagen-reagen yang berfungsi untuk mengoptimasi laju konveksi termal,

menstabilisasi gradien temperatur, mengurangi interaksi antara larutan dan R-

tube, dan meningkatkan efisiensi DNA polymerase untuk keberhasilan reaksi

iiPCR.

2. R-tube

Tube terbuat dari bahan plastik optik yang memastikan transmisi

fluoresensi yang optimal. Bahan plastik berkelas medis juga memastikan bahwa

produk bebas dari DNase dan RNase. Tube telah dipatenkan dengan rasio

diameter dan panjang tertentu yang memastikan konveksi isotermal untuk reaksi

iiPCR yang optimal. Tutup yang didesain secara khusus menjaga keamanan

reaksi larutan dan mencegah penguapan pada saat reaksi berlangsung yang dapat

menyebabkan kontaminasi.

3. Primer

Desain primer untuk ii-PCR harus memenuhi persyaratan sebagai berikut:

a. Amplikon harus kurang dari 150 bp, semakin pendek semakin baik.

b. Tm (melting temperature) harus pada rentang 58±2oC

c. Primer harus mempunyai kandungan GC antara 45-60%

d. Hindari 4 atau lebih pengulangan G atau C.

e. Hindari pengulangan (ATATATATATAT)

f. Lima basa terakhir pada ujung 3’ harus mempunyai 1-3 G atau C.

g. Potensi untuk membentuk primer-dimer harus seminimal mungkin.

h. Hindari pembentukan bentuk homo-, hetero-dimer, dan hairpin

4. Probe

Probe POCKIT harus:

a. Terdiri dari 40-80 % GC

b. Mempunyai panjang 15-30 basa, lebih pendek lebih baik.

c. Menghindari daerah target pada template yang dapat membentuk

struktur sekunder.


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Gen, Balai

Pengkajian Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang, dari bulan Maret 2013

hingga bulan Januari 2014.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau steril [Vidrex], pipet

mikro 0,1-2µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL [Nichipet EX], tips 10 µL, 100

µL, 1000 µL, tabung sentrifugasi 1,5 m, tabung mikrosentrifugasi 200 µl

[Axygen], rak tabung, mesin micro sentrifuge [TOMY MX-301], timbangan

analitik [ADAM®

], ice maker [HOSHIZAKI], vortex [Heidolph], magnetic

stirrer, inkubator [Memmert], spatula, kulkas [Toshiba], autoclave, freezer -20oC

[Angelantoni Scientifica], lemari pendingin 4oC [Iberma], microwave [National],

satu set elektroforesis [Mupid®

-2Plus], gel documentation, Spektrofotometer

Nano Drop [ND-1000], dan Insulated Isothermal PCR. Alat gelas yang digunakan

adalah gelas ukur 100 ml, Labu Erlenmeyer 250 ml, gelas Beaker [Pyrex], kaca

arloji, dan batang pengaduk.

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging babi segar dan

daging sapi segar yang didapatkan dari pasar swalayan di Lebak Bulus. Bahan lain

seperti cell lysis buffer (Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1% v/v), proteinase K, RNAse

A, NaCl 5M, fenol, kloroform, isoamilalkohol, etanol 70%, etanol absolut, Na

asetat, agarosa, buffer TAE, loading dye 6x , Sybr Safe, free nuclease water, Go

Taq Green Master Mix®, primer babi, primer sapi, probe babi, probe sapi, dNTP,

KAPPA 2G Robust, buffer ii-PCR.

22


3.3. Tahapan Penelitian

1. Pengumpulan sampel daging babi dan daging sapi.

2. Isolasi DNA daging babi dan DNA daging sapi.

3. Cek keberadaan DNA babi dan DNA sapi dengan elektroforesis.

4. Optimasi suhu annealing primer dengan PCR konvensional.

5. Uji spesifitas dan sensitivitas primer dengan PCR konvensional.

6. Optimasi komposisi ii-PCR untuk amplifikasi DNA babi dan DNA sapi.

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1. Isolasi dan Purifikasi DNA pada Daging Sapi dan Daging Babi.

Proses isolasi DNA pada daging sapi dan daging babi adalah sebagai

berikut: ditimbang sebanyak 500 mg daging yang telah dihaluskan, kemudian

dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5 ml, ditambahkan 750 µl cell lysis

buffer (Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1% v/v) dan ditambahkan 3µL proteinase K

lalu dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 55oC overnight (16 jam). Setelah

diinkubasi, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm, selama 10

menit. Setelah itu supernatan yang terbentuk dipisahkan dan ditambahkan 20 µl

NaCl 5 M dan 5 µL RNAse, lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit.

Supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan fenol-kloroform (1:1)

equal volume, kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi dengan kecepatan

14000 rpm selama 10 menit. Kemudian lapisan atas yang terbentuk dipisahkan

lalu ditambahkan kloroform-isoamilalkohol (24:1) equal volume, kemudian

dihomogenkan dan disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm selama 10 menit.

Setelah itu lapisan atas dipisahkan dan ditambhakan etanol absolute 2x volume

dan Na asetat 3 M pH 7 1/10 volume, kemudian dihomogenkan dan diinkubasi

selama 1 jam pada suhu -20oC. Setelah diinkubasi, campuran disentrifugasi

dengan kecepatan 14000 rpm dengan suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan yang

terbentuk dibuang sedangkan pelet ditambahkan dengan 500 µl etanol 70%,

kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan

yang terbentuk dibuang, DNA dikeringkan dengan pompa vakum selama 10 menit

kemudian ditambahkan buffer TE 100 µl. Keberadaan DNA dicek dengan

23


menggunakan metode elektroforesis, sedangkan konsentrasi dan kemurnian DNA

dicek dengan menggunakan spektrofotometri Nano Drop 1000. DNA yang telah

dilarutkan disimpan pada suhu -20oC (Kesmen et al., 2009).

3.4.2. Elektroforesis

Gel agarosa 1% digunakan untuk elektroforesis DNA genom dan hasil

produk PCR. Untuk pembuatan gel agarosa 1%, ditimbang sebanyak 0,3 gr atau

0,6 gr agarosa dan kemudian dilarutkan dengan 30 mL atau dengan 60 mL TAE

1x, lalu dipanaskan di dalam microwave selama 1 menit sampai agarosa menjadi

larut dan larutan berwarna bening. Selanjutnya larutan agarosa didinginkan hingga

suhu 40oC, kemudian ditambahkan 0,6 µL atau dengan 1,2 µL sybr safe dan

dihomogenkan, lalu dituang ke dalam gel caster yang telah disisipkan comb.

Selanjutnya agarosa didiamkan hingga membentuk gel padat.

Setelah terbentuk gel padat, gel diletakkan pada chamber elektroforesis

dengan posisi sumur pada muatan negatif. Kemudian buffer TAE 1x dituang

hingga gel terendam dalam chamber elektroforesis namun tidak melebihi garis

batas maksimum.

Pencampuran sampel yang akan dielektroforesis dilakukan dengan

menggunakan parafilm. DNA sampel yang digunakan sebanyak 5 µL dan

ditambah 1 µL Loading dye. Kemudian marker DNA diletakkan di sumur paling

kiri, diikuti selanjutnya DNA sampel.

Chamber elektroforesis ditutup rapat. Alat elektroforesis dinyalakan (diberi

arus listrik) dengan tegangan 100 Volt selama 30 menit untuk DNA genom dan 20

menit untuk produk PCR. DNA akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan

positif.

3.4.3 Dokumentasi Gel

Komputer dan kamera digital dinyalakan. Gel agarosa hasil elektroforesis

dimasukkan ke dalam UV transiluminator. UV transiluminator dinyalakan dan

pita DNA akan berpendar saat terkenar sinar UV. Pendaran tersebut dapat

didokumentasikan dengan software yang terhubung dengan kamera sehingga

gambar yang ditangkap oleh kamera kemudian disimpan dalam komputer.

24


3.4.4 Optimasi Suhu Annealing dengan menggunakan Metode Gradien PCR

Uji ini dilakukan untuk mengetahui suhu optimal primer babi dan primer

sapi pada proses annealing. Pada PCR di setting pembuatan gradien suhu

annealing. Rentang suhu yang digunakan untuk pembuatan gradien suhu

annealing adalah 50-65oC.

3.4.5 Uji Spesifitas primer

Setelah didapat suhu annealing optimum dari primer babi dan primer sapi

selanjutnya diuji spesifitasnya dengan menggunakan PCR. Primer babi dapat

dikatakan spesifik jika primer babi hanya dapat mengamplifikasi sekuen DNA

babi, begitu juga pada primer sapi yang hanya dapat mengamplifikasi sekuen

DNA sapi.

3.4.6 Uji Sensitivitas primer

Primer babi dan primer sapi diuji sensitivitasnya dengan menggunakan

PCR. Pengujian ini ditujukan untuk melihat konsentrasi terendah yang masih

dapat terdeteksi dengan menggunakan primer babi dan primer sapi. Gradien

konsentrasi yang digunakan yaitu 20 ng/ 25 µl, 10 ng/ 25 µl, 2 ng/ 25 µl, 0,2 ng/

25 µl, dan 0,02 ng/ 25 µl.

3.4.7 Insulated Isothermal PCR

Optimasi alat insulated isothermal PCR dilakukan untuk mengetahui

konsentrasi Taq polymerase, dNTP, buffer, primer, DNA template optimal untuk

dapat mengamplifikasikan DNA babi dan DNA sapi. Uji ini dilakukan dengan

campuran reaksi primer-probe, uni-ii buffer, probe, dNTP, DNA template, DNA

polymerase.

Setelah campuran reaksi total PCR dibuat, campuran reaksi tersebut

dimasukkan ke dalam R-tube, disentrifugasi, kemudian diletakkan pada mesin

insulated isothermal PCR. Kemudian program amplifikasi dijalankan dan hasil

amplifikasi DNA dapat dilihat pada akhir reaksi dalam bentuk “+” atau “-”.

25


3.5. Alur Penelitian

Persiapan daging babi segar dan daging sapi segar

Isolasi DNA

Cek keberadaan DNA dengan elektroforesis

DNA tidak ada DNA ada

Cek konsentrasi DNA

PCR 1. Optimasi Suhu

Annealing

2. Uji spesifitas

primer

3. Uji sensitivitas

primer

Insulated Isothemal PCR

Hasil

Kesimpulan


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi Genom

Genom diisolasi dari daging babi dan daging sapi yang didapatkan dari

pasar swalayan yang berada di Lebak Bulus. Masing-masing sampel diisolasi

sebanyak 500 mg dengan menggunakan metode cell lysis buffer berupa Tris-Cl

pH 8, EDTA pH 8, dan SDS 1% w/v (Kesmen et al., 2009; Kumari, 2007;

Sambrook dan Russel, 2001) dengan beberapa modifikasi diantaranya volume

sampel dan pereaksi, kecepatan sentrifugasi, dan urutan langkah kerja.

Isolasi dimulai dengan menginkubasi sampel dalam cell lysis buffer dan

Proteinase K pada suhu 55oC selama 16 jam. Cell lysis buffer yang digunakan

mengandung SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang merupakan deterjen anionik

yang dapat melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier

protein yang terdapat pada membran. Pada proses lisis sel, EDTA mempunyai dua

fungsi. Pertama, EDTA mengikat ion logam divalen (Mn2+

, Mg2+

) yang dapat

membentuk garam dengan grup anionik fosfat pada DNA. Kedua, EDTA

menghambat DNAse yang membutuhkan Mg2+

atau Mn2+

(Dale dan Malcom,

2002). Tris berperan sebagai buffer selama proses isolasi yang dapat menjaga pH

7,4-9,0 karena DNA dapat mengalami denaturasi pada pH ekstrim (pH<5 atau

pH>16) (Ageno et al., 1969; Marmur dan Lane, 1958; Sambrook dan Russel,

2001).

Kontaminasi protein dikurangi dengan menggunakan Proteinase K, yang

merupakan protease endolitik golongan serin protease dengan aktivitas tinggi

(Sambrook dan Russel, 2001). Proteinase K memotong ikatan peptida yang

berdekatan dengan grup karboksil dari asam amino alifatik dan aromatik.

Proteinase K menunjukkan aktivitas optimal pada pH 7,5 – 9 (Sambrook dan

Russel, 2001; Sweeney & Walker, 1993) dan distimulasi dengan SDS pada

konsentrasi 0,1 hingga 1 % (Hilz et al., 1975). Setelah proses lisis berakhir

komponen-komponen yang ditimbulkan akibat perusakan sel dipisahkan dengan

cara sentrifugasi.

27


Supernatan yang terbentuk masih mengandung pengotor lipid, protein,

RNA, dan karbohidrat (Dale and Malcom, 2002). Supernatan diinkubasi dalam

RNAse dan natrium klorida 5 M pada suhu 37oC selama 1 jam. RNAse

merupakan endoribonuklease yang mengkatalisis degradasi untai tunggal RNA

dengan pemotongan rantai 3’, 5’-fosfodiester, dimana basa dari nukleotida pada

ikatan di posisi 3’ yang akan dipotong merupakan pirimidin (Moussaoui et al.,

2007; Raines, 1998). Penambahan natrium klorida 5 M berfungsi untuk

mengendapkan protein dan kontaminan lainnya. Konsentrasi garam yang tinggi

dapat mengendapkan protein karena adanya fenomena salting-out.

Purifikasi DNA dilakukan untuk menghilangkan kontaminan selain DNA.

Metode purifikasi DNA yang dilakukan adalah ektraksi fenol-kloroform.

Campuran fenol-kloroform mempunyai berat jenis yang berbeda dengan air

sehingga ketika dicampurkan terbentuk dua fase, dimana fase fenol-kloroform

berada di bawah karena memiliki berat jenis yang lebih besar. DNA bersifat polar

karena mengandung muatan negatif akan larut dalam fase air. Fenol dan

kloroform akan mendenaturasi protein dan kontaminan lainnya. Penggunaan

kloroform juga digunakan untuk memperkecil zona interfase sehingga terdapat

perbedaan jelas antara fase air dan fase organik. Isoamil alkohol digunakan

sebagai anti foaming agent yang dapat menjaga kestabilan interfase sehingga

memperjelas batas fase air dan fase organik. (Sambrook dan Russel, 2001).

DNA dipisahkan dari larutan dengan cara presipitasi dengan menggunakan

alkohol yang dapat berupa isopropanol atau yang lebih sering etanol (Sambrook

dan Russel, 2001; Dale dan Malcom, 2002). Proses presipitasi dibantu dengan

garam yang berfungsi untuk menetralkan muatan pada gugus fosfat DNA. Garam

yang umumnya digunakan adalah natrium asetat. Dalam larutan, natrium asetat

akan terionisasi menjadi Na+ dan CH3COO

- dimana Na

+ akan berinteraksi dengan

gugus fosfat (PO42-

) pada DNA. Ikatan Na+ dan fosfat (PO4

2-) yang terbentuk akan

menyebabkan DNA menjadi kurang hidrofilik. Interaksi ion di dalam larutan

dipengaruhi oleh konstanta dielektrik pelarut. Etanol dalam hal ini berperan untuk

menurunkan konstanta dielektrik air yang mempermudah interaksi ion Na+

dan

(PO42-

) sehingga membuat DNA menjadi kurang hidrofil dan dapat mengendap.

28


Inkubasi campuran DNA dilakukan pada suhu -20oC karena suhu yang

rendah mendukung flokulasi DNA untuk membentuk kompleks presipitat yang

lebih besar, sehingga DNA dapat dengan mudah terbentuk pelet dengan

sentrifugasi. Pada langkah berikutnya, 70% etanol ditambahkan ke dalam pelet

dan divortex untuk melonggarkan pelet, sehingga etanol dapat berpenetrasi dan

membersihkan garam-garam yang terikat pada DNA. Suspensi yang terbentuk

kemudian disentrifugasi selama 5 menit dimana pelet akan terbentuk kembali.

Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan menguapkan sisa etanol dengan

menggunakan desikator. Pelet DNA yang telah kering dapat dilarutkan dengan air

(ddH2O) ataupun TE buffer (Muladno, 2010).

Gel divisualisasikan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1 %

dengan tegangan 100 volt. Loading Dye terdiri dari sebuah pewarna yaitu

bromophenol blue yang berfungsi untuk visualisasi pergerakan DNA pada saat

elektroforesis dicampurkan ke dalam genom. Adanya gliserol di dalam loading

dye memastikan bahwa DNA di dalam ladder dan sampel membentuk lapisan di

bawah sumur gel. Pada gambar 4 menunjukkan hasil isolasi genom dari daging

sapi dan daging babi.

Gambar 4. Elektroforesis hasi isolasi genom daging sapi dan

daging babi

Keterangan:

M. Marker 100bp

1. Genom

Daging Babi

2. Genom

Daging Sapi

29


Gambar 4 menunjukkan pita yang smear. Hasil pita yang smear pada gel

elektroforesis dapat disebabkan tidak utuhnya DNA yang terisolasi dimana

fragmen-fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda tertahan oleh gel sesuai

dengan ukurannya. Karena antar satu fragmen dengan fragmen lainnya memiliki

ukuran yang hampir sama maka pita tampak menyatu. Terjadinya fragmentasi

DNA pada daging segar dikarenakan genom yang terisolasi mengalami degradasi

baik pada saat penyimpanan maupun selama proses isolasi berlangsung, namun

hasil isolasi tersebut masih dapat digunakan untuk PCR selama di dalamnya

terdapat target yang diinginkan (Anonimd, 2013).

Konsentrasi genom hasil isolasi diukur dengan menggunakan

spektrofotometer Nano Drop ND-1000 pada panjang gelombang 260 nm dan 280

nm. Konsentrasi genom yang dihasilkan dari sampel daging babi adalah 713

ng/µl, sedangkan daging sapi adalah 746 ng/µl (Lampiran 1). Asam nukleat dan

protein mempunyai absorban maksimum pada panjang gelombang 260 nm dan

280 nm. Rasio absorban pada kedua panjang gelombang ini digunakan untuk

pengukuran kemurnian dari ekstraksi DNA dan protein, dimana rasio 1,8 – 2

secara umum diterima sebagai nilai kemurnian untuk DNA (Thermo Scientific,

2012). Nilai A260/A280 hasil isolasi genom babi adalah 1,81, sedangkan genom sapi

1,67.

Pada gambar 4 terlihat pita yang memisah pada bagian bawah dari semua

lajur yang menandakan keberadaan RNA, namun dalam jumlah sedikit sehingga

tidak perlu dilakukan pemurnian ulang.

4.2. Polymerase Chain Reaction

Proses PCR dilakukan setelah genom telah berhasil diekstraksi. Primer

yang digunakan pada proses amplifikasi DNA spesies babi dan sapi terletak pada

daerah cytochrome b DNA mitokondria. Adanya variasi urutan pada cyt b

menyebabkan gen ini banyak digunakan sebagai penanda untuk membedakan

material yang berasal dari jenis hewan yang berbeda (Primasari, 2011), selain itu

terdapat banyak sekuens pada daerah ini yang telah terdaftar dalam database bank

DNA (Kocher et al., 1989). Produk PCR dengan primer babi pada daging babi

menghasilkan amplikon dengan ukuran 141 pasang basa, sedangkan amplifikasi

30


primer sapi pada daging sapi menghasilkan panjang produk 128 pasang basa.

Waktu reaksi PCR berjalan selama 100 menit dan jumlah siklus yang digunakan

yaitu 35.

4.2.1. Optimasi Suhu Annealing Primer Babi dan Primer Sapi dengan PCR

Konvensional

Optimasi suhu annealing merupakan salah satu kriteria parameter yang

penting untuk keberhasilan PCR. Optimasi suhu annealing bertujuan untuk

menghindari mispriming yang terjadi bila suhu annealing terlalu rendah, tidak

teramplifikasinya DNA bila suhu annealing terlalu tinggi, dan meningkatkan

spesifitas produk PCR (Dale & Malcom, 2002; Prezioso & Jahns, 2013). Suhu

annealing dapat ditentukan dengan menghitung Tm dimana biasanya suhu

annealing 5oC di bawah Tm primer yang sebenarnya. Namun, dalam pelaksanaan

amplifikasi DNA pada PCR, terkadang suhu annealing yang digunakan

berdasarkan perhitungan tidak menunjukkan hasil yang optimal. Sehingga,

dilakukan metode gradien PCR, suatu metode yang memungkinkan untuk

melakukan PCR sampai dengan dua belas suhu denaturasi, annealing, dan

elongasi yang berbeda dalam satu kali run PCR (Prezioso & Jahns, 2013).

Gradien suhu annealing dan siklus PCR yang digunakan adalah 50-65 o

C dan

35 siklus.

Gambar 5. Elektroforesis produk PCR konvensional hasil optimasi suhu

annealing primer babi pada untai DNA daging babi dengan

menggunakan metode gradien PCR

Pada gambar 5, hasil elektroforesis PCR untuk optimasi suhu annealing

primer babi menunjukkan pita yang sama tebal pada rentang suhu 50-58oC,

31


sedangkan pada suhu diatasnya menunjukkan pita-pita yang semakin samar yang

disebabkan oleh semakin sedikitnya jumlah DNA yang teramplifikasi. Suhu

annealing primer babi yang kemudian digunakan untuk proses PCR selanjutnya

adalah 51oC.

Gambar 6. Elektroforesis produk PCR konvensional hasil optimasi suhu

annealing primer sapi pada untai DNA daging sapi dengan

menggunakan metode gradien PCR.

Gambar 6 menunjukkan pita juga yang hampir sama tebal pada rentang suhu

50-58oC, dimana pada lajur 4 dengan suhu 56

oC, pita terlihat sedikit lebih tebal

dibandingkan dengan yang lainnya, sehingga suhu yang digunakan sebagai suhu

annealing primer sapi untuk pengujian selanjutnya.

4.2.2. Uji Spesifitas Primer Babi dengan DNA Daging Babi dan DNA Daging

Sapi

Setelah penentuan suhu annealing primer sapi dan babi, kedua primer ini

diuji spesifitasnya. Primer sapi dapat dikatakan primer spesifik jika hanya dapat

mengamplifikasikan DNA daging sapi saja, begitu juga dengan primer babi.

32


Pada gambar 7a. dapat terlihat adanya pita DNA daging sapi pada lajur dua.

Hal ini menunjukkan bahwa pada suhu annealing 51oC, primer babi dapat

mengamplifikasi DNA daging sapi. Banyaknya siklus dapat menyebabkan

amplifikasi nonspefisik (Bio-Rad, 2006). Sehingga, dilakukan pengujian spesifitas

ulang dengan menaikkan suhu annealing dan mengurangi jumlah siklus PCR yang

digunakan menjadi 25.

Gambar 7a. Elektroforesis uji spesifitas primer babi

dengan DNA daging babi dan DNA daging

sapi pada suhu annealing 51oC.

7a. 7b.

Gambar 7a. dan 7b. Elektroforesis produk PCR hasil uji

spesifikasi primer babi dan primer

sapi

Gambar

33


Gambar 7b. Elektroforesis uji spesifitas primer babi dengan DNA daging

babi dan DNA daging sapi pada suhu annealing 53oC.

Gambar 7b. menunjukkan bahwa DNA daging sapi tidak lagi teramplifikasi

dengan primer babi, sehingga dapat dikatakan primer babi spesifik

mengamplifikasi DNA daging babi pada suhu annealing 53oC dan jumlah siklus

25.

4.2.3. Uji Spesifitas Primer Sapi dengan DNA Daging Sapi dan DNA Daging

Babi

8a. 8b.

Gambar 8a. dan 8b. Elektroforesis uji spesifitas primer sapi dengan DNA

daging sapi dan DNA daging babi pada suhu annealing 56oC dan 62

oC.

34


Pada gambar 8a. dan 8 b. terdapat pita yang menunjukkan bahwa DNA

daging babi dapat teramplifikasi hingga suhu annealing 62oC oleh primer sapi.

Gambar 8c. Elektroforesis uji spesifitas primer sapi dengan DNA

daging sapi dan DNA daging babi pada suhu annealing

63oC.

Gambar 8c. menunjukkan bahwa DNA daging babi tidak lagi teramplifikasi

dengan primer sapi, sehingga dapat dikatakan primer sapi spesifik

mengamplifikasi DNA daging sapi pada suhu annealing 63oC dan jumlah siklus

25 (Lampiran 3).

4.2.4. Uji Sensitivitas Primer Sapi dan Primer Babi.

Uji ini dilakukan dengan cara mengencerkan konsentrasi DNA daging sapi

dan DNA daging babi menjadi seri konsentrasi sebagai berikut; 0.02 ng/ 25 µl, 0,2

ng/ 25 µl, 2 ng/ 25 µl, 10 ng/ 25 µl, dan 20 ng/ 25 µl, yang kemudian

diamplifikasi dengan PCR.

35


Gambar 9. Elektroforesis produk PCR hasil uji sensitivitas menggunakan primer

babi dan primer sapi.

Gambar 9. menunjukkan kesensitivitasan primer babi dalam mendeteksi

DNA daging babi sampai dengan konsentrasi 0,2 ng/ 25 µl, sedangkan primer sapi

hanya sensitif terhadap keberadaan DNA daging sapi sampai dengan konsentrasi 2

ng/ 25 µl. Batas kemampuan primer sapi untuk mendeteksi sampai dengan

konsentrasi 2 ng/ 25µl disebabkan oleh suhu annealing yang cukup tinggi. Suhu

annealing yang tinggi menurunkan kemampuan primer untuk menempel pada

template sehingga DNA yang teramplifikasi sedikit.

Primer yang spesifik dan sensitif sangat penting dalam pengujian makanan

halal dengan menggunakan metode yang berbasis PCR. Kehalalan suatu makanan

merupakan hal yang mutlak dan tidak dipengaruhi oleh besarnya cemaran dalam

produk makanan. Oleh karena itu diperlukan primer yang spesifik dan sensitif

yang dapat mendeteksi suatu spesies sampai dengan konsentrasi yang sangat kecil.

4.3. Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction

Insulated Isothermal PCR merupakan teknik yang masih tergolong baru

yang sejauh ini digunakan untuk mendeteksi penyakit yang disebabkan oleh virus

dan bakteri. Teknik ini memanfaatkan fenomena konveksi termal untuk

menjalankan reaksi PCR di sebuah tube yang telah didesain secara khusus di

36


dalam chamber POCKIT, yang merupakan alat PCR konvektif dengan satu

sumber panas. Ketika pemanasan pada suhu 95oC diaplikasikan pada bagian

bawah R-tube, gradien temperatur akan terbentuk, dimana reaksi PCR berjalan

mengikuti arus konveksi cairan. Teknik ini memerlukan waktu yang lebih singkat

dari reaksi PCR yang dilakukan di dalam sebuah thermocycler. Hal ini

dikarenakan, pada PCR konvensional, antara satu tahap dan tahap lainnya

diperlukan penyesuaian suhu dengan pemanasan atau pendinginan sehingga

banyak waktu yang terbuang untuk mengontrol perubahan suhu.

Reagen yang digunakan untuk iiPCR hampir sama dengan PCR

konvesional yaitu DNA polymerase, dNTP, primer forward, primer reverse,

template, dan buffer, dengan tambahan fluoresens probe. POCKIT dilengkapi oleh

dua channel panjang gelombang untuk mendeteksi sinyal fluoresens dari sinyal

target asam nukleat.

Pada penelitian ini, teknik iiPCR digunakan untuk mendeteksi DNA daging

babi dan DNA daging sapi dengan menggunakan primer yang telah diuji

spesifitasnya dan sentivitasnya dengan PCR konvensional. Probe untuk DNA

daging sapi diberi label dengan 6-carboxyfluorescein (6-FAMTM ; maksimum

panjang gelombang eksitasi dan emisi, 494 nm dan 518 nm) dan Black Hole

quencher (BHQ1, maksimum eksitasi 534 nm dan tidak mengemisi cahaya)

(Anonimb, 2011). Probe untuk DNA daging babi diberi label dengan VIC

(maksimum panjang gelombang eksitasi dan emisi, 538 nm dan 554 nm) dan

BHQ1. Penggunaan probe dengan label yang berbeda memungkinan amplifikasi

DNA daging sapi dan DNA daging babi dalam satu kali running.

Probe yang digunakan merupakan TaqMan probe yang juga disebut dengan

probe hidrolisis. Probe hidrolisis bekerja dengan memanfaatkan aktivas

eksonuklease 5’ – 3’ dari Taq polymerase untuk mendeteksi dan mengukur

produk spesifik PCR pada saat reaksi berjalan (Velden, 2003). Probe dikonjugasi

dengan reporter fluorochrome (babi; VIC, sapi; 6-FAMTM) dan quencher

fluorochrome (BHQ1) yang diposisikan pada target. Ketika proses ekstensi

berlangsung, probe akan dilepaskan dari untai DNA oleh Taq Polymerase dan

dihidrolisis oleh aktivitas eksonuklease 5’ – 3’dari Taq Polymerase yang

37


Gambar 10. Elektroforesis produk ii-PCR hasil optimasi reaksi ii-PCR dengan

variasi komposisi untuk deteksi DNA daging babi dan DNA

daging sapi.

menyebabkan separasi antara reporter dan quencher, sehingga fluoresens yang

diemisi oleh reporter menjadi terdeteksi. Sistem optikal dari iiPCR akan

mengakumulasi fluoresensi seiring dengan meningkatnya jumlah reporter yang

bebas, yang juga menunjukkan bahwa target spesifik berhasil diamplifikasi. Hasil

‘+’ atau ‘-’ yang ditampilkan pada layar alat iiPCR bergantung pada perbandingan

intensitas sinyal fluoresensi sesudah dan sebelum reaksi yang dinyatakan dalam

rasio S/N. Bila rasio S/N mencapai lebih atau sama dengan 1,3 maka layar akan

menampilkan tanda positif (Anonimc, 2012).

Pada gambar 10, lajur dengan no 1, 2, 3, 4, 5, 6a, dan 7a merupakan produk

ii-PCR dari amplifikasi DNA daging babi, sedangkan lajur 6b dan 7b DNA

daging sapi. Lajur 1 menunjukkan produk ii-PCR untuk amplifikasi DNA babi

dengan konsentrasi 100 ng/ 50 µl menggunakan komposisi nomor 1 (Lampiran 5).

Pada akhir amplifikasi yang berlangsung selama 58 menit, didapatkan hasil

negatif pada mesin ii-PCR, namun adanya pita yang cukup tebal dan jelas dengan

ukuran 141 bp menandakan DNA dapat teramplifikasi, tetapi tidak terdeteksi oleh

mesin ii-PCR karena rasio intensitas fluoresensi sesudah reaksi dan sebelum

reaksi yang dihasilkan adalah 1.0328 (Tabel 5). Karena rasio yang dihasilkan

belum mencapai 1,3, maka optimasi reaksi ii-PCR dilakukan.

38


Konsentrasi DNA babi diperkecil menjadi 60 ng / 50 µl dengan asumsi

konsentrasi DNA 100 ng / 50 µl terlalu pekat sehingga meningkatkan

kemungkinan kesalahan primer dan probe menempel pada template. Selain itu,

dilakukan pengujian lain dengan konsentrasi DNA daging babi diperbesar menjadi

200 ng / 50 µl dengan asumsi konsentrasi DNA 100 ng / 50 µl terlalu kecil

sehingga primer dan probe tidak dapat menemukan target. Gambar 10

menunjukkan hasil amplifikasi DNA, lajur 2 dengan konsentrasi 60 ng / 50 µl dan

lajur 5 menggunakan konsentrasi DNA 200 ng / 50 µl. Hasil elektroforesis

menunjukkan pita DNA dengan ukuran 141 bp, lebih tipis, dan hasil negatif pada

layar mesin ii-PCR dengan rasio S/N di bawah 1,3 (Tabel 5).

Tabel 5. Intensitas sinyal yang diemisi oleh probe sebelum reaksi dan sesudah

reaksi.

Lajur/Sampel B550 A550 Rasio S/N

1 / DNA daging babi 32,1033 33,1549 1,0328

2 / DNA daging babi 31,9109 32,7641 1,0267

3 / DNA daging babi 30,5803 30,6831 1,0034

4 / DNA daging babi 31,0074 31,8297 1,0265

5 / DNA daging babi 31,0981 31,9145 1,0263

6 a/ DNA daging babi 31,4589 29,9477 0,952

7a/ DNA daging babi 30,6696 31,0530 1,0125

B520 A520

6b / DNA daging sapi 30,461 28,6922 0,9455

7b/ DNA daging sapi 30,6012 27,5444 0,9001

39


Perubahan konsentrasi template tidak memberikan perubahan rasio yang

signifikan. Optimasi selanjutnya dilakukan pada primer dan probe. Konsentrasi

primer dan probe diperbesar menjadi 0,7 mM dan 0,2 mM dengan asumsi bahwa

dengan konsentrasi 0,5 µM dan 0,15 µM, primer dan probe telah habis sebelum

reaksi selesai. Pada lajur 4 dari gambar 10 dapat terlihat pita tipis yang berada

sedikit di bawah 141 bp dimana rasio S/N yang dihasilkan di bawah 1,3 (Tabel

5). Konsentrasi primer yang terlalu tinggi menyebabkan mispriming dan

akumulasi produk non spesifik, serta meningkatkan terbentuknya primer-dimer

(Sulistiyaningsih, 2007), sehingga produk ii-PCR yang dihasilkan tidak spesifik.

Buffer merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam reaksi iiPCR.

Buffer LS 2x yang digunakan diganti menjadi buffer HS 2x. Produk ii-PCR pada

lajur 3 yang dihasilkan mempunyai ketebalan pita yang sama dengan produk ii-

PCR pada lajur 1. Keduanya terdiri dari komposisi reagen ii-PCR yang sama

dengan tipe buffer yang membedakannya. Pada akhir reaksi, tanda (-) tertera pada

layar mesin ii-PCR dengan rasio S/N 1,0034 (Tabel 5).

Perubahan tipe buffer menunjukkan penurunan rasio S/N sehingga buffer

LS 2x kembali digunakan. Optimasi reaksi ii-PCR kemudian dilakukan dengan

meningkatkan dan menurunkan volume Buffer LS 1,5x dan 0,5 x dari volume

awal. Lajur 6a merupakan produk ii-PCR DNA daging babi dari reaksi dengan

konsentrasi buffer 37,5µl. Pita yang dihasilkan lebih tebal daripada pita pada lajur

1 dan 3, namun dengan rasio S/N lebih kecil yaitu 0,952. Konsentrasi buffer yang

pekat mengandung kandungan Mg2+

yang tinggi yang dapat meningkatkan

pembentukan produk non spesifik (Markoulatos et al., 2002). Pengujian yang

sama dilakukan pada DNA daging sapi. Pita yang terdapat pada lajur 6b

berukuran 128 bp dan tipis dengan rasio 0,9455 yang memberikan hasil (-) pada

layar mesin ii-PCR.

Pada lajur 7a dan 7b tidak adanya pita menandakan DNA daging babi

maupun sapi tidak teramplifikasi. Hal ini dikarenakan konsentrasi buffer yang

terlalu kecil sehingga tidak mendukung reaksi ii-PCR.

40


Optimasi komposisi ii-PCR dengan memvariasikan konsentrasi buffer,

template, dan primer tidak berpengaruh terhadap perubahan nilai rasio S/N. Rasio

S/N yang berada di bawah 1,3 menunjukkan tidak adanya perubahan yang

signifikan antara jumlah fluoresens sesudah reaksi dan sebelum reaksi yang

menandakan bahwa probe tidak bekerja dengan baik.

Probe ii-PCR harus memenuhi kriteria tertentu yaitu nilai Tm yang lebih

tinggi 10oC – 15

oC dari Tm primer, kisaran panjang probe antara 13 – 20

nukleotida, kandungan G/C 30-80%, dan tidak ada pengulangan 4 atau lebih basa

terutama residu G (Anonimc, 2012). Probe yang tidak memenuhi kriteria

memungkinkan kegagalan probe untuk berikatan pada target sebelum proses

ekstensi primer terjadi, sehingga amplifikasi target berjalan tanpa adanya probe

dan menampilkan tanda (-) pada layar pada akhir reaksi.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Optimasi reaksi ii-PCR dengan memvariasikan konsentrasi DNA template,

primer, probe, dan buffer menghasilkan tanda (-) pada layar mesin ii-PCR dengan

rasio S/N di bawah 1,3 yang menunjukkan probe tidak bekerja dengan baik.

5.2. Saran

Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut dan desain ulang probe untuk

mendapatkan kondisi optimal untuk mendeteksi DNA sapi dan DNA babi,

sehingga dapat dijadikan sebagai metode untuk pengujian kehalalan suatu produk

makanan.


DAFTAR PUSTAKA

Anonima.. 2012. http://www.iipcr.com/faq.php. [12 Maret 2012. Pukul 12.50]

Anonimb. 2011. Fluorescence and Fluorescence Applications. Integrated DNA

Technologies.

Anonimc. 2013. POCKIT RUO. GeneReach Corporation Taiwan.

Anonimd. 2013. http://www.viogene.com/faq

Ageno et al.,1969. The Alkaline Denaturation of DNA. Roma: Physics

Laboratory, Istituto Superiore di Sanita

Bio-Rad. 2006. Real-time PCR Application Guide. USA

Cain et al., 2002. Discover Biology 2nd

Edition. Barnes & Nobles : USA

Carson, Susan., & Robertson, Dominique. 2006. Manipulation and Expression of

Recombinant DNA, 2nd

Edition. Elsevier Academic Press : USA

Dale, Jeremy W. & Malcom von Schantz. 2002. From Genes to Genomics:

Concepts and Applications of DNA Technology. John Wiley & Sons, Ltd :

USA

Farrokhi, Reza dan Raziallah Joozani. 2011. Identification of pork genome in

commercial meat extracts for Halal authentication by SYBR green I real-

time PCR. Int. J. Food Sci & Tec Vol. 46. (5): 951-955

Gaffar, Shabarni. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: Jurusan

Kimia, FMIPAUNPAD

Harisha, S. 2006. Biotechnology Procedures and Experiments Handbook. Infinity

Science Press LLC : India

Hilz. H., Wiegers, U., Adamietz, P. 1975. Stimulation of Proteinase K Action by

Denaturing Agents : Application to the Isolation of Nucleic Acids and the

Degradation of ‘Masked’ Proteins. Eur. J. Biochem 56: 103-108

Ilhak, O.I., & Arslan A., 2007, Identification of Meat Species by Polymerase

Chain Reaction (PCR) Technique. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 31(3): 159-163

Jain, Shally. 2004, Use Of Cytochrome B Gene Variability In Detecting Meat

Species By Multiplex PCR Assay. Department Of Veterinary Public Health,

College Of Veterinary Science & Animal Husbandry, Anand Agricultural

University, Anand

http://www.viogene.com/faq

43


Joker, Klass et al., 2006. Species Identification in Meat Products using Real-time

PCR Food and Consumer Product Safety Authority: Netherland

Kesmen, Z. , Yetim, H., Sahin, F. 2009. Identification of Different Meat Species

Used in Sucuk Production by PCR Assay, Research/Arastirma GD090208

Kirby. 1957. A New Method for the Isolation of Deoxyribonucleic Acids:

Evidence on the Nature of Bonds between Deoxyribonucleic Acid and

Protein. Chester Beatty Rese : London

Kocher et al. 1989. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals:

amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A (86) : 6196-6200

Kolmodin & Birch. 2002. Polymerase Chain Reaction: Basic Principle and

Routine Practice. PCR Cloning Protocols 2nd

Edition: 9-10

Koolman, Jan. 1994. Atlas Berwarna dan teks Biokimia / Jan Koolman, Klaus-

Heinrich Rohm ; alih bahasa. Septelia Inawati Wanandai ; editor bahasa

Indonesia, Moh. Sadikin. Hipokrates, 2000 : Jakarta

Kumari, Rajni. 2007. Meat Species Identification by Real Time PCR. Anand

University: Chester Beatty Rese

Margawati, Endang Tri, Muhamad Ridwan. 2010. Pengujian Pencemaran Daging

Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR: Pencarian

Sistem Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI

Markoulatos et al., 2002. Multiplex Polymerase Chain Reaction : A Practical

Approach. J. o. Clinical Lab Analysis 16:47-51

Marmur, J & D. Lane. 1958. Strand Separation and Specific Recombination in

Deoxyribonucleic Acids: Biological Studies. Harvard University: USA

Matsunaga, T., Chikuni, K., Tanabe, R., Muroya, S., Shibata, K., Yamada, J., and

Shinmura, Y. 1999. A quick and simple method for the identifcation of meat

species and meat products by PCR assay. Meat Science (51): 143-148.

Merante, F., Raha, S., & Ling, M., 1998. Molecular Biomethods Handbook, New

Jersey; Humana Press Inc.

Moussaoui et al., 2007. A Phosphate-Binding Subsite in Bovine Pancreatic

Ribonuclease A can be converted into a very efficient Catalytic Site. Protein

Science 16:99-109

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika, Edisi Kedua. IPB Press: Bogor

Passarge, Eberhard. 2007. Color Atlas of Genetics. Thieme : Germany

44


Prezioso, Vincent & Alex Jahns. 2013. Using Gradient PCR to determine the

Optimum Annealing Temperature. Eppendorf Scientific Inc: USA

Promega. 2007. Technical Manual Maxwell®

16 DNA Purification Kits. United

States of America : www.promega.com

Purves et al,. 2003. Life: The Science of Biology. Barnes & Nobles: USA

Putra, Suhartono. 1999. Biologi Molekuler Kedokteran, editor: Suhartono Taat

Putra. Airlangga University Press: Surabaya

Raven et al,. 2002. Biology. McGraw-Hill: USA

Raines, R.T. 1998. Ribonuclease A. Chem. Rev 98: 1045-1065

Reyes A, Gissi c, Pesole G, SaLccone C. 1998. Asymmetrical directional mutation

pressure in the mitochondrial genome of mammals. Mol Biol Evol 15 (8):

957-966.

Riaz, Mian N., Muhammad Chaudry. 2004. Halal Food Production.USA: CRC

Press LLC

Rohman et al,. 2012. Pig species identification in meatballs using polymerase

chain reaction- restriction fragment length polymorphism for Halal

authentication. Int Food Research 19 (3): 901-906

Sambrook, J., & Russel, D. W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual

3rd

Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York

Saez, R, Sanz, Y. and Toldra, F. 2004. PCR-based fingerprinting technique for

rapid detection of animal species in meat product. Meat Science (66): 659-

665.

Saili, Takdir., W. E. Prasetyaningtyas, M.A. Setiadi. S. Agungpriyono., A.

Boediono. 2006. Status DNA Spermatozoa Domba Setelah Proses

Pengeringbekuan. JITV 2 (3): 215-221

Saiyed. Z.M., C.N. Ramchand. 2007. Extraction of Genomic DNA Using

Magnetic Nanoparticle (Fe3O4) as Solid-Phase Support. American Journal

of Infec Dis 3 (4): 225-229, 2007

Sloane, Ethel. 2003. Anatomi dan Fisiologi, untuk Pemula, alih bahasa James

Veldman. EGC: Jakarta

Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA)

dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. FMIPA

IPB. ISSN 0854-8587 : Bogor

http://www.promega.com/

45


Stansfield, William D.; Colomè, Jaime S. dan Cano, Raùl J. 2006. Biologi

Molekuler dan Sel, alih bahasa Varian Fahmi. Erlangga: Jakarta

Stone, Carol Leth. 2004. The Basics of Biology. Greenwood Press: USA

Sulistyaningsih, Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru

Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Laboratorium Fisiologi

Fakultas Kedokteran Universitas Jember : Jember

Sweeny, P.J., J. Patricia., Walker, J.M. 1993, dalam: Micahel M. Burrell, Enzyme

of Molecular Biology. Humana Press Inc, 305-311: New Jersey

Thermo Scientific. 2012. Assessment of Nucleic Acid Purity. www.nanodrop.com

Tsai, Y-L et al., 2012. Development of TaqMan Probe Insulated Isothermal PCR

(iiPCR) for Sensitive and Spesific On-Site Pathogen Detection. PLoS ONE 7

(9): e45278.doi:10.1371/journal.pone.0045278

Utami, Annisa., Riani Meryalita., N. A Prihatin., Laksmi. A., Popi Asri., dkk.

2012. Variation Methods of DNA Isolation From Leaf Of Temulawak

(Curcuma xanthorrhiza Roxb.) Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa,

205-214

Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR

Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles

Velden et al., 2003. Detection of minimal residual disease in hematologic

malignancies by real-time quantitave PCR; principles, approaches, and

laboratory aspects. Nature Publishing Group, 1013-1034

Wijaya, Yoga Permana, 2009. Fakta Ilmiah tentang Keharaman Babi. Bandung.

http://yogapw.wordpress.com, diakses pada tanggal 15 Maret 2013

Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Erlangga: Jakarta

http://www.nanodrop.com/

http://yogapw.wordpress.com/


Lampiran 1

Konsentrasi dan Kemurnian hasil isolasi genom

Tabel 2. Konsentrasi dan Kemurnian hasil isolasi genom

No Sampel Konsentrasi

(ng/µl)

Kemurnian

(A260/A280)

1 Genom Daging Babi 713 1,81

2 Genom Daging Sapi 746 1,67

Lampiran 2

Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA untuk PCR konvensional.

Tabel 3. Campuran reaksi master mix untuk PCR konvensional

Kompisisi Jumlah

Go Taq Green 12, 5 µl

Primer Forward 2 µl

Primer Reverse 2 µl

DNA template 2 µl

Nuclease Free Water 16,5 µl

Total 25 µl

47


Lampiran 3

Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging babi dengan primer babi dan DNA

daging sapi dengan primer sapi.

Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging babi dengan primer babi.

94oC 94

oC 25 siklus

10 menit 15 detik 53oC 72

oC 72

oC

1 menit 30 detik 7 menit 4oC ~

Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging sapi dengan primer sapi.

94oC 94

oC 25 siklus

10 menit 15 detik 63oC 72

oC 72

oC

1 menit 30 detik 7 menit 4oC ~

48


Lampiran 4

Membuat larutan induk primer dan probe

1. Membuat larutan induk primer dan probe 100 µM

Jenis Nama oligo µg To make 100 µM

Bos

Forward 202 Add 335 µL ddH2O

Reverse 239 Add 386 µL ddH2O

Probe 525 Add 793 µL ddH2O

Jenis Nama oligo µg To make 100 µM

Sus

Forward 304 Add 504 µL ddH2O

Reverse 337 Add 549 µL ddH2O

Probe 404 Add 491 µL ddH2O

2. Membuat larutan primer 10 µM dari larutan induk

V1 . M1 = V2 . M2

X . 100 µM = 100 µL . 10 µM

X =

= 10 µL

Maka, 10 µL diambil dari masing- masing primer 100 µM dan di add 90

µL ddH2O

3. Membuat larutan probe 5 µM dari larutan induk

V1 . M1 = V2 . M2

X . 100 µM = 100 µL . 5 µM

X =

= 5 µL

Maka, 5 µL diambil dari masing-masing probe 100 µM dan di add 95 µL

ddH2O

4. Rekomendasi konsentrasi untuk primer dipilih konsentrasi akhir 0,5 µM

(Tsai, 2012) untuk tiap primer

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 µM = 50 µL . 0.5 µM

X =

= 2.5 µL

Maka, diambil 2.5 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM

5. Rekomendasi konsentrasi untuk probe dipilih konsentrasi akhir 0,15 µM

(Tsai, 2012)

V1 . M1 = V2 . M2

X . 5 µM = 50 µL . 0.15 µM

X =

= 1.5 µL

49


Maka, diambil 1.5 µL dari larutan konsentrasi 5 µM

Lampiran 5

Campuran reaksi master mix untuk ii-PCR.

Tabel 4. Variasi komposisi untuk optimasi reaksi ii-PCR.

Final Concentration

1 2 3 4 5 6 7

KAPA2G™

Robust PCR Kit

2,5 U 2,5

U

2,5

U

2,5

U

2,5 U 2,5 U 2,5 U

dNTP

2,5

mM

2,5

mM

2,5

mM

2,5

mM

2,5

mM

2,5

mM

2,5

mM

Primer Forward

0,5

mM

0,5

mM

0,5

mM

0,7

mM

0,5

mM

0,5

mM

0,5

mM

Primer Reverse

0,5

mM

0,5

mM

0,5

mM

0,7

mM

0,5

mM

0,5

mM

0,5

mM

Probe

0,15

mM

0,15

mM

0,15

mM

0,2

mM

0,15

mM

0,15

mM

0,15

mM

Template

100

ng /

50µl

60

ng/

50µl

100

ng /

50µl

100

ng /

50µl

200

ng /

50µl

100

ng /

50µl

100

ng /

50µl

Buffer LS

1 x 1x HS

1x

1x 1x 1.5x 0,5 x

Nuclease Free

Water

Add to 50 µl

50


Lampiran 6

Hasil ii-PCR DNA daging babi dan DNA daging sapi.

Gambar 11. Hasil ii-PCR DNA daging babi dan DNA daging sapi

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Deteksi DNA Babi dan DNA...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Deteksi DNA Babi dan DNA...